CZ307155B6 - Supramolekulární komplex oxycelulózové matrice s antracyklinovým cytostatikem s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika a jeho použití - Google Patents

Abstract

Supramolekulární komplex oxycelulózové matrice s antracyklinovým cytostatikem s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika, který obsahuje 5 až 30 % hmotn. antracyklinového cytostatika, který je s výhodou doxorubicin. nekovalentně vázaného na oxvcelulózovou matrici, která je tvořena oxidovanými formami celulózy s vysokými terapeutickými účinky při topických vnitrotělových aplikacích do reziduáluí nádorové tkáně po chirurgickém odstraněni.

Description

Vynález se týká nových supramolekulámích komplexů oxycelulózových matric s protinádorovými léčivy na bázi vodorozpustných antracykl i nových sloučenin a jejich pooperační vnitrotělové aplikace pro eliminaci reziduálních nádorových buněk/tkáně po chirurgickém zákroku. Předložená metodika eliminuje riziko jak metastáz, tak opakovaného růstu nádoru v původním místě.

Dosavadní stav techniky

Komplikace při chirurgickém odstranění solidních tumorů jsou jak metastáze (pozdní diagnosa), tak neúplné odstranění tumoru. Obě vedou k následným komplikacím a často končí úmrtím pacienta. Obvyklá následná terapie zahrnuje ozařování, fotodynamickou terapii, cytostatickou léčbu s použitím jiných léčiv.

Metastázy, tedy šíření nemocných buněk z nádoru do celého těla, mohou podle odhadů až za 90 procent všech úmrtí spojených s rakovinou. Cílem je tak najít cestu, jak jejich šíření po těle omezit nebo mu zabránit úplně. Nová ložiska nádorů na dalších místech těla (často to bývají například plíce, játra nebo kosti) mají obvykle dvě nepříjemné vlastnosti - bývají agresivnější (rychleji rostou) a jsou hůře léčitelné.

V závislosti na typu a stadiu karcinomu obecně léčíme chirurgicky, pomocí chemoterapie nebo radioterapie. U každého pacienta připadá v úvahu jedna nebo kombinace více uvedených léčebných metod. Chemoterapie se používá jako systémová léčba, která postihuje nádorové buňky v celém těle aje možno ji aplikovat po chirurgickém odstranění nádorové tkáně za účelem zabránění vzniku metastáz. Tato léčba se nazývá doplňková neboli adjuvantní. Chemoterapii používáme také ke zmírnění příznaků nemoci, pokud nelze nádor chirurgicky odstranit a ke kontrole jeho růstu. Chemoterapii podáváme v cyklech, mezi jednotlivými sériemi následuje různě dlouhé období na zotavení.

V současné době byla vyvinuta řada účinných protinádorových léčiv. Nicméně velmi vážný problém jejich klinické aplikace jsou velmi silné nepříznivé vedlejší účinky. Jednou z možností jak daný problém řešit je jejich formulace pomocí vhodných excipientů. Tato strategie by mohla potencionálně zlepšit terapeutické vlastnosti řady používaných protinádorových léčiv. Systémy pro cílený transport léčiv s řízeným uvolňováním a účinkem léčiva představují velmi slibné látky pro současnou farmakoterapii. Cílem jejich aplikace je dosáhnout použití správného množství léčiva, ve správném čase a na správném místě. Mají schopnost přivést léčivo v nezměněné podobě na místo jeho účinku při snížené distribuci do nežádoucích částí organizmu. Cílením léčiva na místo interakce se snižuje jeho podaná dávka a s tím nežádoucí vedlejší účinky. Vzniká tak možnost aplikace vysoce účinných léčiv, ale s velmi nízkou rozpustností jakou jsou taxolové deriváty (např. docetaxel) a tudíž omezenou aplikovatelností nebo s vysokými vedlejšími účinky jako jsou antracykliny (např. doxorubicin) nebo platinové metalokomplexy. Docetaxel (L01CD02) a doxorubucin (L01DB01) patří mezi velmi intenzivně studovaná léčiva pro tyto aplikace. Jejich vhodná formulace by mimo jiné umožnila jejich šetrnější podávání v případě docetaxelu a cisplatiny a podstatnou redukci kardiotoxicity doxorubicinu.

V současné době patří mezi nejvíce perspektivní excipienty pro formulaci protinádorových léčiv polysacharidové polymery, např. oxycelulóza. Aktivní látka je v nich přítomna jako disperze v polymemí matrici, nebo lépe jako komplexované léčivo polymemí matricí. Jejich aplikace vede k snadnější kontrole hladiny léčiva krvi a tím i jeho efektivnějšímu dávkovaní oproti podání volného léčiva. Na bázi polysacharidových polymerů, včetně oxyceulózy, byla připravena a studo- 1 CZ 307155 B6 vána celá řada slibných excipientů včetně multifukčních (někdy zvaných smart excipients). Potencionální výhoda vhodně aplikovaných polymemích excipientů (např. polysacharidových) by mohla být také snadnější kontrola vstupu léčiva do cílové nádorové buňky.

Oxidovaná celulóza (Oxycelulóza, Okcel) je známa jako vysoce slibná látka pro nejrůznější farmaceutické a medicínské aplikace. Oxycelulóza vykazuje vysokou biokompatibilitu a biodegradovatelnost za fyziologických podmínek vedoucí k netoxickým produktům. Oxycelulóza je dlouhodobě studována a používána v medicíně pro podporu krevní srážlivosti, jako prevence pro adhezi tkání po chirurgickém zákroku, pro zlepšení hojení chronickým ran, modulace imunitního systému.

