CZ305607B6

CZ305607B6 - Cholylhydrazony a jejich použití k léčbě nádorových onemocnění a leukémií

Info

Publication number: CZ305607B6
Application number: CZ2014-305A
Authority: CZ
Inventors: Jakub Rak; Robert Kaplánek; Tereza Štulcová; Pavel Drašar; Martin Havlík; Tomáš Bříza; Petr Džubák; Marián Hajdúch; Petr Konečný; Jana Štěpánková; Jarmila Králová; Vladimír Král
Original assignee: Vysoká škola chemicko- technologická v Praze; Ústav Molekulární Genetiky, Akademie Věd Čr; Ústav molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci
Priority date: 2014-05-06
Filing date: 2014-05-06
Publication date: 2016-01-06
Also published as: CZ2014305A3

Abstract

Předmětem vynálezu jsou hydrazony kyseliny cholové obecných vzorců I až V, kde významy obecných substituentů jsou uvedeny v popisné části. Konjugáty jsou tvořeny kovalentně spojenou biologicky aktivní skupinou, hydrazon z části zvyšující její biodostupnost, zbytek kyseliny cholové. Tyto látky mají cytostatický účinek a lze jich použít k přípravě terapeutik pro léčbu nádorových onemocnění a leukémie.

Description

Cholylhydrazony a jejích použití k léčbě nádorových onemocnění a leukémii

Oblast techniky

Vynález se týká hydrazonů kyseliny cholové (cholylhydrazonů), tedy konjugátů biologicky aktivní skupiny se skupinou zajišťující zvýšení její biodostupnosti ajejich použití jako terapeutik pro léčbu nádorových onemocnění a leukémií.

Dosavadní stav techniky

Nádorová onemocnění a leukémie (onkologická onemocnění) jsou v současnosti jednou z nejčastějších příčin úmrtí. Účinná léčba rakoviny a zabránění její recidivy je i v dnešní době stále velký problém. Existuje velké množství látek s protirakovinným účinkem, ale celá řada z nich vykazuje nežádoucí vedlejší účinky. Velkým problémem zejména hydrofobních účinných látek je jejich nízká biodostupnost. Vzrůstající rezistence rakovinných buněk vůči cytostatikům také přináší nemalé potíže. Z těchto důvodů je potřeba stále hledat nové účinné látky, ideálně s kombinovaným mechanismem účinku.

Nedávné studie a naše předchozí výsledky ukázaly, že ligandy založené na heteroarylhydrazonech, acylhydrazonech a aroylhydrazonech (obsahující N-N-N a N-N-0 chelatační systém) vykazují v mnoha případech protirakovinné (cytostatické) účinky [D. R. Richardson: Analogues of pyridoxal isonicotinoyl hydrazonr (PIH) as potential iron chelators for the treatment of neoplasia. Leukemia Limphoma, 1998, 31, 47-60; Z. D. Liu, R. C. Hider: Design of iron chelators with therapeutic application Coord. Chern. Rev. 2002, 232, 151-171; J. L. Buss, B. T. Greene, J. Turner, F. M. Torti, S. V. Torti: Iron Chelators in Cancer Chemotherapy Curr. Top. Med. Chern. 2004, 4, 1623-1635; D. R. Richardson: Molecular Mechanisms of Iron Uptake by Cells and the Use of Iron Chelators for the Treatment of Cancer Curr. Med. Chern. 2005, 12, 2711-2729; D. S. Kalinowski, D. R. Richardson: The Evolution of Iron Chelators for the Treatment of Iron Overload Disease and Cancer Pharm. Rev. 2005, 57, 547-583; S. Rollas, §. G. Kufiikgiizel: Biological Activities of Hydrazone Derivatives. Molecules 2007, 12, 1910-1939; H. Nick: Iron chelation, quo vadis? Curr. Opin. Chern. Biol. 2007,11, 419—423; B. Narasimhan, P. Kumar, D. Sharma: Biological activities of hydrazide derivatives in the new millenium. Acta Pharm. Sci. 2010, 52, 169-180; P. Kumar, B. Narasimhan: Hydrazides/Hydrazones as Antimicrobial and Anticancer Agents in the New Millenium. Mini-Rev. Med. Chern. 2013,13, 971—987; A. M. Merlot, D. S. Kalinowski, D. R. Richardson: Novel chelators for cancer treatment: where are we now? Antioxid. Redox Signal. 2013, 18, 973-1006; R. Kaplánek, J. Rak, V. Král, J. Králová: Ftalazin-l-ylhydrazony a jejich použití k léčbě nádorových onemocnění. Patent, 2010, CZ 303 748]. '

Chelátory na bázi hydrazonů vykazují kromě cytotoxické aktivity také často široké spektrum biologických účinků: řada chelátorů vykazuje antimikrobiální, antimykobakteriální, antivirální, fungicidní, antivirální, protimalarické účinky či mohou sloužit jako antialzheimerika či antiparkinsonika [Z. D. Liu, R. C. Hider: Design of iron chelators with therapeutic application Coord. Chern. Rev. 2002, 232, 151-171; E. A. Malecki, J. R. Connor: The Case for Iron Chelation and/or Antioxidant Therapy in Alzheimer's Disease. Drug Develop. Res. 2002, 56, 526-530; T. F. Tam, R. Leung-Toung, W. Li, Y. Wang, K. Karimian, M. Spinoet: Iron Chelator Research: Past, Present, and Future Curr. Med. Chern. 2003,10, 983-995; A. Gaeta, R. C. Hider: The crucial role of metal ions in neurodegeneration: the basis for a promising therapeutic strategy. Brit. J. Pharmacol. 2005, 146, 1041-1059; H. Zheng, L. M. Weiner, O. Bar-Am, S. Epsztejn, Z. I. Cabantchik, A. Warshawsky Μ. B. H. Youdim, M. Fridkin: Design, synthesis, and evaluation of novel bifunctional iron-chelators as potential agents for neuroprotection in Alzheimer's, Parkinson's, and other neurodegenerative diseases. Bioorg. Med. Chern. 2005, 13, 773-783; S. Rollas, §. G. Kiifiikguzel: Biological Activities of Hydrazone Derivatives. Molecules 2007, 12, 1910—

