CZ47791A3 - Preparations and methods of treating infections caused by organisms responsive to beta-lactam antibiotics - Google Patents

Description

léčbě infekcí, způsobených organismy citlivými na g-laktámová antibiotika. Vynález dále zahrnuje způsoby léčby těchto infekcí v pacientovi určením efektivních množství zmíněných prostředků a k in vitro sledování baktericidní aktivity prostředků v přítomnosti aktivního komplementu2- DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Bakteriální infekce, především gramnegativní bakteriální infekce, jsou stále hlavní příčinou smrti kriticky nemocných pacientů €Kla£ersky et al- 1988, Eur-J-Cancer Clinical

Oncology, 2451:535-5453. Infekce v těchto pacientech postupuje rychle a je často smrtelná.

Pacienti podrobující se chemoterapii mají často nízký počet granulocytů, t.j.granulocytopenié a jsou zvláště náchylní k bakteriálním infekcím ÍKlatersky,1986,Am.J.Ned 80:2-123. Nejběžnější organismy , které v těchto pacientech vyvolávají nákazu jsou gramnegativní bacily Escherichia coli (E- co1 i >, Pseudomonas aeruginosa < P· aerugi nesa) a Klebsiella pneurooníae (K· pngumoniae? a grampositivni koky Staphy1ococcus aureus (S - aureus 3 a Staphy 1 ococcus epeidermis í S epi děrní i s 3 ·

Další pacienti, kteří jsou zvláště náchylní k jak grampositivní tak gramnegativní infekci, jsou ti, kteří se poaroDm gastro i ntest i na 1 n i mu zákroku (Bergarr.ini a 1989, J. Antimicrobiai Chemotherapy 23:30 i - 3039, ačkoliv i jiní pacienti, kteří se podrobili chirurgickému zákroku jsou ohroženi. V současnosti jsou (jedinou {~~antibiotika* účinnou léčbou pro tyto pacienty.

· 1

Jednou ze skupin antibiotik, která byla účinná při léčbě těchto pacientů, jsou p-laktámová antibiotika, která zabraňují syntéze stěn bakteriálních buňek. Společným znakem plaktámovych antibiotik je jejich schopnost zabíjet širokou škálu různých bakterií. Tento znak je velice významný, protože často není vhodné určovat druh bakterie, která způsobuje onemocnění- Léčba navíc začíná většinou dříve než je provedena diagnóza infikujícího organismu, protože bakteriální infekce v těchto pacientech mohou byt rychle smrtelné. Příklady P laktámovych antibiotik zahrnují peniciliny, cefalosporíny, cefamycíny, monobaktamy, pyrazidony, penemy a carbapenemy. Bylo pozorováno, Že nízké koncentrace penicilinů způsobují filamentaci E - col i . zduřeni a. íyza vznikají jen při vyšších koncentracích antibiotik (popsáno . v Maxman a Strominger, 1983, Annual Rev. Biochem. 52:825-869). Bylo také ukázáno, že peptidoglykanové transpeptidazy jsou cílem P-laktámovych antibiotik, a že množství bílkovin v membránách bakteriálních buněk kovalentně váže peniciliny a příbuzné p-laktámyPenicilín G je účinný při inhibici takových grampozitivních druhů koků jakými jsou pneumokoky a streptokoky a gramnegat ivních koky jako Nesseria meningit-ídis

America -7 p U 3 C? D θ Π y Π i se i (Neu, 1987,Pledical Clinics of North Zpočátku byly pro léčbu infekcí influenzae (Η - Influenzae), E-celi, užívány především aminopenici1iny jako ampicilin a aaioxici 1 in. V těchto organismech byla vSak pozorována zvyšující se převaha plazmidově zprostředkovaných beta-laktamáz. Bylo ukázáno, že Cefalosporíny účinkují proti Pseudomonas aeruginosa. meningitidě způsobené běžnými patogeny a proti infekcím způsobených multiresistantními mikroorganismy, i když odolnost vůči těmto činitelům také stoupá. Daší skupina βlaktámú zahrnuje carbapenemové činidlo jako je imipenem, které napadá aerobní a anaerobní grampozitivní a gramnegativní bakterie. Carbapenemy jsou známé pro vysokou afinitu k penicilinům, které váží bílkoviny.

Zvyšující se odolnost vůči β-laktámovým antibiotikům zapříčinila, že jsou těmto pacientům podávány různé kombinace antibiotik. Aminopenici1iny byly kombinovány s clavunalate, což je inhibitor beta-laktamáz, aby byla odstraněny plazmidicky zprostředkované β-laktamázy přítomné v Hinfluenzae. E· coli. Salmonele a Shigele (Neu, 1987, Medica1 Clinics of North America 71:1051-1064). β-laktámy byly také kombinovány s aminoglykosidy (Kláštersky, 1986, Am. J. Med80:2-13). Okázalo se, že taková kombinace je celkem účinná, její účinnost závisí na druhu bakterie proti které je použitaBylo zjištěno, že kombinace β-laktámů s jinými antibiotiky může vést k antagonismu mezi oběma složkami.

Zvyšující se počet publikaci naznačuje, že antibiotika mohou na bakterie působit jinak než je očekávaný baktericidní účinek. (Darveau et al·, 1990, J. Infect·. Dis- 162 :9 i 4-92 1 , Essig et al . , 1982, Arch. Micrcbiol- 132:245-250; Kadurugamuwa et al-,1988, Antimicrob. Agents and Chernother. 32:364-368, Leying et al . , 1986, Antimicrob. Agents and Chernother- 30:475480; Raponi et al . , 1989, Antimicro. Chernother. 23:565-576; Sauerbaum et al., 1987, Antimicrob. Agents and Chernother. 31:1106-1110; Taylor et al., Antimicrob. Agents and Chernother19:786-788; Taylor et al-, 1982, Drugs Expt1. Clin- Res. 8:625-631 and Veringa et al., 1988, Drugs Exptl. Clin. Res. 14:1-8).Příklady některých z těchto efektů zahrnují inhibici produkce exoenzymů (Grimwood et al., 1989, Antimicrob. Agents and Chernother. 33:41-47 ), změny v peptydoglykanové struktuře ( Garcia-Bustos and Dougherty, 1987, Antimicrob. Agents and Chernother- 31:178-182), a ztrátu agresivních přilnavých vlastností (Schifferli and Beachey 1988, Antimicrob. Agents and Chernother- 32:1603-1608 a Vosbeck et al-, 1979, Ref. Inf.

Dis. 1:845-851).

Tyto projevy jsou většinou pozorovány, když jsou bakterie inkubovány antibiotiky na úrovních nižších než je minimální inhibiční koncentrace (MIC). Účinky koncentrace antibiotik pod hranicí inhibice mohou pomoci hostiteli vyhubit bakterii. To platí především pro β-laktámová antibiotika, u kterých je známo, že trvá poměrně dlouhou dobu , než se projeví baktericidní účinek antibiotika.

Obecně jsou antibiotika dávkována v supra MIC úrovních během celé léčby. Jelikož však jak hostitel tak bakteriální faktory jako 0-laktmázy ovlivňují množství aktivních antibiotik v oblasti infekce , nezaručuje supra MIC dávkování dostatečnou koncentraci antibiotika pro každý organismus vykazuj ící lidských a

246-248); sarcotoxiny

Celá škála kationickych oligopeptidů antimikrobiální aktivitu byla izolována z živočišných zdrojů. Obsahuje magaininy ( Zasloff et al ., 1987, Proč. Nati- Acad· Sci. U.S-A. 1984:5449-5453; Zasloff et al.,

1988, Proč. Nati- Acad. Sci- U.S.A. 1985: 910-913; a Zasloff,

1989, U-S. Pat. No. 4,810,777); cecropiny (Christensen et al., 1988, Proč. Nati- Acad. Sci. U.S.A. 85:5072-5076 a Stein et al., 1981, Nátuře (London) 292:

(Nakajima et al. 1987, J. Biol. Chem. 262: 1665-1669 a Okada a

Natori, 1985, Biochem. J. 229:453-458); a defensiny ( Selsted et al., 1985, J. Clin- Investig. 76:1436-1439 a Lehrer et al., U.S. Patent Nos. 4,543,252; 4,659,692 a 4,705,777).

Magaininy byly nalezeny v kožních výměškách jihoafrické žáby Xenopus laevis. Byly isolovány dva druhy magaininů, magainin 1 a Hagainin 2 ( Zasloff et al., 1987, Proč. Nati.

Acad- Sci. U.S.A. 84:5449-5453). Magainin 1 a Magainin 2 jsou si blízce příbuzné, každý obsahuje 23 aminokyselin a liší se jen dvěma aminokyselinami. Tyto peptidy jsou ve vodě rozpustné, v účinných antimikrobiálních koncentracích nehemolytické a potenciálně amphyfi 1ické. Bylo zjištěno,že účinná antimikrobiální koncentrace magaininů nutná pro činnost v sérum neobsahujícím médiu nebo tlumícím roztoku je funkcí magaininů a daného mikrobu.

Byla také studována antimikrobiální aktivita různých syntetických analogů magaininu (Cuervo et al-,1988, Peptide Research 81:81-86; Zasloff et al·, 1988, Froc. Nati- Acad. Sci. U.S.A. 85:9⁺é-913; a Chen et al·, 1988, Antimicrobial Peptides and Process for Haking the Same, PAT-AFPL-7-230,363 National Technical Information Service). Bylo zjištěno, že odstranění tří N-koncovych aminokyselin ξ magaininu-2 neovlivňuje antimikrobiální aktivitu ( Zasloff et al,l988,

Proč. Nati. Acad. Sci- U.S.A. 85:910-913). Avšak odstranění čtvrté aminokyseliny podstatně snížilo antimikrobiální aktivitu. Celá N-koncová oblast je nutná v magaininu 1 (Cuervo et al · , 1988, Peptide Research 1:81-86). Avšak analogy s vynechávkami v C-koncové oblasti, zvláště zbytk^jý alanin15, glycin-18 nebo glutamirleěr kysel ina-19 působily různě hemolyticky, zatímco měly stejnou nebo vyšší antimikrobiální aktivitu ve srovnání s původními .formami magaininu 1 nebo magaininu 2 (Cuervo et al., 1988, Peptide Research 1:81-86). Byly odhaleny analogie magaininovych peptidů, ve kterých byly zbytky aminokyselin s nízkou tendencí k šroubovitým strukturám nahrazeny zbytky aminokyselin s vysokou tendencí k tvorbě šroubovitých struktur, aby se snížila citlivost k exopeptidásní činnosti a zvýraznila se amfifilická strukturální charakteristika a antimikrobiální vlastnosti ( Chen et al-, 1988, Antimicrobial Peptides and Processes for Mking the Same, PAT_APPL-7-280,363 National Technical Information Service).

Dvě skupiny kationickych oligopeptidů, cecropiny a sarcotoxiny, byly izolovány z hmyzu. Cecropiny byly izolovány z různých druhů hmyzu (Christensen et al-, 1988, Proč6

Nati-Acad.Sci. U-S.A. 85:5072-5076

Nátuře(London) 292:246-248).

076	a Stein t	ít al.,	Q C· 1 t z <_> I
Byly	i zolovány	tři	hlavni
36	zbytky ,	každý	ma j íci

amphypaticky charakter. Bylo zjištěno, že pro výslednou, membrány rozkládající aktivitu tohoto peptidu je nutná Nkoncová oblast. Tři sarcotoxiny byly nalezeny v hemolymfě Sarcophraga peregrina.

Kationicke oligopeptidy s antimikrobiální aktivitou, známé jako defensiny byly izolovány z lidí (Selsted et al., 1985, J. Clin. Investig. 76:1436-1439 a Lehrer et al., U.S. Patent Nos. 4,543,252; 4,659,692 a 4,705,777). Tyto peptidy se nacházejí v makrofágách a granulocytech a mají vysoky obsah cysteinu a argininu. Bylo zjištěno šest takových bílkovinBylo také ukázáno, že peptidické fragmenty mitochondríálních bílkovinných prekurzorú jsou aktivní proti grampositivním bakteriím (Lee et al-, 1986, Biochem. Biophys. Acta. 862:211-219). CD spektra těchto peptidů v přítomnosti fosfolipidickych liposomů ukazují, že antimikrobiální aktivita je obecně úměrná obsahu σ-šroubovicové amfifi 1icity Antimikrobiální kationické oligopeptidy, které byly do současnosti zkoumány vykazují určité společné rysy. Zásadně se jedná o kationické peptidy, které hubí široký rozsah druhů bakterií jak bylo zjištěno standartními pokusy in vitro Existují silné důkazy, že mechanismus jejich působení spočívá v pronikání do vnější membrány bakterie a vytvoření malého otvoru, který umožňuje průchod malým iontům (Christensen et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:5072-5076; Nkajima et al·, 1987, J.Biol. Chem. 262:1655-1669; Okada a Natorí,

1985, Biochem. J. 229:453-453; a Sesterhoff et al., 1989, Biochem. Biophys- Acta. 975:361-36?)- Tato aktivita iontů blokuje tvorbu ATP zamezením vzniku protonového gradientu, který je podstatný pro oxidativní fosforylaci COkada a Natori, 1985, Biochem, J. 229:453-458; a Westerhoff et al.,1989 Proč.

Nati. Acad. Sci- U-S-A- 86:0597-6601). V souladu s tímto mechanismem působení se ukázalo, že řada těchto peptidů má aSroubovicovou strukturu v organických rozpoštědlech (Lehrer et al.,U.S. Patent Nos- 4,543,252;4,659,692 a 4,705,777; Westerhoff et al.,1989, Proč- Nat1.Acad-Sci. U-S-A. 86:65976601; a Marion et al. , 1988, FEBS Letters 227:21-26) a vytváří otvory v umělých membránových systémech (Christensen et al, 1988, Proč- Nati- Acad- Sci- U-S-A- 85:5072-5076 a Cruciani et al . , 1988, Biophysical J. 53:9a)Aby byly magaininy nebo podobné prostředky terapeuticky vhodné pro léčení bakteriálních infekcí, které mohou vést k bakteremii, musí byt schopné baktericidně působit v přítomnosti lidského séra. To představuje nelehký problém neboť bylo ukázáno, že aktivita alespoň jednoho lidského defensinu je zcela zbavena účinnosti lidským sérem (Dáher et al., 1986. J. Virol 60: 1068-1074).

2-3.

