CZ309769B6

CZ309769B6 - UV filtr na bázi polyhydroxybutyrátu a způsob jeho přípravy

Info

Publication number: CZ309769B6
Application number: CZ2018-197A
Authority: CZ
Inventors: Ivana MÁROVÁ; CSc Márová Ivana prof. RNDr.; Renata Pavelková; Renata Ing Pavelková; Vojtěch KUNDRÁT; Vojtěch Mgr Kundrát; Petra Matoušková; Matoušková Petra Ing., Ph.D
Original assignee: NAFIGATE Corporation, a.s
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2023-09-27
Also published as: EP3560479A1; CZ2018197A3

Abstract

Popisuje se UV filtr na bázi polyhydroxybutyrátu, kterýobsahuje částice z polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 µm, které jsou funkcionalizované alespoň jedním organickým UV filtrem rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn. Popisuje se také příprava tohoto UV filtru.

Description

Vynález se týká UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu.

Vynález se dále týká také způsobu výroby UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu.

Dosavadní stav techniky

UV záření je elektromagnetické záření s vlnovou délkou 100 až 400 nm; podle vlnové délky a biologických účinků se dělí na tři typy:

UVA záření s vlnovou délkou 320 až 400 nm představuje cca 99 % UV záření, které dopadá na zemský povrch. Toto záření proniká hlouběji do kůže, vyvolává pigmentaci a erytém a ovlivňuje hlubší struktury v koriu (imunosupresivní efekt, akcelerace aktinického stárnutí), kromě toho také vytváří velmi reaktivní druhy kyslíku, které nepřímo poškozují DNA. UVA záření z umělých zdrojů se používá např. v soláriích a v dermatologické fototerapii.

UVB záření s vlnovou délkou 290 až 320 nm představuje cca 1 % UV záření, které dopadá na zemský povrch. Toto záření je karcinogenní a je schopné rozkládat nebo narušovat bílkoviny nebo jiné životně důležité organické sloučeniny a prostřednictvím tvorby pyrimidinových dimerů přímo poškozovat DNA. UVB záření z umělých zdrojů se využívá např. v dermatologické fototerapii.

UVC záření s vlnovou délkou 100 až 290 nm a na zemský povrch v podstatě nedopadá, neboť je za vzniku ozonu inhibováno plynným kyslíkem v zemské atmosféře. Toto záření je prokazatelně zhoubné pro živé organismy - je karcinogenní.

V lidské pokožce je UV záření absorbováno řadou chromoforů, jako je melanin, DNA, RNA, proteiny, aromatické aminokyseliny (např. tyrosin a tryptofan), lipidy, voda a jiné. Absorbování UV záření těmito chromofory přitom vede k různým fotochemickým reakcím a sekundárním interakcím zahrnujícím reaktivní částice (kyslíku a dusíku), které mohou mít škodlivé účinky. Samotná lidská pokožka sice disponuje řadou antioxidantů a enzymů, které opravují poškozenou DNA, přesto však může vlivem UV záření docházet k jejímu poškození, mutacím a genetické nestabilitě. Proto se vyvíjí různé ochranné prostředky proti UV záření a jeho negativním účinkům (včetně urychleného stárnutí kůže), které se nejčastěji přidávají do různých kosmetických přípravků - opalovacích mlék, krémů, pleťových masek apod., nejčastěji v koncentraci 0,1 až 10 %.

V současné době jsou přitom k dispozici anorganické (fyzikální) a organické (chemické) UV filtry. Anorganické UV filtry odráží a rozptylují světlo, přičemž oba tyto jevy se uskutečňují na širokém spektru záření od viditelného, přes UV až po infračervené. K anorganickým UV filtrům patří např. minerální mikročástice TiO2, které vykazují lepší ochranu před UVB zářením nebo ZnO, které naopak vykazují vyšší ochranu před UVA zářením apod. Tyto UV filtry jsou fotostabilní, ale při jejich použití je nutné pro dosažení požadovaného účinku obvykle nanést větší vrstvu daného kosmetického přípravku. Při miniaturizaci částic těchto filtrů na velikosti 10 až 50 nm se snižuje rozptyl viditelného světla a efektivní rozptyl se posunuje k nižším vlnovým délkám, až pod rozsah UVA záření, čímž se dosahuje lepší přijatelnosti těchto filtrů k využití v kosmetických přípravcích. Částice těchto velikostí ale mají vyšší tendenci k agregaci, v důsledku čehož se může efektivita rozptylu světla snižovat. Díky vysoké fotostabilitě jsou anorganické UV filtry využívány především pro ochranu dětí a lidí alergických na organické UV filtry. Organické UV filtry, také známé jako chemické UV filtry pak sluneční záření absorbují a

- 1 CZ 309769 B6 mění zejména jeho UVB složku na tepelnou energii [1]. Jejich nevýhodou je, že absorbují záření jen v určité úzké oblasti, a proto je pro vytvoření produktu s ochrannou proti širšímu spektru UV záření většinou nutné použít vhodnou kombinaci několika z nich. K typickým a nejpopulárnějším představitelům organických UV filtrů patří filtry na bázi cinamátů, vč. octinoxátu a cinoxátu nebo na bázi salicylátů, které na kůži nevytvářejí skvrny a jen vzácně způsobují podráždění. Vzhledem k tomu, že tyto filtry vykazují menší účinnost a nižší voděodolnost, vyžadují častější aplikaci. Další jejich nevýhodou je, že při vystavení slunci degradují, v důsledku čehož se snižuje jejich efektivita [1].

Kromě využití UV filtrů jednoho typu je možné v jednom prostředku kombinovat organické a anorganické filtry, přičemž tyto kombinace mohou vykazovat synergický efekt a dosahovat tak vyššího ochranného faktoru.

K hodnocení účinnosti UVB filtrů se používá ochranný faktor SPF („sun protection factor“), který udává poměr dávky UVB záření potřebné k vytvoření minimálního erytému (MED „minimal erythemal dose“) na chráněné pokožce ve srovnání s nechráněnou pokožkou. Tento faktor se stanovuje in vivo. Např. výrobek s ochranným faktorem 15 odfiltruje 94 % UVB záření, výrobek s ochranným faktorem 30 pak 97 % [2].

K hodnocení ochrany před UVA zářením je k dispozici standardní EN ISO 24443:2012 test pro stanovení ochranného faktoru kosmetických prostředků. Kromě ochranného faktoru se u kosmetických přípravků hodnotí také jejich rezistence a rezistence v nich obsažených UV filtrů vůči vodě [2].

Jako jedna z možností, jak prodloužit účinek a stabilitu UV filtrů v kosmetických prostředích se jeví enkapsulace těchto filtrů do vhodných nosičů pro cílený transport do lidského organismu. S ohledem na hydrofobní bariéru na povrchu těla se jako takové nosiče nejčastěji využívají liposomy, které jsou schopné projít touto kožní bariérou, mají hydrofobní povrch a mohou enkapsulovat různé hydrofobní i hydrofilní molekuly.

Současný trend v kosmetice a v oblasti osobní ochrany před UV zářením směřuje k používání přírodních UV filtrů, jako jsou např. karotenoidy, některé polyfenoly, chlorofyly a další přírodní molekuly, často ještě v kombinaci s přírodními antioxidanty (jako např. tokoferolem, askorbátem a různými směsmi), a případně i k využívání přírodních nosičů, aby se co nejvíce eliminovalo používání syntetických polymerů a s tím související zátěž pro životní prostředí. V současné době jsou tak komerčně dostupné například preparáty z různých typů mořských a sladkovodních řas, u nichž se deklaruje nejen ochranný efekt proti UV záření, ale také pozitivní vliv na kůži a omlazovací efekt. Seriózní studie zaměřené na analýzu reálného potenciálu řas k ochraně před UV zářením a jejich použití v kosmetických přípravcích jsou přehledně shrnuté např. v [2]. Z [3] je pak známé, např. použití extraktu z červené řasy (Potphyra umbilicalis) v komplexu s extraktem z Ginkgo biloba a vitaminy A, C a E, který zvyšuje ochranný faktor kosmetického přípravku o 20 %. Z [4] je známé, že extrakt z řas může v kosmetickém přípravku nahradit alespoň část syntetických UV filtrů, neboť působí jako ochrana proti poškození DNA a proti zarudnutí pokožky a současně podporuje buněčnou obnovu. Vhodným zdrojem dalších aktivních látek použitelných pro ochranu před UV zářením jsou mj. také sinice (cyanobakterie) [5]. Např. sinice Scytonema ho^fman, rostoucí při vysokých intenzitách světla (300 až více než 2000 μmol.m^-2.s^-1) je zdrojem scytonemin-3a-iminu, což je nově identifikovaný pigment červeno-mahagonové barvy, který je považován za nový přírodní UV filtr použitelný v kosmetických přípravcích [6]. Kromě řas a extraktů z nich se z hlediska využitelnosti pro ochranu před UV zářením testovala také řada dalších přírodních látek a rostlinných extraktů, jako např. polyfenoly a flavonoidy. Mezi zdroje těchto aktivních látek patří také například zelený čaj, ostropestřec mariánský (Silybum marianum), kurkuma dlouhá, réva vinná, spatodea zvonkovitá, kapara trnitá, bazalka pravá, mandloň obecná (Prunus amygdalus), kaleda lysá (Pongamia pinnata) a další - viz např. [7, 8]. Dále byl aktivně studován také efekt kůry stromu Zanthoxylum rhetsa, který může být využit jako přírodní aktivní složka širokospektrálních opalovacích

