CZ389598A3

CZ389598A3 - Způsob odstranění rušivého vlivu hemoglobinu při analýze lékařských vzorků

Info

Publication number: CZ389598A3
Application number: CZ983895A
Authority: CZ
Inventors: Ralph Weisheit; Elke Pfitschler
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 1999-07-14
Also published as: HUP9903344A2; DE19622090A1; TW407202B; WO1997045733A1; DE59702900D1; EP0906570A1; ATE198670T1; PL330220A1; IL127275A0; NZ331491A; CN1216614A; AU3093597A; JPH11510902A; EP0906570B1; KR20000010767A; ES2154463T3; DK0906570T3; CA2255851A1

Description

Znůsob odstranění rušivého vlivu hemoglobinu při analýze lékařských vzorků

Oblast_technik£

Vynález se týká způsobu stanovení analytů ve vzorku, který obsahuje volný hemoglobin, o~i kterém se stanovení provádí ootickým bichromatickým měřením oři délce hlavní měřené vlny a vedlejší měřené vlny. Tento zoůsob se hodí zejména oro stanovení parametrů amoniaku,kreatinkinézy a jejích isoenzymů a laktátdehydrogenázy a jejích isoenzymů v lékařském vzorku, například ve vzorku séra nebo vzorku Dlazmy.

Dosavadní stav_techniky.

Všeobecně je známo, Že hemolýza ruší stanovení velkého počtu analytů v částečně značné míře. Aby se presto získaly nezkreslené naměřené hodnoty, publikovaly se v minulosti různé způsoby oro odstranění rušivého vlivu hemolýzy.

Jeden z t&hto způsobů spočívá v tom, če se při měření v automatických analytických přístrojích oouřívá vedle nrvní měřené vlnové délky / hlavní měřené vlnové délky / často druhá měřené vlnová délka / měřená vedlejší vlnová délka /,pomocí nichž se odstraní nebo při nejmenším může minimalizovat rušivý vliv interferujících látek, jako například hemoglobinu,bilirubinu a lipemie.

Požadavkem při tom je,aby se měřená látka při vedlejší vlnové délce co nejméně absorbovala, na-2proti tomu, aby se rušivá látka absorbovala pokud možná ve stejná výšce jako u hlavní vlnové dálky.

II /Praxistechnik: Photometer ftlr die Artzliche PraII xis, Deutscher Arzteverlag 1977, strana 41 - 42/.

V DIA-Letter / Boehringer. Mannheim/ č. 70 /1985/ je zmínka, že by vedlejší vlnová dálka měla ležet co nejblíže hlavní vlnová dálce, nebol zpravidla potom má rušící látka p*i hlavní a vedlejší vlnové dálce podobná extinkce.

V Clin Chem 25/6, 951 - 959 / 1979 / se pouka zuje na to, že se vedlejší vlnová dálka má zvolit tak aby tato ležela blízko absorpčního minima chromogenu a blízko absorpčního maxima rušicí látky. V táto souvislosti se pro stanovení glukózy / hlavní vlnová dál ka 340 nm/ doporučuje vedlejší vlnová dálka 340 nm , nebol zde se absorbují rušící látky podobně jako při 340 nm.

Naproti tomu se v Buř J Clin Chem Clin Biochem 31/9, 595 - 601 /1993/ pohlíží kriticky na to, aby se UV-testy měřily s vedlejší vlnovou dálkou 380 nm, nebol v tomto příoadě vede konverze Hb-02 v Meth-Hb ke změnám spektra při 380 nm a tím k chybným měřením.

Pro testy, která spočívají na měření NAD/P/H- úbytku nebo přírůstku, se proto doporučuje vedlejší vlnová dálka, která je v tak zvaném Soret-regionu, jako například 475 nm.

Všechny dříve popsané způsoby se týkají odrušení chybných měření zoůsobených hemolyzou.Spolu s výrobou náhražek krve na bázi hemoglobinu vyvstává otáz ka odstranění poruch způsobených nativním nebo syntetickým hemoglobinem pop*>íoadě sloučeninami analogický mi Hb ještě daleko brisantněji ne? a? dosud. Takové poruchy se potom objevují toti? jednak i v nehemo lytických materiálech vzorků a jednak ještě v daleko větší míře než při nativní hemolyze, nebof p*i terapii ,p*í níž se používají náhražky krve, může obsah Hb v krevním séru nebo krevní plasmě být až 2. 000 mg/dl.

