CZ309527B6 - Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou - Google Patents

Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou Download PDF

Info

Publication number
CZ309527B6
CZ309527B6 CZ2021-401A CZ2021401A CZ309527B6 CZ 309527 B6 CZ309527 B6 CZ 309527B6 CZ 2021401 A CZ2021401 A CZ 2021401A CZ 309527 B6 CZ309527 B6 CZ 309527B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
detection
particles
conjugate
conjugates
antibodies
Prior art date
Application number
CZ2021-401A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2021401A3 (cs
Inventor
Lucie Korecká
Korecká Lucie RNDr., Ph.D.
Marian KACEROVSKÝ
Kacerovský Marian prof. MUDr., Ph.D.
Ctirad Andrýs
Andrýs Ctirad prof. RNDr., Ph.D.
Zuzana Bílková
Bílková Zuzana prof. RNDr., Ph.D.
Gylxhane KASTRATI
Original Assignee
Fakultní nemocnice Hradec Králové
Univerzita Pardubice
Kastrati Gylxhane MSc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fakultní nemocnice Hradec Králové, Univerzita Pardubice, Kastrati Gylxhane MSc. filed Critical Fakultní nemocnice Hradec Králové
Priority to CZ2021-401A priority Critical patent/CZ309527B6/cs
Priority to PCT/CZ2022/050080 priority patent/WO2023030561A1/en
Publication of CZ2021401A3 publication Critical patent/CZ2021401A3/cs
Publication of CZ309527B6 publication Critical patent/CZ309527B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Předkládané řešení se týká sady pro simultánní detekci až tří proteinových analytů, která obsahuje jeden nebo více typů separačního konjugátu pro každý analyt, jeden typ detekčního konjugátu pro každý analyt, kde - každý typ separačního konjugátu obsahuje primární protilátku proti danému analytu navázanou na povrch magnetické částice; - každý detekční konjugát obsahuje sekundární protilátku pro vazbu na daný analyt, přičemž v každém typu detekčního konjugátu je na sekundární protilátku kovalentně navázána konjugační částice, na jejíž povrch je kovalentně navázáno více detekčních částic jednoho typu vybraného z kvantových teček CdTe, kvantových teček PbS a zlatých nanočástic, přičemž každý typ detekčního konjugátu obsahuje odlišné detekční částice. Dále se řešení týká způsobu simultánního stanovení až tří proteinových analytů s využitím uvedené sady.

Description

Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká sady a metody pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou.
Dosavadní stav techniky
Složení tělních tekutin, jakými jsou např. krev, plazma, mozkomíšní mok, lymfa, výpotek či plodová voda v průběhu těhotenství, je vždy odrazem aktuálního stavu organismu. Přítomnost či koncentrace specifických analytů, v klinické praxi označovaných jako biomarkery, se měří a vyhodnocuje jako indikátor fyziologických, patologických procesů (zánět, infekce, nádorové bujení, tkáňové poškození apod.) nebo odpovědi na terapeutický zásah. Průkaz, příp. změna koncentrace takových analytů v tělních tekutinách se stává efektivním nástrojem pro včasnou diagnostiku, pro sledování průběhu nemoci nebo pro zhodnocení účinnosti terapie. Stanovení jediného analytů je pro diagnostiku některých onemocnění dostatečné, avšak v mnoha případech je vhodné sledovat více analytů současně, protože se tím zvýší diagnostický potenciál metody. Správný výběr analytů, či jejich kombinace také poskytuje také podrobnější informace z hlediska klinické interpretace.
Metody vhodné pro současný průkaz i kvantifikaci analytů jsou v převážné většině imunoanalytické metody postavené na vysoce specifické a citlivé reakci mezi stanovovanými analyty a specifickými protilátkami vedoucí ke vzniku imunokomplexu. Na vzniklý imunokomplex se v následujícím kroku váže tzv. detekční konjugát, tedy sekundární protilátka nesoucí detekční značku. Tato značka je zodpovědná za generování výsledného signálu, který je úměrný koncentraci stanovovaného analytů v analyzovaném vzorku. Značkou je nej častěji enzym, fluorescenční látka nebo radioizotop. Tyto metody jsou v dnešní době běžně využívány v rutinní laboratorní analýze řady látek. Všechny tradiční kolorimetrické (ELISA), fluorescenční (FIA) nebo chemiluminiscenční (CLIA) imunoanalytické metody však mají v klasickém uspořádání své limity. Možnost simultánní detekce různých analytů je vzhledem k povaze generovaného signálu velmi omezená.
Alternativou k těmto technikám jsou elektrochemické biosenzory, které využívají výhod imunoanalytických metod, avšak v kombinaci s elektrochemickou detekcí. Elektrochemický imunosenzor se skládá z biorekogniční části a fýzikálně-chemického převodníku poskytujícího měřitelný signál. Biorekogniční část obsahuje nosič s vázanou specifickou protilátkou, kde se zachycují molekuly analytů. Aby se prokázal vznik imunokomplexu, přidá se do reakčního prostředí další tzv. sekundární protilátka, která nese značku poskytující elektrochemický signál. Fyzikálně-chemický převodník je zařízení přenášející informaci z proběhlé chemické reakce na měřitelný signál zaznamenávaný elektronickou jednotkou. Elektrochemická detekce přináší mnoho výhod, např. možnost prokazovat analyt v nano-, piko- nebo dokonce až ve femtomolových množstvích, měření je dostatečně robustní, snadno miniaturizovatelné a automatizovatcl né.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález si klade za cíl poskytnout systém vhodný pro simultánní detekci až tří analytů proteinové povahy, který by byl dostatečně specifický, robustní, s nulovou interferencí až tří signálů a dosahoval požadované citlivosti.
- 1 CZ 309527 B6
Předkládaný vynález tak poskytuje sadu a způsob pro průkaz a kvantifikaci analytů proteinové povahy, jejichž přítomnost či koncentrace v tělních tekutinách se mění v souvislosti s rozvojem zánětu, nádorového bujení nebo infekce. Zásadním znakem vynálezu je kombinace tří typů detekčních konjugátů obsahujících detekční částice vhodné pro simultánní elektrochemickou detekci bez vzájemných interferencí a pro kvantifikaci až tří různých analytů v jednom vzorku při jedné analýze, a zároveň zajišťujících dostatečně silný a robustní signál pro detekci velmi nízkých množství analytů.
Předmětem vynálezu je tedy sada pro simultánní detekci dvou až tří analytů proteinové povahy, která obsahuje jeden nebo více typů separačního konjugátu pro každý analyt, a alespoň dva typy detekčního konjugátu, přičemž jeden typ detekčního konjugátu je určen projeden analyt, kde:
- každý typ separačního konjugátu obsahuje primární protilátku proti danému analytů navázanou na povrch magnetické částice;
- každý detekční konjugát obsahuje sekundární protilátku pro vazbu na daný analyt, přičemž v každém typu detekčního konjugátu je na sekundární protilátku kovalentně navázána konjugační částice, na jejíž povrch je kovalentně navázáno více detekčních částic jednoho typu vybraného z kvantových teček CdTe, kvantových teček PbS a zlatých nanočástic, přičemž každý typ detekčního konjugátu obsahuje odlišné detekční částice;
přičemž uvedené alespoň dva typy detekčního konjugátu jsou:
- detekční konjugát s kvantovými tečkami CdTe a detekční konjugát se zlatými nanočásticemi, nebo
- detekční konjugát s kvantovými tečkami PbS a detekční konjugát se zlatými nanočásticemi, nebo
- detekční konjugát s kvantovými tečkami CdTe, detekční konjugát s kvantovými tečkami PbS a detekční konjugát se zlatými nanočásticemi.
Sada může dále obsahovat jednorázové senzory pro detekci elektrochemického signálu z detekčních částic. Zejména výhodné jsou tištěné senzory na bázi keramické nebo plastové destičky obsahující pracovní a referentní elektrody, popřípadě také pomocnou elektrodu. Materiál elektrod a jejich povrchová úprava jsou voleny dle reakčních podmínek, dle typu stanovovaného analytů a použité detekční metody. V případě předkládaného vynálezu lze s výhodou použít tříelektrodové senzory SPCE (C-C-Ag) s uhlíkovou pracovní, uhlíkovou pomocnou a stříbrnou referentní elektrodou.
