JP2001527424A

JP2001527424A - Metabolic control fermentation procedure for producing lovastatin hydroxy acid

Info

Publication number: JP2001527424A
Application number: JP54797099A
Authority: JP
Inventors: シェレシュ，ペーテル; バログフ，ガーボル; オラーハ，アンタル; チェーケ，ラースロー
Original assignee: ビオガル・ジョージィセルジャール・エル・テー
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2001-12-25
Also published as: CA2289553C; AU753564B2; NZ500870A; CA2289553A1; AU3046699A; UA73074C2; CZ300153B6; US6500651B1; IL132822A0; CZ412199A3

Abstract

(57)【要約】種培養段階および主発酵段階を有する発酵プロセスにおいて微生物によってメビノリンを生産する方法であって、ａ）種培養段階において、微生物を培養して播種物を生産し；ｂ）主発酵段階において、播種物を発酵培地へ継代し；次いでｃ）主発酵段階において定常状態条件を維持することによってメビノリンを含む発酵ブロスを生産すること、を特徴とする方法。１種または２種以上の有機炭素源を供給すること；グルコースおよび／または総還元糖含量をコントロールすること；有機および／または無機窒素源を供給すること；ｐＨをコントロールすること；泡レベルをコントロールすること；回収することおよび供給することによってブロスの量をコントロールすること；および溶存酸素濃度をコントロールすることによって、定常状態条件が主発酵段階において維持されるのが好ましい。 (57) [Summary] A method for producing mevinolin by a microorganism in a fermentation process having a seed culture stage and a main fermentation stage, the method comprising: a) culturing the microorganism to produce a seed in the seed culture stage; To a fermentation medium; and c) producing a fermentation broth comprising mevinolin by maintaining steady state conditions in the main fermentation stage. Providing one or more organic carbon sources; controlling glucose and / or total reducing sugar content; supplying organic and / or inorganic nitrogen sources; controlling pH; controlling foam levels Preferably, steady state conditions are maintained in the main fermentation stage by controlling the amount of broth by collecting and feeding; and by controlling the dissolved oxygen concentration.

Description

【発明の詳細な説明】ロバスタチンヒドロキシ酸を製造するための代謝コントロール発酵操作技術分野本発明は、一般に、コレステロール降下薬の生合成に関する。さらに詳しくは、本発明は、特定の微生物によるコレステロール低下薬メビノリンの生合成に関する。背景技術メビノリン（ロバスタチン、モナコリンＫ；β,δ−ジヒドロキシ−７−［１, ２,６,７,８,８ａ−ヘキサヒドロ−２,６−ジメチル−８−（２−メチル−ブチリルオキシ）ナフタレン−１−イル］ヘプタン酸δ−ラクトン）は、最も重要な公知のコレステロール低下薬のひとつである。本明細書で用いる語句メビノリンは、ラクトンとヒドロキシ酸の両方の形体を意味する。その開環ヒドロキシ酸体は、コレステロール生合成の初期中間体であるメバロン酸の形成を触媒する、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａの強力なインヒビターである。メビノリンは、その適用の結果として、生合成の後期段階で形成される毒性ステロイド骨格をもつ生合成中間体が蓄積できなくなるので、特に有益である。メビノリンは、血液中を循環しているＬＤＬコレステロールを除去する、細胞膜表面にあるＬＤＬ−レセプターの数を増加し、それによって血漿中コレステロール濃度を低下させる。通例、有効成分は、発酵を介して生産される。ＧＢ２０４６７３７には、たとえば、モナスカス・ルーバー（Monascus ruber）を７から４０℃の間で培養するなど、モナスカス属に属するいくつかの菌株によって有効成分を生産しうることが開示されている。培養培地として、グルコース、ペプトン、トウモロコシ浸漬汁および塩化アンモニウムの水溶液が用いられた。好気性条件下で１０日間発酵を行い、５リットルのブロスの濾液から８７ｍｇのメビノリンが得られた。米国特許第４２９４９２６号には、好ましくは、アスペルギルス・テレウス(A spergillus terreus）属に属する受託番号ＡＴＣＣ２０５４１または２０５４２の微生物を、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトースなどの炭水化物、窒素源として酵母、加水分解酵母、加水分解カゼイン、トウモロコシ浸漬汁など、および炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、コバルト，鉄，マンガンの塩などのミネラル塩を含有する培養培地に２０〜３７℃で適用することによるメビノリンの生合成が開示されている。同様の操作が米国特許第４４２０４９１号、第４３４２７６７号、第４３１９０３９号および第４２９４８４６号に記載されており、これらにおいては、１〜６％の炭水化物および０．２〜６％の窒素源を含有する培地にて３〜５日間発酵が行なわれている。ドイツ特許第４４０２５９１号には、Pleurotus ostreatus、P.sapidus、P.sa caなどのヒラタケ（Pleurotus）属に属する微生物を表面または浸漬培養にて２５〜３５℃で７〜４日間培養することによるメビノリンの生合成が開示されている。カナダ特許第２１２９４１６号には、コニオシリウム（Coniothyrium）属に属する受託番号コニオシリウム・フッケリ（fuckelii）ＡＴＣＣ７４２７７の微生物を、３〜１５％のグルコース、０．５〜４％のペプトン、０．５〜５％のアミラーゼ、０．２〜１％の硫酸アンモニウム、０．０１〜０．１％の硫酸マグネシウム、０．０５〜０．２％の抗泡剤、０．２〜１．５％のＬ−イソロイシン、０．２〜１．５％のＬ−アスパラギン酸を含有するｐＨ５〜６の培養培地で培養することによるメビノリンの製造、もしくは特異的ケースとしてメバスタチンの製造が開示されている。実施例では、ブロスの有効成分濃度は１９〜４３０ｍｇ／Ｌであった。ハンガリー特許ＨＵ２０８９９７には、受託番号ＮＣＡＩＭ(Ｐ)Ｆ００１１８９で寄託されたＭＶ−１と称するアスペルギルス・オブスクルス（Aspergillus obscurus）の正基準標本菌株が開示されている。発酵は、窒素源として酵母抽出物および／またはペプトンおよび／またはカゼイン、炭素源としてグルコースおよび／またはマルトースまたはスクロースを含有する培地で行うのが好ましい。実験室スケールの培養の終了時におけるブロスの活性は４００〜８５０ｍｇ／Ｌである。これまでの議論では、発酵操作それ自体の進歩というよりもむしろ新しいメビノリン産生微生物の発見に集中したメビノリン生合成を進歩させる研究がなされている。いくつかの参考文献には、慣例かつ公知の培地にて表面および固相培養の両方の適用にて発酵を行い得ることが開示されている。バッチ式の操作が適用され、操作の行動様式は、開始条件に依存したものであった。しかし、最も便利な濃度に成分を維持すること、最適溶存酸素の供給およびｐＨといったような技術的制限により、継続的補正作用を実行することは難しい。主発酵段階にある微生物は、その代謝に応じて、最適成長および有効成分の産生を得るために、異なる条件／培地の組成を要求する。本発明者らは、彼らの実験から、種培養中および主発酵の開始時において、活性バイオマスは非常に少なく、かつ変化しやすいものであるという結論に達した。したがって、発酵の収量は、相対的に低く、変化しやすいものである。発酵の終了時の収量、すなわちメビノリン濃度は、もちろん菌株の種類によって異なるが、８５０ｍｇ／Ｌを越えなかった。本発明者らは、種培養段階から発酵の終了までの全発酵操作について詳細な分析を行った。種培養調製段階においては、公知の培地および達成プロセスの両方の場合に、バイオマスは非常に少ないことがわかった。したがって、主発酵中、微生物および培養物の代謝は満たされていない。発明の目的したがって、本発明の目的は、発酵条件を変えて発酵を実行することで微生物の能力を強化することによってメビノリン生産発酵操作の効率を改善することである。本発明の他の目的は、種段階および主発酵段階のいずれかまたは両方において、微生物の代謝にとって最も都合のよい化学的および生理的条件を提供することである。本発明のさらに他の目的は、種段階および主発酵段階のいずれかまたは両方において、成長速度を、次いで、延長された時間、最大の生成物形成速度を定常状態の条件に維持することによつて、微生物の代謝にとって最も都合のよい化学的および生理的条件を提供することである。発明の要約これらの本発明の目的およびその他の目的は、種培養段階および主発酵段階を有する発酵プロセスにおいて微生物によるメビノリンの生産方法を提供することによって、本発明のひとつの具体例において達成されるものであり、該方法は、ａ）種培養段階において、微生物を培養して播種物を生産し；ｂ）主発酵段階において、播種物を発酵培地へ継代し；次いでｃ）主発酵段階において定常状態条件を維持することによってメビノリンを含む発酵ブロスを生産することを特徴とする方法である。本発明の好ましい具体例において、１種または２種以上の有機炭素源を供給すること；グルコースおよび／または総還元糖含量をコントロールすること；有機および／または無機窒素源を供給すること；ｐＨをコントロールすること；泡レベルをコントロールすること；回収することおよび供給することによってブロスの量をコントロールすること；および溶存酸素濃度をコントロールすることによって、定常状態条件は主発酵段階において維持される。約２４℃〜３０℃の温度範囲で、微生物の浸漬培養において発酵段階を行うのが好ましい。本発明の特に好ましい具体例において、微生物はアスペルギルス属である。本発明のさらに他の好ましい具体例において、有機炭素源は、グルコース、デンプン加水分解物および植物油からなるグループから選ばれ；グルコース含量は、主発酵段階の第６０時間目から約０．２％以下に維持され；窒素源は、トウモロコシ浸漬汁および水酸化アンモニウムからなるグループから選ばれ；ｐＨは、炭素源および／または塩基を供給することにより約５．２〜約７．０の範囲、好ましくは約５．２〜約６．２の範囲になるようにコントロールされ；泡レベルは、泡レベルコントロール物質（合成物質または植物油が好ましい）を添加することによりコントロールされ；および溶存酸素濃度は、好ましくは発酵ブロスを攪拌および／または通気することによりコントロールされる。