Kromě toho bylo zjištěno, že při měření určitých analytů, jako například amoniaku,kreatinkinázy a isoenzymů kreatinkinázy stejně tak jako laktátdehydrogenázy a jejích isoenzymů se nedosahuje použitím vedlej ší vlnové délky 475 nebo vyšší, například kolem 480, 505,600,660 nebo 700 nm , beze všeho dostatečné odruš ní hemoglobinu. Vzhledem k tomu, že tyto parametry ma jí v rámci diagnostiky srdce- krevního oběhu a diagno štiky nouzových případů stejně tak jako diagnostiky pacientů léčených nahrážkami krve podstatný význam,by lo úkolem předloženého vynálezu dát k dispozici jednoduchý způsob odstranění poruch, které jsou vyvolány nativním hemoglobinem, .nebo nahrážkainí-krve, zaloěe nými na'syntetickém hemoglobinu nebo sloučeninách,ana logických hemoglobinu, zejména při měření výše uvedených analytů.

?2^®tata_vynálezu___

Úloha ,které je základem vynálezu byla vyřešena způsobem stanovení analytuve vzorku,obsahujícím volný hemoglobin, pomocí optického bichromatického měření oři hlavní vlnové délce a vedlejší vlnové délce, při kterém se použije vedlejší vlnová délka nad 475 nm, ve které se nacházejí absorpční pásy hemoglobinu.

Výhodné vedlejší vlnové délky pro způsob podle fl · fl «

-4vynálezu jsou v rozmezí 546 + 10 nm, zejména 546 + 5 nm, jakož i v rozmezí 570 + 10 nm a nejvýhodněji 570 + 5 nm, Nejvýhodnější jsou vlnové délky 546 popřípadě 570 nm.

Volba vlnových délek podle vynálezu jako vedlejších vlnových délek byla překvapující,neboí při vlnové délce 405 nm, známé ze stavu techniky /např. Geráteinstellungen ftlr das Boehringer Mannheim/Hitachi 717- analytický přístroj podle doooručení cííbalsváho letáku Dro činidlo pro stanovení kreatinkinázy, č. obj. 1 273 248,Boehringer Mannheim Diagnostica Katalog 1997/ , p*i které dochází také k absorpci hemoglobinu, docházelo právě k největším rušením hemoglobinem. Dále se ve výše jmenované publikaci Eur.J.Olin.Chem.Clin. Biochem, poukazuje na to,že by se pro odrušení hemoglobinu měla používat právě vedlejší vlnová délka, která je na druhé straně Soret-regionu /hlavní absorpční pás hemoglobinu /,takže by každooádně bylo nasnadě zvolit jako vedlejší vlnovou délku takové vlnové délky, p*i kterých nedochází vůbec ke vzniku absorpčních pásů hemoglobinu.

Methoda odrušení podle vynálezu se hodí pro způsoby, ρ*ί kterých se měření analytů provádí opticky, zejména pomocí optických měření p*i hlavní vlnové délce v UV-oblasti. Zejména se s výhodou provádí způsob při testech, které snočívají na měření D^wírůstku nebo úbytku koncentrace NADE nebo NADPH ve vzorku. V tomto případě se s výhodou používá hlavní vlnová délka v rozmezí 340 + 10 nm.

Způsob podle vynálezu se hodí pro stanovení li bovolných vzorků, ve kterých je přítomný volný hemoglobin. Příklady takovýchto vzorků jsou hemolytické vzorky séra nebo plasmy, které obsahují náhražku krve.

Příklady náhražek krve , které spadají ve smyslu předloženého vynálezu pod pojem volný hemoglobin, jsou derivatizované, polymerní, modifikované nebo Dříčně zesííované deriváty hemoglobinů, zejména hu -

-5Μ 4 4 4 • 4

4 • 4 raánního hemoglobinu nebo hovězího hemoglobinu, na příklad DCL-hemoglobinu /Diaspirincrosslinkend-hemoglobin/, stejně tak jako rekombinantně vyrobený hemoglobin.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se určuje obsah analytu,vy braného ze skupiny sestávají” cí z amoniaku,kreatinkinázy a jejích isoenzymů a laktátdehydrogenáz a jejích isoenzymů.

Stanovení amoniaku pomocí způsobu podle vynálezu se progádí s výhodou enzymatickou UV-methodou /Da Fonseca-Wollheim F., Z. Kliň. Chem. Kliň. Bio chem. 11 / 1973/ 421 /.

