CZ412199A3 - Metabolically controlled fermentation process when preparing lovastatin hydroxy acid - Google Patents

Metabolically controlled fermentation process when preparing lovastatin hydroxy acid Download PDF

Info

Publication number
CZ412199A3
CZ412199A3 CZ19994121A CZ412199A CZ412199A3 CZ 412199 A3 CZ412199 A3 CZ 412199A3 CZ 19994121 A CZ19994121 A CZ 19994121A CZ 412199 A CZ412199 A CZ 412199A CZ 412199 A3 CZ412199 A3 CZ 412199A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fermentation
main fermentation
glucose
stage
controlling
Prior art date
Application number
CZ19994121A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CZ300153B6 (en
Inventor
Péter Seress
Gábor Balogh
ANTAL OLáH
László Cséke
Original Assignee
BIOGAL Gyógyszergyár Rt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from HU9800619A external-priority patent/HU226966B1/en
Application filed by BIOGAL Gyógyszergyár Rt. filed Critical BIOGAL Gyógyszergyár Rt.
Publication of CZ412199A3 publication Critical patent/CZ412199A3/en
Publication of CZ300153B6 publication Critical patent/CZ300153B6/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42Hydroxy-carboxylic acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A method for producing mevinolin by a microorganism in a fermentation process having a seed culture stage and a main fermentation stage, includinga) cultivating a microorganism biomass in the seed culture stage to produce an inoculum;b) transferring the inoculum into a fermentation medium in the main fermentation stage; and,c) maintaining steady stage conditions in the main fermentation stage, thereby producing a fermentation broth containing mevinolin. Preferably, the steady state conditions are maintained in the main fermentation stage by one or more of feeding of organic carbon sources; controlling glucose and/or total reducing sugar content; feeding of organic nitrogen sources; controlling pH; controlling foam level; controlling the mass of the fermentation broth by withdrawals and feedings; and, controlling the dissolved oxygen level.

Description

177438/HK • · • '· '·· • · • • · ·. · • * 0 · • • • • 1 • * Ml · • t • ·· · • · · • • • • « • • 0 ·· · ··· • · « · *pV &ζι~ή*ί

Metabolicky kontrolovaný proces ferítientace při výrobě lovasta-tinové hydroxykyseliny

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká obecně biosyntézy činidel snižujících hladinu, cholesterolu. Přesněji se předkládaný vynález týká biosyntézy mevinolinu, což je činidlo snižující hladinu cholesterolu, pomocí mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

Mevinolin (lovastatin; monakolin K; δ-lakton kyseliny β,δ-di-hydroxy-7- [1,2,6,7,8,8a-hexahydro-2,6-dimethyl-8- (2-methylbu-tyryloxy)naftalen-l-yl]heptanové) je jedním z nej důležitějších činidel snižujících hladinu cholesterolu. Podle předkládaného vynálezu zahrnuje termín mevinolin jak formu laktonu, tak formu volné hydroxykyseliny.·

Jeho forma volné hydroxykyseliny. je účinným inhibitorem enzymu 3-hydroxy-3-methylglutarylkoenzym A reduktázy, který katalyzuje vznik kyseliny mevalonové, což je časný meziprodukt při bio-syntéze cholesterolu. Mevinolin je zvláště výhodný, protože jako následek jeho aplikace se biosyntetickě meziprodukty s toxickým steroidním skeletem, vznikající v pozdějších stádiích špatně akumulují. Mevinolin zvyšuje počet LDL receptorů na povrchu buněčné membrány, která odstraňuje LDL cholesterol obíhající v krvi, a tak vyvolává snížení hladiny cholesterolu v krvi.

Obecně se aktivní látka vyrábí pomocí fermentace. GB 2046737 popisuje, že aktivní složka se může vyrábět pomocí různých kmenů, patřících do rodu Monascus, například M. ruber 1005, kultivovaných při 7 až 40 °C. Jako kultivační médium se použije vodný roztok glukózy, peptonu, kukuřičný výluh a chlorid • » ·♦ ·* • M - · ·* • · ·« · ♦ · · • · · ♦ ♦ · » « ·(%··· ··· • · ♦ ♦ ··· ··♦ ·# ·· amonný. Fermentace se provádí 10 dní za anaerobních podmínek a získá se 87 mg mevinolinu z filtrátu.5 litrů roztoku. US patent 4,294,926 popisuje biosyntézu mevinolinu s výhodou pomocí aplikace mikroorganismů uložených pod čísly ATCC 20541 nebo 20542, patřících do rodu Aspergillus terreus, do kultivačního média obsahujícího cukry, například glukózu, fruktózu, maltózu, jako zdroj uhlíku, zdroj dusíku, například kvasinky, hydrolyzované kvasinky, hydrolyzovaný kasein, kapalinu po máčení kukuřice a minerální soli, například uhličitan vápenatý, síran hořečnatý, soli kobaltu, železa, hořčíku, při teplotě 20 až 37 °C. Podobné postupy jsou popsány například v US patentu číslo 4,420,491, 4,342,767, 4,319,039 a 4,294,846, kde se fermentace provádí 3 až 5 dní v médiu obsahujícím 1 až 6 % cukrů a 0,2 až 6 % zdrojů dusíku. Německý patent číslo 4,402,591 popisuje biosyntézu mevinolinu pomocí mikroorganismů patřících do rodu Pleurotus, například Pleurotus ostreatus, P. sapidus, P. saca, při 25 až 35 °C během 7 až 14 dní kultivace na povrchu nebo při ponoření do média. ' '

Kanadský patent číslo 2,129,416 popisuje přípravu mevinolinu nebo zejména mevastatinu, pomocí 'mikroorganismů patřících do rodu Conióthyrium, například uložených pod číslem Coniothyrium fuckelii ATCC 74227 v kultivačním médiu obsahujícím 3 až 15 % glukózy, 0,5 až 4 % peptonu, 0,5 až 5 % amylázy, 0,2 až 1 % síranu amonného, 0,01 až 1 % síranu hořečnatého, 0,05 až 0,2. % antipěnícího činidla, 0,2 až 1,5 % L-isoileucinu, 0,2 až 1,5 % L-asparagové kyseliny při pH 5 až 6. Podle příkladů je koncentrace aktivní složky v bujónu 19 až 430 mg/litr. Německý patent číslo HU 208,997 popisuje aplikaci holotypového kmene Aspergillus obscurus očíslovaného jako MV-1, uloženého pod číslem NCAIM(P)F 001189. Fermentace se, s výhodou provádí v médiu obsahujícím kvasinkový extrakt a/nebo pepton a/nebo kasein jako zdroj dusíku a glukózu a/nebo maltózu nebo sacha-rózu jako zdroj uhlíku. Aktivita bujónu na konci kultivace v laboratorním měřítku se pohybuje mezi 400 až 850 mg/litr. Z předchozí diskuse je zřejmé, že se výzkumné práce při bio-syntéze mevinolinu zaměřovaly spíše na nové mikroorganismy produkující mevinolin, než na vývoj samotného procesu fermentace. Některé odkazy popisují, že se fermentace může provádět v běžných a známých médiích za použití jak povrchové kultivace, tak kultivace v pevném stavu. Použily se vsádkové postupy, kdy chování při postupu záviselo na počátečních podmínkách. Avšak technická omezení, například udržení nejvýhodnějších množství složek, optimálně rozpuštěný zdroj kyslíku a pH a tak dále, ztěžovaly zavedení kontinuálních korekčních aktiontů pro zajištění výhodných podmínek. Daný . mikroorganismus během hlavního kroku fermentace, v závislosti na jeho metabolismu, vyžaduje různé podmínky/složení média, aby bylo možné zajistit optimální růst a produkci aktivní složky. Autoři předkládaného vynálezu ze svých pokusů vyvodili, že při očkování kultury a na začátku hlavní fermentace, je množství aktivní biomasy velmi malé a proměnlivé. Výtěžek fermentace je tedy relativně malý a proměnlivý. Výtěžky dosažené na konci fermentace, které samozřejmě závisí na kmenu, nepřevyšovaly koncentraci mevinolinu 850 mg/litr. Autoři předkládaného vynálezu provedli detailní analýzu celého procesu fermentace od kroku přípravy očkovací kultury až do konce fermentace. Bylo zjištěno, že při kroku přípravy očkovací kultury, v případě známého média a provedení procesu, je množství biomasy příliš malé. Proto tedy během hlavní fermentace nejsou metabolismus mikroorganismů a kultivace dostačující. 4 • ·« »· ♦ · • · *

Pódstata vynálezu Předmětem podle předkládaného vynálezu je tedy zlepšit účinnost postupu fermentace při výrobě mevinolinu pomocí zesílení produkční schopnosti mikroorganismu pomocí změny podmínek a provádění fermentace.

Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnout buď krok přípravy očkovací kultury nebo fermentace nebo oba, za nejvhodnějších chemických a fyziologických podmínek pro metabolismus mikroorganismu.

Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je poskytnout při kroku přípravy očkovací kultury nebo fermentace nebo při obou, nejvhodnější chemické a fyziologické podmínky pro metabolismus mikroorganismů pomocí zachování stálých podmínek, rychlosti růstu a potom, po prodlouženou dobu, maximální rychlost tvorby produktu. Těchto a dalších předmětů podle vynálezu bylo dosaženo pomocí provedení podle předkládaného vynálezu poskytnutím způsobu produkce mevinolinu pomocí mikroorganismů při procesu fermentace, která zahrnuje krok přípravy očkovací kultury a hlavní fermentační krok, přičemž tento způsob zahrnuje: . a) kultivaci biomasy mikroorganismu v·kroku přípravy očkovací kultury za vzniku inokula; b) převedení jmenovaného inokula do fermentačního média ve jmenovaném fermentačním kroku; a c) zachování stabilních podmínek při jmenovaném kroku fermentace za vzniku fermentačního bujónu obsahujícího mevinolin.