- 1 CZ 305607 B6

1939; C. A. Perez, Y. Tong, M. Guo: Iron Chelators as Potential Therapeutic Agents for Parkinson's Disease. Curr. Bioactive Comp. 2008, 4, 150-158; B. Narasimhan, P. Kumar, D. Sharma: Biological activities of hydrazide derivatives in the new millennium. Acta Pharm. Sci. 2010, 52, 169-180; A. J. M. Rasras, T. H. Al-Tel, A. F. Al. Aboudi, R. A. Al-Qawasmeh: Synthesis and antimicrobial activity of cholic acid hydrazone analogues. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 23072313; X. Li, J. Jankovic, W. Le: Iron chelation and neuroprotection in neurodegenerative diseases. J. Neural. Transm. 2011,118,473—477; G. Uppal, S. Bala, S. Kamboj. M. Saini: Therapeutic Review Exploring Antimicrobial Potential of Hydrazones as Promising Lead. Pharma Chem. 2011, 3, 250-268; P. Kumar, B. Narasimhan: Hydrazides/Hydrazones as Antimicrobial and Anticancer Agents in the New Millennium. Mini-Rev. Med. Chem. 2013, 13, 971-987; R. León, A. G. Garcia, J. Marco-Contelles: Recent Advances in the Multitarget-Directed Ligands Approach for the Treatment of Alzheimer's Disease. Med. Res. Rev. 2013, 33, 139-189].

Hydrazony nesoucí 2-hydroxyarylovou nebo 2-N-heterocyklickou skupinu mají vazebné účinky vůči celé řadě iontů přechodných kovů. Vazba kovů je zajištěna díky kyslíkovým a dusíkovým donomím skupinám; hydrazony výše uvedeného typu se chovají jako tridentátní chelátory. Vazebné místo je tak tvořeno karbonylovým kyslíkem hydrazonu, enaminovým dusíkem a buď fenolickou hydroxyskupinou, nebo heteroaromatickým dusíkem. Vazba biologicky významných kovů v organismu, zejména železa, zinku, mědi a kobaltu je jedním ze základních mechanismů účinku těchto látek.

Rakovinné buňky potřebují pro svůj růst a zajištění svých funkcí mnohonásobně větší množství železa oproti zdravým buňkám, proto jsou více náchylné na nedostatek železa. Účinek chelátorů jako chemoterapeutik pro léčbu onkologických onemocnění je založen především na chelataci iontů železa a v některých případech i na chelataci dalších iontů biologicky významných kovů např. Cu²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ či Ni²⁺, které jsou nutné pro růst a dělení rakovinných buněk. Dále na inhibici řady enzymů (např. ribonukleotid reduktázy, histon deacetyláz či acyl transferáz; často v přímé souvislosti s chelataci kovu z metaloenzymu), na toxicitě vzniklých metalokomplexů (ty mohou působit jako redox systém produkující toxické reaktivní kyslíkové částice), také na přímých interakcích s DNA díky interkalaci. Přesný mechanismus účinku hydrazonů dosud plně vysvětlen nebyl, předpokládá se kombinace několika výše uvedených vlivů [S. Sarel, C. Fizames, F. Lavelle, S. Avramovici-Grisaru: Domain-Structured N1,N2-Derivatized Hydrazines as Inhibitors of Ribonucleoside Diphosphate Reductase: Redox-Cycling Considerations. J. Med. Chem. 1999, 42, 242-248; D. R. Richardson: Iron chelators as therapeutic agents for the treatment of cancer Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2002, 42, 267-81; J. L. Buss, B. T. Greene, J. Turner, F. M. Torti, S. V. Torti: Iron Chelators in Cancer Chemotherapy Curr. Top. Med. Chem. 2004, 4, 1623— 1635; D. S. Kalinowski, D. R. Richardson: The Evolution of Iron Chelators for the Treatment of Iron Overload Disease and Cancer. Pharmacol. Rev. 2005, 57, 547-583; A. M. Merlot, D. S. Kalinowski, D. R. Richardson: Novel chelators for cancer treatment: where are we now? Antioxid. Redox Signal. 2013, 18, 973-1006].

Hlavní nevýhodou při případném terapeutickém použití hydrazonů je jejich nízká rozpustnost ve vodných roztocích; látky tohoto typu tak mají nízkou biodostupnost díky neúplné absorpci či předsystémovému metabolismu. Pro zvýšení biodostupnosti látek se často používá modifíkátor absorpce, tedy látka či skupina zvyšující (podporující) vstřebávání hydrofobních biologicky aktivních látek. Tento modifíkátor absorpce může být k biologicky aktivní části molekuly kovalentně navázán. Jako skupiny zvyšující biodostupnost se obvykle používají deriváty sterolu a příbuzné struktury, zejména deriváty žlučových kyselin (např. kyseliny cholové) [W. Kramer, G. Wess, A. Enhsen, E. Falk, A. Hoffmann, G. Neckermann, G. Schubert, M. Urmann: Modified bile acids as earners for peptides and drugs. J. Control. Release 1997, 46, 17-30; A. Enhsen, W. Kramer, G. Wess: Bile acids in drug discovery. Drug Discov. Today 1998, 3, 409-418; J. Tamminen, E. Kolehmainen: Bile Acids as Building Blocks of Supramolecular Hosts. Molecules 2001, 6, 21-46; B. Steffansen, C. U. Nielsen, B. Brodin, A. H. Eriksson, R. Andersen, S. Frokjaer: Intestinal solute carriers: an overview of trends and strategies for improving oral drug absorption. Eur. J. Pharm. Sci. 2004, 21, 3-16; E. Virtanen, E. Kolehmainen: Use of bile

-2CZ 305607 B6 acids in pharmacological and supramolecular applications. Eur. J. Org. Chem. 2004, 3385-3399; M. Mikov, J. P. Fawcett, K. Kuhajda, S. Kevresan: Pharmacology of Bile Acids and their Derivatives: Absorption Promoters and Therapeutic Agents. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 2006, 31, 237-251; E. Sievánen: Exploitation of Bile Acid Transport Systems in Prodrug Design. Molecules 2007,12, 1859-1889; W. Kramer: Transporters, Trojan horses and therapeutics: suitability of bile acid and peptide transporters for drug delivery. Biol. Chem. 2011, 392, ΊΊ-94-, O. Jurček, S. Ikonen, L. Buřičova, M. Wimmerová, Z. Wimmer, P. Drašar, J. Horníček, A. Galandáková, J. Ulrichová, E. T. Kolehmainen: Succinobucol's New Coat - Conjugation with Steroids to Alter Its Drug Effect and Bioavailability. Molecules 2011, 16, 9404-9420]. Zbytek žlučových kyselin, zejména kyseliny cholové může sloužit i k specifickému cílení terapeuticky aktivní skupiny na rakovinné buňky [G. Wess, W. Kramer, G. Schubert, A. Enhsen, K. H. Baringhaus, H. Glombik, S. Miiller, K. Bock, H. Kleine, M. John, G. Neckermann, A. Hoffmann: Synthesis of bile acid - drug conjugates: potential drug-shuttles for liver specific targeting. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 819-822; E. Virtanen, E. Kolehmainen: Use of bile acids in pharmacological and supramolecular applications. Eur. J. Org. Chem. 2004, 3385-3399; H. S. Chong, H. A. Song, X. Ma, S. Lim, X. Sun, S. B. Mhaske: Bile acid-based polyaminocarboxylate conjugates as targeted antitumor agents. Chem. Commun. 2009, 3011-3013].

