CZ308447B6 - Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii - Google Patents
Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308447B6 CZ308447B6 CZ2018-331A CZ2018331A CZ308447B6 CZ 308447 B6 CZ308447 B6 CZ 308447B6 CZ 2018331 A CZ2018331 A CZ 2018331A CZ 308447 B6 CZ308447 B6 CZ 308447B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- rna
- transporters
- transporter
- sirna
- hydrazone
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 7
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 title abstract description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 15
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- -1 2,3-dihydroxybenzylidene Chemical group 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 claims description 2
- 125000002160 cholyl group Chemical group [H]C([H])([C@]1(C([C@@]2([H])O[H])([H])[H])[H])[C@@](O[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]1(C([H])([H])[H])[C@]1([H])[C@]2([H])[C@]2([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]([C@](C([H])([H])[H])(C(C(C(=O)[*])([H])[H])([H])[H])[H])([H])[C@@]2(C([H])([H])[H])[C@](O[H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 3
- 238000013149 parallel artificial membrane permeability assay Methods 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 40
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 37
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 36
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- IXWOUPGDGMCKGT-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=CC(C=O)=C1O IXWOUPGDGMCKGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 4
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- SXPSZIHEWFTLEQ-UHFFFAOYSA-N tröger's base Chemical group C12=CC=C(C)C=C2CN2C3=CC=C(C)C=C3CN1C2 SXPSZIHEWFTLEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical class C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BATUORYJCLTZTR-OELDTZBJSA-N (4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanehydrazide Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NN)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BATUORYJCLTZTR-OELDTZBJSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000002071 chiral Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 2
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002212 electronic circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- ZKQFHRVKCYFVCN-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;hexane Chemical compound CCOCC.CCCCCC ZKQFHRVKCYFVCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical class C1=CC=C2C(=O)NNC(=O)C2=C1 KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DMYJOOWXTBSSRB-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O DMYJOOWXTBSSRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJQDRPLHEPIIAC-FDYZEBBJSA-N 2-[(z)-[(3z)-3-(diaminomethylidenehydrazinylidene)cyclopenta[b]naphthalen-1-ylidene]amino]guanidine Chemical class C1=CC=C2C=C3C(=N/N=C(N)N)\C\C(=N\N=C(N)N)C3=CC2=C1 UJQDRPLHEPIIAC-FDYZEBBJSA-N 0.000 description 1
- URSDNTXSIAMTEH-UHFFFAOYSA-N 2-hydrazinylidene-1,3,7-trimethylpurin-6-one Chemical class N1(C)C(N(C)C=2N=CN(C)C=2C1=O)=NN URSDNTXSIAMTEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036284 Hepcidin Human genes 0.000 description 1
- 101001021253 Homo sapiens Hepcidin Proteins 0.000 description 1
- 108700020129 Human immunodeficiency virus 1 p31 integrase Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940124532 absorption promoter Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000034662 activation of innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091022863 bile acid binding Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N gamma-cyhalothrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](\C=C(/Cl)C(F)(F)F)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940124524 integrase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002850 integrase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010082406 peptide permease Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N phthalimide Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
- C07C251/72—Hydrazones
- C07C251/74—Hydrazones having doubly-bound carbon atoms of hydrazone groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C39/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
- C07C39/02—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring monocyclic with no unsaturation outside the aromatic ring
- C07C39/08—Dihydroxy benzenes; Alkylated derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
- C07F15/06—Cobalt compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Vynález se týká nového transportního komplexu RNA na bázi hydrazonů použitelný především jako transportní systém řetězců či fragmentů DNA/RNA přes modelové biologické membrány (PAMPA- paralelní analýza permeability umělou membránou). Připravené komplexy transportér-RNA mohou být použity jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii.
Description
Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii
Oblast techniky
Předmětem vynálezu je příprava komplexů transportér-RNA na bázi hydrazonů použitelných především jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii. Zjištění jejich chemicko-fýzikálních vlastností (termodynamické parametry či struktura) pro tvorbu komplexu transportér-RNA, s využitím zejména spektroskopických metod a PAMPA (paralelní analýza permeability umělou membránou) dovolilo identifikaci účinných transportérů. Dopravní účinnost a cytotoxicita nových nosičů byla otestována na primárních leukemických buňkách (PLC).