(Jan Gajdziok, David Vetchý Oxidized Cellulose and its Pharmatetical and Medical Application Cellulose and Cellulose Derivarives Syntheses, Modification and Applications Nova Science Publishers, lne New York 2015; Schmidt, R., Bogan, D., Moore, J. (2001). Use of oxidized cellulose as free radical scavenger. European Patent EP1153618; Watt, P. W., Harvey, W., Lorimer, E., Wiseman, D. (1998). Use of oxidized cellulose and complexes thereof for chronic wound healing. World Patent W09800180.; Jelínková, M., Briestenský, J., Santar, I., Říhová, B. (2002). In vitro and in vivo immunomodulatory effects of microdispersed oxidized cellulose. Int. Immunopharmacol. 2 (10), 1429-1441; Santar, 1., Kiss, F., Briestenský, J. (1998). Cellulose derivatives. World Patent WO9833822; Dimitrijevich, S. D., Tatarko, M., Gracy, R. W. (1990). Biodegradation of oxidized regenerated, cellulose. Carbohydr. Res. 195 (2), 247-256; Dimitrijevich, S. D., Tatarko, M., Gracy, R. W., Wise, G. E., Oakford, L. X. (1990). In vivo degradation of oxidized, regenerated cellulose. Carbohydr. Res. 198 (2), 331-341; Bankéř, S. G., Kumar, V. (1995). Microfibrillated oxycellulose. United States Patent US5405953; Otterlei, M., Espvik, T., SkjakBraek, G., Smidsrod, O. (1992) Diequatorially bound beta 1-4 polyuronates and use of same for cytokine stimulation. United States Patent US5169840; Doyle P. J., Saferstein L., Lorimer E., Watt P. W. (1998). Oxidized Oligosaccharides. World Patent W09800446; Bajerová, M., Krejčová, K., Rabišková, M., Gajdziok, J., Masteiková, R. (2009). Oxycellulose - significant characteristics in relation to its pharmaceutical and medical applications. Adv. Polym. Tech. 28(3), 199208; Bankéř, G. S., Kumar, V. (1998) Oxidized cellulose. United States Patent US5780618), (Leidgens V, Seliger C, Jachnik B, Welz T, Leukel P, Vollmann-Zwerenz 1, Bogdahn U, Kreutz M, Grauer OM, Hau P Ibuprofen and Diclofenac Restrict Migration and Proliferation of Human Glioma Cells by Distinct Molecular Mechanisms. PLoS One. 2015 Oct 20; 10( 10):e0140613; Chai AC, Robinson AL, Chai KX, Chen LM. Ibuprofen regulates the expression and function of membrane-associated serine proteases prostasin and matriptase BMC Cancer. 2015 Dec 29; 15:1025. doi: 10.1186/s 12885-015-2039-6; da Silveira EF1, Chassot JM, Teixeira FC, Azambuja JH, Debom G, Beira FT, Del Pino FA, Lourenqo A, Horn AP, Cruz L, Spanevello RM, Braganhol E. Ketoprofen-loaded polymeric nanocapsules selectively inhibit cancer cell growth in vitro and in preclinical model of glioblastoma multiforme Invest New Drugs. 2013 Dec;31(6):1424-35. doi: 10.1007/sl0637-013-0016-y. Epub 2013 Sep 27; Damnjanovic I, Najman S, Stojanovic S, Stojanovic D, Veljkovic A, Kocic H, Langerholc T, Damnjanovic Z, Pesic S. Crosstalk between possible cytostatic and antiinflammatory potential of ketoprofen in the treatment of culture of colon and cervix cancer cell lineš Bratisl Lek Listy. 2015; 116(4):22732)

Aplikace oxycelulózových derivátů pro cílený transport léčiv byli popsány v jejich kombinaci s magnetickými nanočásticemi (Sivakumar, Balasubramanian; Aswathy, Ravindran Girija; Nagaoka, Yutaka; Suzuki, Masashi; Fukuda, Takahiro; Yoshida, Yasuhiko; Maekawa, Toru; Sakthikumar, Dasappan Nair Multifunctional Carboxymethyl Cellulose-Based Magnetic Nanovector as a Theragnostic System for Folate Receptor Targeted Chemotherapy, Imaging, and Hyperthermia against Cancer Langmuir (2013), 29(10), 3453-3466), nebo jejich kombinaci s chitosanem a magnetickými nanočásticemi (Synthesis, characterization and in vitro assessment of the magnetic chitosan-carboxymethylcellulose biocomposite interactions with the prokaryotic and eukaryotic cells Grumezescu, Alexandru Mihai; Andronescu, Ecaterina; Ficai, Anton; Bleotu, Coralia; Mihaiescu, Dan Eduard; Chifiriuc, Mariana Carmen International Journal of

-2CZ 307155 B6

Pharmaceutics (Amsterdam, Netherlands) (2012), 436(1-2), 771-777), nebo kombinaci oxycelulózy s nanočásticemi, či její konjugáty s léčivy (Soo, B. Chia; Ting, Kang; Wu, Ben; Zhang, Kevin Transcutaneous multimodal delivery systems comprising dissolvable microneedles PCT Int. Appl. (2012), WO 2012103257 A2 20120802), nebo její kombinaci s chitosanem (Viieira, D. B.; Kim, V.; Petři, D. F. S.; Menck, C. F. M.; Carmona-Ribeiro, A. M.Edited By.Laudon, Matthew; Romanowicz, Bart Polymer-based delivery vehicle for cisplatin Nanotech Conference & Expo 2011: An Interdisciplinary Integrative Fórum on Nanotechnology, Biotechnology and Microtechnology, Boston, MA, United States, June 13-16, 2011 (2011), 3, 382-385), nebo aplikace oxycelulózového hydrogelu pro uvolňování léčiv pro léčbu močových cest (Konorty, Marina; Hakim, Gil Mucoadhesive thermoreversible topical hydrogels and method for treating internal cavities U.S. Pat. Appl. Publ. (2014), US 20140105884 Al 20140417).

Patentový dokument WO 2007147052 popisuje farmaceutickou kompozici pro topické použití tvořenou filmem z celulózy nebo jejich derivátů, obsahující biologicky aktivní činidlo v přesyceném stavu, kterým je např. terbinafin, naftifin, amorolfin, butenafin, jejich deriváty, acyklovir, nepolymemí inhibitor krystalizace - hydroxykarboxylovou kyselinu, těkavé rozpouštědlo. Kompozice je určena pro antifungální léčbu, pro léčbu nebo prevenci varicella zoster infekce HSV-1 infekce nebo HSV-2 infekce, nebo prevenci onychomykózy.

Vynález CN 1843332 A popisuje protinádorové injekce s prodlouženým uvolňováním obsahující angiogenezní inhibitory a cytotoxická činidla, které sestávají z mikrokuliček obsahujících protinádorové účinné látky 0,5 až 60 %, pomocné látky s prodlouženým uvolňováním 40 až 99 %, jako je kyselina polymléčná; kopolymerů kyseliny polyglykolové a kyseliny glykolové; polifeprosan; ethylen-vinylacetátu; di-mastná kyselina a kopolymer kyseliny sebakové; póly (erukové dimer kyseliny - kyselina sebaková) kopolymer; póly (kyselina fumarová - kopolymer kyseliny sebakové). Suspendační činidla 0.0-30%: sodné soli karboxymethylcelulózy, jodu glycerin, dimethikon, propylenglykol, karbomer, mannitol, sorbitol, povrchově aktivní látky, jeden z Tween 20, Tween 40 a Tween 80, nebo jejich kombinace, inhibitor je vybrán z gefitinib, erlotinib, lapatinib, karboxy-amino-triazolu, thalidomid, angiostatin, endostatin, endostatin, imatinib mesylát, kanamycin, erlotinib, sorafenib, imatinib. Cytotoxické činidlo se vybralo z platiny Nida, melfalan, cyklofosfamid, 4H peroxid vinorelbin, tamoxifen, metotrexát, doxorubicin, epirubicin, aktinomycin D, estramustin, semustin nebo ranimustin.