本発明のさらに別の好ましい具体例において、播種物は、種発酵段階のｐＨがその最小値に達した後に増加する時に、種培養段階から主発酵段階へ移される。発明の詳細な説明本発明者らは、生合成プロセスの種培養および主発酵段階のいずれかまたは両方において、１種または２種以上の幾つかのプロセスパラメーター、ステップおよび／または変数を調節することによってメビノリンの最適な生合成が、成し遂げられることを発見した。発明者らは、種培養においては、これらのプロセスパラメーター、ステップおよび／または変数が、必要な培地成分を容易に吸収しうる形態および最も都合のよい濃度で微生物に供給すること、ならびに培養時間を約１０〜約２５％まで延長すること、であることを発見した。本発明者らは、主発酵段階中に定常状態条件を得るためには、これらのプロセスパラメーター、ステップおよび／または変数が、グルコースおよび／または総還元糖含量をコントロールすること；炭素源を適当な最小濃度に維持すること；有機および／または無機窒素源を供給すること；ｐＨをコントロールすること；泡レベルをコントロールすること；回収することおよび供給することによってブロスの量をコントロールすること；および攪拌速度および／または通気速度を変化させることによって溶存酸素濃度をコントロールすること、であることを発見したメビノリン生合成を最適化するために、種培養段階または主発酵段階のいずれかにおける上記プロセスパラメーター、ステップおよび／または変数のそれぞれが、同時に調節される必要はない。しかし、好ましい本発明の具体例において、メビノリンの生合成は、上記プロセスパラメーター、ステップおよび／または変数のそれぞれに関連がある。このような好ましい具体例では、定常状態条件、すなわち一定のｐＨ、グルコース濃度、溶存酸素、粘度、体積などが迅速に達成され、長時間維持され、既存の操作の結果をはるかに超える抗収量を提供することができる、進歩した代謝コントロールされたメビノリン発酵操作が行われる。種培養段階における１種または２種以上の上記プロセスパラメーター、ステップおよび／または変数を調節することにより、該段階において幾つかの利点が実現する。これらの利点としては、成長中心の数を増やすことによって“定常状態 ”条件に到達するのに必要な時間が約２０〜３０％まで短縮されること、およびより有利な形態学的形態において有効バイオマスが成長し、それによってより有利な微生物培養条件が得られることが挙げられる。これらの利点および延長された培養時間の結果として、有効バイオマスの濃度は、ほとんど倍になる。主発酵段階における１種または２種以上の上記プロセスパラメーター、ステップおよび／または変数を調節することにより、該段階において幾つかの利点が実現する。これらの利点としては、成長相がより速く、その変動がより少ないこと、長時間にわたって維持されうる定常状態が迅速に形成されることが挙げられる。これらの利点から、発酵の活性の目覚しい増加が得られる。したがって、ひとつの具体例において、本発明は、アスペルギルス属に属する菌株を、吸収可能な炭素源および窒素源ならびに鉱物塩を含有する培地で、ｐＨ５．２〜７．０にて温度２４〜３０℃の温度で浸漬培養にて培養することによる、メビノリン製造のための発酵操作に関するものであり、該操作においては培養物を“定常状態”段階に維持するために、主発酵段階に代謝コントロール操作が適用される。この具体例において、総還元糖をコントロールするのが好ましい。主発酵の栄養源には、グルコース、加水分解デンプンおよび植物油といったような有機炭素源を供給するのが好ましい。発酵の第６０時間目から、グルコース濃度が０．２％以下に維持されるのが好ましい。この操作中、トウモロコシ浸漬汁および水酸化アンモニウム溶液といったような窒素源を供給する。ｐＨは、炭素源または水酸化アンモニウムおよび／または水酸化ナトリウムといったような塩基を供給することにより、約５．２〜６．２の範囲に維持するのが好ましい。ヒマワリ油および／または大豆油といったような植物油、および／または合成抗泡剤をブロスに供給することにより、発酵槽の泡レベルもまたコントロールすることができる。攪拌速度および／または通気速度を変化させることにより、溶存酸素をコントロールするのが好ましい。該発酵の過程中、一回または２回以上の回収を行う。好ましい具体例において、以下の成分を含む種培養物を主な培養培地に植える。＊）Ｐｈ．Ｈｇ．ＶＩＩにしたがって４倍活性上記成分の培養培地に、通常適用されるナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび鉄といったような微量および多量元素を加えて培地を完成する。培養時間を１０〜２５％延長した種培養物を主培養培地に植える。種培養物を継代する段階において、ｐＨは最小値の後の増加段階にある。発酵に用いるのは、アスペルギルス・オブスクルス菌株、その変異体またはその突然変異体が好ましく、コードナンバーＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１１８９として寄託されているアスペルギルス・オブスクルスｎ.ｓｐ.ＭＶ−１正基準標本がより好ましい。ｐＨが最小値の後の増加段階において、培養時間を延長して、種培養物を滅菌した主発酵培地に植える。主発酵段階において、最大の有効成分産生速度である “定常状態”条件は、栄養要求を満たすための炭素源および窒素源の供給すること；培養物望ましくない厚化およびバイオマスが異常に肥大化することを避けるためにグルコース濃度をコントロールすること；酸素要求にしたがって攪拌速度および通気速度をコントロールすること；泡レベルコントロールと炭素源要求を合わせて、植物油と合成剤の混合物などの両方の目的に適した物質でコントロールすること；グルコースシロップまたは塩基などの炭素源を供給しながらｐＨを約５．２〜６．２の範囲に維持すること；および発酵槽の最大活動体積に達した時、または加工プロセスを行うのに経済的に十分なメビノリン濃度に到達した時に、一回または二回以上の回収を行うこと、によって長時間維持することができる。これらの要素を適用することによって、ライフサイクルに応じて、微生物によく適合した一定の環境を提供することができる、多用途のコントロール可能な発酵操作が得られる。上記好ましい具体例のとおり、本発明操作は、公知の操作よりも優れた収量が得られ、非常に少ない原料およびエネルギーを使用するだけでよく、有効物質の単位量に比べて環境を汚染する廃棄物の量が少なく、より効率的に発酵槽を使用するものである。以下の実施例において、ＨＵ２０８９９７に開示の方法に従ったメビノリンの生合成（比較例１）を、本発明の好ましい具体例にしたがった方法（実施例２）と比較する。比較例１ＨＵ２０８９９７に従ったメビノリンの生合成以下の成分を含む種培養培地を６００リットルの容器で製造する。種数６．５×１０⁹アスペルギルス・オブスクルス菌株の種懸濁液を用いて播種を行った。種培養物のプロセスパラメーターは以下のとおりであった。種培養物の主発酵培地への継代は、ｐＨが低下段階にあって５．６である、３６時間の時点で標準の操作に従って行った。バイオマスを遠心分離で固めた細胞の体積は１４％であった。上記種培養物を播種率１０％でＭＥＦ−０３と表示した主発酵培地に播種した。主発酵培地の成分は以下のとおりであった。＊）Ｐｈ．Ｈｇ．ＶＩＩにしたがって４倍強度０時間の体積：５００リットル。発酵は７日間行う。通気および攪拌速度は以下のとおりである。＊）溶存酸素は飽和値の４０％以上に維持する。発酵過程の間中、４個の５０ｋｇの酵素的に液化したトウモロコシデンプンを５０、７３、９０および１０８時間目にスケジュールにしたがって供給する。有効成分生産のためのデータ発酵時間：１６４時間、ＨＰＬＣにより測定した活性：９２７ｍｇ／ｋｇ、ブロスの量：５８０ｋｇ。上記の結果、発酵有効成分は０．５８トン^*９２７ｇ／トン／１０００／１ｍ³＝０．５４ｋｇ／ｍ³総体積である。実施例２グルコースシロップおよび窒素源供給ならびに水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニウムによるｐＨコントロールを用いたメビノリンの生合成６００リットルの容器に下記の成分を含む種培養培地を調製する。＊）Ｐｈ．Ｈｇ．ＶＩＩにしたがって４倍強度種数６．５×１０⁹アスペルギルス・オブスクルス菌株の種懸濁液を用いて播種を行った。種培養物のプロセスパラメーターは比較例１と同じであった。しかし、種培養物の継代は、比較例１とは異なる作法で行った。継代の時間は第４０時間である。ｐＨが最小値（ｐＨ４．９）に到達し、再度上昇を開始し、約ｐＨ５に到達したときに継代を行った。したがつて、ｐＨはその最小値から約０．１増加した値であった。バイオマスを遠心分離で固めた細胞の体積は２４％であった。上記種培養物を播種率１０％でＭＥＦ−０３と表示した主発酵培地に播種した。主発酵培地の成分は以下のとおりであった。＊）２５％グルコースシロップの形態で２５ｋｇを供給＊＊）Ｐｈ．Ｈｇ．ＶＩＩにしたがって４倍強度発酵は１３日間行う。通気および攪拌速度は以下のとおりである。＊）溶存酸素は、通気優先方法によって飽和値の４０％以上に維持する。発酵過程において、溶存酸素の維持は非常に重要である。最も激しい段階において、約２５〜３２ノーマルｍ³/ｈの通気および３００〜４００ｒｐｍの攪拌速度を供給することにより該維持は達成される。主発酵段階の間、温度は２７±２℃、内圧は０．４バールおよび培養時間は３０９時間であった。発酵の過程において、以下の栄養を供給した。１．加水分解トウモロコシデンプン（グルコースシロップ）を酵素処理およびＨＣ１処理により製造し、供給する。グルコースシロップの製造に用いた生の材料は以下のとおりであった：トウモロコシデンプン２５％、ＣａＣｌ₂０．３〜０．４％、酵素アミラーゼ（ＢＡＮ）０．１〜０．２％および濃塩酸１％。グルコースシロップの供給は、ｐＨがその最小値（５．０）の後、上昇する段階、すなわち第４５時間目のｐＨ値が５．６の時点で開始した。供給は、ｐＨを５．４〜５．８の間に維持にしながら、継続的に行った。最小供給速度は０．５リットル／時間であり、最大速度は５リットル／時間であった。２．グルコースシロップを最小速度で供給することに加えて、ＮａＯＨまたはＮＨ₄ＯＨ溶液をｐＨが５．５以下に低下したときのｐＨコントロールのために供給する。３．トウモロコシ浸漬汁（１％）（０時間の体積との相対値）を、発酵の第１００時間の時点で供給する。有効成分生産のためのデータ発酵時間：３０９時間、ＨＰＬＣにより測定した活性：２８６８ｍｇ／ｋｇ、ブロスの量：６８０ｋｇ。上記の結果、発酵有効成分は０．６８トン^*２８６８ｇ／トン／１０００／１ｍ³＝１．９５ｋｇ／ｍ³総体積である。実施例３供給、コントロールおよび回収によるメビノリンの生合成アスペルギルス・オブスクルスｎ.ｓｐ.ＭＶ−１正基準標本菌株を、以下の組成の滅菌播種培地で培養する。＊）Ｐｈ．Ｈｇ．ＶＩＩにしたがって４倍強度播種段階では、以下のプロセスパラメーターを用いた。ｐＨが最小値（ｐＨ４．８）に到達した後、値が最小値から０．１単位上昇、すなわち値が４．９に到達したときに播種物の継代を行った。バイオマスを遠心分離で固めた細胞の体積は２４％であった。継代率８％において、上記播種物を以下の成分を含む主発酵培地に継代した。＊）Ｐｈ．Ｈｇ．ＶＩＩにしたがって４倍強度主発酵段階では、以下のプロセスパラメーターを用いた。供給材料１．炭素源材料：グルコース（グルコースシロップ）が２５％になるまで大部分を分解した約４０トンの加水分解デンプンを継続的に供給する。グルコースシロップを製造するのに用いた原料は以下のとおりである：トウモロコシまたは小麦デンプン２５％、塩化カルシウム０．３％、ＢＡＮ２４０酵素０．３％および塩酸約２％。２．窒素源材料：トウモロコシ浸漬汁（５０％）を発酵０時間の滅菌体積５ｍ³ に対して１％量で使用した。３．ｐＨコントロールのための塩基。水酸化ナトリウムまたはアンモニアの２５〜３０％非滅菌溶液を用いてｐＨをコントロールした。供給１．