Dosavadní stav techniky
Rakovina je jedním z hlavních cílů terapie primárně založené na RNAi, protože onkogeny, mutované geny potlačující nádory a mnoho různých genů, které přispívají k rozvoji nádoru, jsou potenciálně důležité pro tlumení genů pomocí RNAi. V současné době se siRNA používá jak pro základní výzkum, tak pro terapii různých onemocnění včetně rakoviny. Dodávání nukleokyselinových terapeutik (DNA, siRNA či oligonukleotidy) pro down-regulaci mutovaných genů a na potlačení nechtěné exprese genů se stává zajímavou metodou pro potlačení rakovinného bujení a jeho invazivnosti. Optimální kombinace výrazných protirakovinných siRNA a účinných systémů pro jejich transport do buněk mohou být vhodnou cestu pro úspěšnou klinickou aplikaci siRNA [A. Singh, P. Trivedi, N. K. Jain: Advances in siRNA delivery in cancer therapy. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol. 46 (2018) 274-283], siRNA jsou dvoj řetězcové molekuly RNA o délce 20 až 25 párů bází, o nichž je známo, že způsobují degradaci dokonalé komplementární cílové RNA. siRNA mohou vznikat z RNA transkribované v jádru (endogenní siRNA), nebo mohou být zavedeny virálně nebo jako chemicky syntetizované dsRNA (exogenní siRNA). Aby mohla siRNA vykonávat svoji funkci, musí být odpojena a zachycena do ribonukleoproteinu RISC (z angl. RNA-induced silencing complex). Komplex RISC obsahuje argonaut-proteiny (AGO), které vykazují endonukleolytickou aktivitu zodpovědnou za štěpení cílové RNA. Jeden z obou vláken duplexu siRNA (vedoucí vlákno) je zachyceno v komplexu RISC, zatímco druhé vlákno (vedlejší vlákno) je uvolněno a degradováno [F. Michelini, A. P. Jalihal, S. Francia, C. Meers, Z. T. Neeb, F. Rossiello, U. Gioia, J. Aguado, C. Jones-Weinert, B. Luke, G. Biamonti, M. Nowacki, F. Storici, P. Caminci, N. G. Walter, F. dAdda di Fagagna: From Cellular RNA to Smart RNA: Multiple Roles of RNA in Genome Stability and Beyond. Chem. Rev. 118 (2018) 4365-4403],
Vlastnosti volné siRNA, která je typem dvouvláknové malé RNA, zejména její hydrofilnost a záporný náboj, brání jejímu snadnému překročení biologických membrán [K. A. Whitehead, R. Langer, D. G. Anderson: Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8 (2009) 129-138], Další výzvou pro terapii siRNA je tzv. imunitní stimulace, což je rozpoznávání duplexu siRNA vrozeným imunitním systémem. Zavedení příliš velkého množství siRNA vede k aktivaci vrozených imunitních odpovědí. [J. T. Marques, B. R. Williams: Activation of the mammalian immune system by siRNAs. Nat. Biotechnol. 23 (2005) 13991405], K překonání těchto potíží je nezbytný vývoj bezpečného a efektivního systému pro podání in vivo. Účinnost léčiv na bázi siRNA v boji s rakovinou vyžaduje výrazné a účinné tlumení genů v nádorových buňkách. Pro dosažení efektivního dodávání siRNA by měl ideální transportní systém siRNA vykazovat následující charakteristiky: (1) být biokompatibilní, biologicky odbouratelný a neimunogenní, (2) musí chránit siRNA před sérovými nukleázami během průchodu cirkulací a během uvolňování do endosomů, (3) vyhnout se rychlému jatemímu nebo renálnímu vyloučení a (4) zprostředkovávat dodávání siRNA do cílových buněk při zachování normálních tkání. Návrh vhodného in vivo systému pro dodávání siRNA by měly zahrnovat metody pro zvýšení sérového poločasu siRNA, jeho distribuci do cílové tkáně, její buněčné vychytávání s následným intracytoplazmatickým uvolňováním bez degradace.
Současně vyvinuté systémy pro transport, resp. pro cílené dodávání siRNA pro léčbu rakoviny zahrnují zejména: (1) chemicky modifikované siRNA, (2) lipidové systémy pro transport siRNA, (3) polymemí systémy transport siRNA, (4) systémy s konjugáty siRNA, (5)- kombinace transportu siRNA spolu s protinádorovými léčivy a (6) použití anorganických nanočástic.