Ve výhodném provedení podle vynálezu se stabilní podmínky zachovávají při kroku fermentace pomocí dodávání jednoho nebo více zdrojů organických atomů uhlíku; kontrolou glukózy a/nebo 5

·· ·· • * · ψ • t · *

celkového obsahu redukujících cukru; doplňováním organických a/nebo anorganických zdrojů dusíku; kontrolou pH; kontrolou hladiny pěny; kontrolou hmoty' fermentačního bujónu pomocí odvádění a přivádění; a kontrolou hladiny rozpuštěného kyslíku. FermentaČní proces se s výhodou provádí v ponořené kultuře mikroorganismů a· při teplotě 24 až 30 °C. Ve zvláště výhodném provedení podle předkládaného vynálezu je mikroorganismem kmen Aspergillus. V dalším výhodném provedení podle předkládaného vynálezu je zdroj organického uhlíku vybrán ze skupiny, kterou tvoří glukóza, hydrolyzovaný škrob a rostlinný olej; obsah glukózy se od šedesáté hodiny hlavního fermentacního kroku udržuje pod 0,2 %; zdroj dusíku je vybrán ze skupiny, kterou tvoří kukuřičný výluh a hydroxid amonný; pH se kontroluje na hodnotě 5,2 až 7,0, s výhodou 5,2 až 6,2 pomocí doplňování zdrojů uhlíku a/nebo báze; množství pěny se kontroluje přidáním látky kontrolující hladinu pěny, látka je s výhodou syntetická nebo je to rostlinný olej; a hladina rozpuštěného kyslíku se kontroluje s výhodou mícháním a/nebo aerací fermen-tačního bujónu. V dalším výhodném provedení podle předkládaného vynálezu se inokulum převádí z kroku přípravy očkovací kultury do hlavního fermentačního kroku v době, kdy se pH v kroku přípravy očkovací kultury zvyšuje po dosažení své minimální hodnoty.

Podrobný popis vynálezu

Autoři zjistili, že optimální biosyntéza mevinolinu se může provést pomocí úpravy jednoho nebo více určitých parametrů způsobu, kroků a/nebo změn při kroku přípravy očkovací kultury nebo při fermentačním kroku nebo při obou těchto krocích procesu biosyntězy.

Autoři zjistili, že během fáze přípravy očkovací kultury mezi tyto parametry, kroky a/nebo proměnné patří dodání mikroorganismů ’s potřebnými složkami média ve snadno přizpůsobivé formě a v nejvhodnější koncentraci a při prodlouženém kultivačním čase o asi 10 až 25 %.

Autoři zjistili, že, aby se dosáhlo stabilních podmínek během kroku fermentace, patří mezi tyto parametry procesu, kroky procesu a/nebo proměnné procesu kontrola glukózy a/nebo celkového obsahu .redukujících cukrů, zachování zdrojů uhlíku na vhodné minimální úrovni, dodání organických a/nebo anorganických zdrojů dusíku, kontrola pH, . kontrola hladiny pěny, kontrola hmoty bujónu pomocí odvádění nebo přivádění a kontrola rozpuštěného množství kyslíku pomocí změn rychlosti míchání a/nebo rychlosti aerace.

Aby se optimalizovala biosyntéza mevinolinu, není nutné upravovat každý z výše uvedených procesních parametrů, kroků a/nebo proměnných pro krok přípravy očkovací kultury nebo pro krok hlavní fermentace současně. Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu bude biosyntéza mevinolinu zahrnovat všechny výše uvedené procesní parametry, kroky a/nebo změny. V tomto výhodném provedení se bude provádět metabolicky kontrolovaný způsob fermentace mevinolinu, kdy se stabilních podmínek, tj . při konstantního pH, koncentrace glukózy, rozpuštěného kyslíku, viskozity, objemu, a tak dále, dosáhne rychle a stabilní podmínky se budou zachovávat po dlouhou dobu za', získání výtěžku, který vysoce překračuje výsledky známých postupů.

Určitých výhod se může dosáhnout, v kroku přípravy očkovací kultury pomocí úpravy jednoho nebo více výše uvedených procesních parametrů, kroků a/nebo proměnných v tomto kroku. Mezi tyto výhody patří například snížení doby potřebné k dosažení „stabilních" podmínek pomocí 20 až 30% zvýšení počtu center růstu a aktivní biomasy ve výhodnější morfologické formě, za vzniku výhodnějších podmínek pro kultivaci mikroorganismů. 7 7 • «· Φ· · · • · · ·· t • · ··· ♦«

• · ·» ·* ♦ ♦ · t • « t ·

*♦# »M Výsledkem těchto výhod a prodlouženi kultivačního času je, že se koncentrace biomasy téměř zdvojnásobí.

Určitých výhod se může dosáhnout při hlavním fermentačním kroku pomocí úpravy jednoho nebo více procesních parametrů, kroků a/nebo proměnných při tomto kroku. Mezi tyto výhody patří například rychlejší a méně kolísavá fáze růstu a rychlý vznik stabilního stavu, který je možné zachovávat dlouhou dobu. Výsledkem těchto výhod je značně zvýšená aktivita fermentace. V jednom provedení je předkládaný vynález zaměřen na postup fermentace při výrobě mevinolinu s kmenem patřícím do rodu Aspergillus v ponořené kultuře, při pH 5,2 až 7,0, při teplotě 24 až 30 °C, v médiu obsahujícím upravitelné. zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli, kdy se při hlavní fermentační fázi použije metabolicky kontrolovaný postup, čímž; se zachová kultura ve „stabilním" stavu. V tomto provedení se s výhodou kontroluje celkový obsah redukujícího cukru. Ve zdroji hlavní fermentace se s výhodou doplňují zdroj organického uhlíku, například glukóza, hydrolyzovaný škrob a rostlinný olej. S výhodou se koncentrace glukózy udržuje nižší než 0,2 % od šedesáté hodiny fermentace. Během postupu se doplňují zdroje dusíku, jako je kukuřičný výluh a roztok hydroxidu amonného. pH se s výhodou udržuje na hodnotě v rozmezí 5,2 až 6,2 pomocí doplňování zdroje uhlíku a/nebo báze, například hydroxidu amonného a/nebo hydroxidu sodného. Množství pěny ve fermentéru se může také kontrolovat pomocí doplňování rostlinného oleje, například slunečnicového oleje a/nebo sójového oleje a/nebo syntetických antipěnivých činidel do bujónu. Rozpuštěný kyslík se s výhodou kontroluje změnou rychlosti míchání a/nebo rychlosti aerace. Během fermentace se provádí jedno nebo více odčerpání . • t ·· • ♦ · » • · · · ·#· ♦·· • · ·· «· • ·· · · ·« « · ♦♦ ·· • · · · · • ··· · · * • · · · ···' ·· ······

Ve výhodném provedení se hlavní kultivační médium inokuluje očkovací kulturou, která má následující složení:

Složka Množství (hmotnost/objem) glukóza 2-6 kyselina fosforečná 0,002-0,006 kyselý kasein 0,2-0,8 kukuřičný výluh 1,5-5 slunečnicový olej 0,05-0,18 polypropylenglykol 0,05-0,18 pankreatin* 0,002-0,008 *čtyřnásobná aktivita podle Ph.Hv.VII.

Kultivační médium o výše uvedeném složení se doplní o běžně používané mikro- a makroelementární soli, například anorganické soli sodíku, draslíku, hořčíku a železa. Hlavní' kultivační médium se inokuluje očkovací kulturou, jejíž kultivační čas je prodloužen o 10 až 25 %. Při stupni přenosu naočkované kultury je pH ve fázi růstu po dosažení jeho minimální hodnoty.

Pro fermentaci se s výhodou použije kmen Aspergillus obscurus, jeho varianty nebo jeho mutant nebo výhodněji holotypový kmen Aspergillus obscurus n. sp. MV-1 uložený pod kódovým číslem NCAIM(P)F 001189. Očkovací kultura se inokuluje do sterilního hlavního fermen-tačního média při prodlouženém čase kultivace ve fázi rostoucího pH po dosažení jeho minimální hodnoty. V hlavním fermen-tačním stupni se mohou „stabilní" podmínky s maximální produkcí aktivní složky zachovat po delší dobu pomocí přivádění zdrojů uhlíku a dusíku, aby se vyhovělo požadavkům na živiny; kontroly koncentrace glukózy, aby se zabránilo nežádoucímu zahušťování kultury a zvýraznil se růst biomasy; kontroly rychlosti míchání a rychlosti aerace podle požadavků na kyslík; kombinace vhodného materiálu splňujícího· jak požadavky pro kontrolu množství pěny, tak požadavky na zdroj uhlíku, I I ·· ·· ·· ·· » · · · • · · ♦ ♦ · I « · Μ· ♦·« ·· · I I · · ··· ··· ·· ·· například směs rostlinného oleje á syntetického . činidla; udržení hodnoty pH mezi 5,2 až 6,2 pomocí přivádění zdroje uhlíku, například glukózového sirupu nebo báze; a provedení jednoho nebo více odčerpání, pokud se -dosáhne maximálního pracovního objemu fermentéru nebo pokud se dosáhne ekonomicky dostatečné koncentrace mevinolinu pro provádění souproudého procesu.

Za použití těchto prvků se může dosáhnout mnohostranně kontrolovatelného postupu fermentace, který v závislosti na životním cyklu může poskytnout dobré konstantní okolní podmínky pro mikroorganismus.