Přihláška vynálezu EP1491188 Al popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčbu kožních poruch s obsahem alespoň 0,1 % účinné látky, tvořené VPA a nebo jejich solí, která obsahuje také chemoterapeutické léčivo, kterým je 5-fluorouracil a dále obsahuje nosiče ve formě krémů, mastí, past a gelů. Přípravku má být použito pro léčbu kožních nádorů, pre-neoplastických kožních onemocnění, zánětů kůže a / nebo sliznice a photoaging.

Výběžky nádoru do okolní tkáně a jeho složitá topologie v praxi téměř znemožňují chirurgické odstranění celého nádoru. Následná chemoterapie nebo systémové podávání léčiv je často neúčinné, jelikož koncentrace léčiva v místě původního nádoru je příliš nízká.

Podstata vynálezu

Kvůli málo účinné postoperační léčbě reziduální nádorové tkáně byly vyvinuty nové postupy aplikace cytotoxického léčiva, na bázi antracyklinových sloučenin, nekovalentně vázaných na oxycelulózovou matrici, a to topicky přímo do rány po odstranění tumoru.

Vynález se týká nové metody topické vnitrotělové aplikace stabilních supra-molekulámích komplexů oxycelulózových matric s antracyklinovými proti nádorovým i antibiotiky — cytostatiky, jako je doxorubicin, epirubicin či daunorubicin.

- J “

Byla vytvořena kompozice pro pooperační vnitrotělové topické aplikace sestávající z modifikované oxycelulózy s antracyklinovými antibiotiky pro eliminaci nádorové tkáně/buněk po chirurgickém zákroku. Kompozice umožňuje řízené postupné uvolňování léčiva v nádoru nebo jeho reziduích a tím vede k eliminaci zbytkové nádorové tkáně a zabraňuje jejímu rapidnímu nárůstu po klasickém i laparoskopickém zákroku.

Kompozice je tvořena supramolekulárními komplexy oxycelulózových matric, s výhodou ve formě HD, HL a CaL, s antracykliny s výhodou epirubicinem nebo doxorubicinem.

Oxycelulózová matrice CaL je prášková forma vápenaté soli oxidované celulózy, je organismem dobře snášena a rychle se vstřebává, HD je pletená verze vstřebatelného hemostatického materiálu oxidované celulózy v textilní formě a HL je lintrová kyselá forma oxidované celulózy ve formě prášku který je nerozpustný ve vodě. V lidském těle se oxycelulózové matrice vstřebávají bez jakýchkoli zbytků, jsou biologicky odbouratelné, v průběhu rozkladu vznikají netoxické produkty a jsou plně biokompatibilní. Díky nízkému pH působí antibakteriálně. Pomáhají s regenerací tkáně, tedy i se zvýšením léčebných účinků.

Antracykliny jako je doxorubicin a epirubicin patří mezi nejúčinnější léky používané v léčbě karcinomu prsu. Antracykliny mají několik mechanismů účinku. Nevýznamnějším je blokáda enzymu topoizomerázy II. Topoizomerázy jsou enzymy, které se podílejí na změnách v prostorovém uspořádání DNA při její replikaci (kopírování) před dělením buňky. Při blokádě topoizomerázy II se nespojují jednotlivé části DNA a ta se rozpadá. Antracyklinová antibiotika také tvoří interkalační vazby s DNA, to je pevné spojení obou vláken DNA. To vede ke zlomům molekuly DNA a k poruchám transkripce („kopírování“ úseku DNA do RNA) i replikace („kopírování“) DNA před rozdělením buňky. Třetím cytotoxickým účinkem je vznik volných radikálů.

V případě antracyklinových léčiv je proces přípravy supramolekulárního komplexu založen na aktivaci absorpční schopnosti oxycelulózové matrice ponořením do vody a následném přidání roztoku rozpouštědla obsahujícího dané léčivo. Rozpouštědlo je vybráno ze skupiny obsahující methanol, ethanol, isopropanol, 2-methoxyethanol, AýV-dimethylformamid, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, acetonitril, aceton nebo jejich směs a jako další voda. Dané míšení je kontrolované prováděno tak, aby léčivo obsažené v rozpouštědle zůstalo rozpuštěné i ve vzniklé směsi vody případně s daným organickým rozpouštědlem. Následně jsou vodné systémy s organickým rozpouštědlem obsahující oxycelulózovou matrici a dané léčivo třepány s výhodou po dobu 24 hodin. Poté je modifikovaná matrice, tedy s nekovalentně vázaným léčivem, izolovaná pomocí filtrace, následně promyta použitým rozpouštědlovým systém a nakonec vakuově sušena. Celý proces přípravy je kontrolované prováděn tak, aby teplota oxycelulózových matric nebo jejich roztoků nebyla vyšší než 20 °C.

Připravené kompozice sestávají z supramolekulámích struktur oxycelulózových matric s antracykliny, přičemž antracykliny jsou v matrici v množství 5 až 30 % hmotn. Ze strukturních analýz vyplynulo, že antracykliny jsou skutečně nedílnou součástí oxycelulózové matrice a nejedná se tedy o pouhou mechanickou směs, ale supra-molekulární strukturu. Také byly ověřeny vysoké stability vytvořených struktur, což dokazuje, že k uvolnění cytotoxických antracyklinů nedochází předčasně do okolní zdravé tkáně. Dále byla ověřena zvýšená průchodnost přes simulované biologické membrány oproti průchodnosti samotných antracyklinů, což je přisuzováno právě supramolekulární struktuře a zvyšuje se efektivita transportu léčiva přímo dovnitř nádorové tkáně.

Pro celulózová matrice jsou známy dva základní mechanismy uvolňování léčiv. Ve vodním prostředí se nejprve matrice zvlhčí vodou, čímž dojde k uvolnění počáteční koncentrace rozpuštěného léčiva z povrchu matrice. Díky této gelové vrstvě může voda z matrice uvolňovat léčivo, aniž by došlo k jejímu rozrušení (preferováno hydrofilními léčivy jako je doxorubicin). V následné fázi dojde k hydrataci povrchu matrice, zvýšení pohyblivosti polymerových řetězců a vzniku nabobtnalého gelu. Další fázi dochází k rozvolnění polymerových řetězců a jejich uvolnění do okolí. Na novém povrchu matrice vznikne další gelová vrstva a celý proces se opakuje až do její-4CZ 307155 B6 ho zániku (preferováno pro hydrofobní léčiva např. docetaxel). V případě omezeně rozpustných léčiv se na jejich uvolnění z matrice podílejí oba mechanismy. Na daný proces má velký vliv stabilita použité matrice. V případě stabilnějších matric bude preferováno vymývání léčiva. Naproti tomu v případě méně stabilních matric dojde k uvolnění většiny vázaného léčiva již během rozpadu samotné matrice. Dochází tedy k postupnému uvolňování léčiva z modifikované oxycelulózy a to pouze v místě po vyoperovaném nádoru, čímž se rapidně snižují nežádoucí účinky použitých cytostatik.