- 2 CZ 309769 B6 prostředků a prostředků proti stárnutí [8]. Dalším komplexním přírodním materiálem s vlastností UV filtru jsou různé druhy rostlinných olejů [9], vč. oleje ze zelené kávy [10], pražené kávy [11] i odpadů po přípravě kávy [12]. Nevýhodou je, že pro dosažení ochranného faktoru 20 je nutné tyto přírodní UV filtry kombinovat se syntetickými UV filtry, zejména anorganickými filtry typu TÍO2 nebo ZnO.

Jako potenciální nosiče těchto UV filtrů byla do současné doby vytipována a otestována řada různých polymerů a kompozitů, jako např. nanokompozit na bázi hydroxyapatitu, který absorbuje záření v UV oblasti, a kyseliny askorbové stabilizovaný polyvinylpyrrolidonem, jehož výhodou je, že není cytotoxický [13]. Další variantou je, např. kompozit karboxymethyl-chitosanu a karboxymethylcelulózy z ananasové kůry, který se testoval jako nosič TiO2 [14], apod.

Kromě toho je v současné době známý také gel proti slunečnímu záření s hydroxyapatitem a chitosanem, do kterého může být doplněna řada účinných látek, a který současně likviduje multirezistentní bakterie [15].

Cílem vynálezu je navrhnout UV filtr, čistě na bázi přírodních sloučenin a způsob pro přípravu takového filtru.

Reference

[1] Trager R.: „US bans microbeads from personal care products“ Chemistry Word, January 2016.

[2] Wang H.M.D., Chen Ch.Ch., Hyunh P., Chang J.S.: „Exploring the potential of using algae in cosmetics“ Bioresource Technology 184, 2015, pp. 355-362.

[3] Mercurio D.G., Wagemaker T.A.L., Alves V.M. et al: „In vivo photoprotective effects of cosmetic formulations containing UV filters, vitamins, Ginkgo biloba and red algae extracts“ Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 153, 2015, pp. 121-126.

[4] Chiari B.G., Trovati E., Pecoraro E. et al.: „Synergistic effect of green coffee oil and synthetic sunscreen for health care application“ Industrial Crops and Products 52, 2014, pp.389-393.

[5] Sinha R.P., Hader D.P.: „UV-protectants in cyanobacteria“ Plant Science 174 (3), 2008, pp. 278-289.

[6] Grant C.S., Louda J.W.: „Scytonemin-imine, a mahogany-colored UV/Vis sunscreen of cyanobacteria exposed to intense solar radiation“. Organic Geochemistry 65, 2013, pp. 29-36.

[7] Rojas J., Londono C., Ciro Y.: „THE HEALTH BENEFITS OF NATURAL SKIN UVA PHOTOPROTECTIVE COMPOUNDS FOUND IN BOTANICAL SOURCES“ International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 8(3), 2016.

[8] Santhanam R.K., Akhtar M.T., Ahmad S., Abas F., SafinarIsmail I., Rukayadi Y., Shaari K.: „Utilization of the ethyl acetate fraction of Zanthoxylum rhetsa bark extract as an active ingredient in natural sunscreen formulations“ Industrial Crops and Products 96, 2017, pp.165172.

[9] Lacatusu G.B., Badea N., Ott C., Meghea A.: „Use of various vegetable oils in designing photoprotective nanostructured formulations for UV protection and antioxidant aktivity“ Industrial Crops and Products 67, 2015, pp 18-24.

- 3 CZ 309769 B6

[10] Chiari B.G., Trovati E., Pecoraro E. et al.: „Synergistic effect of green coffee oil and synthetic sunscreen for health care application“ Industrial Crops and Products 52, 2014, pp. 389393.

[11] Rodrigues F., Alves A.C., Nunes C. et al.: „Permeation of topically applied caffeine from a food by-product in cosmetic formulations: Is nanoscale in vitro approach an option?“ International Journal of Pharmaceutics 513 (1-2), 2016, pp. 496-503.

[12] Marto J., Gouveia L.F., Chiari B.G, et al.: „The green generation of sunscreens: Using coffee industrial sub-products“ Industrial Crops and Products 80, 2016, pp. 93-100.

[13] Amin R.M., Elfeky S.A., Verwanger T., Krammer B.: „A new biocompatible nanocomposite as a promising constituent of sunscreens“ Materials Science and Engineering C, Volume 63, 1 June 2016, Pages 46-51. doi.org/10.1016/j.msec.2016.02.044.

[14] Wongkom L., Jimtaisong A.: „Novel biocomposite of carboxymethyl chitosan and pineapple peel carboxymethylcellulose as sunscreen carrier“ Int. J. Biol.Macromolek. Volume 95, February 2017, Pages 873-880.

[15] Morsy R., Ali S.S., El-Shetehy M.: „Development of hydroxyapatite-chitosan gel sunscreen combating clinical multidrug-resistant bacteria“ Journal of Moleculer Structure 1143, 2017, pp. 251-258.

Podstata vynálezu

Cíle vynálezu se dosáhne UV filtrem na bázi polyhydroxybutyrátu, který obsahuje částice z polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 pm, které jsou funkcionalizované alespoň jedním organickým UV filtrem rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn. Tento UV filtr je určený zejména pro dermální aplikace pro osobní ochranu před UV zářením. Všechny jeho složky jsou bezpečné a neškodné vůči lidskému zdraví i životnímu prostředí.

V závislosti na způsobu přípravy je alespoň jeden organický UV filtr rostlinného původu inkorporován, s výhodou s možností uvolnění, ve vnitřní struktuře a/nebo na povrchu částic z polyhydroxybutyrátu, nebo na površích částic z polyhydroxybutyrátu a/nebo v jejich liposomovým obalech a/nebo na površích jejich liposomových obalů a/nebo v prostorech mezi částicemi z polyhydroxybutyrátu a jejich liposomovými obaly.

V případě, kdy je UV filtr tvořen částicí z polyhydroxybutyrátu s liposomovým obalem, je liposomový obal s výhodou tvořený lecithinem a zpevněný cholesterolem, přičemž poměru lecithinu a cholesterolu v tomto obalu je s výhodou 9:1 až 1:1.

Koncentrace polyhydroxybutyrátu u tohoto typu filtrů je pak s výhodou 20 až 30 % hmotn.

Cíle vynálezu se dále dosáhne také způsobem výroby UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu, při kterém se do 0,1 až 20% roztoku polyhydroxybutyrátu v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, přidá alespoň jeden UV filtr rostlinného původu ve formě extraktu do destilované vody nebo do roztoku ethanolu v destilované vodě a z takto vytvořeného roztoku se zvlákňováním vytvoří mikrovlákna o průměru 0,2 až 500 pm s alespoň jedním UV filtrem rostlinného původu zakomponovaným ve své struktuře. Tato mikrovlákna se pro další využití mechanicky dezintegrují např. mixováním a/nebo mletím v mechanickém mlýnu, čímž se z nich vytvoří částice polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 pm, v jejichž struktuře je zakomponovaný alespoň jeden UV filtr rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn. Výhodným způsobem zvlákňování roztoku polyhydroxybutyrátu je odstředivé zvlákňování.