Pro měření signálu se využívá fýzikálně-chemický převodník. Tím se rozumí zařízení přenášející informaci z proběhlé chemické reakce na měřitelný signál. Jako fýzikálně-chemický převodník je s výhodou používán elektrochemický převodník voltametrický. Detekční metodou v tomto výhodném provedení je rozpouštěcí square-wave voltametrie v oblasti záporného nebo kladného potenciálu (Square-wave anodic/cathodic stripping voltammetry; SWASV/SWCSV).
Sada podle předkládaného vynálezu spolu s fyzikálně-chemickým převodníkem tvoří elektrochemický imunosenzor, jehož biorekogniční částí jsou separační a detekční konjugáty. Specifické primární protilátky vázané na povrchu magnetických částic (separační konjugát) vyvažují cílové analyty z vodného prostředí vzorku a poté jsou vzniklé imunokomplexy označeny sekundárními specifickými protilátkami nesoucími signál generující částice (detekční konjugát).
Sada podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat magnetický separator, např. stojan na reakční zkumavky či mikrozkumavky opatřený NdFeB magnetem.
-2CZ 309527 B6
Sada podle předkládaného vynálezu může rovněž obsahovat činidlo pro kyselou hydrolýzu detekčních částic. Tímto činidlem může být například anorganická kyselina, jako je kyselina chlorovodíková.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy sady podle předkládaného vynálezu, při němž se karboxylové skupiny na povrchu detekčních částic aktivují pomocí V-ethyl-V'-(2dimethylaminopropyljkarbodiimidhydrochloridu (EDAC) za vzniku detekčních částic s reaktivními skupinami esteru o-acylisomočoviny na povrchu, které dále reagují s aminoskupinami na povrchu konjugačních částic za vzniku signál generujících částic. Následně se hydroxylové funkční skupiny monosacharidových jednotek přítomných v sekundární protilátce podrobí oxidaci za tvorby reaktivních aldehydických skupin, které se následně uvedou do reakce s aminoskupinami na povrchu konjugačních částic, za tvorby detekčního konjugátu. Karboxylové skupiny na povrchu magnetických částic se aktivují pomocí 7V-ethyl-X'-(2dimethylaminopropyljkarbodiimidhydrochloridu (EDAC) za vzniku aktivovaných magnetických částic s reaktivními skupinami esteru o-acylisomočoviny na povrchu a následně se aktivované magnetické částice podrobí reakci s aminoskupinami v molekule primární protilátky.
S výhodou se nezreagované detekční částice oddělí od signál generujících částic gravitační či odstředivou separační metodou, například centrifůgací.
S výhodou se nezreagované aktivované funkční skupiny detekčního konjugátu, resp. signál generujících částic, podrobí reakci blokace, a to s výhodou pomocí směsi kyseliny 2-(Vmorfolinojethansulfonové (MES, MES pufr), Tris(hydroxymethyl)aminomethanu (Tris pufr) a EDAC pro aktivované karboxylové skupiny, nebo pomocí NaCNBHí v roztoku NaOH pro reaktivní aldehydické skupiny.
Dalším předmětem vynálezu je způsob simultánního elektrochemického stanovení dvou až tří proteinových analytů s použitím výše uvedené sady. Tento způsob zahrnuje následující kroky:
a) uvedení vzorku, v němž mají být tyto analyty stanovovány, do kontaktu se separačními konjugáty za vzniku imunokomplexu navázáním cílových analytů na separační konjugáty;
b) podrobení vzorku separaci magnetickým polem pro oddělení separačních konjugátů s případně navázanými analyty;
c) uvedení oddělených separačních konjugátů s případně navázanými analyty (tj. imunokomplexů) do kontaktu s detekčními konjugáty pro navázání detekčních konjugátů na imunokomplexy;
d) vymytí nenavázaných detekčních konjugátů;
e) podrobení imunokomplexů s navázanými detekčními konjugáty kyselé hydrolýze; a
f) stanovení iontů kovů uvolněných z detekčních částic detekčních konjugátů v produktu kyselé hydrolýzy metodou SWASV/SWCSV.
Kovové ionty uvolněné z jádra kvantových teček a zlatých nanočástic se stanoví elektrochemicky pomocí SWASV/SWCSV. Pro měření jsou s výhodou využívány jednorázové tištěné tříelektrodové senzory umožňující redukci analyzovaného objemu na nezbytné minimum (např. 50 až 100 μΐ, v závislosti na velikosti elektrody). Výsledný signál je přímo úměrný množství uvolněných kovových iontů, a tedy i koncentraci stanovovaného analytů ve vzorku.
Separační konjugát obsahuje magnetické částice s kovalentně vázanou primární protilátkou. Primární protilátka je protilátka specificky se vázající k cílovému analytů.
-3CZ 309527 B6
Magnetické částice jsou částice o velikosti v rozmezí od 0,7 do 3 pm, mající magnetické jádro vykazující superparamagnetické vlastnosti. Superparamagnetické vlastnosti částic umožňují rychlou a účinnou separaci částic z kapalného vzorku a kontaminujících látek a jejich následné promytí. Magnetické částice jsou na povrchu modifikované funkčními skupinami, přes které se kovalentně vážou primární protilátky. Takové magnetické částice jsou známé ve stavu techniky, a jsou běžně komerčně dostupné. Komerčně dostupné magnetické částice obvykle obsahují na povrchu funkční skupiny, které se nejprve aktivují, a následně se navážou primární protilátky, vždy se postupuje podle instrukcí výrobce/dodavatele. V některých provedeních obsahují magnetické částice na povrchu karboxylové skupiny jako funkční skupiny.
Primární protilátky mohou být monoklonální či polyklonální, s výhodou se jedná o monoklonální protilátky. S výhodou jsou primárními protilátkami protilátky třídy IgG.
Detekční konjugát obsahuje sekundární protilátku, na niž je kovalentně navázána signál generující částice. Signál generující částicí se rozumí konjugační částice, na kterou jsou kovalentně navázány detekční částice. Detekční konjugát jako součást biorekogniční části imunosenzoru vytváří specifický komplex s analytem zachyceným na povrchu separačních částic a přináší množství detekčních částic úměrné množství analytu zachyceného v imunokomplexu. Jedná se o nekompetitivní uspořádání, kdy mezi jednotlivými kroky musí být v kapalném prostředí dosaženo rovnovážného stavu.
Sekundární protilátky mohou být monoklonální či polyklonální protilátky, s výhodou se jedná o polyklonální protilátky. S výhodou jsou sekundárními protilátkami protilátky třídy IgG.
IgG protilátky používané pro přípravu separačního a detekčního konjugátu pro konkrétní typ analytu mohou být mono- či polyklonálního původu. Pro oba typy konjugátů lze použít protilátky lišící se ve specifitě a také ve skladbě antigenních determinant, proti kterým j sou namířené. Tyto však musí být pro vazbu s protilátkou na analytu stericky přístupné. IgG protilátky proti mnoha proteinovým analytům jsou komerčně dostupné, nebo je lze připravit známými metodami, jako je například metoda imunizace zvířat nebo metoda hybridomová.
Konjugační částice je navázána na protilátku kovalentně, s výhodou je navázána na sacharidovou část protilátky amidovou vazbou. Na jednu protilátku může být navázána jedna nebo více konjugačních částic. S výhodou je konjugační částice navázána na sacharidovou část protilátky amidovou vazbou. Ukotvení nanočástice s detekčními kvantovými tečkami nebo zlatými nanočásticemi na sacharidové části protilátky zajišťuje, že detekční část nebude zasahovat do vazebných částí protilátky, tzv. Fab fragmentů, a protilátka se tak může účinně vázat na cílový analyt. Rovněž je tím zajištěn sterický přístup k detekčním částicím (kvantovým tečkám, resp. zlatým nanočásticím) při kyselé hydrolýze, a tedy kvantitativní uvolnění kovů pro elektrochemickou detekci.