Kovalentním spojením části s potenciální biologickou účinností (hydrazonová skupina) se zbytkem žlučových kyselin (např. zbytkem kyseliny cholové) vzniknou konjugáty, které budou vykazovat příznivější vlastnosti pro jejich použití jako cytostatik (vyšší rozpustnost v biologických tekutinách, schopnost lépe pronikat buněčnými membránami a tím i vyšší biodostupnost terapeutické jednotky ve srovnání se samotnými hydrazony).

V nedávné době byla připravena a publikována série hydrazonů kyseliny cholové se substituovanými arylkarbaldehydy a u těchto cholylhydrazonů byla testována jejich antimikrobiální aktivita [A. J. M. Rasras, T. H. Al-Tel, A. F. Al.Aboudi, R. A. Al-Qawasmeh: Synthesis and antimicrobial activity of cholic acid hydrazone analogues. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45,2307-2313],

Cholylhydrazony mající substituovanou 2-hydroxyarylovou nebo 2-N-(hetero)arylovou skupinu a jejich farmaceuticky využitelné soli a využití těchto látek k léčbě nádorových onemocnění a leukémie jsou předmětem tohoto patentu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou hydrazony kyseliny cholové (cholylhydrazony), tedy konjugáty tvořené kovalentně spojenou částí s terapeutickým účinkem (hydrazonová skupina) a části zajišťující vhodné vlastnosti pro jejich použití v biologickém systému (zbytek kyseliny cholové).

Předmětem vynálezu jsou cholylhydrazony mající 2-hydroxyarylovou skupinu obecného vzorce I

OH

-3CZ 305607 B6 kde RI, R2, R3, R4 jsou H, OH, alkyl s 1 až 6 uhlíkovými atomy, allyl, halogen, OCH₃, COOCH₃, NO₂, N(CH₂CH₃)₂,

RI, R2 nebo R2, R3 nebo R3, R4 jsou CH=CH-CH=CH, tedy prikondenzované benzenové jádro;

s výjimkou látky, pro níž platí, že RI = R2 = R3 = R4 = H;

dále A^-[(3-Hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-^l-yl)methyliden]cholylhydrazid vzorce II (derivát pyridoxalu)

HO.

OH dále cholylhydrazony mající pyrid-2-ylovou nebo chinolin-2-ylovou skupinu obecného vzorce III

OH kde Y je H nebo 2—pyridyl,

Rl, R2, R3, R4 mají vpředu uvedený význam;

s výjimkou látky, pro niž platí, že Rl = R2 = R3 = R4 = Η; Y = H;

dále jV-[l-(pyrazin-2-yl)ethyliden]cholylhydrazid vzorce IV

-4CZ 305607 B6

OH dále N’-(benzo)[íZ]thiazol-2-ylmethyliden]cholylhydrazid vzorce V

Látky obecného vzorce I-V mají cytostatické účinky a lze je použít pro přípravu terapeutických systémů k léčbě nádorových onemocnění a leukémií.

Příprava cholylhydrazonů obecného vzorce I-V, jejich stabilita v roztoku, komplexační a cytostatické vlastnosti jsou doloženy následujícími příklady, aniž by jimi byly jakkoliv omezeny.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1. Příprava yV-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 3-allyl-2-hydroxybenzaldehyd (71 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 40 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 195 mg (86 %) bílé pevné látky o teplotě tání 134 až 136 °C; [a]/¹ = +27,9°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,57 (s, 3H); 0,75 2,50 (m, 30H); 3,16 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,00 (m, 1H); 4,11 (m, 1H); 4,31 (m, 1H); 5,04 (d, J = 16 Hz); 5,94 (m, 1H); 6,85 (t, J= 7,5 Hz, 1H), 7,14 (d,J= 7,5 Hz, 1H), 7,26 (d, J= 7,5 Hz, 1H); 8,16 a 8,26 (2x s, 1H); 11,69 (s, 1H); 11,90 (s, 1H) ppm. Elementární analýza: C34H50N2O5; Vypočteno % C: 72,05; H: 8,89; N: 4,94. Nalezeno % C: 72,11; H: 8,94; N: 5,00. ESI-MS m/z = 567, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3423 cm“¹ O-H (valenční vibrace); 3250 cm¹ N-H (valenční vibrace); 2938 cm¹, 2872 cm¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1670 cm’¹C=O (valenční vibrace); 1608 cm¹, 1452 cm”¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1378 cm¹ skupiny CH3 a CH₂ (deformační vibrace); 1078 cm¹ C-O (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1265 cm“¹, 1238 cm ’, 1195 cm’¹, 1078 cm’¹, 1043 cm’¹, 1015 cm’¹, 979 cm’¹, 952 cm’¹, 914 cm’¹, 856 cm’¹, 780 cm’¹, 752 cm’¹, 613 cm’¹.

-5CZ 305607 B6

Příklad 2. Příprava A^5-brom-2-hydroxybenzyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 5-brom-2-hydroxybenzaldehyd (88 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (50 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 223 mg (92 %) bílé pevné látky o teplotě tání 154 až 157 °C; [οφ/⁰ = +24,1°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,58 (s, 3H); 0,75 2,50 (m, 30H); 3,16 (m, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,01 (m, 1H); 4,12 (m, 1H); 4,31 (m, 1H); 6,84 (m, 1H), 7,36 (m, 1H); 7,72 (m, 1H); 8,17 a 8,28 (2x s, 1H); 10,36 a 11,65 (2x s, 1H); 11,21 (s, 1H) ppm. Elementární analýza: C31H45N2O5; Vypočteno % C: 61,48; H: 7,49; N: 4,63. Nalezeno % C: 61,41; H: 7,51; N: 4,63. ESI-MS m/z = 606, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3420 cm’¹ OH (valenční vibrace); 3250 cm^-1 N-H (valenční vibrace); 2932 cm’¹, 2871 cm'¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CHj a CH2); 1670 cm'¹ C=O (valenční vibrace); 1618 cm“¹, 1478 cm ¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1379 cm“¹ skupiny CH3 a CH₂ (deformační vibrace); 1272 cm“¹ C-N (valenční vibrace); 1077 cm¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu 1272 cm“¹, 1185 cm“¹, 1077 cm“¹, 1042 cm“¹, 979 cm“¹, 950 cm“', 913 cm“¹, 856 cm“¹, 778 cm“¹, 733 cm“¹, 697 cm¹, 628 cm“¹, 612 cm’¹.