- 4 CZ 309769 B6

V jiné variantě se 0,1 až 20% roztok polyhydroxybutyrátu v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, vytlačí do srážedla, např. 96% ethanolu, přičemž se z něj sráží mikrovlákna polyhydroxybutyrátu o průměru 0,2 až 500 pm, která mají porézní vnitřní strukturu. Takto vytvořená mikrovlákna se následně mechanicky dezintegrují, např. mixováním a/nebo mletím v mechanickém mlýnu, čímž se z nich vytvoří porézní částice polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 pm. Tyto částice se dále inkubují alespoň 1 hodinu při laboratorní teplotě a bez přístupu světla s extraktem alespoň jednoho UV filtru rostlinného původu extrahovaného 20 až 80% roztokem ethanolu v destilované vodě, přičemž se organický UV filtr/filtry přírodního původu sorbuje v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn. do pórů částic z polyhydroxyburytáru a/nebo na jejich povrch.

Srovnatelných výsledků se dosáhne také v případě, kdy se mikrovlákna polyhydroxybutyrátu kontaktují s extraktem alespoň jednoho UV filtru rostlinného původu extrahovaného do 20 až 80% roztoku ethanolu v destilované vodě až během mechanické dezintegrace. I v tomto případě se UV filtr/filtry rostlinného původu sorbuje do pórů a/nebo na povrch vznikajících částic polyhydroxyburytáru v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn.

V jiné variantě způsobu přípravy UV filtru podle vynálezu se v chloroformu v libovolném pořadí rozpustí alespoň jeden fosfolipid, cholesterol a polyhydroxybutyrát, a do takto vytvořeného roztoku se přidá alespoň jeden UV filtr rostlinného původu ve formě extraktu do destilované vody nebo do roztoku ethanolu v destilované vodě. Takto vytvořená směs se naředí destilovanou vodou a vystaví se ultrazvuku, přičemž dojde ke spontánnímu uzavření liposomů tvořených obalem z dvojvrstvy fosfolipidu/fosfolipidů s vnitřním prostorem vyplněným vodnou fází kolem pevného jádra polyhydroxybutyrátu a UV filtr/filtry rostlinného původu se dle polarity uloží v částicích z polyhydroxybutyrátu a/nebo na jejich površích, a/nebo v jejich liposomovým obalech a/nebo na površích jejich liposomových obalů, a/nebo v prostorech mezi částicemi z polyhydroxybutyrátu a jejich liposomovými obaly. Poté se z takto vytvořené směsi odstraní chloroform a oddělí se z ní částice UV filtru, jejichž velikost je 0,2 až 100 pm, a které obsahují alespoň jeden UV filtr rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn.

Ve výhodné variantě provedení se alespoň jeden UV filtr rostlinného původu použije ve formě extraktu do 30 až 40% roztoku ethanolu v destilované vodě.

Pro vytvoření kombinovaných částic tvořených liposomovým obalem a pevným jádrem z polyhydroxybutyrátu, je výhodný poměr fosfolipidu/fosfolipidů a polyhydroxyalkanoátu v roztoku 9:1 až 1:9, výhodnější pak 8:2 až 7:3.

Ve výhodné variantě provedení se jako fosfolipid použijí lecithin a cholesterol v poměru 9:1 až 1:1.

Objasnění výkresů

Na přiložených výkresech je na obr. 1a je snímek liposomových částic z kryogenní elektronové mikroskopie při zvětšení 50 000krát, na obr. 1b snímek kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 10 % hmotn. z kryogenní elektronové mikroskopie při zvětšení 80 000krát, na obr. 1c snímek kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 20 % hmotn. PHB z kryogenní elektronové mikroskopie při zvětšení 50 000krát, na obr. 1d snímek kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 30 % hmotn. z kryogenní elektronové mikroskopie při zvětšení 80 000krát, a na obr. 1e snímek kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 50 % hmotn. z kryogenní elektronové mikroskopie při zvětšení 10 000krát. Na obr. 2 je graf zobrazující obsah polyfenolů v extraktu ze zelené kávy, pražené kávy a zbytků kávových bobů; na obr. 3 graf zobrazující antioxidační aktivitu extraktů ze zelené a pražené kávy vyjádřenou jako ekvivalent

- 5 CZ 309769 B6 koncentrace standardu Troloxu; na obr. 4 graf zobrazující účinnost enkapsulace různých typů extraktů ze zelené kávy, pražené kávy a zbytků kávových bobů do kombinovaných částic tvořených liposomy s přídavkem 30 % hmotn. PHB, a na obr. 5 UV-vis spektra liposomů, PHB a kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s různou koncentrací PHB. Na obr. 6 je graf zobrazující hodnotu ochranného faktoru SPF pro liposomy, PHB a kombinované částice tvořené liposomy a PHB s různou koncentrací PHB a na obr. 7 je graf zobrazující hodnotu ochranného faktoru SPF pro liposomy, PHB a kombinované částice tvořené liposomy a PHB s různým přídavkem extraktu ze zelené a pražené kávy. Na obr. 8a je SEM snímek vláken PHB připravených odstředivým zvlákňováním při zvětšení 1000krát, na obr. 8b a 8c pak SEM snímek vláken PHB, připravených srážením do roztoku, při zvětšení 8000krát a 80 000krát; na obr. 9a je SEM snímek dezintegrovaných vláken PHB připravených odstředivým zvlákňováním a na obr. 9b SEM snímek dezintegrovaných vláken PHB, připravených srážením do roztoku; na obr. 10a pak SEM snímek mletých vláken PHB připravených odstředivým zvlákňováním a na obr. 10b SEM snímek mletých vláken PHB, připravených srážením do roztoku. Na obr. 11a jsou UVvis spektra různých extraktů ze zelené kávy; na obr. 11b UV-vis spektra různých extraktů z pražené kávy a na obr. 11c detail UV-vis spekter pro nejvhodnější extrakty ze zelené a pražené kávy. Na obr. 12 je graf znázorňující cytotoxicitu kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 30 % hmotn., vyjádřenou jako závislost viability keratinocytů na koncentraci těchto částic.

Příklady uskutečnění vynálezu

UV filtr na bázi polyhydroxybutyrátu (PHB) podle vynálezu je tvořen částicemi z PHB o velikosti 0,2 až 500 μm, které jsou funkcionalizované alespoň jedním známým UV filtrem rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn.

Ve výhodné variantě provedení je jádro UV filtru podle vynálezu tvořeno částicí z PHB, přičemž UV filtr/filtry rostlinného původu je/jsou inkorporován/inkorporovány ve vnitřní struktuře této částice a případně i na jejím povrchu. Výhodou tohoto provedení je to, že uložení alespoň části UV filtru/filtrů rostlinného původu ve vnitřní struktuře této částice prodlužuje jeho/jejich stabilitu a účinnost.

Pro výrobu UV filtru podle vynálezu v tomto provedení lze použít tři postupy, které jsou založené na zvlákňování 0,1 až 20% roztoku PHB v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich.

V první variantě se do tohoto roztoku PHB pro zvlákňování přidá požadovaný UV filtr/filtry rostlinného původu, např. ve formě extraktu, a při následném zvlákňování se tento UV filtr/filtry zakomponuje přímo do struktury vytvářených mikrovláken PHB. Pro zvlákňování lze přitom použít libovolný známý postup - např. tryskové nebo beztryskové elektrostatické zvlákňování, srážení z roztoku (např. dle CZ 306448) nebo odstředivé zvlákňování (např. dle CZ 2016-423) atd. Výsledkem jsou přitom vždy mikrovlákna PHB s průměrem v závislosti na použitém postupu 0,2 až 500 pm s UV filtrem/filtry rostlinného původu zakomponovaným/zakomponovanými v jejich struktuře, s výhodou s možností uvolnění. Tato mikrovlákna se přitom pro praktické využití dezintegrují, např. mixováním a/nebo mechanickým mletím či drcením, čímž se z nich připraví částice z PHB o velikosti 0,2 až 500 pm.

Ve druhé variantě se zvlákňováním roztoku PHB, s výhodou srážením z roztoku postupem dle CZ 306448 nebo odstředivým zvlákňováním dle CZ 2016-423, připraví mikrovlákna PHB s průměrem 0,2 až 500 pm. Mikrovlákna PHB připravená těmito postupy jsou přirozeně porézní a mají vysoký měrný povrch, přičemž např. mikrovlákna připravená srážením z roztoku postupem dle CZ 306448 mají měrný povrch v rozmezí 36 až 50 m²/g (BET analýza). Poté se z nich např. mixováním a/nebo mechanickým mletím či drcením připraví porézní částice z PHB o velikosti 0,2 až 500 pm. Takto připravené částice PHB se inkubují s extraktem obsahujícím

- 6 CZ 309769 B6 alespoň jeden UV filtr rostlinného původu, přičemž dochází k sorpci UV filtru rostlinného původu do vnitřní struktury a na povrch těchto částic, s výhodou v takovém poměru, aby se do jejich struktury navázal ekvivalent 20 až 100 mg původního materiálu (např. kávy - viz níže) na 1 g vláken (čímž se dosáhne celkové koncentrace organického UV filtru/filtrů v těchto částicích 2 až 10 % hmotn.). Pro inkubaci se přitom UV filtr/filtry rostlinného původu používá ve formě ethanolového extraktu (extrakce 20 až 80% roztokem ethanolu v destilované vodě) nebo olejového extraktu (extrakce do směsi methanolu a chloroformu - extrakce dle Folche). Inkubace probíhá alespoň 1 hodinu při laboratorní teplotě a bez přístupu světla.