Konjugační částicí je s výhodou mezoporézní nanočástice na bázi S1O2, povrchově modifikovaná funkčními skupinami, jejich prostřednictvím se kovalentně vážou detekční částice. (V některých provedeních je konjugační částice povrchově modifikovaná amino skupinami.) Tato nanočástice má velikost v rozmezí 10 až 900 nm, s výhodou 50 až 500 nm, výhodněji 100 až 300 nm. Velikost mezoporů částice j e s výhodou v rozmezí 2 až 50 nm, výhodněj i do 10 nm, nad touto hranicí stoupá riziko, že se kvantové tečky nebo zlaté nanočástice naváží i do pórů, ze kterých se hůře uvolní atomy kovů při kyselé hydrolýze. Tyto konjugační částice jsou komerčně dostupné.
Konjugační částice v komplexu s částicemi detekčními poskytují vhodnou značku pro přípravu detekčního konjugátu. Díky velkému povrchu konjugačních nanočástic dochází k vazbě většího počtu detekčních nanočástic, vztaženo na jednu konjugační částici, a dojde tak k posílení signálu generovaného na jednu molekulu analytu. Další nespornou výhodou je možnost použití tradičních separačních metod (centrifugace, membránová filtrace) při přípravě detekčních konjugátů a dosáhnout tak vysoké výtěžnosti a čistoty. Problém oddělení detekčních částic navázaných na
-4CZ 309527 B6 analyt od nevyvázaných detekčních částic je zejména v případě kvantových teček značně limitující, míra kontaminace výsledného produktu volnými kvantovými tečkami a reaktivními činidly je tak značná.
Vazba detekčních kvantových teček nebo zlatých nanočástic prostřednictvím konjugační částice dovoluje výrazně zesílit signál i při malém množství cílového analytu. Na každé molekule protilátky je tak navázáno větší množství detekčních částic, tedy každá molekula cílového analytu vyvolá násobně vyšší signál.
Detekční částice jsou částice na bázi kovových iontů a mají velikost v rozmezí 1 až 160 nm. Na povrchu jsou modifikovány funkčními skupinami, jejichž prostřednictvím se kovalentně vážou ke konjugační částici. Takovéto částice jsou komerčně dostupné. V některých provedeních jsou detekční částice modifikovány na povrchu karboxylovými skupinami.
Komerčně dostupné detekční a konjugační částice obvykle obsahují na povrchu fůnkční skupiny, které se nejprve aktivují, a následně se provede reakce vedoucí ke kovalentní vazbě, vždy se postupuje podle instrukcí výrobce/dodavatele.
Detekční částice jsou vzájemně odlišné v různých typech detekčního konjugátu. Detekčními částicemi jsou kvantové tečky CdTe, kvantové tečky PbS, a zlaté nanočástice. V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že se jejich elektrochemické signály nepřekrývají, a zároveň je lze využít ve stejném systému simultánně. Zlaté nanočástice mají s výhodou velikost v rozmezí 1 nm až 100 nm.
Tři analyty jsou tedy detekovány prostřednictvím kombinace tří typů detekčních částic. Tyto tři typy detekčních částic jsou kvantové tečky CdTe pro detekci prvního analytu, kvantové tečky PbS pro detekci druhého analytu, a zlaté nanočástice pro detekci třetího analytu. Jedná se o unikátní kombinaci detekčních částic použitelnou pro simultánní stanovení v rámci jediného měření. Tyto tři detekční částice mohou být detekovány v rámci jediného elektrochemického stanovení, protože poskytují po kyselé hydrolýze (tzv. disoluci) elektrochemický signál. Signály získané z těchto tří značek se nepřekrývají a poskytovaly tak měřitelné hodnoty pro kvantifikaci zachycených antigenů, a to v deklarovaných koncentračních rozmezích.
Pokud je třeba detekovat pouze dva analyty, lze použít jen dva z těchto typů detekčních částic.
Analyty stanovované touto metodou mohou být obecně látky proteinové povahy, s klinickou významností (např. glykoproteiny, fosfoproteiny, nukleoproteiny nebo lipoproteiny), jejichž přítomnost či koncentrace v tělních tekutinách se mění v závislosti na přítomnosti zánětu, infekce či nádorového bujení a lze proti nim připravit specifické protilátky. V tomto textu se tedy analytem rozumí zejména klinicky významná molekula proteinové povahy, jejíž hladiny v tělních tekutinách se mění v souvislosti se zánětem, infekcí, nádorovým bujením, či jinými patologickými stavy. V některých provedeních mohou být analyty stanovovány ve vodném prostředí, v tělních tekutinách, jakými jsou např. sérum, plazma, mozkomíšní mok, cervikální hlen, výpotek či plodová voda v případě gravidity.
V jednom výhodném provedení jsou analyty pentraxin 3 (PTX3), kalretikulin (CALR) a interleukin 6 (IL-6). Tyto analyty hrají významnou roli v patofyziologii specifických těhotenských komplikací, jako je zánět a infekce v amniální dutině (dutina uvnitř těhotné dělohy, vyplněná plodovou vodou, v níž je uložen plod spojený pupečníkem s placentou). Tyto analyty jsou stanovovány ve vodném pufrovaném prostředí a ve vhodně naředěném vzorku plodové vody. Primární a sekundární protilátky používané v sadě podle předkládaného vynálezu pak jsou antiPTX3 protilátky, anti-CALR protilátky a anti-IL-6 protilátky, a zejména jsou používány protilátky třídy IgG. V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že PTX3, CALR a IL-6 v plodové vodě představují ideální kombinaci analytů ke stanovení a predikci zánětu a infekce v amniální dutině u pacientek s předčasným odtokem plodové vody před termínem porodu.
- 5 CZ 309527 B6
Předkládaný vynález tedy poskytuje možnost simultánní čili paralelní detekce až tří analytů, zejména dvou nebo tří analytů. Možnost simultánní detekce více analytů v jednom vyšetřovaném vzorku při jedné analýze přináší řadu výhod, mezi nimiž jsou zejména menší spotřeba reagencií, menší objem vyšetřovaného vzorku, kratší doba nutná pro dosažení výsledku, menší pracnost pro laboratorní pracovníky, konečné nižší náklady jako nejvýznamnější výhody. Vývoj a validace takového elektrochemického imunosenzoru pro klinickou praxi je náročná. Systém musí být dostatečně spolehlivý, robustní a musí umožnit průkaz i kvantifikaci až tří analytů současně, bez vzájemných interferencí, a to i v případě, kde se jejich koncentrace výrazně liší.
Kvalita metody pro simultánní detekci analytů pomocí elektrochemického senzoru je zásadně ovlivněna výběrem elektrochemických indikátorů, které musí poskytovat dostatečně silný signál a současně u nich nesmí docházet k překryvu detekčních potenciálů. Další podmínkou je, že generované signály spolu nesmí nijak interferovat. Dalším parametrem, který musí být při vývoji elektrochemického imunosenzoru zohledněn, je citlivost stanovení. Je-li třeba prokazovat analyty nacházející se v biologickém materiálu v nano- až pikogramových množstvích, pak musí být použity detekční částice odpovídajících vlastností a parametrů. Intenzita generovaného signálu vztažená na jeden mol stanovované látky musí odpovídat požadavkům klinické praxe pro minimální detekční limit (MDL) a limit pro kvantifikaci (LOQ) pro každý ze stanovovaných analytů.
Výše uvedené požadavky sada a způsob podle předkládaného vynálezu zcela naplňují.