Podle výhodného provedení popsaného výše poskytuje postup podle předkládaného vynálezu výtěžky převyšující výtěžky, známých postupů, využívá významně menší množství surovin a energie, snižuje množství odpadního materiálu znečišťujícího životní prostředí na jednotku hmoty aktivního materiálu a lépe využívá fermentér. V následujících příkladech je biosyntéza mevinolinu podle způsobu popsaného v HU 208997 (porovnávací příklad 1) porovnána, se způsobem podle výhodného provedení podle předkládaného vynálezu (příklad 2). Příklady provedení vynálezu

Porovnávací příklad 1

Biosyntéza mevinolinu podle HU 208997 V 6001itróvé nádobě se připraví médium pro očkovací kulturu médium o následujícím složení:

Složka Množství (%) glukóza 4,0 kasein pepton 0,5 NaN03 0,3 « * ·· ·· • · ·· • * • · • • • · • · • t ··· • • • ··* ·* ·« t *♦ ·· t · • · · t ··· 10 ··· *·* kh2po4 0,2 KC1 0,05 MgS04*7H20 0,05 FeS04*7H20 0,001 Očkování inokula se provádí pomocí suspenze zárodečných buněk kmene Aspergillus obscurus o počtu zárodečných buněk 6,5xl09. Procesní parametry očkovací kultury byly následující:

Parametr Hodnota Objem 400 litrů Teplota to Ό o O Rychlost aerace 20 normálních nť/h Vnitřní tlak 50 kPa Rychlost míchání 320 otáček za minutu Přenos očkovací kultury do hlavního fermentačního média se provádí podle standardního postupu ve věku 36 hodin, kdy se pH nachází ve fázi růstu na hodnotě 5,6. Odstředěný objem buněk biomasy (PCV) je 14 %. Očkovací kultura popsaná výše se inokuluje do hlavního fermentačního média značeného MEF-03 při poměru inokůlace 10 %. Složení hlavního fermentačního média je následující:

Složka Množství (%) Monohydrát dextrózy 1,0 Kyselý kasein 0,2 Kukuřičný Škrob 8 Sójová moučka 1/5 Kukuřičný výluh (50 %) 1 Chlorid sodný 1 Dihydrogenfosforečnan draselný 0,2 Glutaman sodný 1,2 Slunečnicový olej 0,16 Polypropylenglykol 0,16 11 11 ·» • ♦ ·· ·# »· • · · • · ♦ · • « ♦♦· ·♦ ♦ ♦ ·♦· ·· ♦# • · ··· ♦ • ·♦

Pankreatin* 0,002 Enzym BAN 240 0,007 Chlorid vápenatý 0,02 Hydroxid draselný pro úpravu pH *čtyřnasobná síla podle Ph.Hg.VII.

Objem v 0 hodin: 500 litrů.

Fermentace se provádí 7 dní. Aerace a míchání jsou následující:

Aerace* Rychlost míchání* 18-25 normálních m3/h 180-320 otáček za minutu ♦Rozpuštěný kyslík se udržuje na hodnotě nad 40 % nasycení. Během fermentace se přidají 50kg podíly enzymaticky zkapalněného kukuřičného škrobu podle rozvrhu ve věku 50, 73, 90 a 108 hodin.

Data pro produkci aktivní složky:

Doba fermentace 164 hodin. Aktivita měřená podle HPLC: 927 mg/kg. Množství bujónu: 580 kg. Podle údajů uvedených výše je množství fermentované aktivní složky 0,58 tun*927 g/tu- na/1000/l m3 = 0,54 kg/m3 celkového objemu. Příklad 2

Biosyntéza mevinolinu se sirupem glukózy a přiváděním zdroje dusíku, a za kontroly pH hydroxidem sodným nebo hydroxidem amonným V 6001 nádobě se připraví očkovací kultivační médium, které má následující složení:

Složka % glukóza 4,0 kasein pepton 0,5 kukuřičný výluh (50 %) 3,0

NaN03 . ; 0,3 KH2P04 0,2 t KC1 0,05 MgS04*7H2 0,05 FeS04*7H20 0,001 pankreatin* 0,005 polypropylenglykol 00,1 slunečnicový olej 0,, 1 *čtyřnásobná síla podle Ph.Hg.VII. Očkování se provádí pomocí suspenze zárodečných buněk kmene Aspergillus obscurus o počtu, zárodečných buněk 6,5xl09. Proces^ ní parametry očkovací kultury jsou stejné, jako je uvedeno pro porovnávací příklad 1.

Avšak přenesení očkovací kultury se provádí jiným způsobem než je popsáno v porovnávacím přikladu 1. Věk při přenosu je 40 hodin.· pH dosáhlo minimální hodnoty (pH 4,9) a přenos se provedl ve fázi, kdy pH začalo růst a dosáhlo hodnoty asi 5,0. Tedy, pH se zvýšilo asi o 0,1 vzhledem k minimální hodnotě. Odstředěný objem buněk biomasy (PCV) je asi 24 %. Výše popsaná očkovací kultura se inokuluje do hlavního fermen-tačního média při poměru inokulace 10 %. Složení fermentačního média je následující:

Složka - Množství (%) kukuřičný škrob 8 glukózový sirup* 1,0 kyselý kasein 0,2 sój ová moučka 1,5 kukuřičný výluh (50 %) 1 chlorid sodný 1 dihydrogenfosforečnan draselný 0,2 glutaman sodný 1,2

slunečnicový olej f 0,16 po1ypropy1englyko1 0,16 pankréatin** 0,002 hydroxid draselný pro úpravu pH *25 kg se přidá ve formě 2 5% glukózového s.yrupu **čtyřnásobná síla'podle Ph.Hg.VII.

Fermentace se provádí 13 dní. Aerace a rychlost míchání jsou následující:

Aerace* Rychlost míchání* min. 12, max. 32 normálních m3/h min. 220, max. 400 otáček za minutu *Rozpuštěný kyslík se udržuje na hodnotě 40 % nasycení pomocí výhodného způsobu aerace. Během fermentace je udržení stupně rozpuštění kyslíku velmi důležité. V nej intenzivnějším stupni se jej může dosáhnout použitím rychlosti aerace 25 až 32 normálních m3/h a rychlosti míchání 300 až 400 otáček za minutu. Během hlavního fermentačního stupně je teplota 27±2 °C, vnitřní tlak je 40 kPa a dobá kultivace 309 hodin. Během fermentace se přidávají následující živiny: 1. Hydrolyzovaný kukuřičný škrob (glukózový sirup) se připraví pomocí enzymatického zpracování a zpracování pomocí kyseliny chlorovodíkové a přidá se. Suroviny použité pro přípravu glukózového sirupu jsou následující: 25 % kukuřičného škrobu, 0,3 až 0,4 chloridu vápenatého, 0,1 až 0,2 amylázového enzymu (BAN) a 1 % koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Přidávání glukózového sirupu se zahájí ve stádiu růstu pH, po dosažení jeho minimální hodnoty (5,0) ve věku 45 hodin a při hodnotě pH 5,6. Přidávání se provádí kontinuálně, pH se udržuje v rozmezí

• · · ♦ ♦ • * · ··* · · • 9 » «·♦ «·» 9· ·» 5,4 až 5,8. Minimální rychlost přidávání je 0,5 litru/hodina a maximální rychlost přidávání je 5 litrů/hodina. 2. pH se kontroluje pomocí přidávání hydroxidu sodného a hydroxidu amonného, pokud hodnota pH poklesne pod 5,5, kromě toho se rychlost přidávání glukózového sirupu sníží na minimální. 3. Kukuřičný výluh (l %) se přidá ve věku fermentace 100 hodin (vzhledem k objemu v čase 0 hodin). Údaje pro produkci aktivní složky:

Doba fermentace: 309 hodin. Aktivita měřená pomocí HPLC: 2868-m9/k9· Množství bujónu: 680 kg. Podle údajů uvedených výše je množství fermentované aktivní složky 0,68 tun*286.8 g/tu- na/lOOO/l m3 = 1,95 kg/m3 celkového objemu. Příklad 3

Biosyntéza mevinolinu s přidáváním, kontrolou a odváděním

Holotypový kmen Aspergillus obscurus n. sp. MV-1 se kultivuje ve sterilním inokulačním médiu o následujícím složení:

Složka % glukóza 4,0 kyselina-fosforečná 0,0035 kyselý kasein 0,5 kukuřičný výluh (50 %) 3,0 NaN03 0,3 KH2P04 0,2 KC1 0,05 MgS04*7H2 0,05 FeS04*7H20 0,001 slunečnicový olej 0,1 polypropylenglykol 0,1 • · • ·

··· ··«

pankreatin* . 0,005 hydroxid draselný pro úpravu pH kyselina chlorovodíková pro úpravu pH

♦čtyřnásobně silný podle Ph.Hg.VII Během iňokulačního stupně se použily následující parametry:

Parametr Hodnota Objem 8 m3 Rychlost míchání 120 otáček za minutu Aerace 400±50 normálních m3/hod Vnitřní tlak 40±10 kPa Teplota 27±2 °C

Inokulum se přenese poté, co hodnota pH dosáhla minima (pH 4,8) a když je hodnota pH vyšší o 0,1 než je minimální hodno-> ta, tj . když pH dosáhne hodnoty 4,9. Odstředěný objem buněčné biomasy (PCV) je 24 %. Při rychlosti přenosu 8 % se výše uvedené inokulum přenese do hlavního fermentačního média, které má následující složení:

Složka Množství (%) Sójová moučka 1,28-1,57 Celkem kukuřičného nebo pšeničného škrobu 9 Kyselý kašein 0,20 Kukuřičný výluh (50 %) 0,857-1,14 chlorid sodný 1,0 dihydrogenfosforečnan draselný 0,2 glutaman sodný 1,14—1,20 chlorid vápenatý , 3,8xl0'3 BAN enzym 2,2x1O3 slunečnicový olej 0,10 polypropylenglykol 0,10 pankreatin* 2,0x10 3 ~ hydroxid draselný chlorovodíková nebo kyselina

pro upravu pH

*čtýřnásobná síla podle Ph.Hg.VII Během hlavního fermentačního stupně se použily následující parametry:

Parametr Hodnota Vnitřní tlak 20+5 kPa Teplota 27±2 °C Rychlost míchání 60-85 otáček za minutu Rychlost aerace 1000±4000 normálních m1/hod Při dáváné 1átky: 1. Zdroj uhlíku: Asi 40 tun hydrolyzovaného škrobu, degradovaného do velké míry až vznikne glukóza (glukózový sirup) v 25% formě, která se kontinuálně přivádí. Suroviny použité pro přípravu glukózového sirupu jsou následující: 25 % kukuřičného nebo pšeničného škrobu, 0,3 % chloridu vápenatého, 0,3 % BAN 240 enzymu a asi 2 % kyseliny chlorovodíkové. 2. Zdroj dusíku: Pro přípravu se použije kukuřičný výluh (50 %) v množství l % vzhledem k fermentačnímu objemu v čase 0 hodin v 5 m1 sterilního objemu. 1 Báze pro kontrolu pH. Pro kontrolu pH se použije nesteri-lizovaný 25 až 30% roztok hydroxidu sodného a hydroxidu amonného. Přidávání: 1. Glukózový sirup: Přidávání se zahájí asi v 50 hodinách ve stádiu růstu pH, poté, co dosáhne první minimální hodnoty. Glukózový sirup se přidává proto, aby se kontrolovala hodnota pH v rozmezí 5,4 až 5,8. Přidávání glukózy se provádí pomocí dávkovacího způsobu nebo kontinuálně. Glukózový sirup se 17 • · ·«< •· 0 0 09 0 0 0 0 * ·· ·· 9 0 9 0 090 9 0 0 990 900 09 přidává rychlostí v rozmezí 0 až 1000 kg/hod, s výhodou rychlostí 150 až 500 kg/hod. Pokud není možné udržet minimální pH dokonce i při minimální rychlosti přidávání glukózy, je pro kontrolu pH nutné přidávat bázi. 2. Kukuřičný výluh: Kukuřičný výluh se přidá v jedné dávce asi ve 100 hodinách. Pokud je to nutné, může se přidat další dávka. 3. Hydroxid sodný nebo hydroxid amonný: Pro kontrolu pH se báze přidávají, pokud pH klesne po 5,5 1 při minimální rychlosti přidávání glukózového sirupu.

Množství pěny se kontroluje pomocí přidávání směsi slunečnicového oleje:PPG v poměru 95:5 tak, aby množství pěny nepřekročilo 25 % pracovního objemu fermentéru.'

Odvádění z fermentéru se provedlo ve věku 112, 13 8, 178, 204 hodin pomocí odebrání 4 m3 bujónu čtyřikrát. Údaje pro produkci aktivní složky:

Doba fermentace: 226 hodin. Aktivita měřená podle HPLC (matečný podíl): 1825 mg/kg. Aktivita sklizené části (s odebíráním) : 1788 mg/kg. Podle údajů uvedených výše je množství fermentované aktivní složky 95 tun*1788 g/tuna/1000/105 m3 celkového objemu.

177438 / HK • · · · · · · · · · · · V 0 V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V

Metabolically controlled ferritation process in the production of lovastatin hydroxy acid

FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to biosynthesis of cholesterol lowering agents. More specifically, the present invention relates to the biosynthesis of mevinoline, which is a cholesterol lowering agent, by microorganisms.

Background Art

Mevinolin (lovastatin; monacolin K; δ, δ-di-hydroxy-7- [1,2,6,7,8,8a-hexahydro-2,6-dimethyl-8- (2-methylbutyryloxy) naphthalen-1-yl] heptanoic acid) is one of the most important cholesterol lowering agents. According to the present invention, the term mevinolin includes both the lactone form and the free hydroxy acid form.

Its free hydroxy acid form. is a potent inhibitor of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, which catalyzes the formation of mevalonic acid, an early intermediate in bio-cholesterol synthesis. Mevinoline is particularly advantageous because, as a consequence of its application, biosynthetic intermediates with a toxic steroid skeleton, arising at later stages, accumulate poorly. Mevinolin increases the number of LDL receptors on the surface of the cell membrane, which removes LDL cholesterol circulating in the blood and thus causes a decrease in blood cholesterol.

Generally, the active ingredient is produced by fermentation. GB 2046737 discloses that the active ingredient can be produced by various strains belonging to the genus Monascus, for example M. ruber 1005, cultured at 7 to 40 ° C. An aqueous solution of glucose, peptone, corn liquor and chloride is used as the culture medium • M · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Fermentation is carried out for 10 days under anaerobic conditions to obtain 87 mg of mevinoline from the filtrate of 5 liters of solution, US Patent 4,294,926 discloses the biosynthesis of mevinoline by the application of microorganisms \ t deposited under ATCC Nos. 20541 or 20542, belonging to the genus Aspergillus terreus, into a culture medium containing sugars such as glucose, fructose, maltose, as a carbon source, a nitrogen source such as yeast, hydrolyzed yeast, hydrolysed casein, maize dipping liquid and mineral salt , for example, calcium carbonate, magnesium sulfate, cobalt, iron, magnesium salts, at a temperature of 20 to 37 ° C. Similar procedures are described, for example, in U.S. Patent 4,420,491, 4,34. Nos. 2,767, 4,319,039 and 4,294,846, wherein the fermentation is carried out for 3 to 5 days in medium containing 1 to 6% sugars and 0.2 to 6% nitrogen sources. German Patent No. 4,402,591 describes the biosynthesis of mevinoline by microorganisms belonging to the genus Pleurotus, for example Pleurotus ostreatus, P. sapidus, P. saca, at 25 to 35 ° C during 7 to 14 days of cultivation on the surface or immersion in the medium. ''

Canadian Patent No. 2,129,416 discloses the preparation of mevinoline, or in particular mevastatin, by means of microorganisms belonging to the genus Conomythrium, for example, deposited under Coniothyrium fuckelia ATCC 74227 in a culture medium containing 3-15% glucose, 0.5-4% peptone, 0.5-5% % amylase, 0.2 to 1% ammonium sulfate, 0.01 to 1% magnesium sulfate, 0.05 to 0.2. % of the antifoaming agent, 0.2 to 1.5% of L-isoileucine, 0.2 to 1.5% of L-aspartic acid at pH 5-6. According to the examples, the concentration of active ingredient in the broth is 19 to 430 mg / liter. German Patent No. HU 208,997 discloses the application of a holotype strain of Aspergillus obscurus numbered MV-1, deposited under NCAIM (P) F 001189. The fermentation is preferably carried out in a medium containing yeast extract and / or peptone and / or casein as a nitrogen source and glucose and / or maltose or sucrose as a carbon source. The broth activity at the end of cultivation on a laboratory scale ranges from 400 to 850 mg / liter. From the previous discussion, it is clear that the research work in the bio-synthesis of mevinolin was directed at the new mevinolin-producing microorganisms rather than at the fermentation process itself. Some references disclose that fermentation can be carried out in conventional and known media using both surface cultivation and solid state culture. Batch procedures were used where the process behavior depended on initial conditions. However, technical limitations, such as maintaining the most advantageous amounts of ingredients, optimally dissolved oxygen source and pH, and so forth, made it difficult to introduce continuous correction actives to provide favorable conditions. Given. The microorganism, during the main fermentation step, depending on its metabolism, requires different media conditions / compositions to ensure optimal growth and production of the active ingredient. The authors of the present invention have inferred from their experiments that in the culture inoculation and at the beginning of the main fermentation, the amount of active biomass is very small and variable. Thus, the fermentation yield is relatively small and variable. The yields obtained at the end of the fermentation, which of course depend on the strain, did not exceed 850 mg / liter of mevinoline. The present inventors have performed a detailed analysis of the entire fermentation process from the seed culture preparation step to the end of the fermentation. It has been found that in the seed culture preparation step, in the case of a known medium and process, the amount of biomass is too small. Therefore, during the main fermentation, the metabolism of microorganisms and cultivation are not sufficient. 4 • · «

SUMMARY OF THE INVENTION It is therefore an object of the present invention to improve the efficiency of a fermentation process in the production of mevinoline by enhancing the production capacity of the microorganism by altering the conditions and performing the fermentation.

Another object of the present invention is to provide either a step of preparing a seed culture or a fermentation or both, under the most appropriate chemical and physiological conditions for the metabolism of the microorganism.

It is a further object of the present invention to provide, in the step of preparing a seed culture or fermentation or in both, the most suitable chemical and physiological conditions for the metabolism of microorganisms by maintaining stable conditions, growth rate and then, for an extended period of time, the maximum rate of product formation. These and other objects of the invention have been achieved by embodiments of the present invention by providing a method of producing mevinolin by microorganisms in a fermentation process comprising the step of preparing a seed culture and a major fermentation step, the method comprising:. (a) culturing the microorganism biomass in a seed culture step to form an inoculum; b) converting said inoculum into a fermentation medium in said fermentation step; and c) maintaining stable conditions at said fermentation step to produce a mevinolin-containing fermentation broth.

In a preferred embodiment of the invention, stable conditions are maintained at the fermentation step by supplying one or more sources of organic carbon atoms; glucose control and / or 5

·· ·· · t · t

total reducing sugar content; supplementing organic and / or inorganic nitrogen sources; pH control; controlling foam levels; controlling the mass of the fermentation broth by draining and feeding; and controlling the dissolved oxygen level. The fermentation process is preferably carried out in a submerged culture of microorganisms and at a temperature of 24 to 30 ° C. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the microorganism is an Aspergillus strain. In another preferred embodiment of the present invention, the source of organic carbon is selected from the group consisting of glucose, hydrolysed starch and vegetable oil; the glucose content is kept below 0.2% from the 60 hour main fermentation step; the nitrogen source is selected from the group consisting of corn liquor and ammonium hydroxide; The pH is controlled at a value of 5.2 to 7.0, preferably 5.2 to 6.2 by carbon and / or base replenishment; the amount of foam is controlled by the addition of a foam level controlling agent, the fabric preferably being synthetic or a vegetable oil; and the dissolved oxygen level is preferably controlled by mixing and / or aeration of the fermentation broth. In another preferred embodiment of the present invention, the inoculum is transferred from the seed culture preparation step to the main fermentation step at a time when the pH in the seed culture step is increased after reaching its minimum value.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

The inventors have found that optimum biosynthesis of mevinoline can be accomplished by modifying one or more particular process, step and / or variation parameters in the seed culture preparation step or in the fermentation step or both of the biosynthesis process steps.