Ve třetí variantě se alespoň jeden UV filtr rostlinného původu přidává k mikrovláknům PHB ve stejném množství a ve stejné formě, jako v předchozí variantě, již během jejich dezintegrace. Doba dezintegrace (obvykle 5 až 30 min) přitom nemá na výsledný materiál a jeho vlastnosti podstatnější vliv.

V jiné variantě UV filtru podle vynálezu tvoří PHB pevné jádro tohoto UV filtru, přičemž je toto jádro opatřené liposomovým obalem, a alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je v závislosti na své polaritě uložen v jádru nebo liposomovém obalu nebo v prostoru mezi nimi, který je vyplněný hydrofilním prostředím.

Pro přípravu této varianty UV filtru se nejprve rozpustí fosfolipid/fosfolipidy (např. lecithin), s výhodu s přídavkem cholesterolu, který následně zpevní liposomovou strukturu a PHB v chloroformu. Do takto vytvořeného roztoku se přidá alespoň jeden UV filtr rostlinného původu, např. ve formě extraktu do destilované vody nebo roztoku ethanolu v destilované vodě apod. (viz výše). Poté se takto vytvořená směs naředí destilovanou vodou a vystaví se ultrazvuku. Přitom dojde k její homogenizaci a také ke spontánnímu uzavření liposomů tvořených obalem z dvojvrstvy fosfolipidu/fosfolipidů s vnitřním prostorem vyplněným vodnou fází, kolem pevného jádra z PHB. UV filtr rostlinného původu se přitom dle své polarity zařadí do jádra z PHB, liposomového obalu nebo do vodné fáze mezi nimi. Po odpaření chloroformu se z roztoku, např. centrifugací oddělí vytvořené částice UV filtru. Tyto částice mají menší velikost než částice připravené předchozími postupy - cca 0,2 až 100 pm. Vzájemný poměr fosfolipidu/fosfolipidů a cholesterolu je 9:1 až 1:1.

PHB pro přípravu UV filtru podle vynálezu může být připraven libovolným ze známých způsobů pro jeho přípravu, přičemž výhodný je zejména způsob známý z CZ patentu 304183 nebo analogické mezinárodní přihlášky WO 2014032633, podle kterého je PHB produkován bakterií Cupriavidus necator H16 na olejovém substrátu. Při tomto postupu přirozeně vzniká i určitý malý podíl (cca do 5 %) polyhydroxybutyrátu-valerátu (PHBV), který se při přípravě UV filtru podle vynálezu chová stejně jako PHB, a proto zde není samostatně uváděn.

Jak bude dále popsáno v příkladech 1 až 4, UV filtry pode vynálezu dosahují ve všech variantách provedení vysokého ochranného faktoru SPF, neboť k absorpci UV záření přispívá kromě UV filtru/filtrů rostlinného původu také samotný PHB (a PHBV), který je schopen absorbovat nebo rozptylovat část UV záření a sám dosahuje v závislosti na koncentraci ochranného faktoru SPF cca 5 až 14. Díky svému hydrofobnímu charakteru danému buď přítomností liposomového obalu nebo povahou PHB je tento UV filtr dostatečně odolný vůči působení vody a současně je schopný částečně proniknout do pokožky a/nebo se udržet v jejích horních vrstvách; přitom jsou všechny jeho složky bezpečné a neškodné vůči lidskému zdraví i životnímu prostředí.

Příklad 1: Příprava liposomů, příprava kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB, a příprava částic z PHB

Rozpuštěním 90 mg lecithinu a 10 mg cholesterolu v chloroformu se připravil roztok pro přípravu liposomů. Tento roztok se následně naředil 10 ml destilované vody a poté se po dobu 1 minuty vystavil působení ultrazvuku (sondový ultrazvuk Sonopuls, Bandelin; průměr sondy 13 mm; frekvence 20 kHz). Přitom došlo k jeho homogenizaci a ke spontánnímu uzavření

- 7 CZ 309769 B6 liposomů tvořených obalem z dvojvrstvy fosfolipidů stabilizované cholesterolem a vnitřkem vyplněným vodnou fází. Poté se pomocí magnetické míchačky s ohřevem z tohoto roztoku zcela odpařil chloroform (zbytková koncentrace nižší než 0,06 pmol/l) a vytvořené liposomy se oddělily centrifugací při 6000 ot/min, která probíhala po dobu 5 minut. Po oddělení supernatantu se sediment tvořený liposomy rozsuspendoval ve sterilní vodě.

Rozpuštěním 80 mg lecithinu, 10 mg cholesterolu a 10 mg PHB (v libovolném pořadí) v chloroformu se připravil roztok pro výrobu kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB. Tento roztok se následně naředil 10 ml destilované vody a poté se po dobu 1 minuty vystavil působení ultrazvuku (sondový ultrazvuk Sonopuls, Bandelin; průměr sondy 13 mm; frekvence 20 kHz). Přitom došlo k jeho homogenizaci a ke spontánnímu uzavření liposomových částic tvořených obalem z dvojvrstvy fosfolipidů stabilizované cholesterolem a vnitřkem vyplněným vodnou fází a s pevným jádrem tvořeným částicí z PHB o velikosti až 100 pm. Poté se pomocí magnetické míchačky s ohřevem z tohoto roztoku zcela odpařil chloroform a vytvořené kombinované částice se oddělily centrifugací při 6000 ot/min, která probíhala po dobu 5 minut. Po oddělení supernatantu se sediment tvořený kombinovanými částicemi rozsuspendoval ve sterilní vodě. Koncentrace PHB v takto připravených kombinovaných částicích byla 10 % hmotn.

Stejným postupem se dále připravily kombinované částice tvořené liposomovým obalem a pevným jádrem z PHB, které obsahovaly PHB v koncentraci 20 %, 30 %, 50 % a 70 % hmotn. Podíl PHB se přitom vždy zvyšoval na úkor podílu lecithinu.

Rozpuštěním 100 mg PHB v chloroformu se připravil roztok pro přípravu částic z PHB. Tento roztok se následně naředil 10 ml destilované vody a poté se po dobu 1 minuty vystavil působení ultrazvuku (sondový ultrazvuk Sonopuls, Bandelin; průměr sondy 13 mm; frekvence 20 kHz). Přitom došlo ke spontánnímu vytvoření částic z PHB v průměrem až 100 pm.

Ve všech případech se přitom použil PHB připravený způsobem dle CZ patentu 304183 ve formě jemného prášku s velikostí částic 0,2 až 10 pm.

Unikátní struktura takto vytvořených částic se ověřila pomocí kryogenní elektronové mikroskopie (cryo-TEM, přístroj FEI Tecnai F20), jejich velikost a stabilita pak metodou dynamického rozptylu světla (DLS, přístroj ZetaSizer Nano ZS, Malvern) - viz níže.

Jako kontrolní a srovnávací vzorek se použil PHB komerčně dodávaný spol. Biomer (Německo).

Stanovení struktury částic pomocí kryogenní elektronové mikroskopie

Kryogenní elektronová mikroskopie je vysoce citlivá technika a současně jediná možná metoda, kterou lze zobrazit mikrostrukturu částic uspořádaných ze dvou různých bezbarvých materiálů. Svazek elektronů přitom prochází velmi tenkou vrstvou vzorku a jejich vzájemná interakce se zaznamenává ve formě detailní struktury materiálu, jímž elektrony prochází. Zobrazit kvalitně pomocí této metody se podařilo pouze vzorky liposomů a kombinovaných částic s koncentrací PHB do 50 % hmotn. Vzorky kombinovaných částic s koncentrací PHB 70 a 100 % hmotn. se chovaly již při přípravě odlišně a nebylo možné je spolehlivě zobrazit.