Tyto modifikace pomáhají řešit problémy nahé siRNA související s: (1) sérovou stabilitou, (2) vylučováním látek s větší molekulovou hmotností, (3) vysokou toxicitou (cytotoxicitou), (4) interakcemi ligand-receptor, (5) dosažení rakovinných tkání a (6) renální vylučování. Všechny tyto výhody je obtížné získat během jediné modifikace. Pro protinádorové siRNA, které mají svou aktivitu v rakovinových tkáních, byly použity chemické modifikace nahé siRNA pro tvorbu siRNA, která je rezistentní vůči nukleáze, aby se zabránilo degradaci, zvýšila se stabilita siRNA a zlepšila se doba cirkulace i absorpce v nádoru in vivo. [A. Singh, P. Trivedi, N. K. Jain: Advances in siRNA delivery in cancer therapy. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol. 46 (2018) 274-283],
Různé strategie dodávání, které se dnes používají, se pohybují od metod variabilního dávkování, jako je endocytóza vezikulámích buněk (např. transfekce na bázi lipidů) nebo dodávání membránovou permeabilizací (např. elektroporace, permeabilizace detergenty a bakteriálními toxiny tvořícími póry) [F. Michelini, A. P. Jalihal, S. Francia, C. Meers, Z. T. Neeb, F. Rossiello, U. Gioia, J. Aguado, C. Jones-Weinert, B. Luke, G. Biamonti, M. Nowacki, F. Storici, P. Caminci, N. G. Walter, F. dAdda di Fagagna: From Cellular RNA to Smart RNA: Multiple Roles of RNA in Genome Stability and Beyond. Chem. Rev. 118 (2018) 4365-4403],
Pro cílenou distribuci léku, jehož vlastnosti neumožňují jeho přímé použití, je třeba vyvinout spolehlivé transportní systémy. Schopnost léčiva nebo sondy přestoupit biologické bariéry (membrány) byla historicky považována za funkci jeho fyzikálních vlastností. Polymemí makromolekuly představují univerzální platformu pro přípravu nosičů nukleových kyselin, které vytvoří interpolyelektronické komplexy se záporně nabitou RNA v důsledku elektrostatických interakcí, které jsou obecně použity pro transfekci v buněčných kulturách. Molekulární transportní systémy představuji novou strategii, jak při pomoci polymemích nosičů obejít omezení. Jako molekulární transportéry lze použít látky s nábojem a/nebo se specifickými skupinami, umožňujícími reverzibilní zachycení léčiva. Hydrazony mohou z principu díky svým vlastnostem být takovými vhodnými látkami, resp. transportéry.
Hydrazony vykazují širokou škálu biologické aktivity, zejména antimikrobiální, protizánětlivou, analgetickou, antimalarickou, protirakovinnou, antituberkulámí či antivirovou [G. Verma, A. Marella, M. Shaquiquzzaman, M. Akhtar, M. R. Ali, Μ. M. Alam: A review exploring biological activities of hydrazones. J. Pharm Bioallied Sci. 6 (2014) 69-80; R. Kaplánek, M. Havlík, B. Dolenský, J. Rak, P. Džubák, P. Konečný, M. Hajdúch, J. Králová, V. Král: Synthesis and biological activity evaluation of hydrazone derivatives based on a Troger's base skeleton. Bioorg. Med. Chem. 23 (2015) 1651-1659; S. Rollas, S. G. Kucukguzel: Biological activities of hydrazone derivatives. Molecules. 12 (2007) 1910-1939; P. Kumar, B. Narasimhan: Hydrazides/Hydrazones as Antimicrobial and Anticancer Agents in the New Millennium. MiniRev. Med. Chem. 13 (2013) 971-987; M. Bijo, S. Jerad, J. A. Mohamed, E. M. Githa, U. Dhasthakeer, N. S. S. Puthucode, F. S. Kallivalappil, M. Srinubabu: Hydrazones as a Privileged Stmctural Linker in Antitubercular Agents: A Review. Infectious Disorders - Drug Targets. 15 (2015) 76-88], Hydrazony tak představují důležitou skupinu sloučenin vhodných pro vývoj nových léčiv. Tyto sloučeniny obsahují vazbu -C=NNH-, která je konjugována s volným elektronovým párem fůnkčního dusíku. Kombinace hydrazonů s jinou fůnkční skupinou (např. s dalším farmakoforem), vede k sloučeninám s jedinečným biologickými, fyzikálními a chemickými vlastnostmi.