Stanovení kreatinkinázy /CK/ se provádí s výhodou podle Optimierten Standard Methode der Deutschen Gesellschaft fůr klinische Chemie /J.Clin. Chem. Clin. Biochem. 15 /1977/ ,249/. Stanovení isoenzymů CK-MB kreatinkinázy se provádí s výhodou podle imunolo gické UV-methody /Wtirzburg U. et al., Kliň. Wschr.

/1976/, 357/.

Stanovení laktátdehydrogenázy /LDH/ nebo isoenzymu laktátdehydrogenázy /HBDH/ /1-hydroxybutyrátdehydrogenázy / se s výhodou provádí podle Optimierten Standard-Methode ” der Deutschen Gesellschaft fůr Klinische Chemie /Z. Kliň. Chem.Kliň. Biochem. 8 /1970/, 658 a 10 /1972/, 182/.

Jako vzorek se p*i způsobu podle vynálezu používá s výhodou vzorek séra nebo plasmy, zejména pak humánního séra nebo humánní plasmy.

Obvzláštní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se může provádět v analytických automa-6tických zařízeních, jako například na Boehrigerově Mannheim/Hitachi 704 nebo 717 analytickém přístroji,

U takovýchto analytických přístrojů se mohou bez dalšího nastavit výhodné vedlejší vlnové délky 546 popřípadě 750 nm.

ady_orovedení_vynálezu

Dále je vynález blíže vysvětlen následujícími pří klady.

Obecné methody

Část zkušebního vzorku séra se doplní roztokem obsahujícím hemoglobin tak, aby se dosáhl obsah hemoglobinu 2.000 mg/dl. Jiná, stejně velká Část zkušebního vzorku séra se doplnila ekvivalentním množstvím roztoku NaCl / 154 mmol/1/. Obě části se smísily spolu v různém poměru tak, aby vznikla ^ada koncentrací Kb, sestávající z 11 vzorků, přičemž jeden vzorek neobsahoval žádný Hb a nejvyšší vzorek obsahoval 2.000 mg/dl Hb.

Příklad 1

Stanovení amoniaku

Stanovení se provádělo na Boehringer Mannheim/Hitachi 717 analytickém přístroji. Byla použita následující činidla:

činidlo 1 : 150 mmolů/1 pufru triethanolaminu,pH 8,6 ;

mmolů/1ot-ketoglutarétu; 1,5 mmolu/1 ÍiADP činidlo 2 : 150 mmolů/1 pufru triethanolaminu; pH 8,6;

mmolů/1 06-ketoglutarátu; 1,5 mmolů/1 ADP ; 0,31 mmolu/1 NADPH; 24 U/ml glutamátdehydrogenázy /GLDK/

Provedení testu bylo následující : Ke 20 /ul vzorku se přidalo 200 ,ul činidla 1 a po 5 minutách 50 /al činidla 2. Stanovení analytů se provádělo do dalších 40 sek* Pro měření byla použita hlavní vlnová délka 340 nm a vedlejší vlnové délky 405 nm,

480 nm,600 nm, 660 nm a 700 nm,/srovnání / , stejně tak jako 546 a 570 nm / vynález /.

Výsledek tohoto stanovení je uveden v tabulce

1. Je vidět, že p*i použití vlnových délek 546 poDřípadg 570 podle vynálezu byla dosažena lepší ná vratnost /recovery/ než při jiných vlnových délkách použitých pro měření.

Příklad 2

Stanovení kreatinkinázy

Stanovení se provádělo na Boehringer-Mannheim/ /Hitachi 717 analytickém přístroji. Byla použita následující činidla:

činidlo 1 : 110 mmolú/1 pufru imidazolu; pH 6,7 ;

20.5 mmolŮ/1 glukózy ; 2,05 mmolů/1 EDTA;

2.5 mmolů/1 ADP;6,1 mmolů/1 AMP;12/umolů/l diadenosinpentafosfátu;2,5 mmolů/1 NADP;

mmolů/1 K-acetylcysteinu ; - 3,1 U/ml hexokinázy /HK/; - 1,8 U/ml glukózy-6-fosfátdehydrogenázy /G6P-DH/ činidlo 2 : 25 mmolů/1 pufru imidazolu; pH 7,5 } 20,5 mmolu/1 glukózy:, 2,05 mraolů/1 SDTA;61 2+ mmolů/1 Mg ; 184 mmolů/1 kreatinfosfátu.