Předkládaný vynález eliminuje limitace imunoanalytických metod, jimiž se prokazují analyty vyskytující se v tělních tekutinách nebo v jiných vzorcích. Vynález na rozdíl od klasických ELISA metod nabízí možnost simultánní detekce až tří analytů v jednom vyšetřovaném vzorku. Přitom je metoda podle vynálezu robustní. Díky simultánní detekci a malému množství potřebných činidel (detekčních konjugátů a separačních konjugátů) jsou náklady na jednu analýzu poměrně nízké. Použitím vynálezu lze dosáhnout vysoké citlivosti metody, nízkého limitu detekce pro analyty, a to v nano až pikogramovém množství (ng až pg/ml vyšetřovaného vzorku).
Unikátní konstrukce detekčního konjugátu, kde je sekundární protilátka označena signál generujícími částicemi, nabízí možnost amplifikovat měřitelný signál a zvýšit citlivost měření. Díky specifickému povrchu konjugačních nanočástic dochází k vazbě většího počtu detekčních nanočástic, vztaženo na jeden detekční konjugát, a dojde tak k posílení signálu generovaného na jednu molekulu analytu. Další nespornou výhodou je možnost použít jednoduchých a levných separačních technik (centrifugace, membránová filtrace) při přípravě detekčních konjugátů a dosáhnout tak vysoké výtěžnosti a čistoty s minimálními ztrátami během přípravy. Další výhodou je i šetrný způsob značení sekundární protilátky i za dodržení podmínek amplifikace signálu. Díky konjugaci detekčních částic s částicemi konjugačními v prvním kroku přípravy bez účasti specifických protilátek není vazebná aktivita a ani specifita těchto molekul ovlivněna.
Předkládaný vynález umožňuje využívat elektrochemických metod stanovení, které nevyžadují nákladné vybavení, automatické analyzátory, vybavenou laboratoř a odborně vzdělané pracovníky.
Metoda detekce analytů podle vynálezu i sada pro její provedení je univerzální. Adaptaci pro jednotlivé analyty zajistí výběr protilátky, přitom protilátky proti různým analytům jsou často komerčně dostupné, nebo je lze připravit obecně známými metodami.
Metoda simultánní detekce analytů podle vynálezu přináší zpřesnění průkazu či predikce daného patologického stavu (tzv. křivka prahové operační charakteristiky [receiver operating characteristic curve; ROC], senzitivita a specificita stanovení a tzv. separační kritérium). Metoda v tomto uspořádání naplňuje požadavky testu prováděného v místě péče o pacienta (point of care testing, POCT), tj. umožňuje stanovovat vybrané analyty i mimo standardní diagnostické laboratoře.
- 6 CZ 309527 B6
K měření pak postačí mít pouze lehce přenositelný potenciostat pro měření elektrochemického signálu na povrchu tištěného tříelektrodového senzoru.
Předkládaný vynález ve výhodném provedení poskytuje možnost simultánně prokazovat a kvantifikovat až tři analyty související s patofyziologií zánětu a infekce v amniální dutině, konkrétně PTX3, CALR a IL-6. Spolehlivé a včasné získání informace o přítomnosti zánětu a infekce v amniální dutině, vyšetřením vzorku plodové vody, je velmi důležité k určení optimální terapeutického managementu u pacientek s předčasným odtokem plodové vody před termínem porodu. Optimální terapeutický management je jedinou možností k minimalizaci závažné krátkoa dlouhodobé neonatální morbidity a mortality, ale také mateřské morbidity. Včasnost získání informace o stavu amniální dutiny je z klinického úhlu pohledu zcela klíčová. V současné době není k dispozici vhodná POCT metoda se simultánním stanovením více než jednoho analytu v plodové vodě ke stanovení a predikci zánětu a infekce v plodové vodě. Pro optimální využití přímo u lůžka pacienta či na porodním sále je zcela nezbytné, aby test byl ve formě POCT. Tedy ve formě, kterou lze provést kdekoliv, s minimálním a levným instrumentálním vybavením, a s nízkými nároky na technickou zdatnost personálu. Využití sady podle předkládaného vynálezu tyto podmínky splňuje.
Následující příklady provedení ilustrují proveditelnost a výhody vynálezu, nemají však být interpretovány jako omezující rozsah vynálezu.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Schematický popis principu přípravy signál generujících částic. Reakce mezi aminoskupinami (-NH2) konjugačních nanočástic na bázi SiO2 a karboxylovými skupinami (COOH) detekčních kvantových teček nebo zlatých nanočástic aktivovaných prostřednictvím EDAC.
Obrázek 2. Schematický popis principu přípravy detekčního konjugátu. Signál generující částice (1) reagují se specifickými protilátkami oxidovanými působením NaIO4 (2) za vzniku detekčního konjugátu (3). Reziduální aldehydové skupiny jsou blokovány působením NaCNBH3 (4).
Obrázek 3. Voltamogram (závislost proudu na vloženém potenciálu) pro testování vlivu konjugačních částic. 1 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs; 2 - detekční konjugát s využitím pouze detekčních kvantových teček CdTe QDs; 3 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami PbS QDs; 4 - detekční konjugát s využitím pouze detekčních kvantových teček PbS QDs.
Obrázek 4. Voltamogram (závislost proudu na vloženém potenciálu) pro testování vlivu blokace reziduálních reaktivních skupin detekčních konjugátů. Separátní analýza detekčních konjugátů bez blokace. 1 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními zlatými nanočásticemi AuNPs; 2 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s detekčními kvantovými tečkami PbS QDs; 3 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs.
Obrázek 5. Voltamogram (závislost proudu na vloženém potenciálu) pro testování vlivu blokace reziduálních reaktivních skupin detekčních konjugátů. Separátní analýza detekčních konjugátů s blokací. 1 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs; 2 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s detekčními kvantovými tečkami PbS QDs; 3 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními zlatými nanočásticemi AuNPs.
- 7 CZ 309527 B6
Obrázek 6. Kalibrační závislosti detekčních konjugátů s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs bez blokace (nahoře) a s blokací (dole) reziduálních reaktivních skupin měřených separátně (křivka 1) a simultánně (křivka 2).
Obrázek 7. Kalibrační závislosti detekčních konjugátů s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami PbS QDs bez blokace (nahoře) a s blokací (dole) reziduálních reaktivních skupin měřených separátně (křivka 1) a simultánně (křivka 2).
Obrázek 8. Kalibrační závislosti detekčních konjugátů s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními zlatými nanočásticemi AuNPs bez blokace (nahoře) a s blokací (dole) reziduálních reaktivních skupin měřených separátně (křivka 1) a simultánně (křivka 2).
Obrázek 9. Voltamogramy (závislost proudu na vloženém potenciálu) pro porovnání separátní a simultánní analýzy detekčních konjugátů s blokací reziduálních reaktivních skupin detekčních konjugátů. Separátní analýza detekčních konjugátů s blokací (nahoře), simultánní analýza (dole). 1 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs; 2 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s detekčními kvantovými tečkami PbS QDs; 3 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními zlatými nanočásticemi AuNPs.
Obrázek 10. Kalibrační závislost měřeného signálu na množství detekčního konjugátu, kde byly použity dva typy separačních konjugátů, konkrétně pro stanovení IL-6. 1 - separační konjugát s monoklonálními protilátkami; 2 - separační konjugát s polyklonálními protilátkami.
Obrázek 11. Voltamogram (nahoře) a kalibrační závislost (dole) pro stanovení proteinového analytu IL-6. 1 - koncentrace IL-6 0 μg ml-1; 2 - koncentrace IL-6 0,015 μg ml-1; 3 - koncentrace IL-6 0,03 μg ml-1.
Obrázek 12. Voltamogram (nahoře) a kalibrační závislost (dole) pro stanovení proteinového analytu PTX 3. 1 - koncentrace PTX 3 0 μg ml-1; 2 - koncentrace PTX 3 0,01 μg ml-1; 3 koncentrace PTX 3 0,02 μg ml-1.
Obrázek 13. Voltamogram (nahoře) a kalibrační závislost (dole) pro stanovení proteinového analytu CALR. 1 - koncentrace CALR 3 0 μg ml-1; 2 - koncentrace CALR 0,075 μg ml-1; 3 koncentrace CALR 0,15 μg ml-1.