Naše předchozí výsledky ukázaly, že chelátory na bázi hydrazonů vykazují mnohdy výraznou cytotoxickou aktivitu a selektivitu vůči rakovinným buňkám [J. Rak, R. Kaplánek, V. Král, J. Králová, T. Štulcová, P. Drašar: Konjugáty hydrazonů s kyselinou cholovou jako nová cytostatika. Patent CZ304112 B6 (2013); J. Rak, R. Kaplánek, T. Štulcová, P. Drašar, M. Havlík, T. Bříza, P. Džubák, M. Hajduch, P. Konečný, J. Štěpánková, J. Králová,V. Král: Cholylhydrazony a jejich použití k léčbě nádorových onemocněni a leukémií, Patent CZ305607 B6 (2016); R. Kaplánek, M. Havlík, B. Dolenský, J. Rak, P. Džubák, P. Konečný, M. Hajdúch, J. Králová, V. Král: Synthesis and biological activity evaluation of hydrazone derivatives based on a Troger's base skeleton. Bioorg. Med. Chem. 23 (2015) 1651-1659; R. Kaplánek, M. Jakubek, J. Rak, Z. Kejík, M. Havlík, B. Dolenský, I. Frydrych, M. Hajdúch, M. Kolář, K. Bogdanová, J. Králová, P. Džubák, V. Král: Caffeine-hydrazones as anticancer agents with pronounced selectivity toward T-lymphoblastic leukaemia cells. Bioorg. Chem. 60 (2015) 19-29],
Hydrazony nesoucí 2-hydroxyarylovou nebo 2-N-heterocyklickou skupinu mají vazebné účinky vůči celé řadě iontů přechodných kovů. Vazba kovů je zajištěna díky kyslíkovým a dusíkovým donomím skupinám. Vazebné místo je tak tvořeno karbonylovým kyslíkem hydrazonů, enaminovým dusíkem nebo heteroaromatickým dusíkem [R. Kaplánek, M. Havlík, B. Dolenský, J. Rak, P. Džubák, P. Konečný, M. Hajdúch, J. Králová, V. Král: Synthesis and biological activity evaluation of hydrazone derivatives based on a Troger's base skeleton. Bioorg. Med. Chem. 23 (2015) 1651-1659; J. Rak, R. Kaplánek, T. Štulcová, P. Drašar, M. Havlík, T. Bříza, P. Džubák, M. Hajduch, P. Konečný, J. Štěpánková, J. Králová,V. Král: Cholylhydrazony a jejich použití k léčbě nádorových onemocněni a leukémií, Patent, CZ305607 B6 (2016)]. Pro zvýšení biodostupnosti látek se často používá modifikátor absorpce, tedy látka či skupina zvyšující (podporující) vstřebávání hydrofobních biologicky aktivních látek. Tento modifikátor absorpce může být k biologicky aktivní části molekuly kovalentně navázán. Jako skupiny zvyšující biodostupnost se obvykle používají deriváty sterolů a žlučových kyselin [J. Tamminen, E. Kolehmainen: Bile Acids as Building Blocks of Supramolecular Hosts. Molecules 6 (2001) 2146; W. Kramer, G. Wess, A. Enhsen, E. Falk, A. Hoffmann, G. Neckermann, G. Schubert, M. Urmann: Modified bile acids as earners for peptides and drugs. J. Control. Release 46 (1997), 1730; A. Enhsen, W. Kramer, G. Wess: Bile acids in drug discovery. Drug Discov. Today 3 (1998) 409-418; M. Mikov, J. P. Fawcett, K. Kuhajda, S. Kevresan: Pharmacology of Bile Acids and their Derivatives: Absorption Promoters and Therapeutic Agents. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 31 (2006) 237-251; E. Virtanen, E. Kolehmainen: Use of bile acids in pharmacological and supramolecular applications. Eur. J. Org. Chem. (2004) 3385-3399; W. Kramer: Transporters, Trojan horses and therapeutics: suitability of bile acid and peptide transporters for drug delivery. Biol. Chem.392 (2011) 77-94; E. Sievánen: Exploitation of Bile Acid Transport Systems in Prodrug Design. Molecules 12 (2007) 1859-1889],
V případě vybraných RNA-transportérů na bázi hydrazonů bylo zjištěno, že snadno prochází nepolární membránou buňky a některé i tkáňovými bariérami. Vybrané deriváty hydrazonů jsou díky svým vlastnostem vhodné pro vazbu na buněčné povrchy s centry záporně nabitých fúnkčních skupin a mohou tak sloužit jako transportéry nukleotidových struktur. Vytvořené komplexy těchto derivátů jsou reverzibilní a umožňují uvolnění léčiva (oligonukleotidových struktur) po vstupu do vnitřního buněčného prostoru.