Provedení testu bylo následující : K 7 ,ul vzorku se přidalo 250 /ul činidla 1 a po 5 minutách 50 /ul Činidla 2-* Stanovení analytů se provádělo po dalších minutách .-^ro měření byla použita hlavní vlnová délka 340 nm a vedlejší vlnové délky 450 nm, 480 nm, 505 nm,600 nm,660 nm a 700 nm / srovnání / stejně tak jako 546 nm a 570 nm / vynález /.

Výsledek tohoto stanovení je uveden v tabulce

2. Lze seznat, že p*i použití vlnových délek při měření podle vynálezu a to 546 popřípadě 570 nm se dosáhla zřetelně zlepšená návratnost /recovery/ než při jiných vlnových délkách.

Příklad 3

Stanovení isoenzymu kreatinkinázy CK-M3

Stanovení se provádělo na Boehringer-Mannheim/ Hitachi 717 analytickém přístroji. Byla použita následující činidla :

činidlo 1 : 110 mmolů/1 pufru imidazolu ; pH 6,7;

mmolů/lglukózy; 11 mmolů/1 ;

2,1 mmolů/1 EDTA; 2,4 mmolů/1 ADP ;

6,0 mmolů/1 AMP; 12 umol/1 diadenosinpentafosfátu; 2,4 mmolů/1 NADP; 24 mmolů/1 N-acetylcysteinu ; - 3,0 U/ml HK; í 1,8 U/ml G6P-DH ; antitělíska, inhibiční kapacita vůči CK-M až 2000 U/l;

činidlo 2 : 110 mmolů/1 pufru imidazolu ; pH 6,7 ;

mmolů/1 glukózy; ?,1 mmolů/1 EDTA ; 11 mmolů/1 Mg^ ⁺ ; 186 mmolů/1 kreatinfosfétu.

Provedení testu bylo následující : E 12 ul vzor ku bylo přidáno 250/ul činidla 1 a po 5 minutách 50 /ul činidla 2. Stanovení analytů se provádělo po

-9dalších 3 minutách. Pro měření bylys použita hlavní vlnová délka 340 nm a vedlejší vlnové délky 405 nm, 480 nm, 505 nm, 600 nm,66O nm a 700 nm / srovnání/ stejně tak jako 546 nm a 570 nm /vynález /,

Výsledek tohoto stanovení je uveden v tabulce

3. Lze seznat, že při použití vlnových dělek 546 nm a 570 nm nodle vynálezu se dosáhlo zřetelně zleošené návratnosti / recovery / než při jiných vlnových délkách.

P*íklad 4

Stanovení laktátdehydrogenázy

Stanovení se provádělo na Boehringer Mannheim/ /Hitachi 717 analytickém přístroji. Byla použita následující činidla:

činidlo 1 : 68 mmolů/l fosfátového pufru; pH 7,5;

£ 0,73 mmolů/l pyruvátu činidlo 2 : 2 i,i mmolu/1 NADH.

Provedení testu bylo následující : k 5 Ail vzorku se přidalo 250 ,ul Činidla 1 a oo 5 minutách 50/ul činidla 2. Stanovení analytů se provádělo po dalších 60 sek. Pro měření byla použita hlavní vlnová délka 340 nm a vedlejší vlnové délky 405 nm, 480 nm, 505 nm, 600 nm, 660 nm a 700 nm / srovnání / jakož i 546 nm a 570 nm / vynález/.

Výsledek tohoto stanovení je uveden v tabulce

4. Lze zjistit, že při použití vlnových délek 546 a popřípadě 570 nm pro měření podle vynálezu dosáhlo se zřetelně zlepšené návratnosti / recovery/ než u jiných vlnových délek.

• · 4 4 · ·

44*4 * ··· 4·· ** **

-10PMklad 5

Stanovení LDH-isoenzymů HBDH

činidlo 1 : 68 mmolů/1 fosfátového pufru; pH 7,5;

3,7 mmolů/1 -oxobutyrátu činidlo 2: 2 1,1 mmolu/1 NADH

Provedení testu bylo následující : K 5 /il vzorku se přidalo 250 /ul Činidla 1 a po 5 minutách 5θ/ul činidla 2. Stanovení analytů se provádělo po dalších 60 sekundách. Pro měření byla použita hlavní vlnová délka 340 nm a vedlejší vlnové délky 405 nm, 480 nm, 505 nm,600 nm,660 nm a 700 nm / srovnání / jakož i 546 nm a 570 nm / vynález/.

Výsledek tohoto měření je uveden v tabulce 5. Lze seznat, že při použití vlnových délek 546 popřípadě p^wi měření podle vynálezu, dosáhlo se zřetelně zlepšené návratnosti / recovery/ než při jiných vlnových délkách.