Na obr. 1a je snímek z kryogenní elektronové mikroskopie liposomů bez přítomnosti PHB při zvětšení 50 000krát, na kterém jsou zachyceny liposomy ve formě většinou unilamelárních částic o jednotné velikosti okolo 100 až 300 nm.

Na obr. 1b je snímek z kryogenní elektronové mikroskopie kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 10 % hmotn. při zvětšení 80 000krát, ze kterého je patrný výrazný vliv PHB na strukturu těchto částic. Vytvořené částice mají pevné jádro z PHB, na kterém jsou shluknuty stěny liposomů, které tak svou hydrofilní slupkou chrání hydrofobní polymer.

- 8 CZ 309769 B6

Na obr. 1c je snímek z kryogenní elektronové mikroskopie kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 20 % hmotn. při zvětšení 50 000krát, na kterém jsou zachyceny částice podobné těm, jako na obr. 1b, jen větší.

Na obr. 1d je snímek z kryogenní elektronové mikroskopie kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 30 % hmotn. při zvětšení 80 000krát, na kterém jsou zachyceny částice podobné těm na obr. 1b a 1c, ale větší. Navíc se mezi nimi začínají objevovat samotné částice a shluky PHB, které mají oproti liposomům vyšší hustotu a při delší fokusované expozici v mikroskopu se mění jejich struktura.

Na obr. 1e je snímek z kryogenní elektronové mikroskopie kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 50 % hmotn. při zvětšení 10 000krát, na kterém jsou patrné především částice PHB o velikosti cca 100 nm. Okolo nich je zřejmě vytvořená liposomová monovrstva, která je chrání před hydrofilním vodním prostředím.

Stanovení velikosti částic pomocí DLS, a jejich koloidní stabilita

Velikost liposomů, částic z PHB a kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 10, 20, 30, 50 a 70 % hmotn. se stanovila metodou dynamického rozptylu světla (DLS) na přístroji ZetaSizer Nano ZS. Stejnou metodou se současně stanovil jejich polydisperzitní index (Pdl - rozptyl velikosti částic) a zeta potenciál (ZP), který definuje jejich koloidní stabilitu. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Vzorek	Velikost částic [nm]	Pdl	ZP [mV]
Liposomové částice	135,9	0,207	-31,6
Kombinované částice s koncentrací PHB 10 % hmotn.	194,3	0,262	-36,3
Kombinované částice s koncentrací PHB 20 % hmotn.	255,3	0,334	-42,1
Kombinované částice s koncentrací PHB 30 % hmotn.	263,2	0,301	-40,0
Kombinované částice s koncentrací PHB 50 % hmotn.	218,3	0,312	-53,7
Kombinované částice s koncentrací PHB 70 % hmotn.	265,2	0,267	-42,5
Částice z PHB	771,9	0,739	-34,4

Průměrná velikost částic se pohybuje do 300 nm a polydisperzitní index do 0,32. Výjimku tvoří jen vzorek částic z PHB, který má průměrnou velikost částic 770 nm a Pdl 0,74. Koloidní stabilita všech částic je vysoká a přesahuje významně limit stability daný hodnotou zeta potenciálu (ZP) -30 mV.

Příklad 2: Příprava liposomů, kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB a částic z PHB s přídavkem UV filtru rostlinného původu

Příprava částic

Stejným způsobem jako v příkladu 1 se připravily liposomy, kombinované částice tvořené liposomy a PHB a částice z PHB, přičemž před sonifikací se do roztoků pro přípravu těchto částic přidaly různé extrakty ze zelené kávy, pražené kávy nebo zbytku kávových bobů (cascara) - viz níže, přičemž množství extraktu bylo vždy takové, aby se dosáhlo výsledné koncentrace původního materiálu 200 pg/ml, tedy 2 % hmotn.

- 9 CZ 309769 B6

Extrakce a charakterizace organických UV filtrů přírodního původu

Jako modelový UV filtr rostlinného původu se použily aktivní látky extrahované ze zelené kávy, pražené kávy a ze zbytků kávových bobů. Extrakce probíhala 30 až 60 minut při laboratorní teplotě. Jako extrakční činidlo se přitom pro hydrofilní složky použila destilovaná voda a 20 až 96% roztok ethanolu v destilované vodě, a pro hydrofobní složky směs methanolu a chloroformu v poměru 2:1 (extrakce dle Folche). Jak je patrné z následujícího, nejlépe se jako extrakční činidlo osvědčil 20 až 60% roztok ethanolu v destilované vodě.

U takto vytvořených extraktů se následně stanovil obsah polyfenolů, flavonoidů a pomocí ABTS radikálu jejich antioxidační aktivita. Kromě toho se měřila jejich UV-vis absorpční spektra a z naměřených hodnot pro UVB oblast se dle Mansurovy rovnice dopočítala hodnota ochranného faktoru SPF.

Stanovení polyfenolů

Obsah polyfenolů v jednotlivých extraktech se stanovil spektrofotometricky. Takto stanovený obsah polyfenolů je graficky znázorněn na obr. 2, ze kterého je zřejmé, že nejvíce polyfenolů ze zelené kávy se vyextrahovalo do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě, z pražené kávy do 60% roztoku ethanolu v destilované vodě a ze zbytků kávových bobů do 20% roztoku ethanolu v destilované vodě. Z obr. 2 je současně zřejmé, že extrakce je v případě zelené kávy nejúčinnější při použití 20% a 40% roztoku ethanolu v destilované vodě, v případě pražené kávy pak při použití 60% roztoku ethanolu v destilované vodě.

Extrakce dle Folche byla provedena jen u vzorku pražené kávy, kdy se obsah polyfenolů shodoval s extraktem připraveným s použitím 90% roztoku ethanolu v destilované vodě.

Stanovení flavonoidů

Spektrofotometricky se současně stanovil obsahy flavonoidů v jednotlivých extraktech. Při extrakci do destilované vody nebo 20 až 80% roztoku ethanolu v destilované vodě byl vyšší obsah flavonoidů u vzorků zelené kávy, při extrakci do roztoku s obsahem ethanolu 90 a 96 % byl vyšší obsah flavonoidů u vzorků pražené kávy. Celkově byl však obsah flavonoidů v extraktu z pražené kávy nižší než u extraktu ze zelené kávy a pohyboval se v rozmezí 5 až 35 mg/ml; u extraktu ze zelené kávy pak o 10 až 15 % výše. Při extrakci dle Folche byl z pražené kávy naopak extrahován až čtyřnásobný obsah flavonoidů - 165 mg/ml.

Antioxidační aktivita

Antioxidační aktivita extraktů ze zelené kávy extrahovaných do destilované vody a do 20 až 60% roztoků ethanolu v destilované vodě byla velice podobná a pohybovala se mezi 5 a 7 mg^g ¹(vyjádřeno jako mg ekvivalentu standardu Trolox na gram výchozího materiálu přírodního UV filtru). Podobné hodnoty antioxidační aktivity byly naměřeny také u extraktů z pražené kávy extrahovaných do 20, 90 a 96% roztoků ethanolu v destilované vodě. Při extrakci vzorků zelené kávy roztoky s vyššími koncentracemi ethanolu byla antioxidační aktivita vzorků téměř nulová. Naopak při extrakci vzorků pražené kávy do 40 až 80% roztoku ethanolu v destilované vodě byla antioxidační aktivita významně vyšší a dosahovala hodnot mezi 20 a 30 mg^g ¹

Na obr. 3 je uveden graf znázorňující antioxidační aktivitu jednotlivých extraktů ze zelené a pražené kávy extrahovaných do destilované vody (na obr. označen jako 0 %) a do 20, 40, 60, 80, 90 a 96% roztoku ethanolu v destilované vodě.

- 10 CZ 309769 B6

Enkapsulační účinnost

Pomocí stanovení množství polyfenolů uvolněných z částic se stanovila účinnost enkapsulace kombinovaných částic s koncentrací PHB 30 % hmotn. pro různé typy extraktů. Na obr. 4 je takto zjištěná účinnost enkapsulace znázorněna graficky. Jednotlivé sloupce představují zleva: enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt ze zelené kávy extrahovaný do destilované vody, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt z pražené kávy extrahovaný do destilované vody, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt ze zbytků kávových bobů extrahovaný do destilované vody, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt ze zelené kávy extrahovaný do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt z pražené kávy extrahovaný do 20% roztoku ethanolu v destilované vodě, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt ze zbytků kávových bobů extrahovaný do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt z pražené kávy při extrakci de Folche, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt ze zelené kávy při extrakci de Folche, enkapsulační účinnost kombinovaných částic pro extrakt ze zbytků kávových bobů při extrakci de Folche.