Velké množství bakterií, zvláště je hubeno čerstvým sérem (Feingold, 120:437-444). Jsou rozeznávány dvě aktivace (popsáno v Joiner et al., gramnegativních bakterií 1969, J. Infectious Dis. hlavní cesty doplňkové

1984, Ann. Rev. Immunol.

aktivována navázáním následnou aktivací je pak podobné dráze koncovými složkami složek. Téměř 3 loe hlubokých hrubých Salmonella minnesota <S Re 595 a 1 log zničené hrubé E. coli J5 bylo použitím čištěných komplementárních složek a C9 (popsáno v Joiner et al - , 1984, Ann. Rev.

2:461-491). Klasická cesta je obecně aktivována interakcí mezi protilátkou a povrchem antigenu. První krok aktivace zahrnuje navázání doplňkové bílkoviny C1 na Fc oblast antigenem vázané protilátky a následnou aktivací molekuly Cl. Další kroky klasické dráhy zahrnují užití všech komplementárních bílkovin, C1-C9. Druhá cesta, alternativní, je

j.inych bílkovin séra na bakterii a komplementární bílkoviny C3. Tato dráha hlavní k komplementární bílkovině C9.

Bylo pozorováno hubení bakterií doplňku C5b-9 v nepřítomnosti předešlých zničených minnesota) pozorováno

C5,C6,C7,C8

Immunol. 2:461-491). Bylo ukázáno, že poškození membrány způsobená doplňky a cytolysa jsou ovlivněny vlastní tvorbou komplexů C5b-9 na cílových buňkách, která je amfifílická a tubulární (Podack a Tschopp, 1984, Mol. Immunol. 21:589-603). Zdá se, že C5b-9 vytváří účinné póry na vnitřní a vnéjší membráně bakterií (Born a Bhadki, 1986, Immunology 59:139145). Vytvořené póry nebo kanálky umožňují rychiy odtok K+, což způsobí smrt buňky zhroucením membránového potenciálu.

2-4.

Potenciální baktericidní prostředky jsou běžně sledovány standartními in vitro metodami. Tyto způsoby jsou podobné těm popsaným v líanual of Clinical Π i crcbi o i ogy , rcurth Edition, Lennette, E-Η·,Ed- in Chief, American Society for Nicrobiology, 1985 str. 9.50-037. Jediné směny byly v urěibi přednosti pro media, přípravu tlumících roztoků, atd. Výběr vhodného antimikrobiálního činidla k léčení infekce vyžaduje řadu ohledů. Mezi mnohými to jsou :(1) in vitro citlivost jiných cílových organismů a (2) vztah citlivosti cílového kmene ke kmenům jiných příslušníků stejného druhu- Koncentrace potenciálního antibakteriálního činitele nutná k inhibici nebo zahubení organismů in vitro a těch, které se nacházejí v tělních kapalinách během in vivo léčby je předmětem přímého laboratorního měření.

Standartní způsoby testováni citlivosti zahrnují diskovou difúzi, kapalinové ředění a agarové ředění. Každá ze tří jmenovaných metod neobsahuje složky, které tvoří aktivní komplementární kaskádu. Tudíž je baktericidní aktivita vztažena jen na schopnost antibakteriálního činitele samotného hubit cílový organismus. Bylo zjištěno, že jisté peptidy , které jsou in vitro baktericidně aktivní nevyhovují, jsou-li testovány v in vitro pokusech, které zahrnují lidská séra a také nevyhovují in vivo. Plagaininy jsou příkladem tohoto jevuDále nebudou registrovány prostředky, které sami mají omezenou nebo žádnou baktericidní aktivitu, ale zvyšují schopnost komplementárního séra hubit bakterie.

3. PODSTATA VYNÁLEZU

Vynález se tyká prostředků a způsobů léčení infekce způsobené organismem citlivým na β-laktámová antibiotika. Organismus může byt gramnegativní nebo grampositivní bakterie. Podle vynálezu jsou tvořeny alespoň dvěma složkami, které reagují synergicky in vivo- Jedna ze složek prostředků podle vynálezu je β-laktámové antibiotikum, β-laktámové antibiotikum může byt penicilín, cephalosporin, carbapenem, monobactam, cephamycin, pyrazidon nebo penem. Konkrétněji cephalosporin je cefepim, cefotaxime nebo ceftadizimě, carbapenem je imipen a monobactam je aztreonam.

Druhá složka prostředků podle vynálezu je kationicky oligopeptid. Kationicky oligopeptid používaný společně s βlaktámovym antibiotikem k vytvoření synergického prostředku zahrnuje magaininy, cecropiny, sarcotoxiny mitochondriální prekurzory bílkovin a fragmenty, analogy a deriváty těchto peptidú. DalSí kationické peptidy zahrnují faktor-4 (PF-4) lidských krevních destiček a fragmenty, analogy a deriváty zahrnující C-13 fragment PF-4. Dále, kationické oligopeptidy tvoří amfipatickou alfa Šroubovici v přítomnosti rozhraní lipid-voda. Oligopeptidy, konkrétněji, mají délku alespoň 8 až 11 aminokyselin a mohou mít obecně sekvence zbytků am i nokyse1 i ny:

aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-Lys-Lys-Ley-Leu-aa3-aa4-X;

kde aa1 je Pro,Ala nebo Lys, aa2 je Ile nebo Leu, aa3 je Glu nebo Lys, aa4 je Ser, Leu nebo Lys a X je sekvence pěti aminokyselin mající charakter alfa Sroubovice s základní či či či Ó J 'Č

S č r* V Θ Π C i či či O i_* y č* i_. y¹ č ď ci O ~ 'j X V /2 d <3 č> <i č- i θ A 1 či Γ.č- O Lj č¹ U

Leu nebo Plné.

názorné kationickě oligopeptidy mohou byt:

AIa-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly (Sekv. I.D.#5>;

A1a-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AIa-LysLys-Leu-Gly (Sekv. I.D.ttó);

AIa-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AIa-LysLys-Leu-Gly (Sekv. I.D.#7>;

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-OrnOrn-Leu-Gly

AIa-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-LysLys-Leu-Gly (Sekv. I.D.#8);

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-LysLys-Phe-Gly (Sekv. I.D.#10);

Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-SerAla-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv.

AIa-Lys-Lys-Leu-AIa-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-LeuLeu-Lys-Ser -AIa-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv. I.D.#12>.

Kationické oligopeptidy mohou také zahrnovat:

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly a podobné, kde zbytky aminokyselin mohou byt d-aminokyseliny. Předkládaný vynález dále popisuje prostředky k léčbě infekce způsobené bakt er i emi Ent srobact er i acsas, z-v i á št ě Esc herichia col i . Entarobaotgr clocag a Klebsiella. pngumoniae· Prostředky podle vynálezu jsou také účinné pro léčbu způsobenou Pseudomonas aeruginosa. Prostředky kombinuji p-laktámová antibiotika popsaná výše s membránovými aktivními složkami. Membránové aktivní složky rozrušují základní funkce membrán, které jsou . závislé například na motorické síle protonů zahrnující oxidativní fosforylaci, základní přenos, atd. Membránové aktivní složky zahrnují kationické oligopeptidy tak jak jsou popsány výše a níže.

Jsou také předloženy způsoby léčení infekcí způsobených organismy citlivými na b-laktámová antibiotika. Některé z infekcí, které jsou léčitelné prostředky podle vynálezu jsou způsobeny bakteriemi Enterobact-eriaceae, zvláště E · col i . V klinických metodách jsou pacientům podávány terapeuticky účinná množství prostředků podle vynálezu po dobu dostatečnou k zamezení růstu bakterie. Specifické kombinace pro léčbu bakteriálních infekcí způsobených Escherichia. coli zahrnují cefepim kombinovaný s magainínem 2, peptídem C-13 faktoru-4 krevních destiček a kationické peptidy se sekvencí zbytků am i nokyse1 i ny:

A13 *_ιθ u i y.r * lys bys u5ti ~ l-- u u y

Lys-Leu-Gly (Sekv. I.D.SÓ);

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly (Sekv. I-D.47)

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-OrnOrn-Leu-Gly dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLysdSer-dAla-dLys-dLys-dLeu-GlyPředkládaný vynález se dále týká in vitro způsobů pro sledování antibakteriální aktivity prostředků s komplementem. Prostředky, které mají být zkoumány jsou kombinovány s cílovou bakterií a složkami aktivní komplementární kaskády v standartním prostředí a po dostatečné době je určena antibakteriální aktivita. Aktivní komplementární prostředky mohou být dodány jako sérum anebo mohou být složky komplementární aktivní kaskády dodány zvlášť. Zvlášť vhodné je lidské sérum.

Ještě další výhody a přednosti předloženého vynálezu jsou zjevné pro odborníky z oboru z následujícího podrobného popisu, příkladů a nároků.

4. Stručný popis obrázků

V obrázkách:

Obr· 1.

ilustruje hubení neošetřené a cefepimem ny do střední log fáze s (cefepimem změněné) a bez (neožetřené) 1/4 MIC cefepimu (0-016 microg/ml cefepimu). Buňky byly rozpuštěné jako je popsáno v 6.1.5 a přidány do zkumavek obsahujících GVB + + tlumicí roztok, s nebo bez cefepimu při různých koncentracích peptidu magainin 2 (vyznačeno na ose x). Cefepim byl přítomen ve zkumavkách užívaných ke zkoumání buněk, které byly předpěstovány s tímto antibiotikem. Po 180 minutách při teplotě 37 °C, byl určen počet živých bakterií měřením počtu kolonii tvořících jednotek (cfu) v každé zkumavce. Počty bakterií byly určeny třikrát. Pro každou koncentraci magaininu platí: Log zahubených = log10 cfu bez magaininu - log10 cfu obsahující magainin.

Obr. 2- ilustruje hubení neošetřené a cefepimem změněné E. coli v lidském séru- Buňky připraven, tak jak je popsáno v obr-1 byly přidány do zkumavek obsahujících 40% lidského séra. Po 180 minutách při teplotě 37°C, byl určen počet živých bakterií měřením počtu kolonii tvořících jednotek (cfu) v každé zkumavce. Pokusy byly provedeny třikrát. Pro každou koncentraci magaininu platí: Log 10 zahubených = LoglO cfu bez magaininu - log10 cfu obsahující magainin.

Obr. 3. ilustruje hubení E- coli magaininem 2 v aktivním a teplem inaktivovaném séru. Buňky připravené tak jak je posáno v obr. 1 byly přidány do sady zkumavek, které obsahovaly 40% lidského séra a 40% séra teplem inaktivovaného. Cefepim byl přítomen ve zkumavkách užívaných ke zkoumání buněk, které byly pěstovány s tímto antibiotikem. Buňky dále obsahovaly buá 100 ug/ml rr.againi nu 2 nebo žádnou pří;;:5s magaininu· Log 10 Zahubených byl vypočítán jak z neošetřených tak z cefepimem změněných bakterií v aktivním nebo teplem inaktivovaněm séru dle následujícího vzorce: LoglO Zahubených = LoglO cfu bez magaininu - LoglO cfu obsahující magainin.

Obr. 4. ilustruje inhibici hubení magaininem cefepimem upravených buňek pomoci inaktivniho séra- Buňky byly předpěstovány v cefepimu jak je popsáno v legendě k obr. 1. Buňky byly přidány do sady zkumavek, které obsahovaly cefepim s 0, 2.5, 5, 10, 20 nebo 40% teplem inaktivovaného séra. Další sada buňek s identickým množstvím teplem inaktivovaného séra obsahovala 200 ug/ml magaininu 2. Procentuální inhibice pro každou koncentraci teplem inaktivovaného séra = ( cfu obsahující magainin/ cfu bez magaininu) x 100Obr. 5. ilustruje roli lidského komplementu v hubení neošetřené a teplem změněné E. coli magaininem- E- coli ATCC 25922 byla pěstována s a bez 1/4 MIC cefepimu. Buňky byly přidány do sady zkumavek, které obsahovaly bu3 40% lidského séra specificky ochuzeného v lidském komplementu C8^f(bez C8) nebo 40% lidského séra ochuzeného v C8, ke kterému byl dodán do 50 ug/ml <+C8) očištěný C8. Cefepim, jestliže byl přítomen byl dodán do 0.016 ug/ml (+ cefepim). Každá sada zkumavek také obsahovala 0, 6.25, 12.5, 25 nebo 50mg/ml magaininu 2. Počet žijících bakterií byl určen v okamžiku přidání bakterií do séra (input) a procento těch, které přežily bylo určeno po třech hodinách. Pokus byl proveden třikrát, průměr +/- 1 intra střední odchylka pokusu je vyznačena.

Obr. ó. ilustruje účinek různých antibiotik na hubení magaimnem v konzervovaném normálním lidském ATCC 25922 byla předpěstována a pokusy byly prováděny bez antibiotik a při 1/32, 1/1ó a 1/13 HIC pro každé zkoumané antibiotikum. Bakterie byly přidány do dvou sad zkumavek, obou obsahujících 40% konzervovaného normálního lidského séra a bu*3 200 micrg/ml magaininu 2 nebo žádny magainin. Pro každou koncentraci antibiotik: LoglO Zahubených = LoglOcfu bez magaininu - LoglO cfu obsahující magainin. Cipro = ciprofloxacin, ND = neurčeno.

Obr. 7 ilustruje množství hubení různých bakterií pomocí magaininu/cefepimu. Bakteriální buňky byly pěstovány do mid log fáze s a bez 1/4 MIC cefepimu- Bakterie byly přidány do dvou sad zkumavek, které obě obsahovaly 40% konzervovaného normálního séra a bu3 žádny nebo 200 ug/ml magaininu. Navíc byl cefepim přítomen ve zkumavkách, ve kterých byly zkoumány buňky předpěstovány s tímto antibiotikem. Pro každé bakteriální kmeny, byl Log10 Zahubených vypočítán následujícím způsobem : MGN 2 = Log10 jgahubenych bez MGN - Log10 zahubených + MGN; cefepim = Log10 zahubených bez MGN - Log10 zahubených bez MGN ♦ cefepim. E. cloa = E cloacae. K-p- = K- pneomoniae·

Obr. 8. ilustruje C-13 peptid z PF-4 hubení E- coli v aktivním a teplem inaktivovaném séru. E- coli ATC 25922 vyrůstala s a bez 1/5 MIC cefepimu. Buňky byly přidány do sady zkumavek, které obsahovaly 40% konzervovaného normálního lidského séra nebo 40% teplem inaktivovaného séra. Cefepim byl přítomen v těch zkumavkách, které sloužily k předpěstování buněk s tímto antibiotikem. Zkumavky také obsahovaly 200 Ug/ml peptidu C-13. Pro neoSetřené a cefepimem změněné seru. Ξ- coli uakterie v aktvním nebo teplem ;naktivovanén seru plaof: Zahubených = Log10 cfu no C-13 - Log10 cfu ♦ C-13. Poznámka: k hubení nedošlo u cefepimem upravených bakterií v inaktivním séru .