Bylo prokázáno, že při standardních testech za podmínek 25 °C ± 2 °C a relativní vlhkosti 60 % ± 5 % i při zrychlených testech (podmínky 40 °C ± 2 °C/75 % RV ± 5 % RV) jsou připravené komplexy modifikovaných celulózových matric stabilní po dobu nejméně 6 měsíců.

K výhodnosti vnitrotělové topické aplikace bylo dospěno až na základě řady experimentů, kdy byly prováděny preklinické testy na myších nu-nu modelech po odstranění nádorové tkáně karcinomu prsu a karcinomu pankreatu a následné aplikaci kompozice jak orálně, v každodenních dávkách, tak jednorázově topicky přímo do místa po vyoperovaném nádoru ve stejné dávce. Porovnání aplikace ve formě orální a vnitrotělové topické pooperační aplikace prokázal výhodnost topické aplikace, protože orální aplikace byla spojena s mortalitou o 26 až 42 % vyšší a především pozorovaný nárůst velikosti tumoru byl cca 33 až 50% vyšší.

Bylo zjištěno, že supermolekulární komplex oxycelulóz s doxorubicinem při vnitrotělové topické aplikaci, kdy je doxorubicin z komplexu postupně uvolňován, má schopnost omezovat nárůst karcinomu pankreatu až na 0,5 % oproti pouze chirurgické léčbě a až na 1,1 % oproti chirurgické léčbě s následným vnitrotělovým topickým podáním samotného doxorubicinu. Také mortalita pokusných myší při topické postoperační aplikaci komplexu je u karcinomu pankreatu nízká a to 11 až 14 %, pro prsní karcinomy 11 až 38 %. Mortalita pokusných myší pri orální aplikaci komplexu dosahuje až 64 %.

Teprve na základě těchto výsledků bylo dospěno k závěrům použití pouze vnitrotělové topické aplikace antracyklinů a pouze ve formě supramolekulárních oxycelulózových struktur, které byly prokázány jako nejšetmější a nejúčinnější.

Objasnění výkresů

Obr. 1. Tabulka přehledu navážek doxorubicinu vzhledem k navážkám oxycelulózy, procentuální obsah léčiva v oxycelulóze a loading léčiva do oxycelulózy, kdy jako rozpouštědlo byla použita směs EtOH: Voda (1:1, V/V)

Obr. 2. Tabulka přehledu navážek doxorubicinu vzhledem k navážkám oxycelulózy, procentuální obsah léčiva v oxycelulóze a loading léčiva do oxycelulózy, kdy jako rozpouštědlo byla použita voda

Obr. 3. Tabulka přehledu navážek doxorubicinu vzhledem k navážkám oxycelulózy, procentuální obsah léčiva v oxycelulóze a loading léčiva do oxycelulózy, kdy jako rozpouštědlo byla použita směs THF:Voda (1:1, V/V)

Obr. 4. A) Kinetika uvolňování doxorubicinu pro HD s 10 % doxorubicinu, jednotlivé křivky znázorňují fluorescenci roztoku v daném čase, čas je uveden v hodinách od začátku experimentu. B) Sledovaní uvolňovaní doxorubicinu z matrice závislosti na čase pomocí maxima jeho emise pri 594 nm. C) Závislost množství uvolněného doxorubicinu (%) na čase vztaženo na celkové množství doxorubicinu obsažené v daném množství matrice před zahájením experimentu (př. 2 A)

-5 CZ 307155 B6

Obr. 5.	A) Kinetika uvolňování doxorubicinu pro HL s 10 % doxorubicinu, jednotlivé křivky znázorňují fluorescenci roztoku vdaném čase, čas je uveden v hodinách od začátku experimentu. B) Sledovaní uvolňovaní doxorubicinu z matrice závislosti na čase pomocí maxima jeho emise při 594 nm. C) Závislost množství uvolněného doxorubicinu (%) na čase vztaženo na celkové množství doxorubicinu obsažené v daném množství matrice před zahájením experimentu (př. 2 B)
Obr. 6.	A) Kinetika uvolňování doxorubicinu pro CaL s 10 % doxorubicinu, jednotlivé křivky znázorňují fluorescenci roztoku vdaném čase, čas je uveden v hodinách od začátku experimentu. B) Sledovaní uvolňovaní doxorubicinu z matrice závislosti na čase pomocí maxima jeho emise při 594 nm. C) Závislost množství uvolněného doxorubicinu (%) na čase vztaženo na celkové množství doxorubicinu obsažené v daném množství matrice před zahájením experimentu (př. 2 C)
Obr. 7.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HL doxorubicinem („Dox.-Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HL“)
Obr. 8.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HL doxorubicinem („Dox.-MeOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HL“)
Obr. 9.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HL doxorubicinem („Dox.EtOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HL“)
Obr. 11.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HL doxorubicinem („Dox.-PrOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HL“)
Obr. 12.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HL doxorubicinem („Dox.-MeCN:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HL“)
Obr. 13.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HL doxorubicinem („Dox.-THF:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HL“)
Obr. 14.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.-Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)
Obr. 15.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.MeOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)
Obr. 16.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.EtOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)
Obr. 17.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.MeOH:EtOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)

-6CZ 307155 B6

Obr. 18.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.PrOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)
Obr. 19.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.THF:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)
Obr. 20.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu HD doxorubicinem („Dox.DMF:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („HD“)
Obr. 21.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL doxorubicinem („Dox.-Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 22.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL doxorubicinem („Dox.MeOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 23.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL doxorubicinem („Dox.EtOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 24.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL („Dox.MeOEtOH-.Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 25.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL („Dox.PrOH:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 26.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL („Dox.MeCN:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 27.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL („Dox.THF:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 28.	Porovnání Ramanových spekter pro modifikovanou oxycelulózu CaL („Dox.DMF:Voda“, obsah 5 hmotn. % doxorubicinu), čisté léčivo („Doxorubicin“) a nemodifikovanou oxycelulózu („CaL“)
Obr. 30.	Vliv oxycelulózové matrice na transport doxorubicinu přes fosfolipidovou PAMPA membránu
Obr. 31.	Vnitrotělová topická aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s doxorubicinem po chirurgické léčbě nu-nu myší s PATU lidský karcinomem pankreatu
Obr. 32.	Orální aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s doxorubicinem po chirurgické léčbě nu-nu myší s PATU lidský karcinomem pankreatu

-7CZ 307155 B6

Obr. 33. Vnitrotělová topická aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s doxorubicinem po chirurgické léčbě nu-nu myší s BT-474 lidský karcinomem prsu

Obr. 34. Orální aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s doxorubicinem po chirurgické léčbě nu-nu myší s BT-474 lidský karcinomem prsu a její porovnání se samotným doxorubicinem a oxycelulózových matric

Obr. 35. In vitro studie mortality nádorových buněk tkáňových kultur působením samotných antracyklinových cytostatik v porovnání s jejich oxycelulózovým komplexem

Obr. 36. Výsledky elementární analýzy modifikované celulózy HD doxorubicinem (5 hmotn. %) pro různé rozpouštědlové systémy