Stanovení ochranného faktoru SPF liposomů, kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB, a částic z PHB

Liposomy, částice z PHB a kombinované částice tvořené liposomy a PHB s koncentrací PHB 10, 20, 30, 50 a 70 se naředily v ethanolu a poté se na UV-vis spektrofotometru měřila jejich absorbance pro záření s vlnovou délkou 280 až 320 nm (s krokem 5 nm). Ilustrační UV-vis spektra těchto částic jsou uvedena na obr. 5. Z těchto spekter se následně dle Mansurovy rovnice dopočítaly hodnoty ochranného faktoru SPF těchto částic, které jsou graficky znázorněné na obr. 6. Z obr. 6 je patrné, že nejvyšší hodnoty ochranného faktoru SPF dosáhly kombinované částice tvořené liposomy a PHB s koncentrací PHB 70 % hmotn. Tyto částice jsou ale už příliš kompaktní a kvůli tomu, že jsou tvořené prakticky jen PHB obaleným jednoduchou vrstvou fosfolipidů (viz např. obr. 1e) se do nich UV filtr rostlinného původu inkorporuje jen obtížně. Z hlediska struktury částic, stability a zajištění kombinovaného efektu liposomů, PHB a organického UV filtru se jako nejvhodnější pro dermální aplikaci jeví kombinované částice s koncentrací PHB kolem 20 až 30 % hmotn., které mají ochranný faktor SPF kolem 6 a nejsou cytotoxické (viz příklad 4).

Stanovení ochranného faktoru SPF extraktů, liposomů, kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB, a částic z PHB s UV filtrem rostlinného původu

Liposomy a částice z PHB bez obsahu extraktu (obr. 7 - liposomy prázdné, resp. PHB prázdné), liposomy a částice z PHB s obsahem extraktu z pražené kávy extrahovaného do destilované vody (obr. 7 - lip praž voda, resp. PHB praž voda), liposomy částice a částice z PHB s obsahem extraktu ze zelené kávy extrahované do destilované vody (obr. 7 - lip zel voda, resp. PHB zel voda), a liposomy a částice z PHB s obsahem extraktu ze zelené kávy extrahovaného do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě (obr. 7 - lip zel 40%, resp. PHB zel 40%) se naředily v ethanolu a poté se na UV-vis spektrofotometru měřila jejich absorbance pro záření s vlnovou délkou 280 až 320 nm (s krokem 5 nm). Z těchto spekter se následně dle Mansurovy rovnice dopočítaly hodnoty ochranného faktoru SPF, které jsou graficky znázorněné na obr. 7, ze kterého je zřejmé, že nejvyšší hodnotu ochranného faktoru SPF měl vzorek zelené kávy extrahovaný do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě. Jeho ochranný faktor SPF měl hodnotu 31,8. K ochrannému efektu proti poškození UV zářením přitom významně přispívá i vysoký antioxidační účinek použitých extraktů.

Dále se připravily liposomy, částice z PHB a kombinované částice tvořené liposomy a PHB s koncentrací PHB 10, 20, 30, 50 a 70 % hmotn., které obsahovaly extrakt ze zelené kávy extrahovaný do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě s koncentrací původního materiálu

- 11 CZ 309769 B6

200 pg/ml, tedy 2 % hmotn. Tento extrakt se přitom inkorporoval dílem do jádra tvořeného PHB, dílem do liposomového obalu a dílem do prostoru mezi nimi vyplněného hydrofilním prostředím. Ochranný faktor SPF pro tyto částice dosahoval hodnotu 25,75 až 38,5 - viz tabulka 2.

Tabulka 2

Částice	SPF	Směrodatná odchylka SD
Liposomy bez extraktu	3,95	0,32
Liposomy s extraktem ze zelené kávy	33,80	4,12
Kombinované částice s koncentrací PHB 10 % hmotn. s extraktem ze zelené kávy	34,75	2,56
Kombinované částice s koncentrací PHB 20 % hmotn. s extraktem ze zelené kávy	32,62	1,88
Kombinované částice s koncentrací PHB 30 % hmotn. s extraktem ze zelené kávy	38,50	2,54
Kombinované částice s koncentrací PHB 50 % hmotn. s extraktem ze zelené kávy	25,75	3,80
Kombinované částice s koncentrací PHB 70 % hmotn. s extraktem ze zelené kávy	27,80	4,60
Částice PHA s extraktem ze zelené kávy	32,20	3,64
Extrakt ze zelené kávy extrahovaný do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě	31,50	0,59

Příklad 3: Částice z PHB vytvořené dezintegrací mikrovláken PHB

Materiál

Způsobem dle CZ patentu 304183 se připravil PHB se střední molekulovou hmotností 50 000 až 1 000 000 Da, který se mletím zpracoval do formy granulátu s velikostí částic 200 až 500 pm. Takto vytvořený granulát se rozpustil v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, čímž se vytvořil roztok pro zvlákňování s koncentrací PHB 0,1 až 20 % hmotnostních. Tento roztok se poté zvlákňuje libovolným způsobem zvlákňování - např. tryskovým nebo beztryskovým elektrostatickým zvlákňováním, s výhodou pak srážením z roztoku (např. dle CZ 306448) nebo odstředivým zvlákňováním (např. dle CZ 2016-423) atd., přičemž se z něj vytvářejí mikrovlákna PHB s průměrem mezi 0,2 a 500 pm.

Příprava porézních mikročástic z mikrovláken PHB

Ze 4% roztoku PHB v chloroformu připraveného výše popsaným způsobem se způsobem odstředivého zvlákňování dle CZ PV 2016-423 připravila porézní mikrovlákna PHB s průměrem 0,5 až 100 pm. Čirý lehce nažloutlý roztok PHB se přitom rychlostí 1 ml/s přiváděl na rotující disk, který se otáčel rychlostí 20 000 otáček za minutu. Přitom se okamžitě ve vzdálenosti cca 10 cm od disku vytvořila síť bílých vláken. Tato mikrovlákna se následně sušila a charakterizovala elektronovou mikroskopií. SEM snímek takto připravených mikrovláken při zvětšení 1000krát je na obr. 8a.

Mikrovlákna PHB s vyšší porézností se připraví srážením z roztoku způsobem dle CZ 306448, kdy se připraví 0,1 až 20% roztok PHB v chloroformu, který se následně vytlačuje do vhodného srážedla, kterým je např. ethanol o koncentraci 96 %. Průměr takto vytvořených mikrovláken je cca 0,2 až 100 pm, jejich délka stovky mikrometrů až milimetrů. SEM snímky tímto způsobem připravených mikrovláken při zvětšení 8000krát je na obr. 8b a při zvětšení 80 000krát na obr. 8c.

- 12 CZ 309769 B6

Mikrovlákna vytvořená kterýmkoliv z těchto způsobů se rozstříhala a rozmixovala na částice o velikosti v rozmezí 0,2 až 500 pm - viz obr. 9a na kterém je SEM snímek nastříhaných a rozmixovaných vláken připravených odstředivým zvlákňováním, a obr. 9b, na kterém je SEM snímek nastříhaných a rozmixovaných vláken připravených vytlačováním do srážedla. Pokud by pouhé rozstříhání a rozmixování vláken nebylo dostatečné, je možné je nahradit nebo doplnit mletím v mechanickém mlýnu.

Na obr. 10a je pak SEM snímek takto připravených částic z PHB o rozměru 1 pm v každém směru.

Takto vytvořené částice z PHB se vyznačují podobným rozměrem jako mletý komerční polymer (Biomer), mají však podstatně vyšší sorpční kapacitu pro přírodní látky.

Všechny částice připravené dezintegrací mikrovláken PHB mohou být využity jako nosiče UV filtrů rostlinného původu pro dermální aplikace (do opalovacích prostředků nebo pleťových masek apod.).

Příklad 4: Způsob funkcionalizace částic z PHB vytvořených dezintegrací mikrovláken PHB UV filtrem rostlinného původu

U částic z PHB připravených postupem dle příkladu 3 se zkoumala možnost sorpce UV filtrů rostlinného původu do jejich struktury během zvlákňování a u již připravených vláken, která se poté vyhodnotila kvalitativně pomocí časově rozlišené fluorescenční mikroskopie FLIM. Sorpce během zvlákňování vedla k začlenění UV filtru rostlinného původu do struktury vlákna, sorpce během dezintegrace byla zahájena přídavkem UV filtru rostlinného původu k vláknům těsně před dezintegrací. Sorpce na již připravená vlákna probíhala alespoň 1 hodinu při laboratorní teplotě a bez přístupu světla.