Deriváty hydrazonů použitelné jako transportéry RNA a nukleotidových struktur a jejich použití jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii jsou předmětem tohoto patentu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou komplexy RNA-transportér, kde transportér je na bázi hydrazonů, použitelné především jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii. S využitím spektroskopických metod a s pomocí PAMPA byly stanoveny efektivní parametry stabilizace transportního komplexu pro prostup biologickou membránou, dále dopravní účinnost transportérů a cytotoxicita nových nosičů a jejich chemicko-fýzikální vlastnosti pro tvorbu komplexu RNA-transportér.
Vybrali jsme transportéry na bázi hydrazonů, které jsou schopné s nukleotidovými řetězci, tedy s nukleovými kyselinami (RNA, DNA a jejich fragmenty) tvořit stabilní komplexy, které po průchodu přes membránu do vnitřního prostoru buněk molekuly RNA, případně její fragmenty opět uvolní. Schéma 1 zobrazuje vznik komplexu transportér-nukleová kyselina.
Mechanismus transportu je, že transportér je k molekule RNA nekovalentně vázán přes kolumbickou interakci, zejména na fosfodiesterovou vazbu. Takto molekuly transportéru obalí molekulu RNA a díky nábojové neutralitě navržených struktur tento komplex snadno prochází membránou, a nezávisí tak na jeho velikosti. Je tak možný transport jak fragmentů RNA/DNA, tak celých molekul.
Komplex RNA-HZ 1
Komplex RNA-HZ 2
Schéma 1. Tvorba komplexů RNA-transportér
Tyto transportéry velice účinně přenášejí RNA přes buněčné membrány. Jejich vlastnosti jsme testovali na syntetických modelových buněčných membránách. Byly stanoveny koncentrace RNA, které jsou transportéry schopné přes membránu dopravit. Také byly stanoveny konstanty stability kvantifikující sílu vazby molekuly v komplexu a jejich vyvázání po průchodu membránou. Také bylo zjištěno, že velmi záleží na molámím poměru mezi transportérem a transportovanou RNA. Desetinásobný a vyšší přebytek transportéru nemá pozitivní vliv na účinnost transportu do buněk. Naopak má negativní dopad na transportovatelnost vzniklého komplexu.
Interakce RNA se syntetickými transmembránovými nosiči způsobuje významné změny její nativní konformace. Tyto změny byly sledovány a rozpoznány díky ECD výsledného komplexu. Ramanova (ROA) spektra RNA odrážejí její konformační stav a poskytují informaci o uspořádání nukleových bází. Tato metoda poskytuje jedinečnou možnost sledovat komplexaci syntetických transmembránových nosičů s RNA na supramolekulámí úrovni a detekovat vhodné konformační a strukturální změny v molekulách.
Studovali jsme transport RNA pomocí PAMPA testu s deriváty na bázi hydrazonů, RNA/DNA od krmných kvasnic ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Měření ukázalo, že testované sloučeniny HZ 1 a HZ 2 působí jako efektivní transportéry.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Spektra ECD a ROA (elektronový cirkulámí dichroismus a ramanova optická aktivita) zobrazující tvorbu komplexu RNA jednotlivých transportérů - HZ 1, HZ 2, číselné označení příkladu, dle kterého byly připraveny.
Obrázek 2. Graf závislosti absorbance na vlnové délce při rozdílných koncentracích RNA a transportéru pro stanovení konstanty stability transportéru dle příkladu 4.
Obrázek 3. Cytotoxicita nových transportérů.
Příklady uskutečnění vynálezu
Pro charakterizaci navržených komplexů - transportérů RNA byly využity následující analytické metody: UV-Vis spektroskopie, elektronový cirkulámí dichroizmus a ramanova optická aktivita (UV-VIS, ECD a ROA). Mezi strukturními metodami s rozlišením - Ramanova spektroskopie orientovaná na vlnočet polohy vibrací chemických vazeb, elektronový cirkulámí dichroismus (ECD) poskytuje informace o struktuře malých chorálních biologicky významných molekul v roztocích. Spektra ECD byla měřena na spektrometm J-815 (Jasko, Japonsko při teplotě 22 °C v křemenné kyvetě o tloušťce 0,01 cm (Hellma, Německo). ROA spektra byla měřena na spektrometm ChiralRaman-2X (Biotools, USA), který je vybaven laserem Opus (Laser Quantum, Velká Británie).