グルコースシロップ：ｐＨが最小値になった後、増加を始める約５０時間の時点で、供給を開始する。グルコースシロップは、ｐＨを５．４〜５．８の範囲にコントロールするために供給する。グルコースの供給は一回分ずつの形態で行うかまたは継続的に行う。グルコースシロップは、０〜１０００ｋｇ／時間の範囲、好ましくは１５０〜５００ｋｇ／時間の範囲の速度で供給する。最少量のグルコースシロップ供給を最低速度で行っても、ｐＨ最小値が維持できなくなった時に、ｐＨコントロールのための塩基供給が必要となる。２．トウモロコシ浸漬汁：トウモロコシ浸漬汁は、約１００時間の時点で１回分を供給する。以後は、必要になれば１回分ずつ供給する。３．ＮａＯＨまたはＮＨ₄ＯＨ：最低のグルコースシロップ供給速度においてもｐＨが５．５以下に低下するような場合に、塩基を供給してｐＨをコントロールする。泡レベルは、ヒマワリ油：ＰＰＧ（９５：５）の混合物を供給することによって、泡体積が発酵槽の運転容積の２５％を越えないようにコントロールする。回収は、１１２、１３８、１７８、２０４時間に発酵槽から４ｍ³のブロスを採取することによって４回行う。有効成分生産のためのデータ発酵時間：２２６時間、ＨＰＬＣにより測定した活性（母液）：１８２５ｍｇ／ｋｇ、採取された活性（回収による）：１７８８ｍｇ／ｋｇ。上記の結果、発酵有効成分は９５トン^*１７８８ｇ／トン／１０００／１０５ｍ³総体積である。The present invention relates generally to the biosynthesis of cholesterol-lowering drugs for the production of lovastatin hydroxy acids. More particularly, the present invention relates to the biosynthesis of the cholesterol-lowering drug mevinolin by certain microorganisms. BACKGROUND ART Mebinoline (lovastatin, monacolin K; β, δ-dihydroxy-7- [1,2,6,7,8,8a-hexahydro-2,6-dimethyl-8- (2-methyl-butyryloxy) naphthalene-1) -Yl] heptanoic acid δ-lactone) is one of the most important known cholesterol lowering drugs. As used herein, the term mevinolin means both lactone and hydroxy acid forms. The ring-opened hydroxy acid form is a potent inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, which catalyzes the formation of mevalonic acid, an early intermediate in cholesterol biosynthesis. Mevinolin is particularly beneficial as its application results in the inability to accumulate biosynthetic intermediates with toxic steroid backbones formed at later stages of biosynthesis. Mevinolin increases the number of LDL-receptors on the cell membrane surface, which removes LDL cholesterol circulating in the blood, thereby lowering plasma cholesterol levels. Usually, the active ingredients are produced via fermentation. GB2046737 discloses that an active ingredient can be produced by several strains belonging to the genus Monascus, such as culturing Monascus ruber at 7 to 40 ° C. As a culture medium, an aqueous solution of glucose, peptone, corn steeped juice, and ammonium chloride was used. Fermentation was performed for 10 days under aerobic conditions, and 87 mg of mevinolin was obtained from the filtrate of 5 liters of broth. U.S. Pat. No. 4,294,926 discloses that microorganisms belonging to the genus Aspergillus terreus having an accession number of ATCC 20541 or 20542 are preferably prepared using a microorganism such as glucose, fructose or maltose as a carbon source, a yeast such as glucose, fructose or maltose as a carbon source. The biosynthesis of mevinolin by application at 20-37 ° C to a culture medium containing degraded yeast, hydrolyzed casein, corn dip, and mineral salts such as calcium carbonate, magnesium sulfate, cobalt, iron and manganese salts. It has been disclosed. Similar operations are described in U.S. Pat. Nos. 4,420,491, 4,342,767, 4,319,039 and 4,294,846, which contain 1-6% carbohydrate and 0.2-6% nitrogen source. Fermentation is performed in the medium for 3 to 5 days. German Patent No. 4,402,591 discloses that a microorganism belonging to the genus Pleurotus, such as Pleurotus ostreatus, P.sapidus, P.sa ca, is cultured for 7-4 days at 25-35 ° C. on a surface or by immersion culture. Biosynthesis of mevinolin is disclosed. In Canadian Patent No. 2,219,416, a microorganism with accession number Coniothyrium fuckelii ATCC 74277 belonging to the genus Coniothyrium, comprising 3-15% glucose, 0.5-4% peptone, 0.5-5% Amylase, 0.2-1% ammonium sulfate, 0.01-0.1% magnesium sulfate, 0.05-0.2% antifoam, 0.2-1.5% L-isoleucine, 0. The production of mevinolin by culturing in a culture medium of pH 5-6 containing 2-1.5% L-aspartic acid or, as a specific case, the production of mevastatin is disclosed. In the examples, the active ingredient concentration of the broth was 19 to 430 mg / L. Hungarian patent HU208997 discloses a positive control specimen strain of Aspergillus obscurus, designated MV-1, deposited under accession number NCAIM (P) F001189. The fermentation is preferably carried out in a medium containing yeast extract and / or peptone and / or casein as nitrogen source and glucose and / or maltose or sucrose as carbon source. The activity of the broth at the end of the laboratory scale culture is 400-850 mg / L. In previous discussions, research has been made to advance mevinolin biosynthesis, focusing on the discovery of new mevinolin-producing microorganisms, rather than the progress of the fermentation procedure itself. Several references disclose that fermentations can be performed in both surface and solid phase culture applications in conventional and known media. A batch operation was applied and the behavior of the operation was dependent on the starting conditions. However, due to technical limitations such as maintaining the components at the most convenient concentrations, optimal dissolved oxygen supply and pH, it is difficult to perform a continuous correction action. Microorganisms in the main fermentation stage, depending on their metabolism, require different conditions / media compositions to obtain optimal growth and production of active ingredients. We have concluded from their experiments that active biomass is very low and variable