Obr. 37. Výsledky elementární analýzy modifikované celulózy HL doxorubicinem (5 hmotn. %) pro různé rozpouštědlové systémy

Obr. 38. Výsledky elementární analýzy modifikované celulózy CaL doxorubicinem (5 hmotn. %) pro různé rozpouštědlové systémy

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava a charakterizace supra-molekulárních komplexů oxycelulózových matric (HD, HL a CaL) s doxorubicinem

Příklad 1A

Použití rozpouštědla ethanol/voda (1:1, V/V) mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve směsi ethanol/voda (1:1, V/V; 5 ml) a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 24 hodinách třepání při teplotě 20 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta směsí ethanol/voda (1:1, V/V; 3 ml), vodou (3 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 20 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 5 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 1.

mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve směsi ethanol/voda (1:1, V/V; 5 ml) a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 24 hodinách třepání při teplotě 20 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta směsí ethanol/voda (1:1, V/V; 3 ml), vodou (3 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 20 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 10 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 1.

mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve směsi ethanol/voda (1:1, V/V; 5 ml) a přidáno koxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 36 hodinách třepání při teplotě 19 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta směsí ethanol/voda (1:1, V/V; 3 ml), vodou (3 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 19 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 30 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 1.

-8CZ 307155 B6

Pro takto připravené modifikované oxycelulózy byla změřena jejich Ramanova spektra a porovnána se spektrem čistého doxorubicinu a nemodifikované oxycelulózy (obrázek 9, 16, 23). Porovnáním pozice píků ajejich poměru intensit modifikovaných oxycelulóz, samotného doxorubicinu a nemodifikovaných oxycelulóz, lze usoudit, že účinná látka doxorubicinu není vázána čistě íyzikální absorpcí, ale tvoří inklusní komplex s danou matricí.

Příklad 1B

Použití rozpouštědla voda mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve vodě 5 ml a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 24 hodinách třepání při teplotě 20 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta vodou vodou (6 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 20 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 4 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 2.

mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve vodě 5 ml a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 24 hodinách třepání při teplotě 20 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta vodou (6 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 20 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 8,5 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 2.

mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve vodě 5 ml a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 36 hodinách třepání při teplotě 19 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta vodou (6 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 19 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 26 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 2.

Pro takto připravené modifikované oxycelulózy byla změřena jejich Ramanova spektra a porovnána se spektrem čistého doxorubicinu a nemodifikované oxycelulózy. Porovnáním pozice píků ajejich poměru intensit modifikovaných oxycelulóz, samotného doxorubicinu a nemodifikovaných oxycelulóz, lze usoudit, že účinná látka doxorubicinu není vázána čistě fyzikální absorpcí, ale tvoří inklusní komplex s danou matricí.

Příklad 1C

Použití rozpouštědla THF/voda (1:1, V/V) mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve směsi THF/voda (1:1, V/V; 5 ml) a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 24 hodinách třepání při teplotě 20 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta směsí THF/voda (1:1, V/V; 3 ml), vodou (3 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 20 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 5 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 3.

mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve směsi THF/voda (1:1, V/V; 5 ml) a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 24 hodinách třepání při teplotě 20 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta směsí THF/voda (1:1, V/V; 3 ml), vodou (3 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 20 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 10 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 3.

-9CZ 307155 B6 mg doxorubicinu bylo rozpuštěno ve směsi THF/voda (1:1, V/V; 5 ml) a přidáno k oxycelulóze (HL, HD nebo CaL) (100 mg). Po 36 hodinách třepání při teplotě 19 °C byla modifikovaná oxycelulóza odfiltrována, promyta směsí THF/voda (1:1, V/V; 3 ml), vodou (3 ml) a následně vysušena za vysokého vakua při teplotě 19 °C. Elementární analýzou bylo stanoveno, že na oxycelulózu bylo navázáno přibližně 30 % doxorubicinu s přesnými hodnotami hmotnostních koncentrací dle obr. 3.

Pro takto připravené modifikované oxycelulózy byla změřena jejich Ramanova spektra a porovnána se spektrem čistého doxorubicinu a nemodifikované oxycelulózy (obrázek 13, 19, 27). Porovnáním pozice píků ajejich poměru intensit modifikovaných oxycelulóz, samotného doxorubicinu a nemodifikovaných oxycelulóz, lze usoudit, že účinná látka doxorubicinu není vázána čistě fyzikální absorpcí, ale tvoří inklusní komplex s danou matricí.

Příklad 2A

Stabilita supra-molekulárních komplexů oxycelulózových matric HD s doxorubicinem a kinetika uvolňování doxorubicinu v HD s 10 % doxorubicinu

Kinetika uvolňovaní doxorubicinu z matrice HD ajejich stabilita byla sledována pomocí fluorescenční spektroskopie. Excitační vlnová délka byla 450 nm. Měření probíhalo v intervalu od 500 nm do 750 nm, délka kroku 1 nm, rychlost 1 nm za 2 vteřiny. Fluorescence doxorubicinu byla sledována při maximu jeho emisního pásu 594 nm. Měření bylo provedeno v plastových kyvetách. Do jednotlivých kyvet bylo naváženo po 1 mg modifikovaných matric (10 hm % doxorubicinu), pak zalito 2,4 ml PBS (lOmM fosfátový pufr, 0,137M NaCl a 0,0027M KC1), pH = 7,4 a následně uzavřeno parafilmem.

Pro všechny typy matric byla pozorována vysoká stabilita vázaného doxorubicinu. Pro porovnání: 0,1 mg volného doxorubicinu se rozpustí ve 2,4 ml PBS během necelých 5 minut. Zatímco v případě výše uvedených matric se rozpustí pouze část doxorubicinu (jak dokládá obr. 4), přičemž daný proces trvá 6 hodin.

Příklad 2B

Stabilita supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric HL s doxorubicinem a kinetika uvolňování doxorubicinu v HD s 10 % doxorubicinu

Kinetika uvolňovaní doxorubicinu z matrice HL ajejich stabilita byla sledována pomocí fluorescenční spektroskopie. Excitační vlnová délka byla 450 nm. Měření probíhalo v intervalu od 500 nm do 750 nm, délka kroku 1 nm, rychlost 1 nm za 2 vteřiny. Fluorescence doxorubicinu byla sledována při maximu jeho emisního pásu 594 nm. Měření bylo provedeno v plastových kyvetách. Do jednotlivých kyvet bylo naváženo po I mg modifikovaných matric (10 hm % doxorubicinu), pak zalito 2,4 ml PBS (lOmM fosfátový pufr, 0,137M NaCl a 0,0027M KC1), pH = 7,4 a následně uzavřeno parafilmem.

Pro všechny typy matric byla pozorována vysoká stabilita vázaného doxorubicinu. Pro porovnání: 0,1 mg volného doxorubicinu se rozpustí ve 2,4 ml PBS během necelých 5 minut. Zatímco v případě výše uvedených matric se rozpustí pouze část doxorubicinu (jak dokládá obr. 5), přičemž daný proces trvá 6 hodin.