The inventors have found that during the preparation phase of the seed culture, these parameters, steps and / or variables include the delivery of the microorganisms with the necessary media components in an easily adaptable form and at the most appropriate concentration and at a prolonged culture time of about 10-25%.

The inventors have found that, in order to achieve stable conditions during the fermentation step, process parameters, process steps and / or process control variables include controlling glucose and / or total reducing sugars, conserving carbon sources at an appropriate minimum level, delivering organic and / or or inorganic nitrogen sources, pH control,. controlling the level of foam, controlling the mass of the broth by withdrawing or feeding and controlling the dissolved amount of oxygen by varying the stirring speed and / or aeration rate.

In order to optimize mevinoline biosynthesis, it is not necessary to modify each of the above process parameters, steps and / or variables for the seed culture preparation step or for the main fermentation step simultaneously. In a preferred embodiment of the present invention, the mevinoline biosynthesis will include all of the above process parameters, steps and / or changes. In this preferred embodiment, a metabolically controlled mevinoline fermentation process will be performed, wherein the stable conditions, i.e. at constant pH, glucose concentration, dissolved oxygen, viscosity, volume, and so forth, will achieve fast and stable conditions will be maintained for a long time, yielding a yield that far exceeds the results of known procedures.

Some advantages may be achieved in the step of preparing the seed culture by modifying one or more of the above process parameters, steps and / or variables in this step. These benefits include, for example, reducing the time required to achieve " stable " by increasing the number of growth and active biomass centers in a more favorable morphological form, with more favorable conditions for the cultivation of microorganisms. 7 7 • «· · · · · · · · T · · ···

• · · · · · · · · · · · · · · ·

* ♦ # »M As a result of these benefits and the extension of the cultivation time, the biomass concentration is almost doubled.

Certain advantages may be achieved in the main fermentation step by adjusting one or more process parameters, steps and / or variables in this step. These benefits include, for example, a faster and less volatile growth phase and a rapid steady state that can be maintained for a long time. These advantages result in significantly increased fermentation activity. In one embodiment, the present invention is directed to a fermentation process for the production of mevinoline with a strain belonging to the genus Aspergillus in a submerged culture, at a pH of 5.2 to 7.0, at a temperature of 24 to 30 ° C, in a medium containing a treatable. carbon and nitrogen sources and mineral salts, where a metabolically controlled process is used during the main fermentation phase, thereby; preserves culture in " stable " status. In this embodiment, the total reducing sugar content is preferably controlled. Preferably, an organic carbon source such as glucose, hydrolysed starch, and vegetable oil is added to the main fermentation source. Preferably, the glucose concentration is maintained less than 0.2% from the 60 hour fermentation. Nitrogen sources such as corn liquor and ammonium hydroxide solution are added during the process. The pH is preferably maintained between 5.2 and 6.2 by replenishing the carbon source and / or base such as ammonium hydroxide and / or sodium hydroxide. The amount of foam in the fermenter can also be controlled by adding vegetable oil, for example, sunflower oil and / or soybean oil and / or synthetic antifoam agents to the broth. The dissolved oxygen is preferably controlled by varying the mixing speed and / or aeration rate. One or more draining is performed during fermentation. • t ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ··· ·

In a preferred embodiment, the main culture medium is inoculated with a seed culture having the following composition:

Component Quantity (weight / volume) glucose 2-6 phosphoric acid 0.002-0.006 acid casein 0.2-0.8 corn steep liquor 1.5-5 sunflower oil 0.05-0.18 polypropylene glycol 0.05-0.18 pancreatin * 0.002-0.008 * quadruple activity according to Ph.Hv.VII.

The culture medium of the above composition is supplemented with commonly used micro- and macro-elemental salts, for example inorganic salts of sodium, potassium, magnesium and iron. The main culture medium is inoculated with a seed culture whose culture time is extended by 10-25%. At the stage of transfer of the inoculated culture, the pH is in the growth phase after reaching its minimum value.

Preferably, a strain of Aspergillus obscurus, a variant thereof or a mutant thereof, or more preferably a holotype strain of Aspergillus obscurus n. Sp. MV-1 deposited under the code number NCAIM (P) F 001189. The inoculum culture is inoculated into sterile main fermentation medium at a prolonged culture time at increasing pH after reaching its minimum value. In the main fermentation stage, they can be " stable " maintaining the maximum active ingredient production conditions over a longer period by supplying carbon and nitrogen sources to meet nutrient requirements; controlling glucose concentration to avoid undesirable thickening of the culture and enhancing biomass growth; agitation speed control and aeration rate according to oxygen demand; a combination of a suitable material meeting both the requirements for controlling the amount of foam and the requirements for the carbon source, II ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · - · For example, a blend of vegetable oil and synthetic oil. reagents; maintaining a pH between 5.2 and 6.2 by supplying a carbon source such as glucose syrup or base; and performing one or more draining when the maximum working volume of the fermenter is reached or when an economically sufficient concentration of mevinoline is achieved to perform the co-current process.

Using these elements, a multi-controllable fermentation process can be achieved which, depending on the life cycle, can provide good constant ambient conditions for the microorganism.

According to a preferred embodiment described above, the process of the present invention provides yields in excess of the yields of known processes, uses significantly less raw materials and energy, reduces the amount of environmental pollutant waste material per unit of active material and makes better use of the fermenter. In the following examples, the biosynthesis of mevinoline according to the method described in HU 208997 (Comparative Example 1) is compared with the method of the preferred embodiment of the present invention (Example 2). EXAMPLES OF THE INVENTION

Comparative Example 1

Mevinoline Biosynthesis According to HU 208997 In a 600 liter vessel, a seed culture medium is prepared with a medium of the following composition:

Component Quantity (%) Glucose 4.0 Casein Peptone 0.5 NaN03 0.3 «* ·· ·· • • · · 0.2 KC1 0.05 MgSO4 * 7H2O 0.05 FeSO4 * 7H2O 0.001 Inoculum inoculation is performed by germ cell suspension of Aspergillus obscurus strain with germ cell count of 6.5x10 9. The vaccine culture process parameters were as follows:

Parameter Value Volume 400 liters Temperature to O o O Aeration rate 20 normal n / h Internal pressure 50 kPa Stirring speed 320 rpm The transfer of the seed culture to the main fermentation medium is carried out according to the standard procedure at 36 hours when the pH is in phase growth of 5.6. The centrifugal volume of biomass cells (PCV) is 14%. The inoculum culture described above is inoculated into the main fermentation medium labeled MEF-03 at a 10% inoculation rate. The composition of the main fermentation medium is as follows:

Component Quantity (%) Dextrose Monohydrate 1.0 Acid Casein 0.2 Corn Starch 8 Soybean Meal 1/5 Corn Extract (50%) 1 Sodium Chloride 1 Potassium Dihydrogen Phosphate 0.2 Sodium Glutamate 1.2 Sunflower Oil 0.16 Polypropylene Glycol 0 , 16 11 11 · »· ·» · »· ♦ ♦ · • • • • • •

Pancreatin * 0.002 Enzyme BAN 240 0.007 Calcium Chloride 0.02 Potassium hydroxide for pH adjustment * Four-sided strength according to Ph.Hg.VII.

Volume at 0 hours: 500 liters.

The fermentation is carried out for 7 days. Aeration and mixing are as follows:

Aeration * Stirring speed * 18-25 normal m3 / h 180-320 rpm ♦ Dissolved oxygen is maintained above 40% saturation. During fermentation, 50 kg aliquots of enzymatically liquefied corn starch are added according to schedule at 50, 73, 90 and 108 hours.

Data for active ingredient production:

Fermentation time 164 hours. Activity measured by HPLC: 927 mg / kg. Broth amount: 580 kg. According to the data above, the amount of fermented active ingredient is 0.58 tons * 927 g / ton / 1000 / m 3 = 0.54 kg / m 3 of total volume. Example 2

Biosynthesis of mevinoline with glucose syrup and nitrogen source feed, and pH control with sodium hydroxide or ammonium hydroxide In a 6001 flask, a seed culture medium is prepared having the following composition:

Component% glucose 4.0 casein peptone 0.5 maize liquor (50%) 3.0

NaNO3. ; 0.3 KH 2 PO 4 0.2 t KCl 0.05 MgSO 4 * 7H 2 0.05 FeSO 4 * 7H 2 O 0.001 pancreatin * 0.005 polypropylene glycol 00.1 sunflower oil 0, 1 * 4 times the strength according to Ph.Hg.VII. The vaccination is carried out with a germ cell suspension of Aspergillus obscurus strain 6.5x10 9. The processing parameters of the seed culture are the same as for Comparative Example 1.

However, the transfer of the seed culture is carried out in a manner different from that described in Comparative Example 1. The transmission age is 40 hours · The pH has reached a minimum value (pH 4.9) and the transfer is carried out at the stage where pH has started to rise to about 5 , 0. Thus, the pH increased by about 0.1 relative to the minimum value. The centrifugal volume of biomass cells (PCV) is about 24%. The above-described seed culture is inoculated into the main fermentation medium at a 10% inoculation ratio. The composition of the fermentation medium is as follows:

Ingredient - Quantity (%) Cornstarch 8 Glucose Syrup * 1.0 Acid Casein 0.2 Soybean Meal 1.5 Corn Leach (50%) 1 Sodium Chloride 1 Potassium Dihydrogen Phosphate 0.2 Sodium Glutamate 1.2

sunflower oil f 0.16 propylene glycol 0.16 pancreatin ** 0.002 potassium hydroxide to adjust pH * 25 kg is added in the form of 2.5% glucose buffer * quadruple strength by Ph.Hg.VII.