Obrázek 14. Voltamogram pro stanovení proteinového analytu IL-6 pro ověření vlivu matrice reálného vzorku - plodové vody. 1 - IL-6 o koncentraci 0 μg ml-1 v 0,2 M Tris-HCl pufru pH 8,0 s 1% BSA a 0,1% Tween 20; 2 - IL-6 o koncentraci 0 μg ml-1 ve vzorku plodové vody ředěné 1:1; 3 - IL-6 o koncentraci 0,015 μg ml-1 ve vzorku plodové vody ředěné 1:1; 4 - IL-6 o koncentraci 0,015 μg ml-1 v 0,2 M Tris-HCl pufru pH 8,0 s 1% BSA a 0,1% Tween 20.
Obrázek 15. Voltamogram simultánní detekce proteinových analytů PTX 3, IL-6 a CALR. PTX 3 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs; IL-6 - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s detekčními kvantovými tečkami PbS QDs; CALR - detekční konjugát s využitím signál generujících částic s konjugačními částicemi a detekčními zlatými nanočásticemi AuNPs. Koncentrace proteinových analytů: PTX 3 - 0,02 μg ml-1 , IL-6 - 0,03 μg ml-1, CALR - 0,15 μg ml-1 v reakčním prostředí 0,2 M Tris-HCl pufru pH 8,0 s 1% BSA a 0,1% Tween 20.
- 8 CZ 309527 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Příprava detekčního konjugátu
Pro přípravu detekčního konjugátu jsou využívány chemické reakce mezi funkčními skupinami (v tomto příkladu skupiny -NH2, -COOH, -CHO) přítomnými na jednotlivých složkách detekčního konjugátu.
Vstupní komerčně dostupné materiály:
- konjugační částice: nanočástice na bázi SiO2 (SiNPs): komerčně dostupné (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) - povrchová modifikace - NH2, mezoporézní, velikost částic 200 nm, velikost pórů 4 nm.
- CdTe kvantové tečky (CdTe QDs) - komerčně dostupné (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) - povrchová modifikace - COOH, velikost částic 6 až 7 nm, λem 570 nm
- PbS kvantové tečky (PbS QDs) - komerčně dostupné (Suzhou Xingshuo Nanotech, Čína) povrchová modifikace - COOH, velikost částic 80 nm, kem 1100 nm
- zlaté nanočástice (AuNPs) - komerčně dostupné (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) - povrchová modifikace - COOH, velikost částic 20 nm
- protilátky proti Pentraxinu 3 (anti-PTX3 IgG), Kalretikulinu (anti-CALR IgG), Interleukinu 6 (anti-IL-6 IgG), polyklonální - anti-PTX3 IgG (Sino Biological Inc., Beijing, Čína), antiCALR IgG (ThermoFisher Scientific, USA), anti-IL-6 IgG (LS Bio, USA).
Postup:
1. Příprava signál generujících částic: vznik kovalentních vazeb mezi detekčními kvantovými tečkami a nanočásticemi na bázi SiO2 probíhá jednokrokovou karbodiimidovou metodou s využitím N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochloridu (EDAC) jako tzv. crosslinkujícího činidla. Karboxylové skupiny detekčních kvantových teček nebo zlatých nanočástic jsou aktivovány pomocí EDAC za vzniku aktivního intermediátu (QDs/AuNPs-o acylisomočovina), který ihned reaguje s amino skupinami na povrchu nanočástic na bázi SiO2 za tvorby amidové vazby (viz obr. 1). Velikost pórů mezoporézních nanočástic na bázi SiO2 (4 nm) stericky brání kvantovým tečkám do porézního povrchu pronikat a negativně ovlivňovat jejich uvolnění nezbytné pro finální elektrochemickou detekci. Díky vysoké hustotě signál generujících částic je tento snadno oddělen z roztoku obsahujícího reagencie a volné nekonjugované detekční kvantové tečky nebo zlaté nanočástice. Nekonjugované detekční kvantové tečky nebo zlaté nanočástice lze snadno oddělit centrifugací a je tak nahrazen zdlouhavý dialyzační krok snižující výtěžnost přípravy.
Konkrétněji je postup přípravy signál generujících částic následující: Konjugační částice (SiNPs, 3 mg) jsou 5x promyty 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,3 (1 ml). Částice jsou od roztoku separovány pomocí centrifugace 5 min při 5000 rpm. Následně je přidán roztok EDAC o koncentraci 0,5 mg/1 ml, roztok CdTe QDs (50 μΐ o koncentraci 1 mg/ml), PbS QDs (4 μ1 zásobního roztoku) nebo AuNPs (10 μ1 o koncentraci 1 mg/ml). Po doplnění reakčního objemu na 1 ml následuje inkubace 1 hodinu při teplotě místnosti ve tmě za mírného otáčení. Po inkubaci jsou detekční částice 3x promyty 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 s 1M NaCl a 2x 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,3 (1 ml). Přebytečné aktivované -COOH skupiny detekčních kvantových teček nebo zlatých nanočástic jsou blokovány roztokem 0,1M hydrátu kyseliny 2-(N-morfolino)ethansulfonové (MES pufr) pH 4,7 s 0,1M Tris s přídavkem 10 mg EDAC (celkový reakční objem 1 ml). Blokační krok probíhal 2 hod při teplotě místnosti ve tmě za mírného otáčení. Po inkubaci jsou detekční částice
- 9 CZ 309527 B6
3x promyty 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 s 1M NaCl a 2x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 (vždy 1 ml).
2. Příprava detekčního konjugátu: při přípravě signál generujících částic je poměr obou složek, tedy SiNPs a QDs/AuNPs nastaven tak, že jsou v přebytku nanočástice na bázi SiO2 s volnými funkčními aminoskupinami. Ty jsou následně využity pro vazbu specifických protilátek za tvorby detekčního konjugátu. Protilátky jsou konjugovány metodou tzv. místně specifické kovalentní vazby. Hydroxylové funkční skupiny monosacharidů na konci glykosidického řetězce jsou nejprve oxidovány jodistanem sodným za tvorby reaktivních aldehydů spontánně reagujících s aminoskupinami signál generujících částic. Reakcí vzniká stabilní amidová vazba (viz obr. 2). Konečným stabilizačním krokem je blokace zbylých reaktivních funkčních skupin. Blokace zásadně snižuje míru nespecifické sorpce detekčního konjugátu na povrch separačního konjugátu.
Konkrétněji byl detekční konjugát připraven následovně: Detekční protilátky (20 μg) jsou oxidovány roztokem NaIO4 (0,02 M) v reakčním objemu 250 μΐ po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě za mírného otáčení. Po zastavení oxidace přídavkem 1,5 μl ethylenglykolu a odstranění NaIO4 odsolením pomocí centrifugačních kolonek s vrstvou silikagelu jsou oxidované protilátky přidány k připraveným detekčním částicím. Po doplnění reakčního objemu na 1 ml 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 následuje inkubace přes noc při teplotě 2 až 8 °C ve tmě za mírného otáčení. Po promytí 4x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 (vždy 1 ml) byly zbylé reaktivní aldehydové skupiny protilátek blokovány roztokem 1M NaOH obsahujícím 10 μl 5M NaCNBH3. Blokace probíhá 15 minut při teplotě místnosti za mírného otáčení. Následuje finální promytí 3x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 s 1M NaCl a 2x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 (vždy 1 ml). Detekční konjugáty jsou uchovány při teplotě 2 až 8 °C.
Příklad 2: Příprava separačního konjugátu
Pro přípravu separačního konjugátu jsou využívány chemické reakce mezi funkčními skupinami přítomnými na povrchu magnetických částic (-COOH) a na molekulách specifických IgG protilátek (-NH2).