·«·· « ·· · · · · tabulka 1.

ω

-X2

Tabulka 2

0) o

CO

C' ςζ ω „ HO ω g “ Φ Ο	Ο ο	CN (Ν Ο Ο	V) CT)	m cn	-«r cn	LQ cn	Xf cn	co cn	Ν’ cn	v cn
co fc Φ Ε ^C : ί·'— Φ ^u λρ °β S “ 1 £:^W'' Φ	ο ο T“	Ο T“	ο ο	ιη cn	cO cn	co cn	řO cn	CN cn	<N Cn	CN cn	CN cn
C0 fc, φ Έ c C Φ ο Εφ ο Φ Ό fc Φ	Ο ο V“	Ο σ	ο σ	Ν- cn	CN cn	co cn	co o>	cn	cn	cn	cn
Ο ω t-t '. ρ
£ Ε ~ φ Ρ — Φ fc Φ	Ο ο V	CN ο	CN ο	d- cn	co cn	>- cn	co cn	co cn	00 Cn	O o Γ^-*	o *r-
Ο CJ Ε'··' Φ C — C ^c χθ φ ρ “ 0C S φ fc .:;/-	Ο ο	ο ο ΐ—	<Ν Ο τ—	CO cn	(O cn	r~ cn	r~ cn	r- Cn	CD cn	co σ>	σ> cn
Ο /U' Φ ΚΈ;/. Φ c : -Τ’ C ΙΟ . φ ο . (φΙΟ ’φ Λ1	ο ο τ-	ο ο ν·	V“ Ο ν—	co cn	*rr cn	co cn	co cn	CN cn	CN cn	CN cn	r— cn
υ 8; Ε Φ ί C ·—’ C. _ο S? Φ ' to '—’ Οφ Š φ '. I*·	Ο ο	V“ ο	ο	N^- Ol	N* Cn	N Cn	o Cn	co cn	co cn	cn	cn
φ ο ρ φ ^c C w £, Φ .° ΕΦ Φ	ο ο V“	fO Ο ν^-	00 σ T“	o	cn o	Τ’* T—	CN	r-	CN	(N CN	co CN
M χ.- to «' : jO~ o5 σ> <*'Έ ·. Π :.<= :< ~	ο	Ο Ο <Ν	Ο Ο ν	o o CO	o o co	O O O	O o CN v*	O o v·	O O lO	O O co	o o o <N
. Μ ,.. Φ ' fc ,· ο Ν >		CN	co	Xt	m	to	t*	<o	cn	o	-

·· · tabulka <3

Claims

PATENTOVÍ NÁROKY

1. Způsob odstranění rušivého vlivu hemoglobinu při analýze lékařských vzorků .obsahujících volný hemoglobin optickým bichromatickým měřením při hlavní vlnové délce a vedlejší vlnové délce , vyznačující se tím, že se použije pro měření vedlejší vlnová délka nad 475 ηω,ρ^Λί níž se nacházejí absorpční pásy hemoglobinu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije vedlejší vlnová délka v rozmezí 546 + 10 nm.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije pro měření ve dlejší vlnová délka v rozmezí 570 + 10 nm.
4. Způsob podle jednoho z nároků 1 až. 3, v y značující se tím, že se provádí test, který spočívá v měření přírůstku nebo úbytku koncentrace NADH nebo NADPH.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ιοί se tím, že se použije hlavní vlnová délka v rozmezí 340 + 10 nm.
6. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se stanoví obsah analytu,vybraného ze skupiny sestávající z amoniaku,kreatinkinézy ajejích isoenzyraů a laktátdehydrogenázy a jejích isoenzymů.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačujíφφ φφφ· • · φ φ φ φ φφ φ φ · • φ φ φ φφφ ·>Μ Φ *·· «ΦΦ Φ« ··

-17c ί s e t ί m , že se provádí stanovení amoniaku.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačuj íc í se t í m , že se provádí stanovení kreatinkinázy a/nebo isoenzymu CK-MB kreatinkinázy.
9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že se provádí stanovení laktátdehydrogenázy a/nebo isoenzymu HBDH laktatdehydrogenézy.
10. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 9 , vyznačující se tím, Že se analyzuje vzo rek, který obsahuje nahrážku krve.
11. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 10 , vyznačující se tím, že se stanovení provádí u vzorku krve nebo séra.
12. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 11 , v yznačující se tím, že se stanovení pro vádí v automatickém analytickém zařízení.