5.

Vynález se týká prostředků a způsobů způsobených organismy citlivými léčby infekcí b-laktámová na antibiotika.Takové prostředky jsou tvořeny alespoň dvěma složkami, které reagují synergicky. Jako důsledek mají prostředky větší účinnost, než které lze dosáhnout jednotlivými složkami. Synergismus může být také patrný ze stejné nebo větší účinnosti s nižšími a/nebo méně častými dávkami, než by bylo potřeba pro jednotlivé složky zvlášť. Prostředky podle vynálezu mohou být také vhodné pro léčbu resistentních antibiotických kmenů. Dále se vynález týká in vitro způsobů sledování prostředků synergických s βlaktámovými antibiotiky v hubení bakteriálních buněk a na prostředky schopné hubit bakterie s aktivním komplementem pro baktericidní aktivitu.

5.1

Vynález se týká prostředků zahrnující nejméně dvě neb více složek pro léčbu infekcí způsobených oorganismem citlivým na b-laktámová antibiotika. Organismy citlivé na β-laktámová ant ibiotika mohou ______ být gramposit i vní bakterie (např.

Streptococcus? nebo

Ent erobac t e r i .3 c e a e ( gramnegat 1 vn 1 bakt en « např igchericnia o o i 1 omezená na, cefotaxim a pneumoniae a Enterobacter cloacae). čeledi Pseudomonadaceae t.j. Pseudomonas a.eruginosa) a. čeledi Bacteroides- V jednom konkrétním provedení prostředek obsahuje (1) β-laktámové antibiotikum, které inhibuje růst organismu a (2) kationický oligopeptid- β-laktámové antibiotikum může inhibovat růst bakterie změnou struktury membrány bakterie a kationický oligopeptid může tvořit kanálky v membráně bakterie. Tudíž βlaktámové antibiotikum a kationický oligopeptid se mohou chovat synergickyβ-laktámová antibiotika jsou definovány v 2.1-, supra jsou ta antibiotika, která brání syntéze stěny bakteriální buňky. Taková antibiotika mohou zahrnovat, ale nejsou pouze peniciliny, čephalosporiny (např cefepim, ceftadizim), carbapenemy (např imipenim), monobactamy ( např- aztreonam), cephamyciny, pyrazidony a penemy- β-laktámová antibiotika mohou být získány z obchodních zdrojů nebo využitím postupů pro získání těchto antibiotik, běžně známé odborníkům z oboruPojem kationický oligopeptid tak jak je používán v tomto specifikací a v nárocích se týká amphypatických oligopeptidů s antimikrobiální aktivitou, které mohou pronikat vnitřní membrány bakterie a kombinací s β-laktámovým antibiotikem provádět synergické hubení bakteriálních buněk.

V jednom konkrétním provedení kationický oligopeptid obsahuje oblasti, které mají charakter alfa šroubovice v ;ίίtemnost i \ 23 kj j x i ρ; g ·· v <·_·· c a

Vytvc^swá šicií:·· šroubovicové projekce

J.7:121-135). Oblasti bu3 levo nebo prsvotočivá a rnůíe obsahovat aminokyseliny ( t.j. alfa, alfa-dialkyl aminokyseliny, deriváty aminokyselin). Dále tvoří kationické oligopeptidy amfipatické šroubovice. Některé oblasti lineárního peptidu jsou hydrofobního charakteru zatímco jiné jsou charakteru hydrofilního, tak že když se šroubovice vytvoří je jedna strana šroubovice především hydrofobní zatímco druhá je především hydrofi lni. Ačkoliv tato charakteristika nemusí byt zřejmá při sledování lineárního řetězce je zcela patrná při využití šroubovicovych síťových diagramů (Crick, 1953, Acta Crystallogr. 6:684-697) nebo osové (Schiffer et al-, 1967, Biophyss hydrofobním nebo hydrofilním charakterenj nemusí byt tvořeny výhradně zbytky aminokyselin stejného charakteru, ale pokud je zachován amphypaticky rys peptidu stačí aby byly převážně hydrofobní nebo hydrofi lni. Podobně by mělo byt poznamenáno, že oblasti s podobnou fyzikální charakteristikou nemusí byt přísně paralelní s osou šroubovice, ale mohou s ní svírat kosy úhel. Navíc mohou byt šroubovicové oblasti přerušeny oblastmi nešroubovicovitymi a stále zachovávat výraznější baktericidní aktivitu v přítomnosti p-laktámovych antibiotik.

V konkrétním provedení, může byt kationickym oligopeptidem faktor-4 lidské krevní destičky a jeho fragmenty, analogy a deriváty. Analogy a deriváty jsou takové peptidy, které zachovávají kationicky amphypaticky ašroubovicovity charakter peptidu a dále si zachovávají baktericidní aktivitu. Faktor-4 (PF-4) lidských krevních destiček, který obsahuje 70 aminokyselin je destičkový agranulový protein, který má vysokou afinitu k heparinu a omezuje endotheliální proliferaci buněk stimulovanou růstovým faktorem (Maione et al . , 1990, Science 247:77-80) a je také imunoregulačně aktivní (Zucker et al., 1989, Proč- Nat 1 . AcadSci. U.S.A. 86: 7571-7574). Bylo zjištěno, že koncový karboxy fragment tvořený 13 aminokyselinami (aminokyseliny 58-70), zde nazývaný C-13 PF-4 fragment nebo peptid C-13 mající sekvenci:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Sekv.I-D.#1 ) zachovává jak růst omezující tak imunoregulační aktivitu (maione et al · , 1990, Science 247:77-8é a Zucker et al. , 1989, Proč. Nati. Acad. Sci- U.S.A- 86:7571-7574)- Bylo však zjištěno, že menší peptidy, C-12 (aminokyseliny 58-69) a C-11 (aminokyseliny 58-68) jsou méně omezjící (Maione et al . , 1990, Science 247:77-). Malá omezující aktivita byla pozorována u peptidu C-10 (aminokyseliny 58-67).

Kat ionické oligopeptidy mohou být připraveny postupy známými, odborníkům z oboru. V jednom provedení mohou být kationické oligopeptidy izolovány ze svého přírodního zdroje. Například jak je vysvětleno v 22.supra. mohou být magaininy izolovány z Xenopus laevis (Zasloff, 1987, proč- Nati. AcadSci U.S.A. 84:5449-5453), cecropiny a sarcotoxiny mohou být izolovány z hmyzu (Christensen et al., 1983, Proč. Na11 - Acad. Sci. U.S.A. 85:5072-5076 a Nakajima et al., 1987, J- Biol. Chem. 262:1655-1669), mitochondriální prekurzory bílkovin mohou byt izolovány z mitochondrií a faktor-4 lidských krevních destiček může byt izolován z krevních destiček užitím známých postupů. Mimoto kationické oligopeptidymohou byt získány rekombinovanymi DNA postupy. Byly objeveny například způsoby získání magaininů (Zasloff, 197, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:5449-5453), cecropinů (Christensen et al.

1988, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:5072-5076), sarcotoxinú (Nakajima et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 1665-1669) a faktoru-4 lidských krevních destiček (St. Charles et al.,

1989, J. Biol- Chem. 264:2092-2099). Kationické oligopeptidy podle vynálezu mohou byt také získány chemickou syntézou řetězců oligopeptidú s využitím známých procesů jako je obchodně dostupný syntezátor peptidů a další. Takové standartní techniky polypeptidické syntézy mohou byt nalezeny v publikacích jako Merrifield, 1963, J. Chem. Soc. 85:21492154 a Hunkapillar et al., 1984, Nátuře (London) 310: 105-111.

Syntézou byly vytvořeny různé analogy peptidu C-13 faktoru-4 lidské krevní destičky. Analogy, které si zachovaly baktericidní aktivitu jsou a-šroubovice s přibližně 3.6 aminokyselinami na otáčku s minimální délkou 11 až 18 aminokyselin,a které mají střídavé hydrofobní a hydrofilní oblasti každé dva nebo tři zbytky aminokyselin jso považovány za část předkládaného vynálezu- Syntezované analogy, které rozrušují šroubovicovy charakter molekuly nebo její amphypaticky charakter podstatně redukují nebo ztrácejí jakoukoliv baktericidní aktivitu.

Obecně sekvence aminokyselin

Sroubovicov itych amfipat ických prostředků podle vyn<

<2která vykazuje anti bakteriální aktivitu obsahuje sekvenci zbytků aminokyselin:

aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X kde a1 je pro Ala nebo Lys; aa3 je Glu nebo Lys; aa4 je Ser,Leu nebo Lys a X je sekvence pěti aminokyselin tvořeny Ala-Lys-Leu-Gly.

Specifické provedení předloženého vynálezu obsahuje olígopeptidy s následujícími řetézci aminokyselin:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser;

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-LysLys-Leu-Gly;

dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLysdSer-dAla-dLys-dLys-dLeu-Gly;

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-OrnOrn-Leu-Gly;

A1a-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-A1a-LysLys-Leu-Gly;

yx-Arg-A:

?u- Ai m ·· Lei: - Ar g - Se r ·· A1 a Arg-Leu-GIy

A1a-Leu-7yr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Ly3Lys-Phe-Gly;

Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-SerAla-Lys-Lys-Leu-Gly;

Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-LeuLeu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly.

Po popsání základní struktury kationického a šroubovicového amfipi1ického bakterícidního prostředku, peptidu C-13 faktoru4 krevních destiček a různých analogů a derivátů s antibakteriální aktivitou, mohou být peptidy běžně vytvářeny syntézou provedenou běžně známými standartními metodami, jako je např. obchodně dostupný symtezátor peptidů a podobně.

Je však také nutné podotknout, že když je dána základní struktura antibakteriálních prostředků podle vynálezu a způsoby sledování prostředků působících synergicky s βlaktámovými antibiotiky nebo lidskými komplementárními složkami množství různých dalších analogů a derivátů může být snadno předpovězeno, generováno a/nebo připraveno standartními a běžnými metodami jako je počítačové modelování a podobně. Všechny takové analogy a deriváty, které jsou ve své struktuře a funkci ekvivalentní prostředkům zde popsaným jsou zahrnuty do rozsahu předloženého popisu.

V specifickém provedení, prostředek obsahující (1) βlaktámové antibiotikum, které zamezuje růstu bakterií a (2) membránovou aktivní složku může byt užity k způsobené bakterií. Příklady 3- 1aktdrnových diskutovány výše. Termín membránová a?

jo/: je

Λ, o i“ x cl používán v předloženém popisu a nárocích je schopna narušovat integrální funkce membrán. Takové funkce zahrnují, ale nejsou omezeny na, oxidativní fosforylaci, základní transport a další činnosti membrán svázaných s motorickou silou protonů. Příkladem takové složky je kationicky oligopeptid. Příkladné kationické peptidy jak jsou diskutovány supra zahrnují, ale nejsou omezeny na, magaininy (např- magainin 1 a magainin 2), cecropiny, sarcotoxiny, mitochondriální prekurzory bílkovin, faktor-4 lidských krevních destiček a na fragmenty, analogy a jejich deriváty.

V jednom velice specifickém provedení může byt prostředek obsahující (a) cefepim a (b) magainin(2) využita k léčbě infekce způsobené Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa. Enterobacter clocae a Klebseilla pneumoniae· V jiném konkrétním provedení prostředek obsahující (a) cefepim a (b) peptid C-13 faktoru-4 lidských krevních destiček může byt využit k léčbě infekcí způsobených Escherichia coli. Zase v jiném specifickém provedení prostředek obsahující; (a) cefepim a (b) analog peptidu C-13 může byt využit k léčbě infekcí způsobených Escherichia coli. V dalším velice konkrétním provedení prostředek tvořeny (a) ceftazidimem, aztreonamem nebo imipenem a (b) magaininem (2) může byt využit k léčbě infekcí způsobených Escherichia coli. Prostředek tvořeny: (a) aztreonamem a (b) analogem G peptidu C-13 může byt využit k léčbě infekcí způsobených Escherichia coli zase v jiném spec rifickém provedení.

Předloženy vynález se také tyká metod léčby infekce v pacientovi způsobené organismem citlivým na 0-laktámy. V jednom provedení vynálezu je pacientovi podáváno terapeuticky účinné množství prostředku tvořeného (1) β-laktámovym

ant ibiot ikem,	které	zamezuj e	růst organismu	a	(2) a
kat ionickym	oligopeptidem po	dobu	dostatečnou	k	zničení
bakteriální	infekce.	β-laktámová	antibiotika a	kat ionické
oligopeptidy	jsou definovány	a	diskutovány	v	5-1. V
spéci fickém	provedení	může byt	dávka β-laktámu	pod	hranicí
inhibiční dávky.
Vynález	se také	tyká metod	pro	specifické léčení	infekcí

způsobených bakteriemi Enterobacteriacea podáváním prostředků pacientovi, které obsahují množství β-laktámů, které omezují růst Enterobacteriaceae a přinejmenším jedné membránové aktivní složky. V jednom provedení podávané množství βlaktámovych antibiotik vytváří koncentraci antibiotika pod hranicí inhibice v infikované oblasti pacienta. Membránová aktivní složka, jak je popsána v 5.1., supra může zahrnovat sérum, dalčí složky a kationické olígopeptidy.