Příklad 3. Příprava Y-(2,5-dihydroxybenzyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 2,5-dihydroxybenzaldehyd (61 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt diethylétherem (3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 165 mg (76 %) bílé pevné látky o teplotě tání 168 až 171 °C; [afo²⁰ = +27,3°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,58 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 30H); 3,16 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 3,80 - 4,35 (m, 3H); 6,60 - 7,08 (m, 4H); 8,16 a 8,23 (2x s, 1H); 8,85 (s, 1H), 11,07 a 11,45 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C3]H46N2O6; Vypočteno % C: 68,61; H: 8,54; N: 5,16. Nalezeno % C: 68,57; H: 8,56; N: 5,17. ESI-MS m/z = 543, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3400 cm ¹ O-H (valenční vibrace); 3253 cm“¹ N-H (valenční vibrace); 2930 cm“¹, 2870 cm“¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH₂); 1663 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1491 cm“¹, 1465 cm”¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1377 cm“¹ skupiny CH3 a CH2 (deformační vibrace); 1282 cm“¹ C-N (valenční vibrace); 1075 cm¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1282 cm“¹, 1277 cm“¹, 1216 cm ', 1196 cm“¹, 1162 cm“¹, 1123 cm ’, 1075 cm¹, 1040 cm 1014 cm’¹, 980 cm’¹, 953 cm’¹, 914 cm’¹, 857 cm’¹, 822 cm’¹, 798 cm’¹, 785 cm’¹, 730 cm¹.

Příklad 4. Příprava Y-[5-(/erc'-butyl)-2-hydroxybenzyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 5-(/-butyl)-3-methoxybenzaldehyd (78 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:2 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 191 mg (82 %) bílé pevné látky o teplotě tání 162 až 164 °C; [α]_Ώ ²⁰ = +23,9°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,57 (s, 3H); 0,75-2,50 (m, 39H);3,16(m, lH);3,59(m, 1H); 3,77 (m, lH);4,00(m, 1H);4,U (m, 1H);4,31 (m, 1H); 6,81 (m, 1H); 7,27 (m, 1H); 7,43 a 7,60 (2x m, 1H); 8,22 a 8,31 (2x s, 1H); 9,91, 10,99, 11,12 a 11,54 (4x s, 2H) ppm. Elementární analýza: C35H54N2O5; Vypočteno % C: 72,13; H:

-6CZ 305607 B6

9,34; N: 4,81. Nalezeno % C: 72,10; H: 9,38; N: 4,79. ES1-MS m/z = 583, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3420 cm¹ O-H (valenční vibrace); 3250 cm“¹ N-H (valenční vibrace); 2955 cm¹, 2935 cm 2870 cm“¹ C-H (vibrační vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1670 cm¹ C=O (valenční vibrace); 1625 cm¹, 1495 cm’¹, 1465 cm ¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1377 cm”¹ skupiny CH3 a CH₂ (deformační vibrace); 1285 cm”¹ C-N (valenční vibrace); 1075 cm“¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1285 cm“¹, 1263 cm“¹, 1186 cm“¹, 1075 cm¹, 1042 cm¹, 1018 cm 980 cm“¹, 952 cm¹, 913 cm¹, 856 cm 827 cm ', 788 cm 742 cm¹, 624 cm“¹, 613 cm“¹.

Příklad 5. Příprava M-(2-hydroxy-5-nitrobenzyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 2-hydroxy-5-nitrobenzaldehyd (73 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (5 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsi diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 201 mg (88 %) šedobílé pevné látky o teplotě tání 169 až 171 °C; [α]γ° = +20,8°. ’H NMR (DMSO-d6) δ: 0,57 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 30H); 3,15 (m, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,02 (m, 1H); 4,10 - 4,35 (m, 2H); 7,12 (m, 1H); 7,95 - 9,10 (m, 3H); 11,32, 11,65, 11,76 a 12,28 (4x s, 2H) ppm. Elementární analýza: C₃₁H4₅N₃O₇; Vypočteno % C: 65,13; H: 7,93; N: 7,35. Nalezeno % C: 65,09; H: 7,98; N: 7,32. ESI-MS m/z = 572, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3426 cm¹ O-H (valenční vibrace); 3390 cm“¹N-H (valenční vibrace); 2933 cm¹, 2868 cm¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1632 cm ¹ C=O (valenční vibrace); 1515 cm“¹, 1485 cm ¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1346 cm“¹ skupiny CH3 a CH₂ (deformační vibrace); 1297 cm“¹ C-N (valenční vibrace); 1103 cm“¹ C-O (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1297 cm“¹, 1238 cm“¹, 1189 cm’¹, 1103 cm 969 cm“¹, 940 cm“¹, 906 cm“¹, 840 cm“¹, 787 cm 752 cm“¹, 738 cm“¹, 722 cm“¹, 637 cm“¹.

Příklad 6. Příprava 2V-[5-(methoxykarbonyl-2-hydroxybenzyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a methyl-3-formyl-4-hydrobenzoát (79 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán isopropanol (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 208 mg (89 %) bílé pevné látky o teplotě tání 154 až 156 °C; [a]_tí ²⁰ = +29,7°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,58 (s, 3H); 0,75-2,50 (m, 30H); 3,16 (m, lH);3,59(m, 1H); 3,78 (m, 1H); 3,81 (s, 3H); 4,00 (m, 1H); 4,11 (m, 1H); 4,30 (m, 1H); 6,98 (m, 1H); 7,65 - 8,33 (m, 2H); 8,25 a 8,39 (2x s, 1H); 10,96, 11,22, 11,65 a 11,78 (4x s, 2H) ppm. Elementární analýza: C33H48N2O7; Vypočteno % C: 67,78; H: 8,27; N: 4,79. Nalezeno % C: 67,73; H: 8,30; N: 4,80. ESI-MS m/z = 585, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3417 cm“¹ O-H (valenční vibrace); 2935 cm“¹, 2868 cm“¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 aCH₂); 1673 cm’¹ C=O (valenční vibrace); 1627 cm“¹, 1492 cm¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1379 cm”¹ skupiny CH₃ a CH₂ (deformační vibrace); 1076 cm”¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1263 cm’¹, 1232 cm’¹, 1197 cm’¹, 1113 cm“¹, 1076 cm“¹, 1042 cm’¹, 986 cm“¹, 953 cm’¹, 917 cm’¹, 837 cm’¹, 818 cm“', 768 cm’¹, 725 cm’¹, 636 cm’¹, 611 cm’¹.