during seed culture and at the beginning of the main fermentation. Thus, the fermentation yield is relatively low and variable. The yield at the end of the fermentation, ie the mevinolin concentration, of course depends on the type of strain, but did not exceed 850 mg / L. The present inventors have performed a detailed analysis of the entire fermentation operation from the seed culture stage to the end of fermentation. At the seed culture preparation stage, biomass was found to be very low for both the known media and the achieved process. Therefore, during the main fermentation, the metabolism of microorganisms and cultures is not satisfied. The purpose of the invention is therefore an object of the present invention is to improve the efficiency of the mevinolin production fermentation operations by enhancing the ability of the microorganisms performing the fermentation with different fermentation conditions. Another object of the present invention is to provide the most favorable chemical and physiological conditions for the metabolism of microorganisms in either or both the seed stage and the main fermentation stage. Yet another object of the present invention is to maintain the growth rate at either or both the seed stage and the main fermentation stage, and then for an extended period of time, the maximum product formation rate at steady state conditions. It is thus to provide the most favorable chemical and physiological conditions for the metabolism of the microorganism. SUMMARY OF THE INVENTION These and other objects of the present invention are achieved in one embodiment of the present invention by providing a method for producing mevinolin by a microorganism in a fermentation process having a seed culture step and a main fermentation step. The method comprises: a) culturing a microorganism to produce a seed in a seed culture stage; b) passing a seed to a fermentation medium in a main fermentation stage; A method comprising producing a fermentation broth containing mevinolin by maintaining steady state conditions. In a preferred embodiment of the present invention, providing one or more organic carbon sources; controlling glucose and / or total reducing sugar content; providing organic and / or inorganic nitrogen sources; Steady-state conditions are maintained in the main fermentation stage by controlling; controlling foam levels; controlling the amount of broth by withdrawing and feeding; and controlling dissolved oxygen concentration. Preferably, the fermentation step is carried out in a submerged culture of the microorganisms at a temperature range of about 24C to 30C. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the microorganism is of the genus Aspergillus. In yet another preferred embodiment of the present invention, the organic carbon source is selected from the group consisting of glucose, starch hydrolysate and vegetable oil; the glucose content is less than about 0.2% from the 60th hour of the main fermentation stage The nitrogen source is selected from the group consisting of corn steep juice and ammonium hydroxide; the pH is in the range of about 5.2 to about 7.0 by supplying a carbon source and / or a base, preferably The foam level is controlled by adding a foam level control substance (preferably synthetic or vegetable oil); and the dissolved oxygen concentration is preferably controlled to be in the range of about 5.2 to about 6.2; It is controlled by stirring and / or aerating the fermentation broth. In yet another preferred embodiment of the invention, the inoculum is transferred from the seed culture stage to the main fermentation stage when the pH of the seed fermentation stage increases after reaching its minimum. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present inventors have determined that one or more of several process parameters, steps and / or variables may be adjusted during either or both the seed culture and main fermentation stages of a biosynthetic process. Found that optimal biosynthesis of mevinolin was achieved. We have found that in seed culture, these process parameters, steps and / or variables provide the microorganisms in a form that can readily absorb the required media components and in the most convenient concentration, and the culture time. To about 10% to about 25%. We have determined that these process parameters, steps and / or variables control the glucose and / or total reducing sugar content in order to obtain steady state conditions during the main fermentation stage; Maintaining a minimum concentration; supplying an organic and / or inorganic nitrogen source; controlling pH; controlling foam levels; controlling the amount of broth by collecting and supplying; and stirring. Controlling dissolved oxygen concentration by altering the rate and / or aeration rate to optimize mevinolin biosynthesis, in order to optimize the mevinolin biosynthesis; Each of the steps and / or variables are adjusted simultaneously That need not be. However, in a preferred embodiment of the present invention, the biosynthesis of mevinolin is related to each of the above process parameters, steps and / or variables. In such preferred embodiments, steady-state conditions, i.e., constant pH, glucose