The fermentation is carried out for 13 days. Aeration and stirring speed are as follows:

Aeration * Mixing Speed * min. 12, max. 32 normal m3 / h min. 220, max. 400 rpm * Dissolved oxygen is maintained at 40% saturation using a preferred aeration method. During fermentation, maintaining the degree of oxygen dissolution is very important. In its more intense stage, it can be achieved by using an aeration rate of 25 to 32 normal m 3 / h and a stirring rate of 300 to 400 rpm. During the main fermentation stage, the temperature is 27 ± 2 ° C, the internal pressure is 40 kPa and the cultivation time is 309 hours. The following nutrients are added during fermentation: 1. Hydrolysed corn starch (glucose syrup) is prepared by enzymatic treatment and treatment with hydrochloric acid and added. The raw materials used for the preparation of glucose syrup are as follows: 25% corn starch, 0.3 to 0.4 calcium chloride, 0.1 to 0.2 amylase enzyme (BAN) and 1% concentrated hydrochloric acid. The addition of glucose syrup is initiated at the pH growth stage, after reaching its minimum value (5.0) at 45 hours and at pH 5.6. The addition is carried out continuously, the pH is kept within

5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 5 · 9 · The minimum addition rate is 0.5 liters / hour and the maximum addition rate is 5 liters / hour. 2. The pH is controlled by the addition of sodium hydroxide and ammonium hydroxide when the pH drops below 5.5, in addition the rate of addition of glucose syrup is reduced to a minimum. 3. The corn liquor (1%) is added at 100 hours fermentation age (relative to the 0 hour volume). Data for active ingredient production:

Fermentation time: 309 hours. Activity measured by HPLC: 2868-m9 / k9 · Broth amount: 680 kg. According to the data above, the amount of fermented active ingredient is 0.68 tons * 286.8 g / tons / 1000 m3 / l = 1.95 kg / m 3 of total volume. Example 3

Biosynthesis of mevinoline with addition, control and removal

The Holotype strain of Aspergillus obscurus n. Sp. MV-1 is cultured in sterile inoculum medium of the following composition:

Ingredient% glucose 4.0 acid-phosphorous 0.0035 acid casein 0.5 corn extract (50%) 3.0 NaNO3 0.3 KH2PO4 0.2 KCl 0.05 MgSO4 * 7H2 0.05 FeS04 * 7H20 0.001 sunflower oil 0.1 polypropylene glycol 0.1 • · • ·

··· ·· «

pancreatin *. 0.005 potassium hydroxide to adjust the pH of hydrochloric acid to adjust the pH

Silný four times strong by Ph.Hg.VII The following parameters were used during the seed step:

Parameter Value Volume 8 m3 Stirring speed 120 rpm Aeration 400 ± 50 normal m3 / h Internal pressure 40 ± 10 kPa Temperature 27 ± 2 ° C

The inoculum is transferred after the pH has reached a minimum (pH 4.8) and when the pH is greater than the minimum value > ta, ie. when the pH reaches 4.9. The centrifugal volume of cellular biomass (PCV) is 24%. At a transfer rate of 8%, the above inoculum is transferred to a main fermentation medium having the following composition:

Ingredient Quantity (%) Soybean Meal 1.28-1.57 Total Corn or Wheat Starch 9 Acid Porridge 0.20 Corn Extract (50%) 0.857-1.14 Sodium Chloride 1.0 Potassium Dihydrogen Phosphate 0.2 Sodium Glutamate 1 14—1,20 calcium chloride, 3,8x103 BAN enzyme 2,2x1O3 sunflower oil 0,10 polypropylene glycol 0,10 pancreatin * 2,0x10 3 ~ potassium hydroxide hydrochloric or acid

for pH adjustment

* four times the strength of Ph.Hg.VII The following parameters were used during the main fermentation stage:

Parameter Value Internal pressure 20 + 5 kPa Temperature 27 ± 2 ° C Stirring speed 60-85 revolutions per minute Aeration rate 1000 ± 4000 normal m1 / h At 1 mg available: Carbon source: About 40 tons of hydrolysed starch degraded to a large extent until glucose (glucose syrup) is formed in 25% form which is fed continuously. The raw materials used for the preparation of glucose syrup are as follows: 25% corn or wheat starch, 0.3% calcium chloride, 0.3% BAN 240 enzyme and about 2% hydrochloric acid. 2. Nitrogen source: Corn leachate (50%) at 1% relative to the fermentation volume at 0 hour in 5 ml sterile volume is used. 1 pH Control Base. A non-sterilized 25-30% solution of sodium hydroxide and ammonium hydroxide was used to control pH. Addition: 1. Glucose Syrup: Addition is initiated in about 50 hours at the pH growth stage, after reaching the first minimum value. Glucose syrup is added to control the pH in the range of 5.4 to 5.8. The addition of glucose is carried out by means of a dosing method or continuously. Glucose Syrup with 17 • · · < • 0 0 09 0 0 0 0 * ···· 9 0 090 9 0 990 900 09 09 is added at a rate in the range of 0 to 1000 kg / h, preferably at a rate of 150 to 500 kg / h. If it is not possible to maintain a minimum pH even at the minimum glucose addition rate, it is necessary to add a base to control pH. 2. Corn Extract: The corn extract is added in one dose in about 100 hours. If necessary, an additional dose may be added. 3. Sodium hydroxide or ammonium hydroxide: To control the pH, the bases are added when the pH drops after 5.5 L at minimum glucose syrup addition rate.

The amount of foam is controlled by adding a 95: 5 mixture of sunflower oil: PPG so that the amount of foam does not exceed 25% of the working volume of the fermenter.

Extraction from the fermenter was performed at the age of 112, 13, 8, 178, 204 hours by removing 4 m3 of broth four times. Data for active ingredient production:

Fermentation time: 226 hours. Activity measured by HPLC (parent): 1825 mg / kg. Harvested Activity (with collection): 1788 mg / kg. According to the data above, the amount of fermented active ingredient is 95 tonnes * 1788 g / ton / 1000/105 m3 total volume.

Claims (50)