-7CZ 305607 B6

Příklad 7. Příprava A⁷ [(l-hydroxynaítalen-2-yl)methyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a l-hydroxynaftalen-2-karbaldehyd (76 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 214 mg (93 %) tmavě žluté pevné látky o teplotě tání 151 až 154 °C; [a]_D ^2ř? = +24,2°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,58 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 30H); 3,17 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,78 (m, 1H); 4,00 (m, 1H); 4,12 (m, 1H); 4,31 (m, 1H); 7,54 (m, 3H); 7,87 (m, 1H); 8,36 (m ,1H); 8,41 a 9,25 (2x s; 1H); 11,11 a 11,33 (2x s, 1H); 11,76 a 12,79 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C35H48N2O5; Vypočteno % C: 72,89; H: 8,39; N: 4,86. Nalezeno % C: 72,86; H: 8,43; N: 4,90. ESI-MS m/z = 577, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3414 cm ¹ O-H (valenční vibrace); 3050 cm¹ N-H (valenční vibrace, alkeny); 2932 cm’¹, 2865 cm’¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1670 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1636 C=C cm ¹ (valenční vibrace); 1605 cm“¹, 1505 cm“¹, 1465 cm“¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1379 cm“¹ skupiny CH3 a CH2 (deformační vibrace); 1148 cm¹, 1077 cm“¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1204 cm“¹, 1148 cm“¹, 1177 cm“¹, 1022 cm“¹, 981 cm 953 cm“¹, 915 cm“¹, 880 cm“¹, 805 cm“¹, 777cm“¹, 751 cm“¹, 744 cm'¹, 710 cm'¹, 675 cm¹.

Příklad 8. Příprava A'-[(2-hydroxynaftalen-l-yl)methyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 2-hydroxynaftylalen-l-karbaldehyd (76 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:2 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 218 mg (95 %) žluté pevné látky o teplotě tání 165 až 168 °C; [a]_D ²⁰ = +25,3°. ‘H NMR (DMSO-d6) 8: 0,58 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 30H); 3,16 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,79 (m, 1H); 4,01 (m, 1H); 4,10 - 4,35 (m, 2H); 7,23 (m, 1H); 7,39 (m , 1H); 7,56 (m, 1H); 7,87 (m, 2H); 8,00 - 8,70 (m; 1H); 8,89 a 9,14 (2x s, 1H); 11,05, 11,19, 11,68 a 12,64 (4x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C35H48N2O5; Vypočteno % C: 72,89; H: 8,39; N: 4,86. Nalezeno % C: 72,85; H: 8,42; N: 4,89. ESI-MS m/z = 577, [M+H]⁺. 1Č spektrum: 3420 cm”¹ O-H (valenční vibrace); 2932 cm¹, 2870 C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1668 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1602,1467 cm“¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1418 O-H (deformační vibrace); 1376 cm¹, skupiny CH₃ a CH2 (deformační vibrace); 1281 cm”¹ C-N (valenční vibrace); 1076 cm”¹ C-O (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1281 cm”¹, 1241 cm ', 1184 cm”¹, 1167 cm'¹, 1142 cm”¹, 1076 cm”¹, 1043 cm“¹, 1031 cm¹, 1014 cm”¹, 980 cm¹, 955 cm“¹, 914 cm¹, 870 cm“¹, 857 cm“¹, 835 cm“¹, 819 cm“¹, 797 cm ', 788 cm“¹, 777 cm 755 cm“¹, 722 cm“¹, 657 cm“¹.

Příklad 9. Příprava /^-(3,5-dibrom-2-hydroxybenzyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 3,5-dibrom-2-hydroxybenzaldehyd (123 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 249 mg (91 %) světle žluté pevné látky o teplotě tání 167 až 170 °C; [a]/¹ = +20,5°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,57

-8CZ 305607 B6 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 30H); 3,16 (m, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,00 (m, 1H); 4,10 (m, 1H); 4,31 (m, 1H), 7,70 - 8,00 (m, 2H); 8,15 a 8,23 (2x s, 1H); 9,06 a 11,47 (2x s, 1H); 11,98 a 12,62 (2xs, 1H), ppm. Elementární analýza: C₃iH44Br₂N₂O_s; Vypočteno % C: 54,40; H: 6,48; N: 4,09. Nalezeno % C: 54,41; H: 6,50; N: 4,07. ESI-MS m/z = 685, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3416 cm'¹ O-H (valenční vibrace); 3253 cm'¹ C-N (valenční vibrace), 2935 cm'¹, 2868 cm'¹ CH (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1672 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1618 cm¹, 1445 cm'¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1377 cm“¹, skupiny CH3 a CH₂ (deformační vibrace); 1075 cm“¹ C-O (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1218 cm“¹, 1167 cm“¹, 1075 cm'¹, 1042 cm'¹, 1015 cm“¹, 980 cm“¹, 948 cm“¹, 914 cm“¹, 865 cm“¹, 758 cm'¹, 740 cm“¹, 733 cm“¹, 690 cm“¹.

Příklad 10. Příprava jV’-[(3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methylprid-4-yl)methyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec II.

Pyridoxal hydrochlorid (82 mg; 0,4 mmol) a octan sodný (36 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny ve vodě (15 ml) a směs byla míchána při 25 °C 5 minut. Poté byl k roztoku přidán roztok cholylhydrazidu (169 mg; 0,4 mmol) v ethanolu (30 ml). Reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Po vychladnutí byla do reakční směsi přidána voda (45 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt vodou (3 x 10 ml), 50% ethanolem (10 ml) a diethylétherem (10 ml). Produkt byl sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 213 mg (93 %) žluté pevné látky o teplotě tání 169 až 171 °C; [a]_o ²⁰ = +23,5°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,57 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 33H); 3,05 - 3,65 (m, 2H); 3,78 (m, 1H); 4,01 (m, 1H); 4,14 (m, 1H); 4,37 (m, 1H); 4,55 (d, J= 5 Hz, 2H); 5,39 (t, 5 Hz, 1H); 7,90 (s, 1H); 8,60 (s, 1H); 12,08 (s, 1H);

12,15 (s, 1H) ppm. Elementární analýza: C₃₂H4₉N₃O₆; Vypočteno % C: 67,22; H: 8,64; N: 7,35. Nalezeno % C: 67,20; H: 8,67; N: 7,38. ESI-MS m/z = 572, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3408 cm“¹ OH (valenční vibrace); 3240 cm“¹, N-H (valenční vibrace); 2932 cm”¹, 2868 cm“¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1674 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1439 cm“¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1380 cm“¹ skupiny CH3 a CH₂ (deformační vibrace); 1292 cm“¹ C-N (valenční vibrace); 1078 cm'¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1292 cm¹, 1260 cm”¹, 1214 cm'¹, 1078 cm“¹, 1032 cm ', 981 cm“¹, 952 cm ', 915 cm“¹, 901 cm“¹, 858 cm¹, 786 cm“¹, 760 cm“¹, 733 cm¹.