Různé typy RNA jsou opticky aktivní molekuly mající charakteristické sekundární a terciární struktury. Forma A je typická konformace nativní RNA rozpuštěné v neutrálním pufru se střední iontovou silou. Roztok RNA testovaný za výše uvedených podmínek demonstruje dva pásy ECD, tj. negativní při 210 nm a pozitivní při 260 nm. Obě tyto pásma jsou charakteristická pro formu A.
Příklad 1. Transportér HZ 1
Příprava derivátu HZ 1: cholylhydrazonový derivát byl připraven postupem popsaným v literatuře [A. J. M. Rasras, T. H. Al-Tel, A. F. Al-Aboudi, R. A. Al-Qawasmeh: Synthesis and antimicrobial activity of cholic acid hydrazone analogues. Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 23072313], Cholylhydrazid (127 mg; 0,3 mmol) a 2,3-dihydroxybenzaldehyd (69 mg; 0,5 mmol) byly rozpuštěny v ethanolu (25 ml) a reakční směs byla míchána při 75 °C 2 dny. Poté byla směs odpařena do sucha a odparek byl suspendován v diethylethem (80 ml). Pevný produkt byl odfiltrován, promyt diethyletherem (60 ml) a usušen ve vakuu při 50 °C. Bylo získáno 153 mg (94 %) V-(2,3-dihydroxybenzyliden)cholylhydrazidu (HZ 1). Ή NMR (DMSO-A,) δ: 0,59 (s, 3H); 0,81 (s, 3H); 0,75 až 2,50 (m, 30H); 3,60 (m, 1H); 3,79 (m, 1H); 4,04 (m, 1H); 6,71 až 7,04 (m, 3H); 8,24 a 8,28 (2x s, 1H); 9,19 a 9,39 (2x s, 1H); 10,84 a 11,16 (2x s, 1H); 11,07 a 11,61 (2x s, 1H).
V získaných spektrech A lze pozorovat pásy (2 negativní pásy s maximem 240 nm a 337 nm a pozitivní pás s maximem 270 nm, 284 nm, 323 nm, 352 nm), které odpovídají vznikajícímu komplexu transportér-RNA. Při porovnání spekter samotné RNA a komplexu transportér-RNA vychází rozdíl v intenzitě pásů charakteristických pro RNA a transportér HZ 1. V získaných spektrech ROA lze pozorovat negativní pásy s maximem 240 nm a 337 nm a pozitivní pásy s maximem 270 nm, 284 nm, 323 nm a 352 nm, které odpovídají vznikajícímu komplexu s RNA.
Příklad 2. Transportér HZ 2
Příprava HZ 2: benzhydrazonový derivát byl připraven postupem popsaným v literatuře pro jiné aroylhydrazony [J. Rak, R. Kaplánek, V. Král, J. Králová, T. Stulcová, P. Drašar: Konjugáty hydrazonů s kyselinou cholovou jako nová cytostatika. Patent CZ304112 B6 (2013); R. Kaplánek, M. Havlík, B. Dolenský, J. Rak, P. Džubák, P. Konečný, M. Hajdúch, J. Králová, V. Král: Synthesis and biological activity evaluation of hydrazone derivatives based on a Troger's base skeleton. Bioorg. Med. Chem. 23 (2015) 1651-1659],
2,3-Dihydroxybenzohydrazid (168 mg; 1 mmol) a 2,3-dihydroxybenzaldehyd (138 mg; 1 mmol) byly smíseny v isopropanolu (15 ml). Reakční směs byla míchána při 80 °C 2 dny, poté odpařena do sucha. Surový produkt byl suspendován ve směsi diethylether-hexan (1:1 v/v, 80 ml), pevný produkt byl odfiltrován a promyt směsí diethylether-hexan (1:1 v/v, 60 ml) a usušen ve vakuu při 50 °C. Bylo získáno 249 mg (86 %) JV-(2,3-dihydroxybenzyliden)-2,3-dihydroxybenzhydrazidu (HZ 2). Ή NMR (DMSO-rie): 6,76 (m, 2H); 6,87 (dd, J = 7,9, 1,6 Hz, 1H); 7,00 (m, 2H); 7,35 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H); 8,65 (s, 1H); 9,29 (s, 1H); 9,43 (s, 1H); 10,96 (s, 1H); 11,73 (bs, 1H); 12,09 (s, 1H).