- 10CZ 307155 B6

Příklad 2C

Stabilita supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric CaL s doxorubicinem a kinetika uvolňování doxorubicinu v CaL s 10 % doxorubicinu

Kinetika uvolňovaní doxorubicinu z matrice CaL ajejich stabilita byla sledována pomocí fluorescenční spektroskopie. Excitační vlnová délka byla 450 nm. Měření probíhalo v intervalu od 500 nm do 750 nm, délka kroku 1 nm, rychlost 1 nm za 2 vteřiny. Fluorescence doxorubicinu byla sledována při maximu jeho emisního pásu 594 nm. Měření bylo provedeno v plastových kyvetách. Do jednotlivých kyvet bylo naváženo po 1 mg modifikovaných matric (10 hm % doxorubicinu), pak zalito 2,4 ml PBS (lOmM fosfátový pufr, 0,137M NaCl a 0,0027M K.C1), pH = 7,4 a následně uzavřeno parafilmem.

Pro všechny typy matric byla pozorována vysoká stabilita vázaného doxorubicinu. Pro porovnání: 0,1 mg volného doxorubicinu se rozpustí ve 2,4 ml PBS během necelých 5 minut. Zatímco v případě výše uvedených matric se rozpustí pouze část doxorubicinu (jak dokládá obr. 6), přičemž daný proces trvá 6 hodin.

Během rozpadu celulózových matric dochází k uvolňování jednotlivých vláken do roztoku. Daný jev se projeví změnou jeho absorpčního spektra oproti spektru naměřenému v čase t₀. Pokud nejsou v daném čase pozorovaný významné změny oproti to lze danou matrici považovat v tomto čase za stabilní. Kompletní uvolnění léčiva v organismu lze očekávat do jednoho měsíce po aplikaci oxycelulózy do organismu.

Pro všechny typy matrix byl pozorován prudký nárůst fluorescence zhruba do 6 hodin od začátku měření. Jelikož už další uvolňování nebylo pozorováno, jelikož matrice zůstala stále barevná, po 7 dnech měření byly z kyvet isolovány jednotlivé matrice a předány na elementární analýzu, HL frakce samostatně ostatní vzhledem k malému izolovanému množství spojeny dohromady.

Doxorubicin je na výše uvedené matrice navázaný dvěma vazebnými módy. První z nich váže slabě a doxorubicin je uvolněný do 6 hodin, jedná nejspíš o jeho absorpci na povrch matrice. V druhém případě se jedná velmi silnou vazbu, nejspíš inkorporace v do nitra matrice. Na základě závislosti fluorescence doxorubicinu na jeho koncentraci, lze usoudit, že většina doxorubicinu je vázána prvním způsobem.

Příklad 3

PAMPA studie supramolekulárních komplexů celulózových matric (HD, HL a CaL) s doxorubicinem

Vliv oxycelulózových matric na propustnost léčiv přes buněčnou membránu byl studován pomocí PAMPA testu (Paralelní umělý membránový systém pro stanovení propustnosti). PAMPA obsahuje umělou fosfolipidovou membránu používanou jako model buněčné membrány. Propustnost látek např. léčiv přes PAMPA membránu silně koreluje s propustností přes buněčnou membránu. Do spodní (akceptorové) části PAMPA bylo přidáno 300 μΐ PBS (lOmM fosfátový pufr, 0,137M NaCl a 0,0027M KC1). Poté do vrchní (donorové) části PAMPA byla přidána modifikovaná oxycelulóza s 10 hm % doxorubicinu, nebo nemodifikovaná oxycelulóza či samotný doxorubicin a 200 μΐ PBS. Po 5 hodinách experimentu byl odebrán alikvotní podíl roztoků z akceptorové a donorové části PAMPA a poté byla změřena jejich absorbance v maximu vlnové délky doxorubicinu. Procentuální obsah prošlého léčiva, nebo oxycelulózové matrice bylo spočítáno pomoci následující rovnice. A_Sp_o3ni|_loro_Zt_OR_U/(A_Sp₀₍j_nj),₀roztoku Έ A|_lorní|_{]o r0zt0}k_U)

- 11 CZ 307155 B6

Výsledky provedených experimentů ukazují, že oxycelulózová matrice má pozitivní vliv na průchod léčiv přes PAMPA membránu (viz obrázek 30) a tudíž i velmi pravděpodobně přes buněčnou membránu. Tím pádem lze očekávat, že in vivo po enzymatickém rozkladu oxycelulózové matrice antracyklinové léčivo ve formě supramolekularního rozpustného komplexu bude efektivně vstřebáváno buňkami tumorové tkáně i z toho důvodu, že rakovinné buňky, které tvoří menšinu z celkové buněčné populace mají lepší prostupnost pro biopolymery než normálních zdravé buňky. Dá se tedy předpokládat, že tato formulace může dále výrazně přispět k selektivitě použitých léčiv. Výše uvedené jednoznačně ukazuje výrazně pozitivní vliv testovaných oxycelulózových matric na terapeutickou efektivitu použitých léčiv. Propustnost doxorubicinu v supramolekulárním komplexu s oxycelulózou byla zvýšena o 5 %.

Příklad 4

Příprava Nu-nu myší s lidským karcinomem a následná chirurgická léčba

Holé imunodeficientní myši postrádají T-lymfocyty v důsledku absence brzlíku, takže nemohou vytvořit imunologickou odezvu na cizí tkáně. Proto je možná xenotransplantace buněk lidského karcinomu.

Buněčné rakovinné linie (lidský nádor prsu - BT-474, slinivky - PATU) byly vytvořeny transfekcí buněk. Buňky karcinomu prsu a slinivky byly udržovány v T-mediu doplněném 5% fetálním bovinním sérem. Všechny buňky byly udržovány při 5 % CO₂ (V/V) při 37 °C ve zvlhčené atmosféře. Všechny experimenty byly prováděny na buňkách v exponenciální růstové fázi.

Podkožní implantace buněk lidského karcinomu do boků imunodeficientních nahých nu-nu myší (Samice, bezthymové, věk 6 týdnů, váha 18 až 20 g). Nádorové buňky (lxlO⁷) byly resuspendovány v 0.1 ml PBS a 0.1 ml Matrigelu (BD Biosciences) a aplikovány podkožně do boku myší pomocí inzulínové stříkačky a jehly velikosti 27.

Jakmile dosáhla nádorová masa velikosti cca 5x5 až 5x8 mm, bylo zahájeno operativní chirurgické odstranění nádoru z 95 až 97 % a měření velikosti nádorů.