Příklad 11. Příprava V-[(6-methylpyrid-2-yl)methyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec III.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 6-methylpyridin-2-karbaldehyd (53 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethylether/petrolether (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 177 mg (84 %) narůžovělé pevné látky o teplotě tání 134 až 136 °C; [a]_D ²⁰ = +29,2°. Ή NMR (DMSO-d6) δ: 0,57 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 33H); 3,16 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,02 (m, 1H); 4,10 - 4,38 (m, 2H); 6,85 - 7,82 (m, 3H); 7,95 a 8,09 (2x s, 1H); 11,37 a 11,51 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C3iH47N3O4; Vypočteno % C: 70,82; H: 9,01; N: 7,99. Nalezeno % C: 70,80; H: 9,04; N: 8,02. ESI-MS m/z = 526, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3417 cm’¹ O-H (valenční vibrace); 3237 cm“¹, N-H (valenční vibrace); 2928 cm“¹, 2870 cm ¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH₂); 1672 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1587 cm“¹, 1455 cm“¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1380 cm’¹ skupiny CH₃ a CH₂ (deformační vibrace); 1080 cm”¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1252 cm”¹, 1200 cm¹, 1160 cm¹, 1180 cm”¹, 1145 cm”¹, 1015 cm”¹, 981 cm’¹, 948 cm”¹, 915 cm”¹, 857 cm”¹, 795 cm”', 738 cm”¹, 614 cm”¹.

-9CZ 305607 B6

Příklad 12. Příprava M-[di(pyrid-2-yl)methyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec III.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a 2,2'-dipyridylketon (81 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny 5 v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethylether/petrolether (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován a na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 mi) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 218 mg (93 %) bílé pevné látky o teplotě tání 134 až 136 °C; [a]_D ^2ň = +29,4°. 'H NMR (DMSO-<i6) δ: 0,56 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 30H); 10 3,16 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,02 (m, 1H); 4,12 (m, 1H); 4,31 (m, 1H); 7,33 - 8,85 (m, 8H); 12,78 a 12,88 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C3₅H4₈N₄O4; Vypočteno % C: 71,40; H: 8,22; N: 9,52. Nalezeno % C: 71,38; H: 8,23; N: 9,52. ESI-MS m/z = 589, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3420 cm'¹ O-H (valenční vibrace); 3060 C-H (valenční vibrace, alkeny); 2935 cm“¹, 2868 cm“¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH2); 1673 cm ¹ C=O (valenční vibrace); 15 1588 cm'¹, 1450 cm'¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1377 cm'¹ skupiny CH3 a CH2 (deformační vibrace); 1079 cm'¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1249 cm'¹, 1138 cm'¹, 1079 cm ', 1045 cm 1006 cm'¹,981 cm'¹, 950 cm“¹, 913 cm ', 858 cm“¹, 805 cm¹, 744 cm'¹.

Příklad 13. Příprava V-(chinolin-2-ylmethyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec III.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a chinolin-2-karbaldehyd (69 mg; 0,44 mmol) byly rozpuš25 těny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován na fritě promyt směsí diethylether/petrolether (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 177 mg (79 %) šedobílé pevné látky o teplotě tání 144 až 146 °C; [a]/' = +24,5°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,59 (s, 3H); 0,75 - 2,50 30 (m, 30H); 3,17 (m, 1H); 3,60 (m, 1H); 3,80 (m, 1H); 4,03 (m, 1H); 4,10 - 4,35 (m, 2H); 7,61 (m,

1H); 7,77 (m, 1H); 8,00 (m, 3H); 8,15 a 8,28 (2x s, 1H); 8,39 (m, 1H); 11,56 a 11,69 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C₃4H47N₃O4; Vypočteno % C: 72,69; H: 8,43; N: 7,48. Nalezeno % C: 72,70; H: 8,41; N: 7,46. ESI-MS m/z = 562, [M+H]⁺. 1Č spektrum: 3417 cm’¹ O-H (valenční vibrace); 2915 cm¹, 2870 cm'¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH₃ a CH₂); 1676 cm'¹ C=O 35 (valenční vibrace); 1597 cm“¹, 1504 cm“¹, 1462 cm”¹ C-C (valenční vibrace, aromatický kruh);

1378 cm“¹ skupiny CH₃ a CH₂ (deformační vibrace); 1117 cm'¹, 1077 cm“¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1254 cm“¹, 1195 cm ’, 1148 cm ’, 1117 cm ', 1077 cm“¹, 1045 cm“¹, 1026 cm“¹, 982 cm“¹, 949 cm“¹, 913 cm ', 900 cm 835 cm ', 788 cm“¹, 756 cm“¹.

Příklad 14. Příprava V-fl-řpyrazin^-yljethylidenjcholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec IV.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a acetylpyrazin (54 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v etha45 nolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán chloroform (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 160 mg (76 %) bílé pevné látky o teplotě tání 129 až 131 °C; [a]Ý° = +31,9°. ’H NMR (DMSO-d6) 6: 0,58 (s, 3H); 0,75 - 2,50 (m, 33H); 3,16 50 (m, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,00 (m, 1H); 4,11 (m, 1H); 4,30 (m, 1H); 8,55 - 9,38 (m,

3H); 10,59 a 10,70 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C₃oH4₆N₄04; Vypočteno % C: 68,41; H: 8,80; N: 10,64. Nalezeno % C: 68,38; H: 8,83; N: 10,60. ESI-MS m/z = 52Ί, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3420 cm“¹ O-H (valenční vibrace); 2936 cm“¹, 2870 cm“¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH₃ a CH₂); 1679 cm“¹ C=O (valenční vibrace); 1520 cm“¹, 1466 cm“¹ C-C (valenční vibrace,

-10CZ 305607 B6 aromatický kruh); 1377 cm¹ skupiny CH₃ a CH₂ (deformační vibrace); 1110 cm¹, 1077 cm¹ CO (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1252 cm¹, 1175 cm“', 1110 cm“¹, 1077 cm“¹, 1048 cm¹, 1016 cm¹, 981 cm¹, 949 cm¹, 915 cm¹, 856 cm“¹, 733 cm¹, 614 cm¹.