concentration, dissolved oxygen, viscosity, volume, etc., are quickly achieved, maintained for long periods of time, and have an anti-yield far exceeding the results of existing operations. An advanced metabolically controlled mevinolin fermentation procedure is provided that can be provided. By adjusting one or more of the above process parameters, steps and / or variables in the seed culture stage, several advantages are realized in the stage. These advantages include the fact that increasing the number of growth centers reduces the time required to reach "steady state" conditions to about 20-30%, and the more effective biomass in more advantageous morphological forms Grow, thereby providing more favorable microbial culture conditions. As a result of these advantages and the extended incubation time, the concentration of available biomass is almost doubled. By adjusting one or more of the above process parameters, steps and / or variables in the main fermentation stage, several advantages are realized in the stage. These advantages include the faster growth phase, less fluctuation, and the rapid formation of a steady state that can be maintained over time. These advantages result in a remarkable increase in the activity of the fermentation. Thus, in one embodiment, the present invention provides a method for transforming a strain belonging to the genus Aspergillus into a medium containing absorbable carbon and nitrogen sources and mineral salts at pH 5.2-7.0 at a temperature of 24-30. The present invention relates to a fermentation operation for producing mevinolin by immersion cultivation at a temperature of ℃ C. In this operation, a metabolic control operation is performed in the main fermentation stage in order to maintain the culture in a “steady state” stage. Is applied. In this embodiment, it is preferred to control the total reducing sugar. Preferably, the nutrients of the main fermentation are provided with organic carbon sources such as glucose, hydrolyzed starch and vegetable oils. Preferably, from the 60th hour of the fermentation, the glucose concentration is kept below 0.2%. During this operation, a nitrogen source such as corn steep juice and ammonium hydroxide solution is provided. Preferably, the pH is maintained in the range of about 5.2 to 6.2 by providing a carbon source or a base such as ammonium hydroxide and / or sodium hydroxide. By supplying the broth with a vegetable oil, such as sunflower oil and / or soybean oil, and / or a synthetic antifoam, the foam level of the fermenter can also be controlled. It is preferable to control the dissolved oxygen by changing the stirring speed and / or the aeration speed. During the course of the fermentation, one or more recovery is performed. In a preferred embodiment, a seed culture containing the following components is inoculated into a primary culture medium. *) Ph. Hg. According to VII, the medium is completed by adding a trace amount and a large amount of elements such as sodium, potassium, magnesium and iron to a culture medium of the above components. Seed cultures with an extended culture time of 10 to 25% are planted in the main culture medium. At the stage of passage of the seed culture, the pH is in an increasing stage after a minimum. For the fermentation, an Aspergillus obsculus strain, a mutant thereof or a mutant thereof is preferable, and a positive reference sample of Aspergillus obsculus n.sp. MV-1 deposited as code number NCAIM (P) F001189 is more preferable. . In the increasing phase after the minimum pH, the culture time is extended and the seed culture is planted in a sterile main fermentation medium. In the main fermentation stage, the "steady-state" condition, which is the highest rate of active ingredient production, is the supply of carbon and nitrogen sources to meet nutritional requirements; undesired thickening of the culture and abnormal growth of biomass Controlling the glucose concentration to avoid agitation; controlling the agitation and aeration rates according to the oxygen demand; combining foam level control and carbon source requirements, suitable for both purposes such as a mixture of vegetable oil and synthetic agent Maintaining the pH in the range of about 5.2-6.2 while supplying a carbon source such as glucose syrup or base; and when the maximum active volume of the fermenter is reached or processed Performing one or more recoveries when the mevinolin concentration is economically sufficient to perform the process. It can be maintained for a long period of time I. The application of these factors provides a versatile and controllable fermentation operation that can provide a consistent environment that is well suited to microorganisms, depending on the life cycle. As in the preferred embodiment above, the operation of the present invention provides better yields than known operations, requires very little use of raw materials and energy, and is a waste that pollutes the environment compared to the unit amount of active substance. The amount of material is small and the fermenter is used more efficiently. In the following examples, the biosynthesis of mevinolin according to the method disclosed in HU208997 (Comparative Example 1) is compared with the method