V jednom velíce specifickém provedení může byt léčena infekce způsobená Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter clocae a Klebseílla pneumoniae podáváním pacientovi účinného množství prostředku tvořeného (a)

2ó noqoiu ‘ωχοχοΓυχ isoupsjd vut?Af?p sf ju^A^pod ýtxojuja^sZs oaj · xuepXA jups^sod ‘vd 'uoiseg '-oj Sutqsi xqnj spesa ‘ssou3jos iBOtinsOBUUBqd suoaSuiuisa λ jzpjpu ou^oui ef nzexvuXA oqpuo^oxpojd ijxpejisoad jupAppod oad Xsxdpojd e nxxuxxooj, •qosstj qoXuzija a oqou noupsfBU j5^;az -eu-pAfpod eipiuiQ juAxaxe iXq noqoiu nz9i?u/A juspsAoad oqjiUTf expoj -ujju^A^pod pojd euesjtus expiuij juaii^b nosí nzex^uÁA ovx?ue?oxpejd eoexxxde v^uP®í expoj -juvAppod οχχιιχχνχοχ oqou oq^xoxdoa ‘oqvxoxmoisXs ^u^oqa ‘ju^Afpod Xqospdz puzpa oad XuoAeadn ^Xq noqoui nzexpuXA XxpejisoJd •pouxpef qoXusujuiz vqqvi 21 ο^ι^πΧλ Vuaxixsjs qXq esxjui ijxpejasoad oiqovi -ηχοαχνζ uivxoxSanaxqo od TiusxoBd ρ χ xdeaeioiueqo ss jojfnqoapod nouiAoxea juoouieu xnuejoed ‘x^uejoed juoouiau Χχοτ^ταχ §u xzeui jj^ed •aoxejux juxvxaaqx^q bu vaxxixd jsviAzqo ef ζίΟΛΧ χ ^oupef uxdnxs epej eadn3 -3 λ θ§Χλ ou^sdod sf xep -joxsjux qojujpxasqxeq qoXuzQj vqpvx X Xqx?nÁA qXq noqoui ozsxvuXa ©xpod Xxpejqsoaj i

•SXVP ou^sdod af xef £L-D npxided Soxeue 9 uibuobjizb :afnuxquiox Xasqx ' nxpejqsoad uijAqs?ouui uijuAxqxeje oqou 3 uiouxuxe^eui <q) e uisuodiuix oqeu uieuieuoeaqzi? 'uieuixpxzeqjao (h) OI49U3JOA1 nxpejqsoad uijAqssouui tujuAxixsje husqvx χχοο exqoxaoqosg v^u®Q^osQd² ao^ajui iXq a^Qui juepsAoad uivxoxjxosds uivuxf a 3SB2 -xsQxqssp qojuAsax qoXxspxx f-naoixej £L-d prqded <q) e tuxdejao (e> efnqesqo Xasqx ‘nxpejisoad jAqsjouux oqvuuxQp uijuvAVPod eusQvx χχοο exqoxasqosg vusqosQdz aoxsjur iXq θ?ςιω vpexxjjd uijuívjxuox uipuxf λ ‘3 uieuxuxe^eui (q) e uieuirdejso oýt intrarauskulárni, intraver.ozn šubcutčínni. ro injekce jsou připraveny v kapalných roztocích, nejlépe ve fyziologicky kompatibilních tlumících roztocích jako je Hankův nebo Ringerův. Navíc mohou být prostředky připraveny v tuhé formě a rozpuštěné nebo převedeny do suspenze těsně před podáváním. Lyofi 1izované formy jsou také zahrnuty.

Systemické podávání může byt také transmucosální nebo transdermální nebo mohou byt prostředky podávány orálně. Pro transmucosální nebo pro transdermální podávání, jsou použity penetranty podle bariéry, kterou je nutno pronikat. Takové penetranty jsou obecně známé a zahrnují například žlučovou sůl a deriváty fusidické kyseliny pro transmucosální aplikace. Navíc mohou byt použity detergenty k usnadnění pronikání. Transmucosální podávání může byt provedeno například nosními spreji nebo použitím čípků- Pro orální podávání, jsou prostředky připravovány do konvenčních forem jako jsou kapsle, tablety nebo tonikum.

Pro topické podávání jsou popisované prostředky připraveny do běžně používaných mastí, krémů, želatin.

5.3.

Dále se předkládaný vynález tyká zlepšených metod in vitro sledování prostředků s baktericidní aktivitou, zvláště kationickych α-šroubovicovych amfifi 1ickych peptidů. Způsoby jsou v zásadě ty, které jsou známé odborníkům z oboru, ale dále zahrnuj i prostředky funkční komplementární kaskády. ťředeSle způsoby zahrnují diskové rozpouštění, agarové ředění procedury rnikro a makro ředění v bujónu. Každá z těchto metod může být modifikována komplementární kaskádu.

tak , aby zahrnovala aktivní Zahrnutí funkční komplementární kaskády umožňuje rozlišení určitých prostředků, které vyžadují aktivní komplement pro baktericidní aktivitu. Tyto prostředky při aplikaci in vivo jsou kombinovány s komplementy, jelikož komplementy jsou součástí imunitního systému savců. Běžné in vitro metody, které nezahrnují aktivní komplementy nerozeznávají tyto prostředky a proto vyloučily výzkum mnoha aktivních nových prostředků, včetně prostředků podle vynálezu.

Aktivní komplementární složky, podle vynálezu, pro použití při sledování zkoušek in vitro mohou být přidány ve formě séra. Séra izolovaná z lidského organismu, krys, morčat, králíků atd. mají vysoký obsah aktivního komplementu a mohou být použita při zkouškách podle vynálezu. Je dávána přednost komplementům z lidského téla- Může být též zajištěna komplementní funkční kaskáda, stejně jako její jednotlivé složky a přidána k standardnímu zkušebnímu materiálu.

V předešlém textu je popsán předložený vynález a některá jeho konkrétní provedení, následující příklady mají ukázat některá jeho použití, nelze je chápat jako limitujícíPříklady provedení vynálezu

6. Příklad: Synergické účinky cefalosporinu a kationického peptidů magainin 2

V tomto příkladu je popsán synergický účinek různých typů beta-iaktámovych antibiotik a magaininu. Při těchto pokusech jsou bakterie zabíjeny v koncentracích nižších než inhibičních kombinací antibiotika a magaininu. Pokud každé z činidel je aplikováno samostatně, má malé nebo žádné smrtící účinky. Druhy typ synergismu se vztahuje k použití těchto dvcu činidel v normální lidském séru. 2a přítomnosti lidského séra zabila magainin/antibiotická kombinace baktérie při nižší koncentraci než bylo pozorování) v tlumivém roztoku. Tyto výsledky indikují užitečnost použití těchto prostředků k léčení in vivo infekcí způsobených bakteriemi. Prokázal se přídavný synergicky efekt. Synergismus v séru vyžaduje faktor tepelné nestability. Tento faktor byl pokusy se sérem se specificky ochuzeným komplementárním proteinem C8 určen jako komplement séra.

6.1. Materiály a metody

6.1.1. Reakční činidla a tlumivé roztoky

Byly užity následující tlumivé roztoky: želatinoveronalovy tlumivy roztok (GVB+ +) (Gewortz H. et al., 1985, v Manual of Clinical Imunology, N.R.Rose a H. Freedman (eds.) ASM, Washington, D.C.). Dále byla přidána 0,1$ dextrosa k tlumivém roztoku jako zdroj uhlíku. Fosfátový fyziologicky tlumivy roztok byl připraven v naší laboratoři. Antibiotika byla získána od dr- Roberta Kesslera, Bristol-Myers Squibb Company, Wallingford, Conn. v lyofj>l i zované formě- Magainin 2 byl syntetizován v naší laboratoři z publikované sekvence aminokyselin (Zasloff et al, 1987, Proč. Nati- Acad Sci.

U.S.A. 85:910-913; and Zasloff, 4,810,777).

•at&nt

6.1.2. Kmeny baktérií a podmínky kultivace

Escherichia coli ATCC 25922 užívané, pro většinu pokusů byla získána z American Type Culture Collection (ATCC). Jiné E coli kmeny byly A011, získané z Harbcview Pfedical Center, Seattle, WA a H16 získané z Walter Reed Army Inst. of Research, Dept. of Bacterial Diseases, Washington, D-C. Dále byly vyšetřovány K1ebs i e11a pneumon i ae kmen ATCC 13883 a

Enterobacter cloacae získané z Veterans Administration Hospital, Seattle, WA. Kmeny byly zkoušeny na čistotu, řádně identifikovány .a poté uchovávány při teplotě -70°C. Všechny kmeny byly pěstovány v AMH (Adjusted Mueller Hlnton) (Jones et al. , 1985, in Manual of Clínical Microbiology, E.H. Lennette (ed.), ASM, Washington, D.C.).

6-1.3SÉRUM

Krev byla získána od pěti zdravých dobrovolníků a srážela se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po další 20ti minutové inkubaci při teplotě 4°C byla krev centrifugována po dobu 15 minut při 1 500 x g. Sérum bylo odstraněno a konzervováno, kyselinou ethylenediamineteroctovou (EDTA, Sigma Chemical Co., St- Louis, Mo-), která byla přidána do koncentrace 10mM a sérum bylo uchováno pří teplotě -70°C v malých množstvích jako konzervované normální normální lidské

alternativní, sérum byle- zmraženo bez EDTA aditiva a použito bez přídavku CaCi._?- Sérum bylo udržováno na ledu než se promíchalo s bakteriemi pro baktericidní zkoušku séra. Kde je uvedeno, byl sérový komplement inaktivován zahřátím na teplotu 56°C po dobu 30 min6.1.4. STANOVENÍ MINIMÁLNÍ INHIBIČNÍ KONCENTRACE (MIC)

MIC představuje nejnižší koncentraci antimíkrobiálního činidla, při které se uskuteční úplná inhibice. MIC byla určena mikrozře<3ovac£ destičkovou zřeSovací metodou užívající

AMH (Manual of Clinical Microbiology, Fourth Edit ion, Lennette, E-H. Ed. in Chief, ASM. 1985. pps 972-977). Byla provedena přinejmenším tři různá stanovení pro každé antibiotikum u každého kmene.

6.1.5. BAKTERICIDNÍ ZKOUŠKA SÉRA

Bakterie inokulované z kultur vypěstovaných přes noc byly pěstovány do střední log fáze s nebo bez antibiotika o (absorbance při óóOnm mezi 0,35 a 0,5; přibližně 2-3 x 10

O buněk/ml pro buňky pěstované s cefepimem a 9x10 buňek/ml pro buňky pěstované bez cefepimu. Buňky byly zředěny bez promytí na 1 χ 10⁴ buněk/ml v želatinově-veronálovém tlumivém roztoku (GVB + + ) a 0,05 ml bylo přidáno do séra v 1,5ml Eppendorfově zkumavce. Bakteriální buňky, které byly předpěstovány v antibiotiku byly zředěny v GVB+ + obsahujícím shodnou koncentraci antibiotika. Bua konzervované normální lidské sérum nebo teplotou inaktivované konzervované normální lidské sérum byly připraveny předem neředěním na patřičnou koncentraci v 0,2 ml GVB + + . Pokud byla antibiotika nebo magaininy přítomny, byly přidány do roztoku směsi séra před přidáním baktérií. Celkový objem reakčního roztoku byl 0,25 ml. Počet bakterií přidaných do séra byl určen přidáním 0,05 ml bakteriální suspenze do zkumavky, která na začátku zkoušky obsahovala pouze GVB+ + a destičky. Reakční směs poté rotovala při teplotě 37°C tři hodiny. Vzorky (25 μΐ) byly v intervalech odebírány pro analýzu počtu destiček. Počet jednotek tvořících kolonii byl určován po inkubaci přes noc v tryptičasovém sojovém agaru- Jednotky tvořící kolonii byly určovány třikrát a byl brán průměr.

6.2. Výsledky

Účinky magaininu 2 (PIGN 2) a cefepimu (cefalosporinové antibiotikum) byly zkoumány v tlumivém roztoku. Jak ukazuje obr. 1, kombinace cefepimu a 100 pg/ml PIGN 2 vedly k usmrcení více jak 1,5 log. Při použití cefepimu samostatně byl úhyn menší než 0,3 log^g. Dále nebyla pozorována výrazná úmrtnost při samostatném použití 100 yg/ml PIGN 2. Na druhou stranu byla pozorována více než tři log (99,9%) úmrtnost bakterií při inkubaci s 200 yg/ml MGN 2- Tato pozorování rozšiřují údaje Zasloffa, protože identifikují synergickou kombinaci.

Byl také zkoušen účinek MGN 2 na neošetřené bakterie (bakterie neošetřené cefepimem) a bakterie změněné cefepimem v přítomnosti čtyřicetiprocentního konzerv lidského séra (viz obr. 2). iídyž byly r přidány do séra, nebyl pozorován výrazný hubicí účinek MGN- To bylo ostrém kontrastu k předešlému pozorování v tlumivém roztoku, kde 200 ug/ml MGN 2 úplně usmrtilo bakteriální kmen (porovnej obr. 1a 2). Je zřejmé, že konzervované normální lidské sérum blokovalo účinek MGN 2 (a MGN 1, data nejsou zobrazena) když byla testována úmrtnost neošetřených bakterií. Avšak pokud bylý testovány bakterie pozměněné cofepimem, úmrtnost účinkem látky PIGN byla zvýšena přítomností konzervovaného normálního lidského séra- Úmrtnost účinkem MGN byla pozorována při 25 pg/ml v konzervovaném normálním lidském séru, kde nebyla pozorována úmrtí při této koncentraci v tlumivém roztoku. Z tohoto důvodu konzervované normální lidské sérum blokuje baktericidní aktivitu MGN 2 na neošetřené baktérie a zvyšuje baktericidní aktivitu MGN na cefepimem změněné bakterie.

Aby bylo určeno, jestli je udpovědný za synergismus mezi cefepimem a MGN 2, tepelně labilní či tepelně stabilní faktor v konzervovaném normálním lidském séru, byla zkoumána úmrtnost v konzervovaném normálním lidském séru, které bylo po dobu 30 minut zahříváno na teplotu 55°C k inaktivaci komplementu séra (inaktivní sérum) a v aktivním séru. Pokud byly zkoumány neošetřené baktérie opět byla pozorována žádná nebo malá úmrtnost jak s tak i bez přítomnosti 100 pg/ml MGN (viz obr. 3). Pokud byly slédovány efepimem změněné baktérie, tepelná inaktivace séra zcela zabrzdila hubící schopnost MGN/cefepimu, pozorovanou v aktivním séru (viz obr- 3 a 4).

Tento experiment jasně ukazuje, že pokud je zkoumána úmrtnost v konzervovaném normálním lidském séru, je nezbytné znát faktor tepelné lability v PNHS (pravděpodobný komplement) oře posuzováni HUN hubicíno učinku na ceíepi rnern modifikované bakterie.

Příčina faktoru tepelné lability byla stanovena jako komplement séra. Schopnost magaininu zabíjet cefepimem změněné a neošetřené Ecoli ATCC25922 byla zkoumána v normální lidském séru, které bylo specificky ochuzeno o komplementárním protein C8. Když nebyla tato součást komplementí kaskády přítomná v séru,· nebylo pozorováno usmrcování bakterií magaininem (obr. 5). Avšak, když bylo vyčištěné C8 přidáno zpět do fyziologické koncentrace (50 gg/ml), bylo pozorováno výrazné usmrcování. Navíc usmrcování cefepimem pozměněných Ecoli se objevilo při výrazně nižších koncentracích magaininu, než bylo potřeba pro neošetřené baktérie.