Příklad 15. Příprava V-(benzo[d]thiazol-2-ylmethyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec V.

Cholylhydrazid (169 mg; 0,4 mmol) a benzothiazol-2-karbaldehyd (72 mg; 0,44 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (30 ml) a reakční směs byla míchána při 70 °C po dobu 24 h. Poté byla směs odpařena do sucha, byl přidán isopropanol (3 ml) a směs diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 50 ml). Pevný produkt byl odfiltrován na fritě promyt směsí diethyléther/petroléther (1:1 v/v; 3x 10 ml) a sušen za vakua olejové pumpy při 50 °C. Bylo získáno 193 mg (85 %) žlutohnědé pevné látky o teplotě tání 134 až 137 °C; [a]_o ²⁰ = +31,3°. 'H NMR (DMSO-d6) δ: 0,57 (s, 3H); 0,75 2,50 (m, 30H); 3,16 (m, 1H); 3,59 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,01 (m, 1H); 4,08-4,35 (m, 2H); 7,52 (m, 2H); 8,05 (m, 2H); 8,25 a 8,46 (2x s, 1H), 11,73 a 11,90 (2x s, 1H) ppm. Elementární analýza: C32H45N3O4S; Vypočteno % C: 67,69; H: 7,99; N: 7,40. Nalezeno % C: 67,70; H: 8,03; N: 7,39. ESI-MS m/z = 568, [M+H]⁺. IČ spektrum: 3420 cm“¹ O-H (valenční vibrace); 2935 cm¹, 2865 cm“¹ C-H (valenční vibrace, skupiny CH3 a CH₂); 1680 cm¹ C=O (valenční vibrace); 1465 cm 'C-C (valenční vibrace, aromatický kruh); 1378 cm“¹ skupiny CH₃ a CH₂ (deformační vibrace); 1077 cm“¹ C-0 (valenční vibrace); oblast otisku prstu - 1244 cm ', 1196 cm¹, 1154 cm¹, 1077 cm¹, 1042 cm¹, 1015 cm¹, 980 cm'¹, 948 cm¹, 915 cm¹, 856 cm¹, 760 cm¹, 730 cm“¹, 713 cm'¹.

Příklad 16. Stabilita benzoylhydrazonů v roztoku.

Hydrazony mohou za určitých podmínek podléhat hydrolýze na výchozí komponenty. Pro jejich případné využití ve veterinární či humánní medicíně je nezbytné, aby byly po určitou dobu (obvykle 1 až 7 dní) stabilní ve vodě či směsi vody s organickými rozpouštědly (zejména dimethylsulfoxidem, jež se u hůře rozpustných látek používá pro jejich převedení do roztoku a následnou aplikaci).

Zředěné roztoky látek uvedených v příkladech 1 až 15 v čisté vodě a ve směsi dimethylsulfoxid/voda (1:1, v/v) jsou stabilní při fyziologickém pH = 7,4 po dobu více než 2 dny při laboratorní teplotě (« 20 °C) a po dobu více než 7 dní při teplotě do 5 °C (jejich UV-Vis spektra jsou po celou dobu neměnná). Látky uvedené v příkladech 1 až 15 jsou stabilní v roztoku deuterovaného dimethylsulfoxidu při laboratorní teplotě (« 20 °C) po dobu více než 30 dní (jejich *H NMR spektra jsou po celou dobu neměnná). Látky je tak možno po uvedené doby skladovat jako roztoky, ideálně jako roztoky v čistém dimethylsulfoxidu při nízké teplotě (tedy za podmínek, kdy nedochází k jejich rozkladu).

Příklad 17. Komplexační vlastnosti.

Jedním z předkládaných mechanismů účinku tohoto typu látek je chelatace iontů biologicky významných kovů, které jsou součástí metaloproteinů a metaloenzymů. Jejich chelatace způsobuje inhibici enzymové aktivity příslušných metaloproteinů.

UV/Vis titrace M-(2,5—dihydroxybenzyliden)cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec I s kobaltnatými (Co² ), měďnatými (Cu²⁺) a nikelnatými (Ni² ) ionty ukazují, že tento chelátor tvoří s kobaltnatým iontem komplex 2:1, s měďnatým a nikelnatým iontem komplex 1:1, které se však liší v konstantě stability. Studovaný chelátor s Cr³⁺, Mn²⁺ a Zn²⁺ neintegruje. UV/Vis titrace /^-[(J-hydroxy-S-ihydroxymethyl^-methylpyrid^L-yljmethylidenjcholylhydrazidu, spadající

-11 CZ 305607 B6 pod obecný vzorec II ukazují, že tento chelátor tvoří s kobaltnatým iontem komplex 2:1, s měďnatým a nikelnatým iontem komplex 1:1. Studovaný chelátor sCr³⁺, Mn²⁺ a Zn²⁺ neinteraguje. UV/Vis titrace /V-[(6-methylpyridin-2-yl)methyliden]cholylhydrazidu, spadající pod obecný vzorec III ukazují, že tento chelátor tvoří s kobaltnatým iontem komplex 2:1 a s měďnatým iontem komplex 1:1, které se však liší v konstantě stability. Studovaný chelátor sCr³⁺, Mn²⁺, Ni²⁺a Zn²⁺ neinteraguje.

Všechny titrace byly provedeny ve směsi dimethylsulfoxid-voda (1:1 v/v) při pH = 7,4 (fosfátový pufr).

Příklad 18. Protirakovinné vlastnosti.

Byly provedeny testy cholylhydrazonů na sedmi rakovinných liniích CCRF-CEM (T-lymfoblastická leukémie), CEM-DNR (T-lymfoblastická leukémie, daunorubicin resistentní), K562 (myeloidní leukémie), K.562-TAX (myeloidní leukémie, paclitaxel resistentní), HCT116 (lidský kolorektální karcinom), HCT116p53-/- (lidský kolorektální karcinom, p53-deficientní), A549 (lidský plicní adenokarcinom) a dvou zdravých liniích BJ (lidské fibroblasty) a MRC-5 (lidské plicní fibroblasty).