Příklad 5

Aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s doxorubicinem po chirurgické léčbě nu-nu myší s PATU lidský karcinomem pankreatu

Příklad 5 A

Vnitrotělová topická aplikace

Imunodeficientní holé nu-nu myši, připravené a chirurgicky léčené dle příkladu 4, tedy s odstraněným nádorem pankreatu, byly rozděleny do 10 experimentů po 6 myších. Skupina A tvořila 2 experimenty, byla jako kontrolní bez jakékoli další aplikace. Ostatním skupinám byly látky podány lokálně, ve formě prášku do místa vyoperovaného nádoru. Skupině B byl podán samotný doxorubicin v množství 0,5 mg, tvořila také 2 experimenty. Skupině C byla v experimentu 1 podána oxycelulóza HL a v experimentu 2 oxycelulóza CaL, vždy v množství 4,5 mg. Skupině D10 byl ve dvou experimentech podán supermolekulární komplex oxycelulózy CaL s doxorubicinem a ve skupině Dli ve dvou experimentech podán supermolekulární komplex oxycelulózy HL s doxorubicinem, v množství 5 mg s 10 % hmotn. obsahem doxorubicinu, což odpovídá množství samotného doxorubicinu.

- 12CZ 307155 B6

Následně byla velikost nádoru monitorována a měřena po 50 dnech po chirurgickém zákroku.

Byla sledována inhibice opětovného růstu nádoru v závislosti na podané látce. Byl vyhodnocen vliv lokální vnitrotělové topické aplikace supramolekulámích komplexů oxycelulózových matric s cytostatiky, samotnou oxycelulózou a samotnými cytostatiky na opětovný růst nádoru, resp. případnou eliminaci residuální nádorové tkáně. Výrazný terapeutický efekt byl pozorován pro topickou vnitrotělovou aplikaci oxycelulózových komplexů projevující se výrazně omezeným růstem nádoru. Tento přístup představuje významný přínos oproti kontrolním experimentům v konečném objemu nádoru. Změny ve velikosti tumoru byly použity pro stanovení protinádorové aktivity. Bylo zjištěno, že supermolekulámí komplex oxycelulóz s doxorubicinem při vnitrotělové topické aplikaci má schopnost omezovat nárůst karcinomu až na 0,6 až 1,8 % oproti pouze chirurgické léčbě a až na 1,1 až 3,5 % oproti chirurgické léčbě s následným podáním samotného doxorubicinu (viz tabulka na obrázku 31). Také mortalita pokusných myší při topické aplikaci komplexu je poměrně nízká, v rozmezí 11 až 14 %.

Příklad 5B

Perorální aplikace

Imunodeficientní holé nu-nu myši, připravené a chirurgicky léčené dle příkladu 4, tedy s odstraněným nádorem pankreatu, byly rozděleny do 5 experimentů po 3 myších. Skupina A byla jako kontrolní bez jakékoli další aplikace. Ostatním skupinám byly látky podávány orálně přímo do žaludku. Skupině B byl podáván samotný doxorubicin v množství 0,5 mg, skupině C byla v experimentu 1 podána oxycelulóza HL a v experimentu 2 oxycelulóza CaL, vždy v množství 4,5 mg. Skupině D10 byl podáván supermolekulámí komplex oxycelulózy CaL s doxorubicinem a ve skupině Dl 1 podáván supermolekulámí komplex oxycelulózy HL s doxorubicinem, v množství 5 mg s 10 % hmotn. obsahem doxorubicinu, což odpovídá množství samotného doxorubicinu.

Velikost nádoru byla monitorována a měřena po 50 dnech po chirurgickém zákroku.

Byla sledována inhibice opětovného růstu nádoru především jako porovnání vůči vnitrotělové topické aplikaci.

Byl vyhodnocen vliv orální a vnitrotělové topické aplikace supramolekulámích komplexů oxycelulózových matric s cytostatiky, samotnou oxycelulózou a samotnými cytostatiky na opětovný růst nádoru, resp. případnou eliminaci residuální nádorové tkáně. Změny ve velikosti tumoru byly použity pro stanovení protinádorové aktivity. Bylo zjištěno, že supermolekulámí komplex oxycelulóz s doxorubicinem při orální aplikaci nemá příliš schopnost inhibovat nárůst karcinomu, pouze na 47 až 50 % oproti pouze chirurgické léčbě a nárůst karcinomu po orální aplikaci komplexu dosahoval 78 % oproti orální aplikaci samotného léčiva. Mortalita pokusných myší při orální aplikaci komplexu byla poměrně značná a to 42 až 54 %.

Porovnání aplikace ve formě orální a vnitrotělové topické pooperační aplikace prokázal výhodnost topické aplikace (viz tabulka na obrázku 32), protože orální aplikace byla spojena s mortalitou o 30 až 41 % vyšší a především pozorovaný nárůst velikosti tumoru byl cca 46 až 48 % oproti vnitrotělové topické aplikaci.

- 13 CZ 307155 B6

Příklad 6

Aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s doxorubicinem po chirurgické léčbě nu-nu myší s BT-474 lidský karcinomem prsu

Příklad 6A

Vnitrotělová topická aplikace

Imunodefícientní holé nu-nu myši, připravené a chirurgicky léčené dle příkladu 4, tedy s odstraněným nádorem prsu, byly rozděleny do 10 experimentů po 6 myších. Skupina A tvořila 2 experimenty, byla jako kontrolní bez jakékoli další aplikace. Ostatním skupinám byly látky podány lokálně, ve formě prášku do místa vyoperovaného nádoru. Skupině B byl podán samotný doxorubicin v množství 0,5 mg, tvořila také 2 experimenty. Skupině C byla v experimentu 1 podána oxycelulóza HL a v experimentu 2 oxycelulóza CaL, vždy v množství 4,5 mg. Skupině D10 byl ve dvou experimentech podán supermolekulární komplex oxycelulózy CaL s doxorubicinem a ve skupině Dl 1 ve dvou experimentech podán supermolekulární komplex oxycelulózy HL s doxorubicinem, v množství 5 mg s 10 % hmotn. obsahem doxorubicinu, což odpovídá množství samotného doxorubicinu.

Následně byla velikost nádoru monitorována a měřena po 50 dnech po chirurgickém zákroku.

Byla sledována inhibice opětovného růstu nádoru se závislostí na podané látce. Byl vyhodnocen vliv lokální vnitrotělové topické aplikace supramolekulárních komplexů oxycelulózových matric s cytostatiky, samotnou oxycelulózou a samotnými cytostatiky na opětovný růst nádoru, resp. případnou eliminaci residuální nádorové tkáně. Výrazný terapeutický efekt byl pozorován pro topickou vnitrotělovou aplikaci oxycelulózových komplexů projevující se výrazně omezeným růstem nádoru. Tento přístup představuje významný přínos oproti kontrolním experimentům v konečném objemu nádoru. Změny ve velikosti tumoru byly použity pro stanovení protinádorové aktivity. Bylo zjištěno, že supermolekulární komplex oxycelulóz s doxorubicinem při vnitrotělové topické aplikaci má schopnost omezovat nárůst karcinomu až na 0,6 % oproti pouze chirurgické léčbě a až na 1,2 % oproti chirurgické léčbě s následným podáním samotného doxorubicinu (podrobné výsledky prezentuje tabulka na obrázku 33). Také mortalita pokusných myší při vnitrotělové topické aplikaci komplexu je v rozmezí 11 až 38 %.