18 618 6 ·· ··· ·♦* *· f\] n ηΐ'Ψ\ NÁROKY PA TENTOV É 1. Způsob fermentace při výrobě mevinolinu vyznačuj í -c í se tím; že se provede pomocí kmene rodu Aspergil-lus v ponořené kultuře, při pH 5,2 až 7,0, při teplotě 24 až 30 °C, v médiu obsahujícím upravitelné zdroje uhlíku a dusíku a minerální soli, kdy se v hlavní fermentační fázi použije metabolicky kontrolovaný způsob za účelem zachování kultury ve „stabilním" stavu.PA TENT REQUIREMENTS 1. A fermentation process in the production of mevinoline, characterized in that it is characterized by: a. that it is carried out using a strain of Aspergillus in a submerged culture, at a pH of 5,2 to 7,0, at a temperature of 24 to 30 ° C, in a medium containing editable sources of carbon and nitrogen and mineral salts, using in the main fermentation phase a metabolically controlled method to maintain the culture in " stable " status. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačují cí še tím, že se během hlavní fermentační fáze. kontroluje obsah redukujícího cukru.2. A process according to claim 1, characterized in that it is during the main fermentation phase. controls the content of reducing sugar. 3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se t í m , že se během hlavní fáze fermentace přidává organický zdroj dusíku.3. The process of claim 1 wherein an organic nitrogen source is added during the main fermentation phase. 4. Způsob podle nároku 3 v y z n a č u j í c í se tím, že se jako zdroj uhlíku přidává glukóza.4. A process according to claim 3 wherein the carbon source is glucose. 5. Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, že se' obsah glukózy kontroluje přidáváním od věku 60 hodin do konce fermentace pod 0,2 %.5. A method according to claim 4, wherein the glucose content is controlled by adding from about 60 hours to less than 0.2% by the end of the fermentation. 6. Způsob podle nároku 3 v y z na č u j í c í se tím, že se jako zdroj uhlíku přidává hydrolyzovaný škrob a/nebo rostlinný olej.6. A process as claimed in claim 3, wherein hydrolysed starch and / or vegetable oil is added as the carbon source. 7. Způsob podle nároku 1- vyznačující se tím, že se během hlavní fermentační fáze přidává zdroj dusíku.7. A process according to claim 1, wherein a nitrogen source is added during the main fermentation phase. 8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že se jako zdroj dusíků přidá kukuřičný výluh a/nebo hydroxid amonný. t· · • • · • · * 9 . · ··· * • • A • ··· * * • · · « · ♦ · · · • * ♦ · i • · ·ι· ··· • · · • · * ·« · ·A process according to claim 7, characterized in that corn extract and / or ammonium hydroxide is added as the nitrogen source. 9 ·. · · * • · · · * i i i i i i i i i i i i i i i i 9. Způsob podle nároku 1 v y z n, a Č^ u jící se tím, že se během hlavní fermentační fáze kontroluje pH na hodnotě mezi 5,2 až 6,2.9. The process of claim 1 wherein the pH of the main fermentation phase is between 5.2 and 6.2. 10. Způsob podle nároku 9 v y z. naču.j í c í se tím, že se kontrola pH provádí pomocí přidání zdroje uhlíku a/nebo báze.10. A method according to claim 9, wherein the pH control is performed by adding a carbon source and / or a base. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že se jako přidávaná báze použije hydroxid amonný a/nebo hydroxid alkalického kovu.11. A process according to claim 10, wherein the added base is ammonium hydroxide and / or an alkali metal hydroxide. 12. Způsob podle nároku 1- vyznačující· se tí m ., že se ve fermentéru kontroluje pěna.12. The method of claim 1 wherein foam is controlled in the fermenter. 13. Způsob podle nároku 12 vyznačující setím, že se pěna kontroluje pomocí rostlinného oleje a syntetického Činidla.13. The method of claim 12, wherein the foam is controlled with vegetable oil and synthetic agent. 14 .Způsob podle nároku 12 vyznačuj í cí se tím, že· rostlinným olejem je slunečnicový olej a/nebo sójový olej .14. A method according to claim 12 wherein the vegetable oil is sunflower oil and / or soybean oil. 15. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že se podle množství rozpuštěného kyslíku kontroluje rychlost míchání a/nebo rychlost aerace.15. A method according to claim 1, wherein the mixing rate and / or aeration rate is controlled according to the amount of dissolved oxygen. 16. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že se během hlavní fáze fermentace provedou částečné odběry kultury.16. The method of claim 1 wherein partial culture sampling is performed during the main fermentation phase. 17. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že se inokulace hlavní fermentační fáze provede pomocí kultury i mikroorganismů Aspergillus kultivované v následujícím médiu pro očkovací kulturu: glukóza 2-6 % hmot./objem kyselina fosforečná 0,002-0,006 % hmot./objem 20 • «« • • »· -'i ♦ ♦ · · · • · 4 · • · ♦ · ♦ · · » • ♦ • · « · * · · • • • «4« • * · 1 fr • • • • • M · * ·»» * · · f · ♦ « 0,,2-0,8 % hmot./objem 1,5-5% hmot./objem 0,05-0,18% hmot./objem 0,05-0,18% hmot./objem 0,002-0,008% hmot./objem kyselý kasein kukuřičný výluh 50 % slunečnicový olej polypropylenglyko.l pankreatin, čtyřnásobná aktivita podle Ph.Hg.VII doplněném vodou a běžně používanými mikro- a makroelementár-ními solemi (například anorganické soli sodíku, draslíku, hořčíku a železa).17. The method of claim 1, wherein inoculating the main fermentation phase is performed using Aspergillus cultures and cultures grown in the following seed culture medium: glucose 2-6% w / v phosphoric acid 0.002-0.006% w / v 20 «I · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr fr • M · * · »· · · · · · 0, 2-0.8% w / v 1.5-5% w / v 0.05-0.18% w / v 0 , 05-0.18% w / v 0.002-0.008% w / v acidic casein maize extract 50% sunflower oil polypropylene glycol pancreatin, quadruple activity according to Ph.Hg.VII supplemented with water and commonly used micro- and macroelementary salts (e.g., inorganic salts of sodium, potassium, magnesium and iron). 18. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že se přenos očkovací kultury do hlavní fermentace provede za použití 10 až 25% prodloužení kultivačního času vzhledem k.normálnímu času a/nebo ve fázi rostoucího pH po dosažení jeho minimálhí hodnoty.18. The method of claim 1 wherein transferring the seed culture to the main fermentation is performed using a 10 to 25% increase in culture time relative to normal time and / or increasing pH after reaching a minimum value. 19. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že použitým mikrooganismem je kmen Aspergillus, jeho varianta nebo jeho mutant. >19. The method of claim 1 wherein the microoganism used is an Aspergillus strain, a variant thereof, or a mutant thereof. > 20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že mikroorganismem použitým při fermentaci je holotypový kmen Aspergillus obscurus MV-1 uložený pod kódovým číslem NCAIM(P)F 001189.20. The method of claim 19 wherein the microorganism used in the fermentation is the Aspergillus obscurus MV-1 holotype strain deposited under code number NCAIM (P) F 001189. 21. Způsob přípravy mevinolinu pomocí mikroorganismu při procesu fermentace zahrnujícím.krok přípravy očkovací kultury a hlavní fe,rmentační krok, kdý se tento způsob vyzná -čuje tím, že zahrnuje: a) kultivaci biomasy mikroorganismu ve jmenované kroku přípravy očkovací kultury za vzniku inokula; b) převedení jmenovaného inokula do fermentačního média ve jmenovaném hlavním fermentačním kroku; •srs rc·21. A method of preparing a mevinoline by a microorganism in a fermentation process comprising the step of preparing a seed culture and a main fermentation step comprising: (a) culturing the microorganism biomass in said seed culture step to form an inoculum; b) converting said inoculum into a fermentation medium in said main fermentation step; • srs rc · ♦ ·· ·# 21 ·· »· * · · I « ψ · · tl» ·»· • · • · «* c) zachování stabilních podmínek při jmenovaném fermentačním kroku za vzniku fermentačního bujónu obsahujícího mevino-lin.C) maintaining the stable conditions in said fermentation step to form a fermentation broth containing mevinoline. \ T 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že stabilní podmínky se v hlavním fermentačním stupni udržují pomocí přivádění jednoho nebo více zdrojů organického uhlíku; kontroly glukózy a/nebo celkového obsahu redukujícího cukru; přivádění organického a/nebo anorganického zdroje dusíku; kontroly pH; kontroly množství pěny; kontroly hmoty ve fermentačním bujónu pomocí odvádění a dopl- -ňování; a kontroly množství rozpuštěného kyslíku.The method of claim 21, wherein the stable conditions are maintained in the main fermentation stage by means of feeding one or more organic carbon sources; glucose control and / or total reducing sugar content; supplying an organic and / or inorganic nitrogen source; pH controls; controlling the amount of foam; controlling the mass in the fermentation broth by draining and refilling; and controlling the amount of dissolved oxygen. 23. Způsob podle nároku 22 vyzná c u j í c í se tím, že se stabilní podmínky v hlavním fermentačním stupni udržují pomocí kontroly glukózy a/nebo celkového obsahu redukujícího cukru.23. The method of claim 22 wherein the stable conditions in the main fermentation stage are maintained by controlling glucose and / or total reducing sugar. 24.. Způsob, podle nároku 22 vy z načující se tím, že se stabilní podmínky v hlavním fermentačním stupni udržují pomocí doplňování organického a/nebo anorganického zdroje dusíku.24. The method of claim 22 wherein the stable conditions in the main fermentation stage are maintained by replenishing the organic and / or inorganic nitrogen source. 25. Způsob podle nároku 22 vyznačující se t. í m , že se stabilní podmínky v hlavním fermentačním stupni udržují pomocí doplňování organického zdroje uhlíku.25. The process of claim 22, wherein the stable conditions in the main fermentation stage are maintained by replenishing the organic carbon source. 26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že se jmenovaný organický zdroj uhlíku vybere ze skupiny, kterou tvoří glukóza, hydrolyzovaný škrob a rostlinný olej.26. The method of claim 25 wherein said organic carbon source is selected from the group consisting of glucose, hydrolyzed starch, and vegetable oil. 27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že zdrojem, organického uhlíku je glukóza.27. The method of claim 26 wherein the organic carbon source is glucose. 28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že se obsah glukózy udržuje pod 0,2 % od šedesáté hodiny hlavního fermentačního stupně. 888385«! i 22 ♦ * ·· ♦· • · <* · * · t * 9 9 * · ♦ · • M ** « * · t«* t»f • . · Ψ · #*· »«» .·· ♦·28. The method of claim 27, wherein the glucose content is maintained below 0.2% from the 60 hour main fermentation stage. 888385 «! i 22 ♦ * ·· ♦ · lt · lt lt lt lt lt lt ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** **. · Ψ · # * · 29. Způsob podle nároku 24 v y z n ,a č u j £ c í se tím, že zdroje dusíku jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří kukuřičný výluh a hydroxid amonný.29. A process according to claim 24 wherein the nitrogen sources are selected from the group consisting of corn liquor and ammonium hydroxide. 30. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že se stabilní podmínky v hlavním fermentačním stupni zachovávají pomocí kontroly pH.30. The method of claim 22, wherein the stable conditions in the main fermentation stage are maintained by pH control. 31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že se pH udržuje v rozmezí 5,2 až 7,0.31. The method of claim 30 wherein the pH is maintained in the range of 5.2 to 7.0. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že se pH udržuje v rozmezí 5,2 až 6,2.32. The process of claim 31 wherein the pH is maintained in the range of 5.2 to 6.2. 33. Způsob podle nároku 30 vyznačuj ící se tím, že se pH kontroluje přiváděním zdrojů uhlíku a/nebo báze.33. The method of claim 30, wherein the pH is controlled by feeding carbon sources and / or base. 34. .Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že jmenovaná báze je vybraná ze skupiny, kterou tvoří hydroxid amonný a hydroxid alkalického kovu.34. The method of claim 33, wherein said base is selected from the group consisting of ammonium hydroxide and an alkali metal hydroxide. 35. Způsob podle nároku 22 v y z n a č u j £ c í s e tím, že se stabilní podmínky v hlavním fermentačním stupni" zachovávají pomocí kontroly množství pěny.·35. The method of claim 22, wherein the conditions in the main fermentation stage are stable. maintain the amount of foam by checking. 36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že množství pěny kontroluje přidáním látky kontrolující množství pěny.36. The method of claim 35 wherein the amount of foam is controlled by the addition of a foam controlling agent. 37. Způsob podle nároku 36 v y z n a č u j í c í' s e tím, že látkou kontrolující množství pěny je syntetická látka.37. The method of claim 36, wherein the foam controlling agent is a synthetic substance. 38. Způsob podle nároku 36 v y z n a č u j i c í se tím, že látkou kontrolující množství pěny je rostlinný olej.38. The method of claim 36 wherein the foam controlling agent is a vegetable oil. 39. Způsob podle nároku 38 vyznačující se tím, že rostlinný olej je vybrán ze skupiny, kterou tvoří slunečnicový olej a/nebo sójový olej. - 23 23 f· · ♦ ♦39. The method of claim 38 wherein the vegetable oil is selected from the group consisting of sunflower oil and / or soybean oil. - 23 23 f · · ♦ ♦ #· · · ·· ·· • «· 4 0 0 0 4 0 4 0 4 4 4 0 0 • 0 44 4 « * 0 404 440 0 0-0 0 0 0 000 04 00· »04 04 04# · 4 0 0 0 4 0 4 0 4 4 4 0 0 • 0 44 4 «* 0 404 440 0 0-0 0 0 0 000 04 00 ·» 04 04 04 40. Způsob podle nároku 22 vy z n a č u jící se tím, že se stabilní podmínky v hlavním fermentačním stupni zachovávají pomocí kontroly množství rozpuštěného kyslíku.40. The method of claim 22 wherein stable conditions in the main fermentation stage are maintained by controlling the amount of dissolved oxygen. 41. Způsob podle nároku 40 vyznačující se tím, že se množství rozpuštěného kyslíku kontroluje pomocí míchání a/nebo aerace fermentačního bujónu.41. The method of claim 40, wherein the amount of dissolved oxygen is controlled by mixing and / or aerating the fermentation broth. 42. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že dále zahrnuje periodické odebírání množství fermentačního bujónu během hlavního fermentačního stupně..42. The method of claim 21, further comprising periodically withdrawing the amount of fermentation broth during the main fermentation stage. 43. Způsob podle nároku 21 vy z n a ču j í c í se tím, že se proces fermentace provádí v ponořené kultuře mikroorganismů .43. The process of claim 21 wherein the fermentation process is carried out in a submerged culture of microorganisms. 44. Způsob podle nároku 21 vyznačuj í c í se tím, že se proces fermentace provádí při teplotě 24 až 30 °C.44. The process of claim 21 wherein the fermentation process is carried out at a temperature of 24 to 30 ° C. 45. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že se inokulum převede ze stupně přípravy očkovací do hlavního fermentačního stupně, když pH ve stupni přípravy očkovací kultury roste po dosažení své minimální hodnoty.45. The method of claim 21, wherein the inoculum is transferred from the seed preparation stage to the main fermentation stage when the pH in the seed culture preparation step rises to its minimum value. 46. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že jmenovaným mikroorganismem je druh Aspergillus.46. The method of claim 21 wherein said microorganism is Aspergillus. 47. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že jmenovaným mikroorganismem je kmen Aspergillus obscurus nebo jeho varianta nebo mutant.47. The method of claim 46 wherein said microorganism is an Aspergillus obscurus strain or a variant or mutant thereof. 48. Způsob podle nároku 47 v y z n a č u j í c í se tím, že jmenovaným mikroorganismem je holotypový kmen Aspérgillus obscurus n. sp. MV-1 uložený pod kódovým číslem NCAIM(P)F 001189.48. The method of claim 47, wherein said microorganism is a holotype strain of Aspergillus obscurus n. Sp. MV-1 stored under code number NCAIM (P) F 001189. 49. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že během-stupně přípravy očkovací kultury se biomasa mikro-49. The method of claim 46, wherein, during the step of preparing the seed culture, the micro- * ·« ·· ·· · « » « • · · · i t 9 · · · **·' # · «Μ « · ·** · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · * * • *· * φ-φ * φ «· • · · · • ··* * · • · * • •9 «· *t 24 organismů kultivuje v médiu obsahujícím 2 až 6 % hmotn./obj. glukózy, 0,002 až 0,006 % hmotn./obj. kyseliny fosforečné, 0,2 až 0,8 % hmotn./obj. kyselého kaseinu, 1,5 až 5 % hmotn./obj. kukuřičného výluhu (50 %), 0,05 až 0,18 % hmotn./obj., slunečnicového oleje, 0,05 až 0,18 % hmotn./obj. polypropylenglykolu, 0,002 až 0,008 % hmotn./obj. pankrea-tinu (čtyřnásobná aktivita podle Ph.Hg.VII.), vodu a mikro-a makroelementární soli.The organisms are cultured in a medium containing 2 to 6% w / v. glucose, 0.002 to 0.006% w / v. phosphoric acid, 0.2-0.8% w / v. acid casein, 1.5 to 5% w / v. corn liquor (50%), 0.05 to 0.18% w / v, sunflower oil, 0.05 to 0.18% w / v. polypropylene glycol, 0.002 to 0.008% w / v; pancreatin (quadruple activity according to Ph.Hg.VII.), water and micro- and macro-elemental salts. 50. Způsob podle nároku 49 v y z n a č u j £ c í se tím, že jmenované mikro- a makroelementární soli jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří soli sodíku, draslíku, hořčíku . a železa a jejich směsi.50. The method of claim 49 wherein said micro- and macro-elemental salts are selected from the group consisting of sodium, potassium, magnesium salts. and iron and mixtures thereof.
CZ0412199A 1998-03-20 1999-03-19 Metabolically controlled fermentation process when preparing lovastatin hydroxy acid CZ300153B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9800619A HU226966B1 (en) 1998-03-20 1998-03-20 Fermentation process