Byl rovněž zkoumán účinek různých antibiotik v konzervovaném normálním lidském séru. Baktérie byly předpěstovány a zkoušky byly provedeny pro 1/32, 1/16 a 1/8 MIC pro každé antibiotikum. Baktérie byly přidány do dvou sad zkumavek obsahujících 40$ konzervované normální lidské sérum bua s 200 ug/ml magaininu 2 nebo bez magaininu. Jak ukazuje obr. 6, beta-laktámové antibiotikum, imipenem byl synergický s magaininem 2, avšak ani Amikacin - aminoglycosid, ani ciproflaxacin - quinolin nebyly synergické. Navíc cefepim, aztreonam a ceftazidim, které jsou všechny antibiotika betalaktámového typu, byly synergické s magaininyByl sledován hubící účinek magaininu/cefetimu, na různé

By

3.

kmen

ΑΟ

Ί ·1 oakt e ria1 η ί buňky by i y p ě a t o v a.ny co Εϊΐυ 1 o MIC cefepimu. Baktérie byly přidány do dvou konzervovaného normálního lidského séra magaininu 2, jednak bez magaininu.

, fa z e s -j o e z 1 / *4 s a o z k u m a. v e κ s -40 >*>

jednak s 20 ug/l

Jak ukazuje obr. 7, všech pět kmenů baktérií vykázalo určitý synergismus s magaininy. V přítomnosti MGN dochází k výraznému zvýšení hubícího účinku v porovnání se samotným MGN či cefepimem. Zvýšení úmrtnosti je přibližně jeden log.

Byl též studován účinek magainin/cefepim kombinace na zabíjení Pseudomonas aeruginosa. Obdobně jako v předešlém případě byl pozorován podstatný nárůst úmrtnosti ve srovnání se samotným MGN či cefepimem.

7. Příklad: Synergické účinky cefalosporinú a katoinického peptidů C-13 s faktorem-4 lidských krevních dest iček

Ve zde popsaném příkladu je ukázán synergicky účinek beta-laktámového antibiotika cefalosporinu a peptidů C-13 s faktorem-4 lidských krevních destiček. V těchto experimentech kombinace cefalosporinu s peptidem C-13 s faktorem-4 lidských krevních destiček v koncentraci pod hranicí inhibice zabíjí bakterie. Pokud je aplikována jen jedna složka jsou pozorovány minimální, nebo žádné účinky. Tyto pokusy byly prováděny v 40%ním NHS. Synergismus v séru vyžaduje faktor tepelné lability, jelikož již mírná tepelná inaktivace séra přeruší jakékoliv synergické účinky.

7.1. Materiály a metody

7.1.1. Reakčaί δ i ni dla a 11 umi vé ro zt oky

Byly použity následující tlumivé roztoky: želatinoveronalovy tlumivý roztok (GVS*+) (Gewortz H. et al>, 1985, v Manuální a klinické imunologii, N.R.Rose a H. Freedman (eds.) ASM, Washington, D.C.). Dále byla přidána 0,1% dextrosá k tlumivému roztoku jako zdroj uhlíku. Fosfátem puffrovany fyziologicky roztok byl připraven v naší laboratoři. Antibiotika byla získána v lyofi 1 izované formě jako v předešlém případě. C-13 PF-4 peptid byl syntetizován v naší laboratoři z publikované sekvence aminokyselin (Maione et al·, 1990, Science 247:77-80). Modifikovaný C-13 PF-4 peptid byl též připraven v laboratoři standardní technikami v pevné fázi.

7.1.2. Kmeny baktérií a podmínky kultivace

Escherichia coli ATCC 25922 užívaná pro tento pokus byla získána z American Type Culture Collection (ATCC). Kmen byl zkoušena na čistotu, řádně určena a poté uchovávána při teplotě -70°C- Všechny kmeny byly pěstovány v AMH7.1.3- SÉRUM

Krev byla získána od pěti zdravých dobrovolníků a byla ponechána srážet se po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po další 20ti minutové inkubaci při teplotě 4°C byla krev centrifugována po dobu 15 minut při 1 500 x g. Sérum bylo odstraněno a konzervováno a uchováno při teplotě -70°C v .na 1 y ϊ j množ ut. v i ch (konzervované normální lidské sérum). Krátce před použitím sérum byla rozmraženo a udržováno na ledu než se promíchalo s bakteriemi pro baktericidní zkoušku séra. Kde uvedeno, sérum komplement byl inaktivován zahřátím na teplotu 56°C po dobu 30 min7-1.4. STANOVENÍ MINIMÁLNÍ INHIBIČNÍ KONCENTRACE (MIC)

MIC bylo určeno mikrozřeSovací destičkovou zřeSovací metodou užívající AMH (Manual of Clinical Microbíology, Fourth Edit ion, Lennette, E.H. Ed. in Chief, ASM. 1985. pps 972-977). Byla uskutečněna nejméně tři různá stanovení pro každé antibiotikum u každého kmene.

7.1.5. BAKTERICIDNÍ'ZKOUŠKA SÉRA

Bakterie inokulované v kulturách přes noc byly pěstovány do střední log fáze s anebo bez antibiotika (absorbánce při 660nm mezi 0,35 a 0,5; přibližně 2-3 x 10® buněk/ml pro buňky pěstované s cefepimem a 9x10®buň4k/ml pro buňky pěstované bez cefepimu). Buňky byly zředěny bez promytí na 1 x 10⁴ buněk/ml v želat i nově-veronálovém tlumivém roztoku (GVB *►) a 0,05 ml bylo přidáno do séra v 1,5ml Eppendorfově zkumavce. Bakteriální buňky, které byly předpěstovány v antibiotiku, byly též zředěny v GVB + + obsahujícím shodnou koncentrací antibiotika. Bu3 konzervované normální lidské sérum nebo tepelně inaktivované konzervované normální lidské sérum byly připraveny předem neředěním na patřičnou koncentraci v 0,2 ml

GVB + +. Pokud byla přítomna antibioti ks nebo přidány do roztoku séra před přidáním baktérii. Celkový objem reakční směsi byl 0,25 ml- Počet bakterií přidaných do séra byl určen přidáním 0,05 ml bakteriální suspenze do zkumavky, která na začátku zkoušky obsahovala pouze GVB + + a destičky. Reakční směsi poté rotovaly při teplotě 37°C tří hodiny. Vzorky (25 μΐ) byly v intervalech odebírány pro analýzu počtu destiček. Počet jednotek tvořících kolonii byl určován po inkubaci trvající přes noc v trypticaseovém sojovém agaru. Jednotky tvořící kolonii byly určovány třikrát a byl brán průměr 7.2. Výsledky

Byl studován bakterieidní efekt C-13 peptidu získaného z HPF 4. Na základě aminokyselinové sekvence tohoto kationického peptidu by se měl vytvořit amfifilicky α helix šroubovice v hydrofobním prostředí. Schopnost toho peptidu zabíjet E·coli byla proto zkoumána v konzervovaném normálním lidském séru (obr. 8). Bakteriální buňky byly pěstovány s a bez 1/5 MIC cefepimu, byly přidány k aktivnímu a tepelně inaktivovaného čtyřicet i procent ní hra konzervovaného normálníheť 1idského séru. Jak ukazuje obr. 8, tento peptid je schopen výrazně usmrcovat baktérie pozměněné cefepimem, pokud nebylo sérum tepelně inaktivováno. Peptid nebyl schopen usmrcovat baktérie, které nebyly pěstovány s cefepimem a taktéž nebyl schopen zabíjet baktérie pozměněné cefepimem, v tepelně inaktivovaném séru. Tyto údaje jasně ukazují, že tento peptid usmrcuje baktérie synergický s beta-laktámovým antibiotikem a aktivním sá

Byl též zkoumán baktericidní peptidu získaného z HPF-<

ucinek módi f i kovaného o sek vane i:

Pro-Leu-Tyr-Lys-Pro-Bys-I1e-I1e-Lys-?ro-Lys-Leu-Leu-GluSer (Seq.I -D.#2)- Když byla tato sekvence přidána k bakteriím spolu s cefepimem za přítomnosti normálního normální lidského séra, byl pozorován bu3 žádny, nebo malý synergický účinek. To je způsobeno sníženým a-spirálovým charakterem modifikované C13 sekvence, protože je známo .porušování a spirálovosti u prolinu.

8. Příklad: Ochraný účinek magaininových a cefepimových kombinací in vivo

Byla zkoumána schopnost magaininových a cefepimových kombinací chránit myši proti smrtelné infekci E-coli Myši byly neutropenizovány injekcí Cytoxanu a poté byl proveden imunologický test s Eco 1 i Myši byly poté rozděleny do čtyř různých skupin: (1) myši, kterým nebyly aplikováhy další látky, (2) myši, kterým byl podáván pouze magainin 2 nebo C-13 peptid, (3) myši, kterým byl podáván pouze cefepim, (4) myši, kterým byla podávána kombinace magaininu 2 či C-13 peptidu a cefepimu. Myši byly pozorovány 10 dní od infekce a byl zaznamenán počet uhynulých zvířat. Výsledky jasně ukazují že žádná léčba, či léčení pouze magaininem, C-13 peptidem či cefepimem samotným není schopno uchránit myši od smrti. Kombinace magaininu a cefepimu či C-13 peptidu a cefepimu poskytuje myším zřetelnou ochranu. Pokud byl zkoumán v podobných experiment i n vit ro baktericidn ech am i kac i n-ami nozi ·/

O Λ í aktivita, či ochran i a nalezena

8.1. Materiály a metody

8.1.1. Reakční činidla a tlumivé roztoky

Fosfátem puffrovaný fyziologický roztok byl připraven v naší laboratoři. Cefepim byl obdržen v lyofi 1izované formě jako v předešlém případě. C-13 peptid a magainin 2 byly syntetizovány v naší laboratoři z publikované sekvence aminových kyselin.

8.1.2. Kmeny baktérií a podmínky kultivace

Escherichia coli H16 získaná z Walter Reed armádního výzkumného ústavu, oddělení bakteriálních nemocí, Washington D.C. Kmen byl přezkoušen na čistotu, přesně určen a poté uchováván při teplotě -70°C. Baktérie byla pěstována v AMH bujónu.

8.1.3. Experimenty in vivo

Myši byly neutropenizovány pět dní před bakteriálním výzkumem. Neutropenie byla indukována podkožní injekcí 250 mg/kg Cytoxanu (cyclofoshamide). Myším bylo aplikováno

Λ x 10 Ecoli H16- Aplikace byla provedena intraperitoneální injekcí. Myši byly poté rozděleny do čtyř skupin: (1) myši , kterým byla aplikovány injekce PBS 1 a 3,5 hodiny po infikaci, (2) myši, kterým bylo aplikováno dohromady 2 mg/myš magaininů dvou injekcích 1 a 3 každá injekce obsahov.Oa 1mg/myS Tag~in dcst,.ly celkové 3 3 mc/cv¹; -_nu

0,1 mg/myš cefepimu v ?33 v době 1 a 3,5 u i i Λ O. C i r’·(4) myši dostaly celkově 2 mg/myš magaininu 2 a 0,2 mg/kg cefepimu ve dvou dávkách po 1 mg/myš magaininu 2 a 0,1 mg/kg cefepimu v době 1 a 3,5 hod po infikaci- Všechny injekce magaininu a cefepimu byly aplikovány intramuskulárně. Přežití myší bylo pozorováno nejméně po dobu deseti dnů.

8.2. výsledky

Při sledování přežití myší po výše popsaných bakteriologických testech byly obdrženy následující výsledky: ve skupině 1, kde bylo aplikováno pouze PBS, přežila 1 z 15 myší, ve skupině 2, kde byl aplikován pouze magainin 2, přežila 1 z 15 myší, ve skupině 3, kde byl apikován pouze cefepim, přežila 1 z 20 myší a ve skupině 4, kde byla aplikována kombinace magaininu 2 a cefepimu, přežilo 11 z 20 myší. Nárůst v počtu přeživších myší, kterým byla aplikována kombinace znamená významný (p<0,05, Fisher Exact test) nárůst ochrany proti případům, kdy nebyla použita žádná léčba, či léčba samotným magaininem 2, nebo cefepimem.

Navíc byly provedeny obdobné zvířecí imunologické testy s peptidem C-13 z PF-4. V těchto experimentech byl skupině 2 aplikován C-13 peptid místo magaininu 2 a skupině 4 byla aplikována kombinace C-13 peptidu a cefepimu. Výsledky byly následující: skupiny 1 a 3 viz výše, ve skupině 2, kde byl aplikován samotný C-13 peptid přežila 1 z 10 myší a ve skupině

4, kde byla aplikována kombinace C- 13 peptidu a cefepimu, přežily 4 z 10 myší. Znamená do zlepšení šance na přežití při aplikaci kombinace C-13 peptidu a cefepimu.

Byly též zkoumány účinky kombinace amikacinu

aminoglycosidu	a magaininu	2 in vivo- Po	určen í	MIC	pro
amikacin a rozdělení myší do	4 skupin obdobně	jako v	minulých
příkladech byly	obdrženy tyto výsledky: pouze	PBS -	z 8	myší
nepřežila žádná,	magainin 2	(dvě injekce po 1	mg ./myš)	z 9	myší
nepřežila žádná,	amikacin (dvě injekce po 3	mg/kg) z	10	myší
přežily 3, magainin 2 a	amikacin (množství viz	před	leš 1 é

skupiny) přežila 1 myš z 109. Příklad: syntéza analogů C-13 peptidu

Technikou pevné fáze byly připraveny různé analogy C-13 peptidu (Tabulka 1). Tyto analogy byly navrženy pro změny fyzikálních vlastností C-13 peptidu určitým směrem. Některé změny fyzikálních parametrů měly vliv na interakci analogu peptidu s bakteriální membránou. Prodlužování molekuly, přidáváním dodatečného a helixového závitu a změna hustoty kladného náboje podél spirály byly identifikovány, že vyvolávají změnu synergické aktivity s cefepimem.

9.1. Materiály a metody

9.1.1. Reakční činidla a metody

Magainin 2, cecropin a analogy C-13 peptidu byly syntetizovány technikou pevné fáze (Merrifield, R-B. 1963 J.Am. Chem. Soc. 85:2149-2154) na syntezátoru Applied Biosystems Peptide Synthethiser, modelu 430A při použití

Vt·- w,-, *.·

ochrany založené	na 3c
by * a o šot fena m r	kou/vy
1983. J.Arn. Chem	i· Soc .
HF procedurou s	90%HF

CC/o tony 1.

*05:6402-0455) nebo standardní vysokou 7 anisol a poté rozštěpená. Peptíd zbavený chránících skupin byl vyčištěn vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) v Dynamax C-8 koloně (Rainin). Vyčištěné peptidy byly určeny standardními analytickými (HPLC) a aminokyselinovými analytickými metodami.