according to a preferred embodiment of the present invention (Example 2). Comparative Example 1 Biosynthesis of Mevinolin According to HU208997 A seed culture medium containing the following components is prepared in a 600 liter vessel. The seeding was performed using a seed suspension of 6.5 × 10 ⁹ Aspergillus obsculus strain. The seed culture process parameters were as follows: Passage of the seed culture to the main fermentation medium was performed according to standard procedures at 36 hours, when the pH was in the decreasing phase of 5.6. The cell volume of the biomass solidified by centrifugation was 14%. The seed culture was seeded at a seeding rate of 10% on the main fermentation medium labeled MEF-03. The components of the main fermentation medium were as follows. *) Ph. Hg. Four-fold intensity 0 hour volume according to VII: 500 liters. Fermentation is performed for 7 days. The aeration and agitation rates are as follows. *) Dissolved oxygen is maintained at 40% or more of the saturation value. During the fermentation process, four 50 kg enzymatically liquefied corn starches are supplied on schedule at 50, 73, 90 and 108 hours. Data for active ingredient production Fermentation time: 164 hours, activity determined by HPLC: 927 mg / kg, amount of broth: 580 kg. As a result of the above, the active ingredient for fermentation is 0.58 tons ^* 927 g / ton / 1000/1 m ³ = 0.54 kg / m ³ total volume. EXAMPLE To prepare a seed culture medium containing the following components in the biosynthesis 600 liters container of mevinolin with 2 glucose syrup and nitrogen source feeding and pH control by sodium hydroxide or hydroxide of ammonium. *) Ph. Hg. Seeding was performed using a seed suspension of 6.5 × 10 ⁹ Aspergillus obsculus strain according to VII. The process parameters of the seed culture were the same as in Comparative Example 1. However, the passage of the seed culture was performed in a manner different from that in Comparative Example 1. The passage time is forty hours. When the pH reached a minimum (pH 4.9) and started to rise again, passage was performed when it reached about pH 5. Thus, the pH was about 0.1 increased from its minimum. The volume of cells obtained by consolidating the biomass by centrifugation was 24%. The seed culture was seeded at a seeding rate of 10% on the main fermentation medium labeled MEF-03. The components of the main fermentation medium were as follows. *) Supply 25 kg in the form of 25% glucose syrup **) Ph. Hg. Four-fold intensity fermentation is carried out for 13 days according to VII. The aeration and agitation rates are as follows. *) Dissolved oxygen is maintained at 40% or more of the saturation value by the ventilation priority method. In the fermentation process, maintaining dissolved oxygen is very important. In the most intense stages, the maintenance is achieved by supplying a ventilation of about 25-32 normal m ³ / h and a stirring speed of 300-400 rpm. During the main fermentation phase, the temperature was 27 ± 2 ° C., the internal pressure was 0.4 bar and the incubation time was 309 hours. The following nutrients were supplied during the fermentation process. 1. Hydrolyzed corn starch (glucose syrup) is produced and supplied by enzyme treatment and HC1 treatment. Raw materials used in the production of glucose syrup were as follows: 25% corn starch, CaCl ₂ 0.3~ 0.4%, enzyme amylase (BAN) 0.1 to 0.2% and concentrated hydrochloric acid 1%. The supply of glucose syrup was started when the pH rose after its minimum value (5.0), ie, at the 45th hour when the pH value was 5.6. Feeding was continuous, while maintaining the pH between 5.4 and 5.8. The minimum feed rate was 0.5 liter / hour and the maximum rate was 5 liter / hour. 2. In addition to supplying the glucose syrup at a minimum speed, supplied for pH control when the pH of NaOH or NH ₄ OH solution was reduced to 5.5 or less. 3. Corn soak (1%) (relative to 0 hour volume) is fed at 100 hours of fermentation. Data for active ingredient production Fermentation time: 309 hours, activity measured by HPLC: 2868 mg / kg, amount of broth: 680 kg. As a result of the above, the fermentation active ingredient is 0.68 ton ^* 2868 g / ton / 1000/1 m ³ = 1.95 kg / m ³ total volume. Example 3 Biosynthesis of Mevinorin by Supply, Control and Recovery Aspergillus obsculus n.sp. MV-1 positive reference strain is cultured in a sterile seeding medium of the following composition: *) Ph. Hg. The following process parameters were used in the 4 × strength seeding stage according to VII. After the pH reached the minimum value (pH 4.8), the inoculum was passaged when the value rose 0.1 units from the minimum value, ie, when the value reached 4.9. The volume of cells obtained by centrifuging the biomass was 24%. At a passage rate of 8%, the inoculum was passaged to a main fermentation medium containing the following components. *) Ph. Hg. The following process parameters were used in the 4-fold main fermentation stage according to VII. Supply Materials 1. Carbon source material: Continuous supply of about 40 tons of hydrolyzed starch, mostly degraded, until glucose (glucose syrup) is 25%. The raw materials used to make the glucose syrup are as follows: 25% corn or wheat