Příklad 6B

Perorální aplikace

Imunodefícientní holé nu-nu myši, připravené a chirurgicky léčené dle příkladu 4, tedy s odstraněným nádorem prsu byly rozděleny do 5 experimentů po 3 myších. Skupina A byla jako kontrolní bez jakékoli další aplikace. Ostatním skupinám byly látky podávány orálně přímo do žaludku. Skupině B byl podáván samotný doxorubicin v množství 0,5 mg, skupině C byla v experimentu 1 podána oxycelulóza HL a v experimentu 2 oxycelulóza CaL, vždy v množství 4,5 mg. Skupině D10 byl podáván supermolekulární komplex oxycelulózy CaL s doxorubicinem a ve skupině Dli podán supermolekulární komplex oxycelulózy HL s doxorubicinem, v množství 5 mg s 10 % hmotn. obsahem doxorubicinu, což odpovídá množství samotného doxorubicinu. Velikost nádoru byla monitorována a měřena po 50 dnech po chirurgickém zákroku.

Byla sledována inhibice opětovného růstu nádoru především jako porovnání vůči vnitrotělové topické aplikaci.

- 14CZ 307155 B6

Byl vyhodnocen vliv orální a vnitrotělové topické aplikace supramolekulámích komplexů oxycelulózových matric s cytostatiky, samotnou oxycelulózou a samotnými cytostatiky na opětovný růst nádoru, resp. případnou eliminaci residuální nádorové tkáně. Výrazný terapeutický efekt byl pozorován pro topickou vnitrotělovou aplikaci oxycelulózových komplexů projevující se výrazně omezeným růstem nádoru. Tento přístup představuje významný přínos oproti kontrolním experimentům v konečném objemu nádoru. Změny ve velikosti tumoru byly použity pro stanovení protinádorové aktivity. Bylo zjištěno, že supermolekulární komplex oxycelulóz s doxorubicinem při orální aplikaci nemá příliš schopnost inhibovat nárůst karcinomu, pouze na 33 % oproti chirurgické léčbě a pouze na 46 až 48 % oproti chirurgické léčbě s podáváním samotného cytostatika. Mortalita pokusných myší při orální aplikaci komplexu byla poměrně značná a to 53 až 64 %.

Porovnání aplikace ve formě orální a vnitrotělové topické pooperační aplikace prokázal výhodnost topické aplikace (viz tabulka na obrázku 34), protože orální aplikace byla spojena s mortalitou o 26 až 42 % vyšší a především pozorovaný nárůst velikosti tumoru byl cca 10 až 32% oproti vnitrotělové topické aplikaci.

Příklad 7

Studium efektivity terapie komplexy oxycelulózové matrice s cytostatiky na tkáňových kulturách nádorových buněk in vitro

Linie nádorových buněk solidních tumorů byly získány od ETCC. Všechny buňky byly pěstovány exponenciálně v médiu RPM1 1640 s 10 % fetálního telecího séra v 35mm Petriho miskách. Pro experimenty byly buňky kultivovány v čistém růstovém médiu po dobu 16ti hodin pro dosažení exponenciální fáze růstu. Poté bylo naočkováno 5 χ 10⁵ buněk do 1,8-2 cm jamek a inkubováno 16 hodin v růstovém médiu se supermolekulárním komplexem oxycelulózy CaL a doxorubicinu. Po promytí byla buněčná smrt pozorována s DM IRB Leica mikroskopem s DFC 480 fotoaparátem pomocí imerzního X63 oleje a filtru Leica krychle N2.1.

Sledována byla mortalita buněk v tkáňových kulturách po ovlivnění samotným doxorubicinem v porovnání s CaL oxocelulózovým komplexem s 10 % hmotn. doxorubicinu v čase 24 hodin po aplikaci. CaL oxycelulózový komplex s doxorubicinem byl v koncentraci 0,1 pmol/ml růstového média. Buněčná mortalita byla stanovena sulforhodamine B (SRB) testem, alternativně vylučovacím barvením tiypanovou modří, výsledky vyjádřeny jako % usmrcených buněk z celkového počtu jednotlivých buněčných linií (jak dokládá obrázek 35), kde je viditelné, že protinádorová aktivita v daných podmínkách je u CaL oxycelulózového komplexu s docetaxelem u některých nádorových buněčných linií až třikrát vyšší.

Claims (8)

1. Přípravek pro vnitrotělovou topickou aplikaci obsahující supramolekulámí komplex sestávající z oxycelulózové matrice a antracyklinového cytostatika s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika ze supramolekulárního komplexu, vyznačující se tím, že obsahuje 5 až 30 % hmotn. antracyklinového cytostatika, nekovalentně vázaného na oxycelulózovou matrici.

2. Přípravek pro vnitrotělovou topickou aplikaci obsahující supramolekulámí komplex sestávající z oxycelulózové matrice a antracyklinového cytostatika s postupným uvolňováním antra- 15 CZ 307155 B6 cyklinového cytostatika ze supramolekulárního komplexu podle nároku 1, vyznačující se t í m , že oxidovaná celulóza je v lintrové kyselé formě.

3. Přípravek pro vnitrotělovou topickou aplikaci obsahující supramolekulámí komplex sestávající z oxycelulózové matrice a antracyklinového cytostatika s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika ze supramolekulárního komplexu podle nároku 1, vyznačující se tím, že oxidovaná celulóza je ve formě vápenaté soli.

4. Přípravek pro vnitrotělovou topickou aplikaci obsahující supramolekulámí komplex sestávající z oxycelulózové matrice a antracyklinového cytostatika s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika ze supramolekulárního komplexu podle nároku 1, vyznačující se t í m , že oxidovaná celulóza je v textilní pletené formě.

5. Přípravek pro vnitrotělovou topickou aplikaci obsahující supramolekulámí komplex sestávající z oxycelulózové matrice a antracyklinového cytostatika s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika ze supramolekulárního komplexu podle nároku 1, vyznačující se t í m , že obsahuje 10 až 20 % hmotn. antracyklinového cytostatika.

6. Přípravek pro vnitrotělovou topickou aplikaci obsahující supramolekulámí komplex sestávající z oxycelulózové matrice a antracyklinového cytostatika s postupným uvolňováním antracyklinového cytostatika ze supramolekulárního komplexu podle nároku 1, vyznačující se tím, že antracyklinovým cytostatikem je doxorubicin.

7. Použití přípravku podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro topickou cytostatickou léčbu nádorové tkáně.

8. Použití přípravku podle nároku 7, kdy topickou cytostatickou léčbou nádorové tkáně je pooperační vnitrotělová topická aplikace na reziduální nádorové buňky/tkáň po chirurgickém zákroku.