TABULKA 1

Číslo

B

W

H

F

G

X

KK

HH

P

N

J

ANALOGY PEPTIDU C-13

Sekvence

I dent - Sekvence ami nokyselín číslo

Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-LeuGlu-Ser

Pro-Leu-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ile-Lys-Lys-Glu-LeuLeu-Ser

Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Pro-Ile-Lys-Lys-Pro-LeuGlu-Ser

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-LeuGlu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-LeuGlu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-LeuLys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLysdLeu-dLeu-dLys-dSer-dAla-dLys-dLys-dLeu-Gly

Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-LeuOrn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-LeuLys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly

A1a-Leu-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-LeuArg-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Gly

Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-LeuLys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly

Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-LysLeu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly

Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-LeuLeu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-A1a-Lys-Lys-LeuGly ί i rí i ac ;

váni nor c> * y n l κ j

S Π čk 1 O Li p © p t 1 Ó LI in vitrc

Synteticky vyrobené analogy peptidu C-13 faktoru-4 krevních destiček byly testovány na synergickou aktivitu s cefepimem v baktericidních a hernolytických zkouškách in vitro. Peptidy, které obsahovaly nejméně 11 až 18 aminokyselin, vytvářejících 4 nebo 5 závitů alfa-helix šroubovice, snížily množství peptidů nutných k usmrcení poloviny bakteriálních buněk při faktoru 8 až 80.

Analogy peptidu, které narušily přirozenou strukturu alfa-helix peptidu nebo snížily její amfifi 1icitu, snížily nebo zabránily jakékoli baktericidní aktivitě. Přídavek aminokyselin, nutné k vytvoření pátého závitu alfa-helix, vede k zlepšení baktericidní aktivity. Tato aktivita byla dále zlepšena změnou hustoty positivního náboje podél šroubovice.

U analogu H, F, a v menším rozsahu u analogu G, X a L peptidu C-13 bylo zjištěno, že dávají lepší výsledky při ničení buněk, jestliže jsou použity v kombinaci s antibiotikem. U analogů H, F, G, X, II, KK, Na J bylo zjištěno, že je nutný kompement nebo dávají mnohem lepší výsledky, jestliže kompement byl přítomen ve sledovaném médiu. Vzrůst hemolytické aktivity analogů peptidu C-13 byl zjištěn při vzrůstající délce řetězce aminokyselin, nebo když arginin byl nahrazen lysinem v polohách 4, 5, 8, 9, 12, 15 a 1610.1.

Materiály a metody

10.1.1. Reakční činidla a tlumivé roztoky .ati no Syly použity následující tlumivé veronalový tlumivý roztok (073+ + jak je popsán výše). Dále byl přidán 0,1% roztok dextrózy jako zdroj uhlíku. V naší laboratoři byl připraven fosfátový fyziologický tlumivý roztok. Antibiotika, t-j. cefepim, byl získán v 1yofy1 izované formě, jak je popsáno výše.

10-1.2. Bakteriální kmeny a podmínky kultivace

Pro většinu experimentů byl použit kmen Esoherichia coli ATCC 25922, který byl získán z americké typové sbírky kultur. Dále byly použity kmeny E-coli A011 získané z Harboview Hedícal Center,Seattle, WA, K1 kapsle isolované ýz H16 z Walter Reed Army Institute of Resarch, Washington D.C.. E-coli A645AP vypěstovaný v naší laboratoři, je animálně pěstovanou verzí ATCC .25922, E-coli AÓ45AP (pBR322) je E-coli AÓ45AP obsahující plasmid pBR322 pro dosažení odolnosti k beta-laktamovým antibiotikům a byla připravena v naší 1 abo rat oři. Klebsiella pneumoniae C3 29 (ATCC 13883) by 1 a získána z americké typové sbírky kultur, stejně jako kmen Pseudomonas aeruginosa A366 (ATCC 27317)- Kmen Staphylococcus aureus A546 byl získán z Harboview Medical Center, Seattle, WA. Kmen Enterobacter aerogenis G438 byl získán z Veterans Administration Hospital, Seattle, WA a kmen Streptococcus agarlactiae 1334 byl získán z Childrens Orthopedic Hospital, Seattle, WA. Kmen Pseudomonas aeruginosa M990, resistentni biotikům byl získán s naší sbírkl,,,’ . .· přezkoušeny na čistotu, řádně identifikovány a pak při teplot

5X: Gcovuny aždy týden byly vytvořeny nově kultury se zmrzlých bakteriálních kmenů, aby nedošlo k opakované subkultivaci. Všechny kmeny byly pěstovány v Adjusted Mueller Hinton bujónu (AMH) obsahujícím 50 pg/l CaCl,₇ a 25 mg/1 MgCl^.

10.1.3.

Zkouška baktericidního séra

Bakterie všech kmenů, naočkovaných z kultur pěstovaných přes noc, byly kultivovány do střední log fáze s nebo bez 1/4 nebo 1/5 MIC cefepimu (absorbánce při 660 nm mezí 0,35 a 0,5; přibližně 2-3 x 10® buněk/ml pro růst buněk s cefepimem a 9 x 10® buněk/ml pro růst bez cefepimu). Buňky byly zředěny bez promyvání na 5 x 10⁴ buňek /ml želatin- veronolového tlumicího roztoku (GVB+ *) a 0,05 ml bylo přidáno k séru (viz oddíl 7.1.3·) v 1,5 ml Eppendorfově zkumavce. K bakteriálním buňkám předpěstovanym v cefepimu, bylo přidáno stejné množství cefepimu, jaké bylo přítomno během růstu, jak pro přípravu tak pro zkoušku baktericidní aktivity. Nejprve bylo připraveno bu8 normální lidské sérum z banky sér anebo teplem inaktivované sérům rozředěné na vhodnou koncentraci v 0,2 ml GV3+ +· Jestliže byl přítomen cefepim, tak byl přidán do směsi séra před přidáním bakteriálních buněk. Pro vytvoření roztoku o koncentraci 2 mg/ml byly peptidy zředěny v deionizované vodě a byly přidány do reakční zkumavky, aby bylo dosaženo vhodné koncentrace. Celkový reakční objem byl 0,25 ml. Množství bakterií přidaných k séru bylo stanoveno přídavkem 0,05 ml bakteriální suspenze do zkumavky obsahující na pouze GV3+ + a destičky

V f ”! c· ' '-· - » L- i Λ ·' L i.

při

Reakční směsi potě rotovaly 3 hodiny

M x .· x / v v J i i/ v λ V x ’v cA x k? ‘ J * í ΟΣ”Ο de^t xλ o vou ->č í u ac i analýzu- Množství j ednoísk vy t vá ře j ících kolonie bylo stanoveno po inkubaci přes noc s trypticaseovým sojovým agarem. Jednotky tvořící kolonie byly stanoveny třikrát a pak určen průměr.

10.1.4. Zkouška hemolýzy

Všechna krev získaná od zdravých dobrovolníků byla rozředěna v PBS tak_f aby bylo dosaženo koncentrace červených o

krvinek asi 6 x 10° buněk/m1. Peptidy byly suspendovány v PBS za tvorby roztoku kmenu o koncentraci 2 mg/ml a 100 μΐ kmenového roztoku bylo přidáno k 900 jíl zředěných červených krvinek. Vzorky byly inkubovány při teplotě 37°C po dobu 45 min, odstředěny při 1000 ot/min po dobu 5 minut a supernatant byl odstraněn.

Supernatanty byly zkoušeny spektrofotometricky při 541 nm. Procento hemolýzy bylo odečteno ze standardní křivky, určené ze sérií ředění krevních zředění v poměru 1:10 v destilované vodě. Zředění 1:10 v destilované vodě reprezentuje 100%-ní hemolýzu.

,ΚΑ

	BAKTERICIDNÍ A HEMOLYTICK _> KATIONICKÝCH OLIGOPEPTIDU S E-C (ATCC 25922) IN VITRO	£ ft t/ t· τ t r r ·τ> n ,·-.. ? τ n .·· .n cr V L- i řl ů?
	ΒΕΞ CEFEPIMU 1/4 MIC CEFEPIM	* REC LÝ2A (
PEPTID	NHS HI-NHS NHS HI-NHS	(1OOug/ml)

MGN 2	>200	>200	85	>200	1
C-13	>200	>200	80	>200	< 1
B	>200	>200	>200	>200 ·	ND***
W*	>200	>200	>200	>200	ND
H	>100	>100	10	>100	1,5
F	70	>200	10	90	< 1
G	4	>200	1	>200	< 1
X	4	>50	< 1	>50	< 1
HH**	>50	>50	>50	>50	3
H**	1	47	<1	43	<1
KK	1	>50	< 1	>50	< 1
P	1O	10	10	10	21
L	46	40	1 1	40	3
N	1	10	1	>2	7,5
J	1	>8	1	4	2,5
Cecropin	1	1	0,25	0,5	< 1

* ^id50 znamená sinožství peptidu (ug/ml > potřebného k snížení původního množství bakterií o 30?ó.

** 1/5 ΠΙΟ cefepimu *** ND - nestanovena

10-2. Výsledky

Byl testován baktericidní účinek různých kationickych oligopeptidů s a bez antibiotika a s nebo bez aktivního komplementu a to včetně magaininů, cecropinu, peptidu C-13 HPF-4 a různých analogů a derivátů peptidu C-13 (Tab. 2). Dále byl sledována náchylnost k toxicitě zkoušením schopnosti peptidů štěpit lidské červené krvinky. Původně byly zkoušeny dva různé aspekty sekundární struktury. Peptidy obsahující záměny aminokyselin, které rozrušují bu3 (analog W) molekuly, byly inaktivní při všech testovacích podmínkách. Jelikož pro účinek byla nutná jak amphipatická tak alfa helix přirozená struktura peptidu, všechny následné modifikace oba tyto parametry zachovávaly. Byla vyzkoušena modifikace, u které došlo k vytvoření dalšího závitu alfa helixu přidáním pěti aminokyselin při zachování přirozené amphipatické struktury (analog H). Tato modifikace specificky zesiluje ničení bakterií s cefepimem v NHS- Došlo k osminásobnému vzrůstu antimikrobiálního účinku (peptidovy analog H) proti cefepimem změněným bakteriím v NHS, i když odpovídající vzrůst nebyl pozorován v ΗΙ-ΝΗΞ nebo proti neošetřeným bakteriím. Nenší změna dvou hydrofobních aminokyselin v analogu H (analog F) způsobila menší vzrůst antimikrobiální aktivity. Byl pozorován desetinásobný vzrůst specifické aktivity na bakterie

cefepimem v NHS,	když zbytek kyseliny glutamové v analogu F
by 1 nahrazen 1y3 i	ir.em (analog G). V případě tohoto peptidu v
HI-NHS nebo při	zkoušce proti .neošetřenym bakteriím nebyl
pozorován vzrůst	antimikrobiální aktivity. Dále přitom nebyl
pozorován vzrůst	rozpadu červených krvinek (RBC). Peptidovy

analog G ukázal, že změna v jednotlivých šaržích by mohla výrazně ovlivnit účinek.

Prodloužení helix šroubovice o další závit přidáním pěti aminokyselin na aminový konec (analog J) nezpůsobil žádné další zvýšení antibakteriálního účinku. Tato modifikace měla za následek zvýšený rozpad RBC- To může znamenat toxicitu peptidů s větším počtem helixovych závitů. Analýzou

ant imikrobiálního	účinku v NHS s cefepimem, prováděné in
vitro, u peptidu	(analog G) byl zjištěn 80-ti násobný vzrůst í

antibakteriální aktivity. V ostrém protikladu k tomu v HI-NHS nebo proti neošetřenym bakterím nebyla zjištěna žádná aktivita. Další zkoušky analogu G objevila, že bakterieidní aktivita je závislá na NHS s dalšími bakteriálními kmeny (Tab3). Tato data též ukazují, že bakterieidní účinek analogu G s normálním lidským sérem může byt zvýšen antibiotikem na různý stupeň, v závislosti na bakteriálním kmenu.

TABULKA 3

BAKTERICIDNÍ (ID₅₀>* AKTIVITA ANALOGU G PEPTIDU C-13 PROTI RŮZNÝM BAKTERIÁLNÍM KMENŮM

TESTOVANÁ IN VITRO

	BEZ	CEFEPIMU	1/4 MIC CEFEPIM*
KMEN	NHS	HI-NHS	NHS HI-NHS & SÉRA	MIC

H1ó	>200	>200	15	100	40	1 /4
C329	1	80	1	50	10	1/8
G438	1	45	, 1	45	10	1/4
A36Ó	<25	40	<25	40	1O	1 /8
AO11	2	80	2	80	1O	1 /4
A58Ó	>200	>200	>200 >200	40	SL***
1334	>200	45	80	25	40	1 /4
AÓ45AP	1	70	1	80	10	1 /4
A645AP**	1	70	ND	80	10	1 /8
(pER.322)
Π009**	2	120	ND	ND	20	1 /8
* ID50	- znamená množství peptidu	(ug/ml)	potřebného
k	snížení	původního	množství	bakteri í	o 50¾.

kmenu odolné proti antibiotikům MIC A645AP (pBR322), • f i . ’)» τ ·-* v r> '-j . / !! X . li i ·.. i i '_· ?·’ *' ♦’*' sLbl-:K .5.1ní ( SL ) konc-snt r ífepimu by hodinách

11. Příklad: Ochranný účinek kombinace analogů peptidu C-13 s cefepimem, in vivo

Byla vyzkoušena schopnost analogů peptidu C-13 v kombinaci s cefepimem ochránit myši proti smrtelné infekci způsobené E.coli. U myši byla vyvolána neutropenie injekcí cyklofosfamidu a pak byly nakaženy Ecoli - Myši byly poté rozděleny do čtyř skupin: (1) myši, kterým bylo podáno PBS; (2) které dostaly pouze anology peptidu C-13; (3) které dostaly pouze cefepim; (4) které dostaly kombinaci analogů peptidu C-13 a cefepimu. Myši byly pozorovány po dobu 10 dnů po infikování a byl zaznamenáván počet uhynulých zvířat. Výsledky těchto studií jasně ukazují, že žádné léčení, léčení samotným cefepimem nebo analogy peptidu C-13 typů G, X, II a F bylo nedostatečné pro zabránění úhynu myší. Kombinace analogů peptidu C-13 s cefepimem vykázala výrazný ochranný účinek na myši .

11.1. Materiály a metody

11.1.1. Reakční činidla a tlumivé roztoky

Fosfátový fyziologický tlumivý roztok byl připraven v naší laboratoři. Cefepim byl získán od Dr. Roberta Kesslera,

Squibb

Company, lyoiylizovane formě. Cecropin byl připraven v naší laboratoři podle publikovaného postupu. Cyklof osf amid byl získán od Plead Johnson pod výrobní značkou Cytoxan.