Vstupní komerčně dostupné materiály:
- protilátky proti Pentraxinu 3 (anti-PTX3 IgG), Kalretikulinu (anti-CALR IgG), Interleukinu 6 (anti-IL-6 IgG), monoklonální nebo polyklonální - anti-PTX3 IgG (Abnova, Tchajwan), antiCALR IgG (ThermoFisher Scientific, USA), anti-IL-6 IgG (LS Bio, USA)
- Magnetické mikročástice: Dynal MyOne carboxylic, velikost částic 1 μm, funkční skupiny COOH (ThermoFisher Scientific, USA)
Postup:
Magnetické mikročástice (1 mg) jsou 5x promyty roztokem 0,1M MES (MES pufrem pH 5,0; 0,1 ml). Částice jsou od roztoku separovány pomocí magnetického separátoru. Následně je přidán roztok EDAC o koncentraci 7,5 mg/0,5 ml. Po doplnění reakčního objemu na 1 ml roztokem 0,1M MES (MES pufrem pH 5,0) následuje inkubace 1 hodinu při teplotě místnosti za mírného otáčení. Po inkubaci jsou magnetické mikročástice 2x promyty 0,1M MES pH 5,0 (1 ml). Následně jsou přidány specifické IgG protilátky v koncentraci 50 μg/1 ml 0,1 M MES pH 5,0. Následuje inkubace 16 hodin při 4 °C za mírného otáčení. Separační konjugát je promyt 3x 0,1M MES pH 5,0, 2x 0,1M PBS pufrem pH 7,4 a 3x 0,1M MES pH 5,0 (vždy 1 ml). Separační konjugáty jsou skladovány při 4 °C.
Příklad 3: Postup stanovení analytu (tvorba imunokomplexu a následná elektrochemická detekce)
- 10 CZ 309527 B6
Jednotlivé kroky probíhají v celkovém reakčním objemu 100 μl. Obecně jsou tyto podmínky vhodné pro různé analyty.
1. Vazba stanovovaného analytu se separačním konjugátem: vazba probíhá v reakčním prostředí 0,2M Tris-HCl pufru pH 8,0 s 1% BSA a 0,1% Tween 20. Pro vazbu je použito takové množství separačního konjugátu, které odpovídá 2,5 μg specifických protilátek proti stanovovanému analytu. Inkubace separačního konjugátu s analytem probíhá 10 minut při teplotě místnosti za mírného otáčení. Následuje promytí vytvořeného imunokomplexu 3x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 s 1M NaCl a 2x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 (vždy 100 μl).
2. Vazba detekčního konjugátu: vazba probíhá v reakčním prostředí 0,2M Tris-HCl pufru pH 8,0 s 1% BSA a 0,1% Tween 20. Pro vazbu je použito takové množství suspenze, které odpovídá 0,5 (0,75) μg protilátek. Inkubace s detekčním konjugátem probíhá 10 minut při teplotě místnosti za mírného otáčení. Následuje promytí vytvořeného imunokomplexu 3x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 s 1M NaCl a 2x 0,1M fosfátovým pufrem pH 7,3 (vždy 100 μl).
3. Kyselá hydrolýza: kovové ionty jsou uvolněny z detekčních konjugátů působením 0,1M HCl po dobu 3 minut při teplotě místnosti, za mírného otáčení. Reakční objem je 100 μl. Působením kyseliny chlorovodíkové dochází k disoluci detekčních kvantových teček a uvolnění kovových iontů tvořících jádro QDs, konkrétně Cd(II) a Pb(II), jejichž elektrochemický signál je monitorován. V případě detekčních zlatých nanočástic dochází působením kyseliny chlorovodíkové k tvorbě intermetalické sloučeniny Au(III), jejíž signál je elektrochemicky analyzován.
Po separaci probíhá elektrochemické stanovení v roztoku po magnetické separaci za podmínek uvedených v tabulce 1.
Kovové ionty uvolněné z jádra kvantových teček a zlatých nanočástic, které jsou jednou ze složek detekčních konjugátů, jsou měřeny elektrochemicky pomocí rozpouštěcí square-wave voltametrie v oblasti záporného nebo kladného potenciálu (SWASV/SWCSV). Pro měření lze využít jednorázových tištěných tříelektrodových senzorů umožňujících redukci analyzovaného objemu na nezbytné minimum (např. 50 až 100 μl, v závislosti na velikosti elektrody). Výsledný signál je přímo úměrný množství uvolněných kovových iontů, a tedy i koncentraci stanovovaného proteinového analytu ve vzorku.
Pro elektrochemickou detekci v příkladech provedení se používalo přenosné elektrochemické zařízení MultiEmStat 3 se čtyřmi nezávislými potenciostaty ovládanými softwarem MultiTrace 4 (PalmSens, Nizozemsko), a tištěné tříelektrodové senzory obsahující uhlíkovou pracovní (měrnou), uhlíkovou pomocnou a stříbrnou referentní elektrodu (C-110; W/A-C, R-Ag; Metrohm, Švýcarsko).
Tabulka 1. Experimentální podmínky elektrochemického stanovení metodou square wave rozpouštěcí voltametrie v anodické (SWASV) a katodické (SWCSV) oblasti
- 11 CZ 309527 B6
Detekční konjugáty s QDs Detekční konjugáty s AuNPs
Detekční metoda SWASV SWCSV
Econd. -0,15 V 0,15 V, 120 s
Edep -1,0 V, 120 s 1,2 V, 180 s
Rozmezí potenciálu -1,0 V až -0,15 V 1,2 V až 0,0 V
Amplituda 0,02805 V
Frekvence 25 Hz
Estep 0,003 V -0,003 V
Příklad 4: Ověření zvýšení signálu detekčních konjugátů
S použitím detekčních konjugátů připravených v příkladu 1 byl potvrzen efekt konjugačních částic na bázi SiO2 na zvýšení výsledného signálu. Byly porovnány dva typy detekčních konjugátů, bez a s využitím konjugačních částic. Byly testovány detekční konjugáty s detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs a PbS QDs. Oba typy detekčních konjugátů byly analyzovány elektrochemicky za experimentálních podmínek uvedených v tabulce 1. Výsledek analýzy je uveden na obr. 3. V případě detekčních konjugátů s CdTe QDs lze pozorovat opravdu zásadní výrazné zvýšení signálu v případě použití konjugačních částic (obr. 3, křivka 1) oproti detekčnímu konjugátu bez konjugačních částic (obr. 3, křivka 2). V případě detekčního konjugátu s PbS QDs je signál obou typů detekčních konjugátů srovnatelný (obr. 3, křivky 3 a 4), což lze vysvětlit velikostí PbS QDs. Ta je v porovnání s CdTe QDs 12x vyšší, nelze tedy předpokládat navázání výrazně většího počtu QDs na konjugační částice. Přesto využití konjugačních částic přináší benefit v podobě snadné přípravy detekčních konjugátů a možnost snadné separace produktu od kontaminujících látek, např. nenavázaných detekčních kvantových teček.
Příklad 5: Ověření vlivu blokačního kroku při přípravě detekčního konjugátu na intenzitu signálu
Pro kvalitu detekčních konjugátů, jejich funkčnost, a výslednou citlivost celého systému je klíčovým parametrem nízká hladina signálu v případě negativních kontrol. Jakákoliv sorpce detekčního konjugátu na povrch separačního konjugátu bez účasti analytu (tzv. míra nespecifické sorpce) je nežádoucí. Vhodnými experimentálními podmínkami přípravy detekčního konjugátu a vazby detekčního konjugátu na antigen je nutné zajistit nulovou nespecifickou sorpci. Míra nespecifické sorpce ovlivňuje citlivost stanovení. V případě detekčních konjugátů jsou za míru nespecifické sorpce zodpovědné zejména zbylé reaktivní skupiny všech reagencií použitých k jejich přípravě. Proto je do protokolu přípravy detekčního konjugátu s výhodou vložen krok blokace. Postup je popsán v příkladu 1. Byly porovnány signály detekčních konjugátů připravených bez blokování zbylých reaktivních skupin (tj. s vynecháním kroků blokace) a s jejich blokací (tj. všemi kroky postupu podle příkladu 1). Byly porovnány i z pohledu způsobu měření, kdy byly změřeny elektrochemicky jednotlivé detekční konjugáty a následně jejich směs, kdy se jednalo o simultánní proměření signálů generovaných třemi detekčními konjugáty současně. Elektrochemické měření probíhalo za podmínek uvedených v tabulce 1. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích 4 až 8. Na obrázcích 4 a 5 jsou výsledky analýzy jednotlivých detekčních konjugátů odděleně. Obrázek 4 je výsledek měření detekčních konjugátů s detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs (křivka 3) a detekčními kvantovými tečkami PbS QDs (křivka 2) bez blokování reziduálních reaktivních skupin. V případě detekčního konjugátu s detekčními zlatými nanočásticemi AuNPs (křivka 1) je používána blokace reaktivních skupin vždy, protože bez blokace neposkytly měřitelný signál. Obrázek 5 je výsledek měření detekčních konjugátů s detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs (křivka 3) a detekčními kvantovými tečkami PbS QDs (křivka 2) s blokováním reziduálních reaktivních skupin.