V Tabulkách 1 a 2 jsou uvedeny příklady struktur a koncentrace cholylhydrazonů inhibující buněčnou viabilitu buněčných linií na 50 % uvedená jako IC₅o (μΜ) ± SD.

Testované látky vykazují hodnoty IC₅₀ v rozsahu 1,1 až 82 μΜ. Všechny deriváty vykazují vyšší cytotoxicitu vůči leukemické buněčné linii CCRF-CEM (T-lymfoblastická leukémie) než vůči buněčné linii CEM-DNR (daunorubicin resistentní T-lymfoblastická leukémie). V případě myeloidní leukémie vykazují testované látky vyšší cytotoxickou aktivitu vůči linii K.526 než vůči linii K562-TAX (paclitaxel resistentní myeloidní leukémie). Většina derivátů vykazovaly vyšší inhibiční aktivitu vůči lidskému kolorektálnímu karcinomu (linie HTC116) než vůči jeho p53 deficitní variantě (linie HCT116p53—/—). Hodnoty IC50 pro linii A549 (lidský plicní adenokarcinom) se pohybovaly v rozmezí 4,5 až 59 μΜ. Připravené a testované látky vykazovaly hodnoty IC50 pro zdravé buněčné linie - BJ (lidské fibroblasty) a MRC-5 (lidské plicní fibroblasty) v rozsahu 4,7 až 81 μΜ. Ve většině případů vykazovaly testované látky vyšší cytotoxicitu (nižší hodnoty IC50) pro leukemické a rakovinné linie CCRF-CEM, K.526, HTC116, HCT116p53—/— A549 než pro zdravé linie BJ a MRC-5.

Ze strukturního pohledu jsou nejaktivnější látky lipofilního charakteru: Jedná se o deriváty znázorněné obecným vzorcem I, kde Y =; Rl = R2 = R3 = R4 = H; R3 = tBu; Y = H; Rl = R2 = R3 = R4 = H; R3 = Br; Y = H; Rl, R2 = CH=CH-CH=CH; R3 = R4 = Η; Y = H; Rl = R2 = H; R3, R4 = CH=CH-CH=CH; Y = H; Rl = Allyl; R2 = R3 = R4 = H, deriváty znázorněné obecným vzorcem III, kde Y = 2-Py; R1=R2 = R3 = R4 = H;Y = H;R1,R2 = CH=CH-CH=CH; R3 = R4 = H a derivát znázorněný obecným vzorcem V, kde Y = Η; X = S.

Průmyslové využití

Vynález je využitelný ve farmaceutickém průmyslu, k přípravě nových léčiv a k léčbě rakoviny a leukémií.

- 12CZ 305607 B6

Tabulka 1. IC₅₀ (μΜ) pro vybrané cholylhydrazony (linie CCRF-CEM, CEM-DNR, K562 a K562-TAX)

- 13CZ 305607 B6

-14CZ 305607 B6

- 15CZ 305607 B6

Tabulka 2. ICso(gM) pro vybrané cholylhydrazony (linie HCT116, HCT116p53-/-, A549, BJ a MRC-5)

MRC-5	9,69 ± 2,85	O cn +1 LH 00	71,19 ± 12,07	8,18 ± 2,78	42,63 ±17,75 \|	CM LQ in +1 co in Ol	7,26 ± 3,03	[0 +1 00 m in	29,66 ± 16,53
—t CD	12,56 ± 2,94	9,73 ± 2,41	98,81 ± 3,08	8,95 ± 2,50	+1 cn o' m	20,57 ± 13,29	7,62 ± 5,25	4,67 ± 2,43	44,67 ± 6,40
CO OJ 5 0Í £t \ / )—< Q Cť—(f ')—££ +1 < \ / O \ / m /—\ y __	6,37 ± 1,29	4,97 ± 1,15	59,33 ±17,07	4,64 ± 0,52	33,86 ± 12,26	21,32 ± 2,39	5,25 ± 1,52	4,52 ± 0,34	16,92 ± 0,98
H ' —y^N'N* ° H< 1 HCT116 p53-/-	5,06 ± 2,13	7,47 ± 3,39	35,30 ±21,18	7,28 ± 2,47	16,39 ± 2,03	8,30 ± 5,02	13,91 ± 2,39	4,86 ± 0,58	15,05 ± 2,27
OH HCTI16	Lfl +1 rn	O +1 cn rn	49,01 ± 20,04	1,13 ±0,61	20,52 ± 4,90	17,43 ± 5,38	1,61 ± 1,06	1,65 ± 1,09	6,66 ± 1,96
O	\| Y = H; Rl = Allyl; R2 = R3 = R4 = H	Y = H; Rl = R2 = R4 = H; R3 = Br	Y = H; Rl = R2 = R4 = H; R3 = OH	Y = H; Rl = R2 = R4 = H; R3 = tBu	\| Y = H; Rl = R2 = R4 = H; R3 = N0₂	\| Y = H; Rl = R2 = R4 = H; R3 = COOCH₃	Y = H; Rl, R2 = CH=CH-CH=CH; R3 = R4 = H	X 0 II X u 1 X u II X u II S rri CL x' II Ol CL II X II >	Y = H; Rl = R3 = Br; R2 = R4 = H

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Cholylhydrazony mající 2-hydroxyarylovou skupinu obecného vzorce 1

kde Rl, R2, R3, R4 jsou H, OH, alkyl s 1 až 6 uhlíkovými atomy, allyl, halogen, OCH₃, COOCH₃, NO₂, N(CH₂CH₃)₂,

Rl, R2 nebo R2, R3 nebo R3, R4 jsou CH=CH-CH=CH, tedy přikondenzované benzenové jádro;

s výjimkou látky, pro níž platí, že Rl = R2 = R3 = R4 = H;

^-[(S-Hydroxy-S-íhydroxymethyl^-methylpyridin^l-yljmethylidenJchoIylhydrazid vzorce II

OH kde Y je H nebo 2-pyridyl,

-19CZ 305607 B6

RI, R2, R3, R4 mají vpředu uvedený význam;

s výjimkou látky, pro niž platí, že RI = R2 = R3 = R4 = Η; Y = H;

Λ'-[ Mpyrazi n2-yl)ethyl iden] cholyl hydrazid vzorce IV

OH

ÝV-(benzo)[</]thiazol-2-ylmethyliden]cholylhydrazid vzorce V
2. Použití látek obecného vzorce I, II, III, IV a V podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčbě nádorových onemocnění.
3. Použití látek obecného vzorce I, II, III, IV a V podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčbě leukémií.