11-1-2. Bakteriální kmeny a podmínky kultivace

E. co 1 i H16 byla získána z Walter P.eed Army Institute of Resarch, Washington D-C. a E col i A645AP byla. vypást ována v naší laboratoři kultivací kmene Ecoli ATCC 25922 na zvířatech. Kmeny byly přezkoušeny na čistotu, řádně identifikovány a pak skladovány při teplotě -70°C. Každý týden byly vytvořeny nové kultury ze zmrzlých bakteriálních kmenů, aby nedošlo k opakované subkultivaci. Všechny kmeny ,byly pěstovány v Adjusted Mueller Hinton bujónu (AKH) obsahujícím 50 mg/l CaCl₂ a 25 mg/1 MgCl₂11.1.3. Experimenty in vivo

U myších samců CrL:CF1 byla vyvolána neutropenie pět dnů před bakteriálním napadením. Neutropenie byla vyvolána podkožní injekcí 250 mg/kg Cytoxanu (cyklofosfamidu). Myši byly nakaženy kmenem bu3 2 χ 10⁴ Ecoli H16 (Tab- 4) anebo 5 x 10 ⁴ A645AP intraperitoneální injekcí- Myši byly rozděleny do čtyř skupin podle aplikovaných léčiv: (1) PBS; (2) anolog peptidu C-13 (15 mg/kg); (3) cefepim (0,1 mg/kg); (4)

3,5 hodiny po bakteriálním napadení. Myši, které přežily, byly sledovány 10 dnů a výsledky analyzovány Fischerovým exaktním testem.

11.2. Výsledky

Byl zkoušen ochranný účinek analogů peptidu C-13 a cefepimu na myši proti systemické infekci kmenem E-coli H16 (Tab- 4). Podáním samotných PBS, cefepimu nebo analogů peptidu C-13 typů G, X, II a F se nedosáhlo výrazného stupně ochrany. Proti tomu byl pozorován výrazný vzrůst přežití u myší <p < 0,05, Fischerův exaktní test), kterým byla podána kombinace analogů G nebo F peptidu C-13 s cefepimem, ve srovnání s myšmi bez léčby nebo s léčbou samotným cefepimem či analogem peptidu C-13. Mimo to byly stejné pokusy provedeny s cecropinem. Nedošlo k žádnému výraznému zvýšení ochrany af při použití samotného nebo v kombinaci s cefepimem.

Dále aztreonam, jiné antibiotikum, byl testován pří stejných pokusech. Toto bb-laktamové antibiotikum dosáhlo, v kombinaci s analogem G peptidu C-13, statisticky výrazné ochrany (p < 0,05, Fischerův exaktní test). Výsledky tohoto pokusu byly následující: když byl podán samotný PBS, nepřežila žádná z devíti myší; když byl podán samotný aztreonam, přežila jedna z dvaceti myší; když byl podán samotný analog G peptidu

C-⁴3, nepřežila žádná z deseti mkdyž t-'-

Ana1og	G peptidu C-13 byl také	zkoušen u myší	s v
neutropěni í	nakažených kmenem non K1	tT —·7 * n _í. . .h	/ —
organismů).	Pří zkoumání přežití po	bakteriálním n	.apad
získány násl	edující výsledky: v 1.	skupině, kde	byl

byly láván pouze PBS přežily tři ze dvaceti myší; v 2- skupině, kde byl podáván pouze analog G nepřežila žádná z patnácti myší; v 3. skupině, kde byl podáván cefepim přežily tři za dvaceti myší; ve 4. skupině, kde byl podáván jak analog G tak cefepim přežilo osm z patnácti myší. Vzrůst přežití myší, kterým byla podávána kombinace byl opět výrazný (p < 0,05, Fischerův exaktní test) a představoval zlepšení v přežití oproti peptidúm čí antibiotikům podávaným samostatně.

< χ , _____

Léč i vo

NA

IXOU INF ΐ?. ^r Počet přeživších/celkový počet

PBS cefepim

G cefepim + G

X cefepim + X

II cefepim + II

F cefepim ♦ F Cecropin cefepim + Cecropin

2/25

3/25 / 15

11/20 / 18

15/20

0/5

3/10

0/10

3/10

2/20

2/10

2 ^ó, ⁷

5,6

Zde uvedený popis a nároky vynálezu nejsou omezeny rámcem zde uvedených konkrétních provedení, tyto příklady slouží k ilustraci různých aspektů tohoto vynálezu. Jakékoliv podobné příklady lze zahrnout do rámce vynálezu. Pro odborníky v oboru budou samozřejmě, po předchozím popisu, zjevné různé modifikace vynálezu kromě těch, které zde byly ukázány a popsány. Takovéto modifikace jsou také obsaženy v rámci připojených nároků.

SEZNAM SEKVENCÍ

1) OBECNÉ INFORMACE;

(i) PŘIHLAŠOVATEL;

Darveau, Richard PBlake, James J. Cosand, Wesley L(ii) NÁZEV VYNÁLEZU; PROSTŘEDKY A ZPŮSOBY LÉČENÍ INFEKCÍ ZPŮSOBENÝCH ORGANISMY CITLIVÝMI NA

BETA-LAKTAMOVÁ ANTIBIOTIKA (iii) POČET SEKVENCÍ: 12 _;; (iv) ADRESY PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Bristol-Myers Squibb Company,·

Patent Department

(B)	ULICE	: 3005 First Avenue
(C)	MÍSTO	: Seattle
(D)	STÁT:	Washington
(E)	ZEMÍ:	USA
(F)	ZIP: '	98121

(v) FORMA PRO POČÍTAČ:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompaktibilni (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 < vi )

ATM
(A)	Čí:-L
(B)	r\ η *τ» r » Lz d x 'j
(O	TZ* A C' txj tl

IČCVACÍ ÚDACS

^.*y_V února 1991 (ví i) PŘEDCHOZÍ PŘIHLAŠOVACÍ ÚDAJE: PŘIHLÁŠKY: US 07/484 020 (A) ČÍSLO (B) DATUM PODÁNÍ: 23 února 1990 (vili) INFORMACE O ZÁSTUPCI/ZMOCNĚNCI (A) JMÉNO: Poor, Bryan W(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 32,928 (C) REFERENČNÍ/ŠTÍTKOVÉ ČÍSLO: 0N0063A (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 206/728-4800 (B) TELEFAX: 206/448-4775 (2) INFORMACE O SEKV ID

Č.1;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE o r·, o u i,

Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Lsu Glu Ser

5 10 (2) INFORMACE 0 SEKV ID. Č.2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č-2:

Pro Leu Tyr Lys Pro Lys Ile Ile Lys Pro Lys Leu Leu

5 10

Gly Ser (2) INFORMACE 0 SEKV ID- Č.3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: peptíd (iii) ΗΥΡΟΤΞΤICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č-3:

Pro Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Lys Lys Glu Leu Leu Ser

5 10 (2) INFORMACE O SEKV ID- Č-4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID. Č-4:

Pro Leu Tyr Lys Lys Pro Ile Lys Lys Pro Leu Glu Ser

5 10 (2) INFORMACE O SEKV ID. Č-5:

( i ) CHARAKTERISTIKY SEKVEN<

Z T3 \ '’.ΛΓ _ 1 j. J. i . o.i i x Hvá / í i i .3 (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č-5:

Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser 1 5 10

Ala Lys Lys Leu Gly (2) INFORMACE 0 SEKV ID- Č-6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č.6:

Al a

A * Ξι i, y s L y 22 Lei. G i y , cI v_>

(2) INFORMACE 0 SEKV ID- Č-7;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID. Č.?_:

Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Glu Ser 1 5 10

Ala Lys Lys Leu Gly (2) INFORMACE O SEKV ID- Č-3;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

TYP MOLEKULY: peptid (i i i) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE; SEKV ID- Č-3:

Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ser ¹ 5 10

Ala Lys Lys Leu Gly (2) INFORMACE O SEKV ID- Č-9;

(í) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (i i i) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č-9;

Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Ser

5 10 íA, *. 3.

T v p r·, T-ι M η ρ TT* fl Γ' p V * 7 •Lití 1 \ i a ΖΛ *_ i-» -j -.jZí ·. ·/ (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (E) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č.10:

Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Phe 1 5 10

Ala Lys Lys Phe Gly (2) INFORMACE O SEKV ID- Č-11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (S) TYP: aminokyselina

TOPOLOGIE: lineární (D) i

f ί ·? - λ tJVO/>’T'77’T’ Τ /“‘τζ , ΛΜ.··.

\ i χ i / iiii. viúi i\--Α\Λ : A?·*7 (xi) POPIS SEKVENCE; SEKV ID- Č

Lys Trp Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu

Lys Ser Ala Lys Lys Leu Cly (2) INFORMACE O SEKV ID- Č-12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: £3 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ANO (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV ID- Č-12

Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Leu Lys

5 10

Lys Leu Leu Lys Ser Ala Lys Lys Leu Gly

Claims (11)

1. 67- 66 vyznačující se tím, že obsahuje (a) beta-laktámové antibiotikum schopné inhibovat růst organismu a (b) kationicky oligopeptid.
2. 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že beta-laktámové antibiotikum je vybráno ze skupiny obsahující penicilín, cefalosporin, karbapenem, monobaktam, cefamycin, pyrazidon a penem.
3. 3. Prostředek podle nároku 2, vyznačuj ící se tím, že beta-laktámové antibiotikum je cefalosporin.
4. 4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že cefalosporin je vybrán ze skupiny obsahující cefepim, cefotaxim a ceftazidin.
5. 5- Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že beta-laktámové antibiotikum je karbapenem.

   ó. Prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že karbapenem je imipenem.
6. 7. Prostředek podle nároku 2, vyznačující žnobakt.
7. 8. Prostředek se t í
8. 9. Prostředek t í m, obsahuj ící podle nároku 7, v y z n a í ·_: j í c i m, že mor.obaktam je aztrsonam.

   podle nároku 1 , vyznačující se že kationicky oligopeptid je vybrán ze skupiny magainin, cecropin, sarkotoxin, mitochondriální prekursor proteinu a jejich fragmenty, analogy a deriváty.
9. 10. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že kationickym oligopeptidem je magainin.
10. 11. Prostředek podle nároku 10, vyznačuj ící se tím, že magainin je vybrán ze skupiny obsahující magainin 1 a magainin 212. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že katíonickym oligopeptidem je faktor-4 lidských krevních destiček nebo jejich fragment, analog nebo derivát.
11. 13. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že fragment faktoru-4 lidských krevních destiček je peptid C-13 této sekvence;

    Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-I le -1le-Lys-Lys-Leu-Leu-GluSer (Sekv. I.D. #1) . - -.+. ...

    15 .

    Prostředek podle nároku 14, vyznačující s tím, že kationicky oligopeptid je tvořen nejméi jedenácti aminokyselinami.

    Prostředek podle nároku 14, se tím, že kationicky oligopeptid odpovídá v podstatě aminokyselinovému zbytku sekvence zahrnující:

    aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3aa4-X, kde aa1 znamená Pro, Ala nebo Lys, aa2 znamená Ile nebo Leu, aa3 znamená Glu nebo Lys, aa4 znamená Ser, Leu nebo Lys a X znamená sekvenci pěti aminokyselin se strukturou přirozené alfa helix šroubovice a mající obecně sekvenci aa5-Lys-Lys-aaó-Gly, kde aa5 znamená Ala nebo Leu a aaó znamená Leu nebo Phe17. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid zahrnuje aminokyselinový zbytek sekvence vybrané ze skupiny zahrnuj ící:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-GIuSer-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv. I-D- 45),

    A1a-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-GluSer-Ala-Lys-Lys-Leu-GIy (Sekv. I-D- #6),

    8.

    7 - τ . _ R ’ 7 . . T . . T ·-« τ

    Γί i Cl “ Lí 2ι y Ž3 L. Č U U i y

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu

    Phe — A1 a — Lys — Lys — Phe — Gly

    Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys

    Leu-Lys-Ser-AIa-Lys-Lys a Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys

    Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser (Sekv. I.D. #12>.

    Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys(Sekv. I.D. »10),

    Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu — Leu-Gly (Sekv- I.D. »11) Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-LeuA1 a — Lys-Lys — Leu-G1y

    Prostředek podle nároku 14, se tím, že kationicky aminokyselinový zbytek sekvence:

    vyznačuj ící oligopeptid zahrnuje

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-LysSer- AI a- Lys -Lys- Leu-Gly , kde aminokyselinové zbytky mohou byt d-aminokyseliny.

    9. Prostředek podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, že kationicky oligopeptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci:

    Ala-Leu-Tyr-Crn-0rn-Leu-Leu-0rn-0rn-Leu-Leu-0rn~ Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly0. Prostředek pro léčení infekcí způsobených bakterií Enterobacteriaceae, v y ζ· n a č u j i c í s e tím, že obsahuje: (a) beta-laktámové antibiotikum ·3. Λ s e tim, žg ost a - akt amuva ant zbíct zzu.z vy o z ano ze SKUpiny o bsshuj i c : pe t*ici 11 n _f o e z a z ospor karbapenaai, monobaktaai, cafamycín, pyrazidon a panem.

    22. Prostředek podle nároku 21, vyznač u j í o £ se tím, že beta-laktámové antibiotikum je cefalosporin.

    23. Prostředek podle nároku 22, vyznačující se tím, že cefalosporin je vybrán ze skupiny obsahující cefepim, cefotaxim a ceftazidin.

    24. Prostředek podle nároku 21, vyznačující t í m, Jfcarbapenemže beta-laktámové antibiotikum je

    25. Prostředek podle nároku 24, vyznačující se tím, že karbapenem je imipenem.

    ?6. Prostředek podle nároku 21, vyznačuj ící se tím, monobaktam.

    že beta-laktámové antibiotikum !7. Prost ředei jcdie naroKU že monobaktam je aztreonam

    o Q Prostředek pod 1 e Πά Γ o k. LI Σ 0 _t v V — ^{11 c}‘ X t Λ L· Lt J I O i s e t í m, Se membránov£ akt i vn; v κ -3. j e kat ionický o 1 i gopept 1 x · 29. Prostředek podle nároku 28, v y z n a č u jící se t í m, že kationický m oligopeptidem je magainin- 30. Prostředek podle nároku 29, v y z n a Č u jící se t í m, že magainin je vybrán ze skupiny obsahuj ící magainin 1 a magainin 2. 31 . Prostředek podle nároku 26, v y z n a č u jící se t í m, že kationickým oligopeptidem je faktor-4

    lidských krevních destiček nebo jejich fragment, analog nebo derivát.