- 12 CZ 309527 B6
Blokace reziduálních reaktivních skupin vedla ke snížení nespecifické sorpce, signálu odpovídající negativní kontrole, ale současně došlo i ke zvýšení výsledného signálu. Blokace žádným způsobem neovlivnila výsledný tvar píků, ani potenciál, při kterém je zaznamenán pík jednotlivých detekčních konjugátů.
Na obrázcích 6 až 8 je porovnání kalibračních závislostí pro separátní a simultánní analýzy pro jednotlivé detekční konjugáty a zároveň porovnání způsobu přípravy, tedy bez blokace (grafy na levé straně) a s blokací (grafy na pravé straně). S rostoucím množství detekčních konjugátů je patrný nárůst hodnot proudů pro všechny tři analyzované detekční konjugáty. S rostoucím množství detekčních konjugátů je také patrný nárůst hodnot proudů pro všechny tři analyzované detekční konjugáty. Je však patrný rozdíl naměřených hodnot proudů zejména v případě detekčních konjugátů s detekčními kvantovými tečkami CdTe QDs, kde při simultánní analýze dochází k potlačení výsledného signálu.
Z výsledků jasně vyplývá, že pro simultánní analýzu je velmi výhodné používat detekční konjugáty po blokaci. Pro detekční konjugáty bez blokace vychází intenzita proudové odezvy v některých případech vyšší, avšak za podmínek simultánní analýzy je signál výrazně potlačen.
Na obrázku 9 je záznam měření, kde jsou srovnány intenzity proudových odezev detekčních konjugátů měřených separátně (nahoře) a simultánně (dole). V případě simultánního měření došlo k významnému potlačení signálu pro PTX3, kde byl detekční konjugát značen detekčními kvantovými tečkami na bázi kadmia (CdTe QDs).
Příklad 6: Ověření vlivu typu protilátek pro přípravu separačního konjugátu
Vliv typu protilátek byl testován na anti-IL-6 protilátce.
Pro výslednou funkčnost a citlivost systému je relevantní i způsob přípravy separačního konjugátu a typ použitých specifických protilátek z pohledu klonality (monoklonální vs. polyklonální). Jako příklad je uveden vliv typu protilátek proti analytu IL-6. Pro přípravu separačního konjugátu byly použity a testovány jak monoklonální, tak i polyklonální protilátky. Pro přípravu detekčního konjugátu byly vždy použity polyklonální protilátky (širší variabilita ve specifitě polyklonálních protilátek vede k vyšší reaktivitě s analytem). Bylo experimentálně potvrzeno, že pro přípravu separačního konjugátu je výhodnější použití monoklonálních protilátek (viz obrázek 10). Postup přípravy separačního konjugátu je uveden v příkladu 2. Elektrochemická detekce probíhala za podmínek uvedených v tabulce 1.
Příklad 7: Analýza analytů
Pro separátní analýzu analytů a sestavení jejich kalibračních závislostí byly použity standardní komerčně dostupné proteiny. Jsou uvedeny příklady pro analýzu proteinu PTX 3, IL-6 a CALR. Pro přípravu separačního konjugátu byly v případě PTX 3 a IL-6 použity monoklonální protilátky, v případě CALR polyklonální protilátky (postup přípravy podle příkladu 2). Pro přípravu detekčních konjugátů byly použity ve všech případech protilátky polyklonální (postup přípravy podle příkladu 1). Postup analýzy je uveden v příkladu 3. Elektrochemická detekce probíhala za podmínek uvedených v tabulce 1. Výsledné voltamogramy a kalibrační závislosti jsou uvedeny na obrázcích 11 až 13.
Příklad 8. Ověření vlivu matrice (plodové vody) na výsledky analýzy
Pro výhodné provedení, analýzu analytů ve vzorcích plodové vody, byl ověřen vliv matrice. Jako příklad je uvedena analýza proteinu IL-6, která byla provedena proměřením standardu v modelovém reakčním prostředí, ve kterém probíhaly optimalizační kroky, tedy v roztoku 0,2 M Tris-HCl pufru, pH 8,0 s 1% BSA a 0,1% Tween 20. Vedle toho byl připraven vzorek fyziologické plodové vody (ředěné 1:1) se standardním přídavkem proteinového analytu IL-6 o koncentraci
- 13 CZ 309527 B6
0,015 pg/ml. Tvorba imunokomplexu probíhala podle postupu uvedeného v kapitole 1.3, podmínky elektrochemické detekce jsou uvedeny v tabulce 1. Výsledný voltamogram (obrázek 14) prokazuje využitelnost systému pro reálné vzorky. Naměřená hodnota proudové odezvy pro vzorek plodové vody (ředěno 1:1) se standardním přídavkem analytu IL-6 (křivka 3) je srovnatelná 5 s průběhem proudové odezvy vzorku, kde je analyt (IL-6) pouze v pufru o definované hodnotě molarity a hodnoty pH (křivka 4). Průběh proudové odezvy se pro negativní kontroly plodová voda (křivka 2), pufr (křivka 1) částečně liší, avšak absolutní rozdíl je pro obě prostředí shodný a naměřené koncentrace analytů ve vzorku plodové vody plně odpovídají očekávaným hladinám IL6.
Příklad 9: Simultánní analýza tří analytů
Pro simultánní analýzu analytů byly použity standardní proteiny komerčně dostupné. Je uveden příklady pro průkaz PTX 3, IL-6 a CALR. Postup sestavení imunokomplexů je uveden v příkladu 15 3. Elektrochemická detekce probíhala za podmínek uvedených v tabulce 1. Výsledný voltamogram je uveden na obrázku 15.

Claims (10)

1. Sada pro simultánní detekci až tří proteinových analytů, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více typů separačního konjugátu pro každý analyt, a alespoň dva typy detekčního konjugátu, přičemž je jeden typ detekčního konjugátu pro každý analyt, kde:
- každý typ separačního konjugátu obsahuje primární protilátku proti danému analytu navázanou na povrch magnetické částice;
- každý detekční konjugát obsahuje sekundární protilátku pro vazbu na daný analyt, přičemž v každém typu detekčního konjugátu je na sekundární protilátku kovalentně navázána konjugační částice, na jejíž povrch je kovalentně navázáno více detekčních částic jednoho typu vybraného z kvantových teček CdTe, kvantových teček PbS a zlatých nanočástic, přičemž každý typ detekčního konjugátu obsahuje odlišné detekční částice;
přičemž uvedené alespoň dva typy detekčního konjugátu jsou:
- detekční konjugát s kvantovými tečkami CdTe a detekční konjugát se zlatými nanočásticemi, nebo
- detekční konjugát s kvantovými tečkami PbS a detekční konjugát se zlatými nanočásticemi, nebo
- detekční konjugát s kvantovými tečkami CdTe, detekční konjugát s kvantovými tečkami PbS a detekční konjugát se zlatými nanočásticemi.
2. Sada podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden jednorázový senzor pro detekci elektrochemického signálu z detekčních částic, s výhodou je senzorem tištěný senzor na bázi keramické destičky obsahující pracovní elektrodu, referentní elektrodu a popřípadě pomocnou elektrodu, s výhodou je jednorázovým senzorem tříelektrodový senzor s uhlíkovou pracovní, uhlíkovou pomocnou a stříbrnou referentní elektrodou.