starch, 0.3% calcium chloride, 0.3% BAN240 enzyme and about 2% hydrochloric acid. 2. Nitrogen source material: was used at 1% weight relative to sterile volume 5 m ³ of corn steep juice (50%) Fermentation time zero. 3. Base for pH control. The pH was controlled using a 25-30% non-sterile solution of sodium hydroxide or ammonia. Supply 1. Glucose syrup: start feeding approximately 50 hours after the pH has reached a minimum, where it begins to increase. Glucose syrup is provided to control the pH in the range of 5.4-5.8. Glucose is supplied in batches or continuously. The glucose syrup is supplied at a rate in the range of 0-1000 kg / hour, preferably in the range of 150-500 kg / hour. When the minimum pH cannot be maintained even when the minimum amount of glucose syrup is supplied at the lowest speed, a base must be supplied for pH control. 2. Corn Steep Juice: Corn steep juice is supplied in one serving at about 100 hours. Thereafter, if necessary, it is supplied once. 3. NaOH or NH ₄ OH: When the pH drops to 5.5 or less even at the lowest glucose syrup feed rate, supply a base to control the pH. The foam level is controlled by feeding a mixture of sunflower oil: PPG (95: 5) such that the foam volume does not exceed 25% of the operating volume of the fermenter. Recovery is performed 4 times by taking broth 4m ³ from the fermentor to 112,138,178,204 hours. Data for active ingredient production Fermentation time: 226 hours, activity measured by HPLC (mother liquor): 1825 mg / kg, activity collected (by recovery): 1788 mg / kg. As a result of the above, the active fermentation ingredient has a total volume of 95 tons ^* 1788 g / ton / 1000/105 m ³ .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者オラーハ，アンタルハンガリー、ハー―4031デブレツェン、イシュトヴァーン15／ア番 (72)発明者チェーケ，ラースローハンガリー、ハー―4032デブレツェン、ガールドニュイ11番────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), E A (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ , TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB , BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, G M, HR, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG , KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, N O, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Orach, Antal Hungary, Har-4031 Debrecen, A Stvan 15 / A (72) Cheke, Lathrow Hungary, Ha-4032 Debrecen, Ga No. 11

Claims

[Claims] 1. Metabolic control during the main fermentation stage to maintain the culture at the "steady state" stage The carbon source that can absorb strains belonging to the genus Aspergillus to which 24-30 at pH 5.2-7.0 in a medium containing a nitrogen source and mineral salts Fermentation operation for mevinolin production by immersion culture at a temperature of ℃ Method. 2. The method according to claim 1, wherein the total reducing sugar content is controlled in the main fermentation stage. . 3. The method of claim 1 wherein an organic nitrogen source is provided in the main fermentation stage. 4. The method according to claim 3, wherein glucose which is a carbon source is supplied. 5. Glucose should be 0.2% or less from the 60th hour of fermentation to the end of fermentation. 5. The method according to claim 4, wherein the content is controlled. 6. 4. A hydrolyzed starch and / or vegetable oil is supplied as a carbon source. The described method. 7. The method of claim 1 wherein a nitrogen source is provided in the main fermentation stage. 8. Provide corn soak and / or ammonium hydroxide as a nitrogen source 8. The method of claim 7, wherein the feeding is performed. 9. 2. The method according to claim 1, wherein the pH is controlled to 5.2 to 6.2 in the main fermentation stage. The method described. 10. PH control by supply of carbon source and / or base Item 10. The method according to Item 9. 11. Ammonium hydroxide and / or alkali metal hydroxide for base supply The method according to claim 10, wherein a compound is used. 12. The method according to claim 1, wherein the foam in the total fermentation is controlled. 13. The foam is controlled by a vegetable oil and a synthetic agent. the method of. 14． 14. The method according to claim 13, wherein the vegetable oil is sunflower oil and / or soybean oil. . The method according to claim 13. 15. Control stirring speed and / or aeration speed according to dissolved oxygen concentration The method of claim 1, wherein 16. 2. The method according to claim 1, wherein a partial harvest is performed in the main fermentation stage. 17． Water and commonly applied trace and major elements (sodium , Potassium, magnesium, iron, etc.) 2. The seeding of the main fermentation stage with a cultured Aspergillus microbial culture. The described method. Glucose 2-6w / v% Phosphoric acid 0.002-0.006w / v% Acid casein 0.2-0.8 w / v% Corn dipping juice (50%) 1.5-5w / v% Sunflower oil 0.05-0.18 w / v% Polypropylene glycol 0.05-0.18 w / v% Pancreatin, 0.002-0.008 w / v% Ph. Hg. 4 times strength according to VII 18. By applying a time that is 10-25% longer than the usual culture time And / or at a stage where the pH rises from its minimum, The method according to claim 1, wherein the method is subcultured to main fermentation. 19. The microorganism to be applied is Aspergillus obsculus strain, a mutant thereof Or the mutant thereof. 