Poněvadž dosud nikde není popsán vliv dezintegrace mikrovláken PHB na hodnotu jejich ochranného faktoru SPF, testovala se kromě dezintegrovaných mikrovláken PHB, také mikrovlákna PHB s přádavkem různých extraktů z kávy, které se k materiálu mikrovláken přidaly v různé fázi jejich zpracování (během jejich přípravy, během jejich dezintegrace, po dezintegraci).

Podrobně se testovalo několik různých materiálů, připravených různými postupy a za různých podmínek - viz tabulka 3. Jako kontrolní se použil mletý PHB komerčně dostupný od společnsoti Biomer a supernatant odebraný z tohoto vzorku.

UV-VIS spektra aktivních látek

U extraktů ze zelené kávy (absorpční spektra na obr. 11a) a z pražené kávy (absorpční spektra na obr. 11b) extrahovaných do destilované vody, 20% roztoku ethanolu v destilované vodě, 40% roztoku ethanolu v destilované vodě, 60% roztoku ethanolu v destilované vodě roztoku, 80% roztoku ethanolu v destilované vodě, 90% roztoku ethanolu v destilované vodě a 96% roztoku ethanolu v destilované vodě se na UV-VIS spektrofotometru měřila jejich absorbance pro záření s vlnovou délkou 280 až 800 nm (s krokem 5 nm; detail příslušné části absorpčního spektra vybraných vzorků viz obr. 11c). Jako nejvhodnější pro UV filtry podle vynálezu se z této skupiny vybraly vzorky extraktu ze zelené kávy extrahované do destilované vody, do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě, 60% roztoku ethanolu v destilované vodě a 80% roztoku ethanolu v destilované vodě, a extraktu pražené kávy do 20% roztoku ethanolu v destilované vodě - viz obr. 11c.

Z takto získaných spekter se dle Mansurovy rovnice dopočítala hodnota ochranného faktoru SPF pro mikrovlákna PHB a částice připravené dezintegrací těchto mikrovlákna bez obsahu extraktu a

- 13 CZ 309769 B6 pro mikrovlákna PHB a částice připravené dezintegrací těchto mikrovláken s extraktem ze zelené kávy do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě - viz tabulka 3.

Tabulka 3

Označení	PHB	PHB s extraktem ze zelené kávy
	SPF	SD	SPF	SD
Dezintegrovaná mikrovlákna PHB (9 g mikrovláken/200 ml destilované vody; mixováno)	3,95	0,32	12,44	1,20
PHB získaný postupem dle z CZ patentu 304183 ve formě částic	12,2	0,82	35,15	2,56
Dezintegrovaná mikrovlákna PHB (4,5 g mikrovláken/200 ml destilované vody; mixováno 10 minut)	3,75	0,54	15,85	1,98
Dezintegrovaná mikrovlákna PHB (4,5 g mikrovláken/200 ml destilované vody; mixováno 5 minut)	3,62	0,46	17,75	3,53
Mikrovlákna PHB (4,5 g mikrovláken/200ml destilované vody) připravená odstředivým zvlákňováném s 10% přídavkem kávového extraktu	-	-	15,85	1,98
Mikrovlákna PHB (4,5 g mikrovláken/200 ml destilované vody) připravená srážením roztoku PHB do srážedla, desintegrovaná v přítomnosti 15 ml extraktu ze směsi zelené a pražené kávy extrahovaného do 40% roztoku	-	-	17,75	3,53
ethanolu v destilované vodě
Biomer - kontrolní vzorek částic PHB o velikosti 1 až 100 pm	6,42	0,72	18,50	2,82
Supernatant z kontrolního vzorku	5,82	0,28	-	-
Částice z PHB o velikosti do 200 pm připravené desitegrací mikrovláken připravených srážením roztoku PHB	12,46	0,59	36,20	4,41
Částice z PHB o velikosti do 200 pm připravené desitegrací mikrovláken připravených odstředivým zvlákňováním roztoku PHB	11,65	0,68	34,50	3,82

Vzorek mletého PHB připraveného postupem dle z CZ patentu 304183 měl ochranný faktor SPF 12,2, zatímco PHB spol. Biomer ve formě částic o rozměru 1 až 100 pm měl SPF 6,4. Ochanný faktor SPF u částic z PHB připravených hrubou dezintegrací mikrovláken PHB připravenách 10 odtředivým zvlákňováním (obr. 9a) byl 3,75 (při mixování 10 minut), resp. 3,62 (při mixování 5 minut). Z toho je zřejmé, že doba dezintegrace neměla na výslednou hodnotu ochranného faktoru SPF významný vliv. Ochranný faktor SPF částic z PHB připravených jemnou dezintegrací mikrovláken PHB připravených odstředivým zvlákňováním (obr. 10a) byl 11,65; částic z PHB připravených srážením roztoku pak 12,46. Z obr. 10b je patrné, že i po dezintegraci 15 si porézní mikrovlákna PHB zachovala vnitřní komplexní nanostrukturu, což je velmi důležité pro sorpci organických UV filtrů.

Z tabulky 3 je současně zřejmé, že po přidání extraktu ze zelené kávy extrahovaného do 40% roztoku ethanolu v destilované vodě došlo k fyzikální adsorpci tohoto materiálu na mikrovlákna

- 14 CZ 309769 B6

PHB, přičemž u většiny vzorků stoupla hodnota ochranného faktoru SPF o 7 až 23. Celkově bylo možné dosáhnout hodnotu SPF cca 35, tedy podobnou jako u kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s extraktem ze zelené kávy o stejné koncentraci (srov. obr.7).

Stanovení interakce složek UV filtrů podle vynálezu s buňkami

Testy cytotoxicity a genotoxicity

Cytotoxicita

Cytotoxicita extraktů a liposomů se stanovila MTT testem, který je založený na tom, že žluté barvivo MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) je mitochondriálními enzymy dýchacího řetězce buněk redukováno na fialový formazanový derivát, který zůstává uvnitř buněk ve formě nerozpustných granulí. Přidáním detergentu SDS (dodecylsíran sodný) se barvivo z buněk uvolní a rozpustí, a tím vznikne čirý fialový roztok, který se měří spektrofotometricky při 540 nm. Test se provádí vždy s koncentrační řadou testovaného materiálu, v daném případě se k lidským buňkám v médiu přidaly liposomy s obsahem 30 % hmotn. PHB ve výsledné koncentraci 2 až 14 % v celkovém objemu a směs se inkubovala 24 hodin. Přitom se zjistilo, že liposomy ani kombinované částice tvořené liposomy a PHB nevykazovaly cytotoxický účinek.

Na obr. 12 je uveden graf viability keratinocytů v závislosti na koncentraci kombinovaných částic tvořených liposomy a PHB s koncentrací PHB 30 % hmotn. a s přídavkem extraktu ze zelené nebo pražené kávy v koncentraci 200 μg/g. Za hraniční hodnotu pro určení vzorku jako cytotoxického je považována hodnota přeživších buněk 60% a méně. Tabulka 4 shrnuje výsledky spektrofotometrického stanovení intenzity fialového roztoku rozpuštěných krystalů formazanu vyjadřující množství živých buněk blanku (%) v porovnání s intenzitou tohoto roztoku v závislosti na množství kombinovaných částic. Čím více kombinovaných částic se přidalo, tím více se snižovala viabilita buněk. Za cytotoxickou lze považovat koncentraci kombinovaných částic vyšší než 12 %. Přídavek vláken cytotoxicitu nevykazoval.