    Prostředek podle nároku 31, vyznačující se tím, že fragment faktoru-4 lidských krevních destiček je peptid C-13 této sekvence:

    Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-GluSer (Sekv. I.D. #1)

    33. Prostředek podle nároku 28, vyznačující se tím, že kationický oligopeptid tvoří amfipatickou alfa helix šroubovici v přítomnosti fázového rozhraní lipid/voda.

    34. Prostředek podle nároku 33, vyznačující s e t- i ffi * že kationicky olieooeptid je tvořen ne i méně J 'SCcflSC i i ΓΠ I Ω o κ y 3 <3 i i Λ <3, m i - 35- Prostředek podi'3 nó.I“C-ÍCL* 33· _t V y 3 Ω £*. č U J i C I se t í m, že kationicky oligopeptid odpovídá v

    podstatě aminokyselinovému zbytku sekvence zahrnující:

    aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3aa4-X, kde aa1 znamená Pro, Ala nebo Lys, aa2 znamená Ile nebo Leu, aa3 znamená Glu nebo Lys, aa4 znamená Ser,

    Leu nebo Lys a X znamená sekvenci pěti aminokyselin se strukturou přirozené alfa helix šroubovice a mající obecně sekvenci aa5-Lys-Lys-aaó-Gly, kde aa5 znamená

    Ala nebo Leu a aaó znamená Leu nebo Phe.

    36. Prostředek podle nároku 35, vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid zahrnuje aminokyselinový zbytek sekvence vybrané zé skupiny zahrnující:

    Ala- -Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu- Ser- -Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv. I-D- #5), Ala- -Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu- Ser- -Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv- I-D- 46), Ala- -Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys- Ser- -Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv- I-D- #7), Ala- -Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys- Lys- -Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv. I-D- US), Ala- -Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-

    a A1 a-Ly»-Lys-Leu-AIa-Lye-L«u-Tyr-Lys-Lys-Leu-LeuLys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AIa-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv. I.D. #12).

    37. Prostředek podle nároku 33, vyznačuj ící se tím, že kationický oligopeptid zahrnuje aminokyselinový zbytek sekvence:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-LysSer-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly, kde aminokyselinové zbytky mohou být d-aminokyseliny.

    38- Prostředek podle nároku 34, vyznačuj ící se tím, že kationický oligopeptid zahrnuje aminokyselinové zbytky sekvence:

    Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-OrnSer-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.

    39. Prostředek pro léčení bakteriální infekce způsobené

    Escherichia coli, vyznačující se tím, že obsahuje: (a) cefepim a (b) magainin 2.

    40. Prostředek pro léčení infekce způsobené Escherichia coli.

    vyznačující se tím, že obsahuje:

    (a) cefepim a (b) peptid C-13 faktoru-4 lidských krevních destiček obsahující aminokyselinový zbytek sekvence:

    7ó

    Pro-Leu-Tyr Lys Lys Ile Zla Ly3-Lys-Leu ekv· I·D·

    41 .

    Prostředek pro léčení

    Escherichia coli.

    tím, Se obsahuje:

    bakteriální infekce způsobené vyznačující se (a) cefepim a (b) kationicky

    42.

    43.

    amfipaticky alfa helix oligopeptid.

    Prostředek podle nároku 41, vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid je tvořen nejméně jedenácti aminokyselinami.

    Prostředek podle nároku 42, vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid odpovídá v _r '/-V,“ L L L',' ..... ‘ ¹ «► “podstatě aminokyselinovému zbytku sekvence zahrnující: —— aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3aa4-X, kde aa1 znamená Pro, Ala nebo Lys, aa2 znamená Ile nebo Leu, aa3 znamená Glu nebo Lys, aa4 znamená Ser, Leu nebo Lys a X znamená sekvenci pěti aminokyselin se strukturou přirozené alfa helix Šroubovice a mající obecně sekvenci aa5-Lys-Lys-aaó-Gly, kde aa5 znamená Ala nebo Leu a aaó znamená Leu nebo Phenároku 43, že kationicky zbytek sekvence

    Prostředek podle se tím, aminokysellnový zahrnuj ící:

    vyznačuj ící oligopeptid zahrnuje vybrané ze skupiny

    44.

    ’ Ή - - ··· - * · ·--/ · ^: _ , .. ·— - · - - - , Alo-Loo -Tyr ' Lys-Lys-Leo-L.,o-Lys-Lyu Loo-Leo T; * · - - ·*— X — _Á ----- - ” 4 - - <Vv - - - - ' - _f Alo L.o Tyr ‘ X, © Li '* ~ j > Li ~ ΐ- -L 3 ” *_ ;'£' - ⁴ · uer-A1 a-o ys -Lys-L2u-Ό iy (Sok v. I.D- 47) A1 a-Leo-Tyr •«ys-tyá-teu-sec-Lys-Lys-Leo-Leu-Lys- Lys -A i a-Lys -Lys-Leu-Gly (Sekv. I.D. 48), AI 5.Lΰc~Tyr -Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leo-Leu-Lys- Phe-Ala-Lys- -Lys-Phe-Gly (Sekv- I-D- 410), Lys-Trp-Lys- Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu- Leu-Lys-Ser- -Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv- I.D. #11) a Ala-Lys-Lys- -Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu- Lys-Lys-Leu- -Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly (Sekv. I.D. 412) . 45. Prostředek podle nároku 44, vyznačuj ící se tím, Se kationický oligopeptid zahrnuje

    aminokyselinovy zbytek sekvence

    Ala-Leu-Tyr- -Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys- Ser-Ala-Lys- • Lys-Leu-Gly,

    kde aminokyselinové zbytky mohou být d-aminokyseliny

    4ó- Prostředek podle nároku *4-Z _ř v y zL π h č u j í c i se tím, že kationický oiígopeptId zahrnuje

    aminokyselinový zbytek sekvence

    Ala-Leu-Tyr- •Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn- Ser-Ala-Orn- -Orn-Leu-GIy 78

    - 79 ,1 ' · m

    ra

    CZ rc

    47. Prostředek pro léčení infekce způsobená~5žg71eřlchiá^colí~~ vyznačující se tím, že obsahuje a/ aztreonam a b/ magainin 2.

    48. Prostředek,obsahující therapeutický účinné množství betalaktámového antibiotika, které je schopno inhibovat růst organismu a kationický oligopeptid,pro použití při léčení infekce způsobené organismem citlivým na beta-laktámové antibiotikum.

    49. Prostředek podle nároku 48,v yznačující se tím, že množství beta-laktámového antibiotika je pod hranicí inhibiční dávky.

    50. Prostředek podle nároku 48,vyznačující se tím, že beta-laktámové antibiotikum je penicilín, cefalosporin, karbapenem, monobaktam, cefamycin, pyrazidon nebo penem.

    51. Prostředek podle nároku 48, vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je magainin, cecropin, sarkotoxin, mitochondriální prekurzor proteinu nebo jejich fragmenty, analogy nebo deriváty.

    52. Prostředek podle nároku 48, vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je faktor-4 lidských krevních destiček nebo jejich fragment, analog nebo derivát.

    53. Prostředek podle nároku 52, vyznačující se tím, že fragment faktoru-4 lidských krevních destiček je peptid C-13, mající aminokyselinovou sekvenci:

    Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-lys-Leu-Leu-Glu-Ser /sekvence I.D. // 1 /.

    54. Prostředek podle nároku 48, vyznačující se tím, že kationický oligopeptid tvoří amfipatickou alfa helix šroubovici v přítomnosti fázového rozhraní lipid / voda.

    55. Prostředek podle nároku 54,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid obsahuje nejméně 11 aminokyselinových zbytků.

    56. Prostředek podle nároku 55,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid v podstatě odpovídá sekvenci aminokyselinových zbytků zahrnující:

    aa i -Leu-Tyr-Lys-Lys-aa₂-aa₂-Lys-Lys-Leu-Leu-aa^-aa^-X, kde aa^ je Pro, Ala nebo Lys, aa₂ je Ile nebo Leu, aa^ je Glu nebo Lys, aa^ je Ser, Leu nebo Lys a

    X je sekvence pěti aminokyselinových zbytků se strukturou přirozené alfa helix šroubovice a mající obecně sekvenci:

    aa^-Lys-Lys-aag-Gly, kde aa^ je Ala nebo Leu a aa^ je Leu nebo Phe.

    57. Prostředek podle nároku 56,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je tvořen aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 5 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaI^s-Itfs-Leu-Gly /sekvence I.D. // 6 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 7 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala Lys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 8 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala Lys-Lys-Phe-Gly /sekvence I.D. // 10 /,

    Lys-Trp-Iys-Leu-Tyr-Lys-Iys-Leu-Leu-Iys-Iys-Leu-Leu-Lys Ser-Ala-Iys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 11 / a

    Ala-Lys-Iys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-LysLeu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 12 /

    58. Prostředek podle nároku 57, vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je tvořen sekvencí aminokyselinových zbytků:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly, kde aminokyselinové zbytky mohou být d-aminokyseliny.

    59. Prostředek podle nároku 55,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je tvořen následující sekvencí:

    Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-AlaOrn-Orn-Leu-Gly.

    60. Prostředek,obsahující therapeuticky účinné množství beta-laktémového antibiotika, které je schopno inhibovat růst Entero bacteriaceae a nejméně jednu membránově aktivní látku, pro použití při léčení bakteriální infekce způsobené bakteriemi Entero— bacteriaceae.

    61. Prostředek podle nároku 60, vyznačující se tím, že množství beta-laktámového antibiotika je pod hranicí inhibiční dávky.

    82 62. Prostředek podle nároku 60, vyznačující se tím, že beta-laktámové antibiotikum je penicilín, cefalosporin, karbapenem, monobaktam, cefamycin, pyrazidon nebo penem.

    63. Prostředek podle nároku 60,vyznačující se tím, že membránově aktivní látka je kationicky oligopeptid.

    64. Prostředek podle nároku 63,vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid je magainin, cecropin, sarkotoxin, mitochondriální prekurzor proteinu nebo jejich fragment, analog nebo derivát.

    65. Prostředek podle nároku 63,vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid je faktor-4 lidských krevních destiček nebo jejich fragment, analog nebo derivát.

    66. Prostředek podle nároku 65,vyznačující se tím, že fragment faktoru-4 lidských krevních destiček je peptid C-13, mající sekvenci aminokyselinových zbytků:

    Pro-Leu-Tyr-hys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser /sekvence I.D. // 1 /.

    67. Prostředek podle nároku 63,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid tvoří amfipatickou alfa helix ároubovici v přítomnosti fázového rozhraní lipid / voda.

    68. Prostředek podle nároku 67,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je tvořen nejméně 11 aminokyse- . línovými zbytky.

    69. Prostředek podle nároku 68,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je tvořen sekvencí aminokyselinových zbytků:

    aa ₁ -Leu-Tyr-Lys-Lys-aa₂-aa₂-Lys-lys-Leu-Leu-aa^-aa^-X,

    - 83 kde aa^ je Pro, Ala nebo Lys, aa₂ je Ile nebo Leu, aa-j ae Glu nebo L^ys, aa^ ae Ser, Leu nebo Lys a

    X je sekvence pěti aminokyselin se strukturou přirozené alfa helix šroubovice a má obecně sekvenci:

    aa^-Lys-Lys-aa^-Gly, kde aa^ je Ala nebo Leu a aa^ je Leu nebo Phe.

    70. Prostředek podle nároku 69,vyznačující se tím, že kationický oligopeptid je tvořen sekvencí aminokyselinových zbytků vybranou ze skupiny zahrnující:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaI^s-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 5 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 6 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 7 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-AlaLys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 8 /,

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-AlaLys-Lys-Phe-Gly /sekvence I.D. // 10/,

    Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-LysSer-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 11 / a

    Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu Leu-Lys-LysLeu-Leu-Iůrs-Ser-Ala-Lys-Itfs-Leu-Gly /sekvence I.D. // 12 /.

    84 71. Prostředek podle nároku 69, vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid je tvořen aminokyselinovou sekvencí:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly, kde aminokyselinové zbytky mohou být d-aminokyseliny.

    72. Prostředek podle nároku 68, vyznačující se tím, že kationicky oligopeptid je tvořen aminokyselinovou sekvencí:

    Ala-Leu-Tyr-Qrn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-AlaOrn-Orn-Leu-Gly.

    73. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství cefepimu a magaininu 2 pro léčení bakteriální infekce způsobené Escherichia coli.

    74. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství cefepimu a C-13 peptidu faktoru-4 lidských krevních destiček, který je tvořen sekvencí aminokyselinových zbytků:

    Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys- _ -Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-GluSer /sekvence I.D. // 1 /, pro použití k léčení bakteriální infekce způsobené Escherichia coli.

    75. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství cefepimu a kationický oligopeptid, který je tvořen aminokyselinovou sekvencí:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Iys-Leu-Gly /sekvence I.D. // 7 /, pro použití k léčení bakteriální infekce způsobené Escherichia

    - 85 coli»

    76. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství cefepimu a kationicky oligopeptid, který je tvořen aminokyselinovou sekvencí:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-AlaLys-Lys-Leu-Gly, kde všechny aminokyselinové zbytky jsou d-aminokyseliny, pro použití k léčení bakteriální infekce způsobené Escherichia_.-C.oli.

    77. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství cefepimu a kationicky oligopeptid, který je tvořen sekvencí aminokyselinových zbytků:

    Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-hys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-AlaIys-Iys-Leu-Gly /sekvence I.D.// 6 /, k

    pro použití k léčení bakteriální infekce způsobené Escherichia coli.

    78. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství cefepimu a kationický oligopeptid, který je tvořen aminokyselinovou sekvencí:

    Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-AlaOrn-Orn-Leu-Gly, pro použití k léčení bakteriální infekce způsobené Escherichia coli.

    79. Prostředek obsahující therapeuticky účinné množství aztreo namu a magaininů 2 pro použití k léčení bakteriální infekce způ sobené Escherichia coli.

    86 80. Způsob sledování antibakteriální aktivity prostředku s účinným komplementem in vitro, vyznačující se tím že a/ se smísí prostředek, který je sledován s cílenými bakteriemi. a složkami účinné komplementové kaskády a b/ se stanoví antibakteriální aktivita prostředku na výše uvedené bak- * terie.

    81. Způsob podle nároku 80,vyznaču jící se tím, že cílená bakterie je před směšovacím krokem předošetřena subminimální inhibiční koncentrací beta-laktémového antibiotika.

    82. Způsob podle nároku 80,vyznačující se tím, že složky účinné komplementové kaskády jsou ošetřeny sérem.