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ412199A3 true CZ412199A3 (en) 2000-02-16
CZ300153B6 CZ300153B6 (en) 2009-02-25

Family

ID=89996304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0412199A CZ300153B6 (en) 1998-03-20 1999-03-19 Metabolically controlled fermentation process when preparing lovastatin hydroxy acid

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6500651B1 (en)
JP (1) JP2001527424A (en)
AU (1) AU753564B2 (en)
CA (1) CA2289553C (en)
CZ (1) CZ300153B6 (en)
IL (1) IL132822A0 (en)
NZ (1) NZ500870A (en)
UA (1) UA73074C2 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080064076A1 (en) * 2006-09-11 2008-03-13 Saucedo Victor M Dissolved Oxygen Profile to Increase Fermentation Productivity and Economics
US20130005010A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Peter Simpson Bell Bioreactor for syngas fermentation

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5925599B2 (en) 1979-02-20 1984-06-19 三共株式会社 New physiologically active substance monacolin K and its production method
US4294926A (en) 1979-06-15 1981-10-13 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4319039A (en) 1979-06-15 1982-03-09 Merck & Co., Inc. Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product
US4294846A (en) 1979-09-21 1981-10-13 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and products of preparation
US4342767A (en) 1980-01-23 1982-08-03 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products
US4420491A (en) 1980-05-28 1983-12-13 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US5316776A (en) 1984-01-31 1994-05-31 Arnott's Biscuits Limited Fermentation method
US4945048A (en) 1987-05-23 1990-07-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing L-sorbose by subculture of seed
NZ245713A (en) * 1992-02-10 1994-12-22 Novopharm Ltd Production of the antibiotic lovastatin from genetically engineered aspergillus strains
HU208997B (en) * 1992-06-17 1994-02-28 Gyogyszerkutato Intezet Microbiological method for producing mevinoline
SI9300047A (en) 1993-01-29 1994-09-30 Krka Microbiological method for preparation of lovostatin and/or mevinoline acid
US5494808A (en) 1994-09-15 1996-02-27 Merck & Co., Inc. Defined medium OMPC fermentation process
SI9500238A (en) * 1995-07-27 1997-02-28 Krka Tovarna Zdravil Procedure for the production of lovastatin
HU226966B1 (en) * 1998-03-20 2010-03-29 Teva Gyogyszergyar Zartkoeruee Fermentation process

Also Published As

Publication number Publication date
CA2289553C (en) 2004-05-18
NZ500870A (en) 2002-03-01
US6500651B1 (en) 2002-12-31
UA73074C2 (en) 2005-06-15
IL132822A0 (en) 2001-03-19
CA2289553A1 (en) 1999-09-30
AU3046699A (en) 1999-10-18
JP2001527424A (en) 2001-12-25
AU753564B2 (en) 2002-10-24
CZ300153B6 (en) 2009-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Novak et al. Increased lovastatin formation by Aspergillus terreus using repeated fed-batch process
EP2084290B1 (en) Production of omega-3 fatty acids in microflora of thraustochytriales using modified media
AU762656B2 (en) Method of producing gamma-decalactone
CA2719581C (en) Improved fermentation process for higher yield coefficient of lipase-inhibitor with respect to consumed fatty acid
Jia et al. Effects of carbon sources on fungal morphology and lovastatin biosynthesis by submerged cultivation of Aspergillus terreus
US20080318289A1 (en) Fermentation Processes for the Preparation of Tacrolimus
CZ412199A3 (en) Metabolically controlled fermentation process when preparing lovastatin hydroxy acid
US6165757A (en) Nitrogen feed in statin fermentation
US6197560B1 (en) Metabolic controlled fermentation procedure for the manufacture of lovastatin hydroxy acid
Cheng et al. Improved riboflavin production by Eremothecium ashbyii using glucose and yeast extract
KR20040026669A (en) Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production
RU2096461C1 (en) Yeast strain yarrowia lipolytica - producer of citric acid and method of citric acid production
CN110468051A (en) A kind of K252A fermentation medium and preparation method thereof
Thitiprasert et al. Correlative effect of dissolved oxygen and key enzyme inhibitors responsible for L-lactate production by immobilized Rhizopus oryzae NRRL395 cultivated in a static bed bioreactor
WO2004003212A1 (en) Novel process for the production of pancreatic lipase inhibitor
SK702019A3 (en) Preparation of pharmaceutically active substance lipstatin using production microorganism Streptomyces toxytricini NRL
KR910000453B1 (en) Novel microorganism streptomyces sp kccb2
RU2426793C2 (en) Method of cephalosporin c biosynthesis with using new acremonium chrysogenum strain, rncm no f-4081d
WO2004005275A1 (en) Fed batch solid state fermentation for the production of hmg-coa reductase inhibitors
WO2004087935A2 (en) Fermentation process for the preparation of pravastatin
JPH0690772A (en) Preparation of optically active gamma- hydroxydecanoic acid
SK278555B6 (en) Method of producing l-lactic acid

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130319