3. Sada podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje magnetický separátor, a/nebo činidlo pro kyselou hydrolýzu detekčních částic.
4. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že primární protilátky jsou monoklonální nebo polyklonální protilátky a sekundární protilátky jsou polyklonální protilátky.
5. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že primární i sekundární protilátky jsou protilátky třídy IgG.
6. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že konjugační částicí je mezoporézní nanočástice na bázi SiO2 povrchově modifikovaná funkčními skupinami, s výhodou aminoskupinami, jejichž prostřednictvím se kovalentně vážou detekční částice, přičemž konjugační částice má velikost v rozmezí 10 až 900 nm, a velikost mezoporů částice je v rozmezí 2 až 50 nm.
7. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že primární a sekundární protilátky jsou anti-PTX3 protilátky, anti-CALR protilátky a anti-IL-6 protilátky.
8. Způsob přípravy sady podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že - karboxylové skupiny na povrchu detekčních částic se aktivují pomocí N-ethyl- N '-(2dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochloridu, EDAC, za vzniku detekčních částic s esterovými skupinami o-acylisourey na povrchu, které dále reagují s aminoskupinami na povrchu konjugačních částic za vzniku signál generujících částic, následně se hydroxylové funkční skupiny monosacharidových jednotek přítomných v sekundární protilátce podrobí oxidaci za tvorby reaktivních aldehydických skupin, které se následně uvedou do reakce s aminoskupinami na povrchu konjugačních částic, za tvorby detekčního konjugátu; a
- 15 CZ 309527 B6
- karboxylové skupiny na povrchu magnetických částic se aktivují pomocí N-ethyl- N '-(2dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochloridu, EDAC, a následně se aktivované magnetické částice podrobí reakci s primární protilátkou.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se nezreagované aktivované funkční skupiny detekčního konjugátu, resp. signál generujících částic, podrobí reakci blokace, a to s výhodou pomocí směsi MES pufru, Tris pufru a N-ethyl- N '-(2- dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochloridu, EDAC, pro aktivované karboxylové skupiny, a/nebo pomocí NaCNBH3 v roztoku NaOH pro reaktivní aldehydické skupiny.
10. Použití sady podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 ve způsobu simultánního elektrochemického stanovení dvou až tří proteinových analytů, který obsahuje kroky:
a) uvedení vzorku, v němž mají být tyto analyty stanovovány, do kontaktu se separačními konjugáty za vzniku imunokomplexu navázáním cílových analytů na separační konjugáty;
b) podrobení vzorku separaci magnetickým polem pro oddělení separačních konjugátů s případně navázanými analyty;
c) uvedení oddělených separačních konjugátů s případně navázanými analyty - imunokomplexů - do kontaktu s detekčními konjugáty pro navázání detekčních konjugátů na imunokomplexy;
d) vymytí nenavázaných detekčních konjugátů;
e) podrobení imunokomplexů s navázanými detekčními konjugáty kyselé hydrolýze; a f) stanovení kovů uvolněných z detekčních částic detekčních konjugátů v produktu kyselé hydrolýzy metodou SWASV/SWCSV.
CZ2021-401A 2021-08-31 2021-08-31 Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou CZ309527B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-401A CZ309527B6 (cs) 2021-08-31 2021-08-31 Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou
PCT/CZ2022/050080 WO2023030561A1 (en) 2021-08-31 2022-08-21 Kit and method for simultaneous electrochemical determination of at least two protein analytes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-401A CZ309527B6 (cs) 2021-08-31 2021-08-31 Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2021401A3 CZ2021401A3 (cs) 2023-03-22
CZ309527B6 true CZ309527B6 (cs) 2023-03-22

Family

ID=83193199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021-401A CZ309527B6 (cs) 2021-08-31 2021-08-31 Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ309527B6 (cs)
WO (1) WO2023030561A1 (cs)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008091708A2 (en) * 2007-01-25 2008-07-31 Source Precision Medicine, Inc. Gene expression profiling for identification, monitoring, and treatment of lupus erythematosus
US9804161B1 (en) * 2012-05-14 2017-10-31 Lawrence Livermore National Security, Llc Detector and related, devices, methods and systems
WO2014081393A1 (en) * 2012-11-21 2014-05-30 Singapore Health Services Pte Ltd Method for detection or an antigen

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ČADKOVÁ, Michaela, et al.: Electrochemical quantum dots-based magneto-immunoassay for detection of HE4 protein on metal film-modified screen-printed carbon electrodes. Talanta, 2018, Vol. 182, p. 111-115, ISSN 0039-9140 *
CENTI, Sonia, et al.: Detection of biomarkers for inflammatory diseases by an electrochemical immunoassay: The case of neopterin. Talanta, 2015, Vol. 134, p. 48-53, ISSN 0039-9140 *
CHEN, Zongbao, et al.: Novel electrochemical immunoassay for human IgG1 using metal silfide quantum dot-doped bovine serum albumin microspheres on antibody-functionalized magnetic beads. Analytica Chimica Acta, 2017, Vol. 979, p. 24-30, ISSN 0003-2670 *
QUIAN, Jing, et al.: Simultaneous detection of dual proteins using quantum dots coated silica nanoparticles as labels. Biosensors and Bioelectronics, 2011, Vol. 28, p. 314-319, ISSN 0956-5663 *
ZHANG, Bing, et al.: Simultaneous multiplexed stripping voltammetric monitoring of marine toxins in seafood based on distinguishable metal nanocluster-labeled moleculat tags. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, Vol. 60, p. 8974-8982, ISSN 0021-8561 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2021401A3 (cs) 2023-03-22
WO2023030561A1 (en) 2023-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rezabakhsh et al. Surface plasmon resonance biosensors for detection of Alzheimer's biomarkers; an effective step in early and accurate diagnosis
Vashist et al. Bioanalytical advances in assays for C-reactive protein
Carneiro et al. Biosensors on the road to early diagnostic and surveillance of Alzheimer's disease
Zhou et al. Detection of Aβ monomers and oligomers: early diagnosis of Alzheimer's disease
US10488408B2 (en) Detection of target molecules in a sample by using a magnetic field
KR101702117B1 (ko) 광범위한 농도범위의 생체물질 농도 측정이 가능한 면역크로마토그래피 스트립 센서
US6110660A (en) Procedure for quantitative and qualitative determination of chemical substances, based on molecular recognition and measurement of magnetic permeability
JP2011514517A (ja) 環状シトルリン化ペプチドに対する抗体のアッセイ方法
Oh et al. High sensitive and broad-range detection of cortisol in human saliva using a trap lateral flow immunoassay (trapLFI) sensor
US20210033605A1 (en) Lateral flow immunoassay strip device
JP2024038323A (ja) 分析物を検出するための方法
Vairaperumal et al. Optical nanobiosensor-based point-of-care testing for cardiovascular disease biomarkers
JP2010281595A (ja) リガンド分子の検出方法
JP2012168012A (ja) 血管内皮障害を検査するための新規な検査方法および検査用キット
Shah et al. Electrochemical detection of glycan and protein epitopes of glycoproteins in serum
Yamamichi et al. Single-step, label-free quantification of antibody in human serum for clinical applications based on localized surface plasmon resonance
Agafonova et al. Quartz crystal microbalance for the cardiac markers/antibodies binding kinetic measurements in the plasma samples
CZ309527B6 (cs) Sada a způsob pro simultánní stanovení dvou až tří proteinových analytů elektrochemickou metodou
JP4394285B2 (ja) コバラミンの検定
CN113702464A (zh) 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法
KR102594453B1 (ko) 남성 불임을 위한 바이오센서
Guo et al. Protein array for assist diagnosis of acute myocardial infarction
JP5997446B2 (ja) 甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途
Mikula et al. Electrochemical biosensor for the detection of glycated albumin
Vargis et al. Peroxidase labeled antibody conjugated gold nanoparticles for ultrasensitive voltammetric immunosensing