- 15 CZ 309769 B6

Tabulka 4

Materiál	Viabilita %	Směrodatná odchylka SD
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 2 % hmotn.	98	4,2
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 4 % hmotn.	94	8,3
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 6 % hmotn.	84	7,2
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 8 % hmotn.	75	5,6
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 10 % hmotn.	66	6,8
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 12 % hmotn.	61	5,2
Kombinované čátice s extraktem z kávy, koncentrace 14 % hmotn.	55	7,4
2,2 mg mletého PHB o velikosti do 500 pm připraveného postupem dle CZ patentu 304183	82	8,8
2,2 mg mletých mikrovláken PHB připravených srážením roztoku PHB	83,5	9,6
2,2 mg mletých mikrovláken PHB připravených odstředivým zvlákňváním roztoku PHB	87,5	7,6
3 mg mletého PHB o velikosti do 500 pm připraveného postupem dle CZ patentu 304183	72,2	6,5
3 mg mletých mikrovláken PHB připravených srážením roztoku PHB	62,8	6,3
3 mg mletých mikrovláken PHB připravených odstředivým zvlákňváním roztoku PHB	65,2	8,2

Genotoxicita

U stejných vzorků se SOS chromotestem stanovila jejich genotoxicita. Tato metoda je založená na sledování exprese genů indukovaných toxickými činidly v důsledku poškození DNA. Hodnocený vzorek působí během inkubace na geneticky modifikovaný kmen E. Coli, u kterého 10 je gen pro β-galaktosidázu spojen s promotory reparačních genů. Po dané době je u exponovaných kultur hodnocena exprese galaktosidázy, která odpovídá míře SOS odpovědi. Měří se spektrofotometricky. Za genotoxickou je považována látka, která má hodnotu SOSIF větší nebo rovno 1,5. Žádný z testovaných materiálů této hodnoty nedosahuje.

Claims

1. UV filtr na bázi polyhydroxybutyrátu, vyznačující se tím, že obsahuje částice z polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 pm, které jsou funkcionalizované alespoň jedním UV filtrem rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn.

2. UV filtr podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je inkorporován ve vnitřní struktuře a/nebo na povrchu částic z polyhydroxybutyrátu.

3. UV filtr podle nároku 2, vyznačující se tím, že alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je ve vnitřní struktuře a/nebo na povrchu částic z polyhydroxybutyrátu inkorporován s možností uvolnění.

4. UV filtr podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že částice z polyhydroxybutyrátu jsou porézní a alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je inkorporován v jejich pórech a/nebo na jejich povrchu.

5. UV filtr podle nároku 4, vyznačující se tím, že alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je v pórech a/nebo na povrchu částic z polyhydroxybutyrátu inkorporován s možností uvolnění.

6. UV filtr podle nároku 1, vyznačující se tím, že částice z polyhydroxybutyrátu mají velikost 0,2 až 100 pm a jsou obaleny liposomovým obalem, přičemž prostory mezi částicemi z polyhydroxybutyrátu a jejich liposomovými obaly jsou vyplněné vodným prostředím, a alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je uložený na površích částic z polyhydroxybutyrátu a/nebo v jejich liposomovým obalech a/nebo na površích jejich liposomových obalů a/nebo v prostorech mezi částicemi z polyhydroxybutyrátu a jejich liposomovými obaly.

7. UV filtr podle nároku 6, vyznačující se tím, že alespoň jeden UV filtr rostlinného původu je uložený na površích částic z polyhydroxybutyrátu a/nebo v jejich liposomových obalech a/nebo na površích jejich liposomových obalů a/nebo v prostorech mezi částicemi z polyhydroxybutyrátu a jejich liposomovými obaly s možností uvolnění.

8. UV filtr podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že liposomový obal částic z polyhydroxybutyrátu je tvořen lecithinem a cholesterolem v hmotnostním poměru 9:1 až 1:1.

9. UV filtr podle libovolného z nároků 6 až 8, vyznačující se tím, že koncentrace polyhydroxybutyrátu v částicích UV filtru je 20 až 30 % hmotn.

10. Způsob výroby UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se do 0,1 až 20% hmotn. roztoku polyhydroxybutyrátu v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, přidá alespoň jeden UV filtr rostlinného původu ve formě extraktu do destilované vody nebo do roztoku ethanolu v destilované vodě a z takto vytvořeného roztoku se zvlákňováním vytvoří mikrovlákna o průměru 0,2 až 500 pm s alespoň jedním UV filtrem rostlinného původu zakomponovaným ve své struktuře, poté se tato mikrovlákna mechanicky dezintegrují, čímž se z nich vytvoří částice polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 pm, v jejichž struktuře je zakomponovaný alespoň jeden UV filtr rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že mikrovlákna polyhydroxybutyrátu se vytvoří odstředivým zvlákňováním.

12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že mikrovlákna polyhydroxybutyrátu s alespoň jedním UV filtrem rostlinného původu zakomponovaným v jejich struktuře se mechanicky dezintegrují mixováním a/nebo mletím v mechanickém mlýnu.

- 17 CZ 309769 B6

13. Způsob výroby UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že 0,1 až 20% hmotn. roztok polyhydroxybutyrátu v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, se vytlačuje do srážedla, přičemž se z něj sráží mikrovlákna polyhydroxybutyrátu o průměru 0,2 až 500 pm, která mají porézní vnitřní strukturu, poté se takto vytvořená mikrovlákna polyhydroxybutyrátu mechanicky dezintegrují, čímž se z nich vytvoří porézní částice polyhydroxybutyrátu o velikosti 0,2 až 500 pm, které se inkubují alespoň 1 hodinu při laboratorní teplotě a bez přístupu světla s extraktem alespoň jednoho UV filtru rostlinného původu extrahovaného 20 až 80% obj. roztokem ethanolu v destilované vodě, přičemž se UV filtr rostlinného původu sorbuje v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn. do pórů částic z polyhydroxyburytáru a/nebo na jejich povrch.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že roztok polyhydroxybutyrátu v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, se sráží ethanolem o koncentraci 96 %.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že mikrovlákna polyhydroxybutyrátu s alespoň jedním UV filtrem rostlinného původu zakomponovaným v jejich struktuře se mechanicky dezintegrují mixováním a/nebo mletím v mechanickém mlýnu.

16. Způsob výroby UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že 0,1 až 20% hmotn. roztok polyhydroxybutyrátu v chloroformu, dichlorethanu nebo dichlormethanu, nebo směsi alespoň dvou z nich, se vytlačuje do srážedla, přičemž se z něj sráží mikrovlákna polyhydroxybutyrátu o průměru 0,2 až 500 pm, která mají porézní vnitřní strukturu, poté se takto vytvořená mikrovlákna polyhydroxybutyrátu dezintegrují v přítomnosti extraktu alespoň jednoho UV filtru rostlinného původu extrahovaného do 20 až 80% obj. roztoku ethanolu v destilované vodě, přičemž během jejich desintegrace se UV filtr/filtry rostlinného původu sorbuje v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn. do pórů a/nebo na povrch vznikajících částic polyhydroxyburytáru.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že mikrovlákna polyhydroxybutyrátu se mechanicky dezintegrují mixováním a/nebo mletím v mechanickém mlýnu.

18. Způsob výroby UV filtru na bázi polyhydroxybutyrátu podle libovolného z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se v chloroformu v libovolném pořadí rozpustí alespoň jeden fosfolipid, cholesterol a polyhydroxybutyrát, a do takto vytvořeného roztoku se přidá alespoň jeden UV filtr rostlinného původu ve formě extraktu do destilované vody nebo do roztoku ethanolu v destilované vodě, takto vytvořená směs se naředí destilovanou vodou a vystaví se ultrazvuku, v důsledku čehož se uzavřou liposomy tvořené obalem z dvojvrstvy fosfolipidu/fosfolipidů s vnitřním prostorem vyplněným vodnou fází kolem pevného jádra z polyhydroxybutyrátu a UV filtr/filtry rostlinného původu se dle své polarity uloží v částicích z polyhydroxybutyrátu a/nebo na jejich površích, a/nebo v jejich liposomovým obalech a/nebo na površích jejich liposomových obalů, a/nebo v prostorech mezi částicemi z polyhydroxybutyrátu a jejich liposomovými obaly, poté se z této směsi odstraní chloroform a oddělí se z ní částice UV filtru, jejichž velikost je 0,2 až 100 pm, a které obsahují alespoň jeden UV filtr rostlinného původu v celkové koncentraci 2 až 10 % hmotn.

19. Způsob výroby podle nároku 18, vyznačující se tím, že alespoň jeden UV filtr rostlinného původu se přidá ve formě extraktu do 30 až 40% obj. roztoku ethanolu v destilované vodě.

20. Způsob výroby podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr fosfolipidu a polyhydroxybutyrátu v roztoku je 9:1 až 1:9.

21. Způsob výroby podle nároku 20, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr fosfolipidu/fosfolipidů a polyhydroxybutyrátu v roztoku je 8:2 až 7:3.

- 18 CZ 309769 B6

22. Způsob výroby podle nároku 18, vyznačující se tím, že fosfolipidy jsou tvořeny lecithinem a cholesterolem v hmotnostním poměru 9:1 až 1:1.

11 výkresů