20. The microorganism applied for fermentation is accession number NCAIM (P) F001189. Deposited Aspergillus obsculus n.sp. MV-1 reference strain 20. The method according to claim 19, wherein 21. Microorganisms in fermentation processes with a seed culture stage and a main fermentation stage Is a method of producing mevinolin, a) in the seed culture stage, culturing the microorganism to produce an inoculum; b) in the main fermentation stage, pass the inoculum to a fermentation medium; c) Including mevinolin by maintaining steady state conditions in the main fermentation stage Producing a fermentation broth. 22.1. Providing one or more organic carbon sources; glucose and / or Or controlling the total reducing sugar content; using organic and / or inorganic nitrogen sources Feeding; controlling pH; controlling foam levels. Controlling the amount of broth by collecting and feeding; Steady-state conditions by controlling dissolved oxygen concentration 22. The method of claim 21, wherein the method is maintained in a step. 23. By controlling the glucose and / or reducing sugar content 23. The method of claim 22, wherein steady state conditions are maintained in the main fermentation stage. 24. By supplying organic and / or inorganic nitrogen sources, the main fermentation stage 23. The method according to claim 22, wherein steady state conditions are maintained in said method. 25. Steady state conditions in the main fermentation stage by supplying organic carbon source 23. The method of claim 22, wherein 26. A glue whose organic carbon source consists of glucose, hydrolyzed starch and vegetable oil. 26. The method of claim 25, wherein the method is selected from the group consisting of: 27. 27. The method according to claim 26, wherein the organic carbon source is glucose. 28. Maintain a glucose content below about 0.2% from the 60th hour of the main fermentation stage 28. The method according to claim 27. 29. A glue whose nitrogen source is corn soak and ammonium hydroxide 26. The method of claim 24, wherein the method is selected from the group consisting of: 30. By controlling the pH, the steady-state 23. The method of claim 22, wherein the condition is maintained. 31. 31. The method of claim 30, wherein the pH is maintained in a range from about 5.2 to about 7.0. 32. 32. The method of claim 31, wherein the pH is maintained in a range from about 5.2 to about 6.2. 33. Control pH by feeding carbon source and / or base 31. The method of claim 30, wherein the method comprises: 34. The base is a glue composed of ammonium hydroxide and an alkali metal hydroxide. 34. The method of claim 33, wherein the method is selected from the group consisting of: 35. By controlling the foam level, a steady state in the main fermentation stage 23. The method of claim 22, wherein the condition is maintained. 36. The main fermentation stage by adding substances that control the foam level 23. The method of claim 22, wherein steady state conditions are maintained at. 37. 37. The method according to claim 36, wherein the substance controlling the foam level is a synthetic substance. Law. 38. 37. The method of claim 36, wherein the substance that controls the foam level is a vegetable oil. . 39. The vegetable oil is selected from the group consisting of sunflower oil and / or soybean oil 39. The method of claim 38, wherein 40. By controlling the dissolved oxygen concentration, 23. The method of claim 22, wherein normal conditions are maintained. 41. The dissolved oxygen concentration can be controlled by stirring and / or aeration of the fermentation broth. 41. The method of claim 40, wherein the rolling. 42. In addition, fermentation broth is periodically collected during the main fermentation stage. 22. The method according to claim 21. 43. 22. The method according to claim 21, wherein the fermentation process is performed by immersion culture of a microorganism. 44. 22. The fermentation process is performed in a temperature range from about 24C to about 30C. the method of. 45. When the pH of the seed culture rises from its minimum, 22. The method of claim 21 wherein the subculture is carried out to a main fermentation stage. 46. 22. The method according to claim 21, wherein the microorganism is of the genus Aspergillus. 47. The microorganism is an Aspergillus obsculus strain, a variant thereof, or a variant thereof; 47. The method of claim 46, which is a mutant. 48. The microorganism was deposited under the accession number NCAIM (P) F001189. 48. The strain is a strain of Lugilus obsculus n.sp.MV-1 positive reference specimen. the method of. 49. During the seed culture stage, glucose 2-6 w / v%; phosphoric acid 0.002-0.0 06 w / v%; acidic casein 0.2-0.8 w / v%; corn steeped juice (5 0%) 1.5-5 w / v%; sunflower oil 0.05-0.18 w / v%; polypropylene Renglycol 0.05-0.18 w / v%; pancreatin (Ph.Hg.V 0.002-0.008 w / v%; water and trace amounts 47. The method of claim 46, wherein the microbial biomass is cultured in a medium containing salts of a large number of elements. Method. 50. Minor and large amounts of salts of sodium, potassium, magnesium and 50. The method of claim 49, wherein the method is selected from the group consisting of iron and iron and mixtures thereof.