Samotný derivát HZ 2 byl již dříve patentován a publikován, byla popsána jeho alternativní syntéza [T. R. Burke, Jr., X. Z. Zhao, E. A. Semenova, K. Maddali, Y. Pommier: Hydrazide, amide, phthalimide and phthalhydrazide analogs as inhibitors of retroviral integrase. Patent WO/2009/026248 (2009); X. Z. Zhao, E. A. Semenova, B. C. Vu, K. Maddali, C. Marchand, S. H. Hughes, Y. Pommier, T. R. Burke, Jr.: 2,3-Dihydro-6,7-dihydroxy-lH-isoindol-l-one-Based HIV-1 Integrase Inhibitors. J. Med. Chem. 51 (2008) 251-259],
V získaném ECD spektru transportéru HZ 2 lze pozorovat 2 negativní pásy s maximem 217 nm a 274 nm a pozitivní pásy s maximem 207 nm, 274 nm, 301 nm. Při porovnání spekter samotné RNA a komplexu transportér-RNA vychází rozdíl v intenzitě pásů charakteristických pro RNA a transportér HZ 2. V získaných spektrech ROA lze pozorovat negativní pásy s maximem 217 nm a 276 nm a pozitivní pásy s maximem 255 nm a 316 nm, které odpovídají vznikajícímu komplexu s RNA.
Příklad 3. Test účinnosti transportérů HZ 1 a HZ 2 pro RNA pomocí PAMPA
V této studii byla použita metoda PAMPA (paralelní analýza permeability umělou membránou). Tato in vitro metoda umožňuje stanovit transportní vlastnosti látek přes fosfolipidové vrstvy. Sestava se skládá z jamek, které tvoří donorové a akceptorové mikrotitrační desky. Celá sestava se běžně označuje jako sendvič. Na začátku testu je látka přidána do donorové části. Do ní se vloží akceptorová destička s fosfolipidovou membránou na dně. Během inkubace dochází k transportu RNA pomocí transportérů RNA do akceptorové části. Po ukončení inkubace je proměřena koncentrace RNA v akceptorové i donorové destičce. Tím se kvantifikuje množství transportované RNA.
Sendvičová struktura byla tvořena 96-jamkovou mikrotitrační destičkou a 96-jamkovou filtrační destičkou (IPVH, 125 pm tlustý filtr, 0,45 pm póry). Zásobní roztoky nosiče vzorků byly připraveny při 50 °C, následně byly smíchány s methanolem a uloženy při teplotě 0 °C. Nejprve byl zásobní roztok zředěn pufrem, aby se dosáhlo konečné koncentrace vzorků 10 až 50 pM a snížení koncentrace methanolu pod 5 % (v/v) a poté byl roztok pipetován do jamek.
Donorová destička byla naplněna 300 pl zředěného nosiče o třech koncentracích (ctranspoitér = 0,1/1/10 mM) + RNA (crna = 0,05 mM). Koncentrace RNA byla vztažena na monomemí jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 pl roztoku pufiru (pH = 7,4). Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části. Takto propojené destičky fosfolipidovou membránou byly inkubovány při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 2 h bez míchání. Po uplynutí doby se sendvičové desky oddělily. Množství (koncentrace) RNA v jamkách donorových a akceptorových destiček bylo změřeno na základě porovnání experimentálního spektra s UV spektrem (220-800 nm) získaným z referenčních standardů.
V tabulce 1 jsou shrnuty výsledky testu účinnosti transportérů HZ 1 a HZ 2 pro RNA pomocí PAMPA (jako hodnoty Kass). Nej efektivnější intracelulámí transport vykazoval HZ 2 transportér (nejvyšší hodnoty Kass).
Tabulka 1. Transportní vlastnosti
| Transportér* | log Kass |
| HZÍ | 3,500 |
| HZ 2 | 4,905 |
*Ctransportér = 0,1 mM; crna = 0,05 mM; λ/nm = 255 nm)
Příklad 4. Cytotoxicita nových transportérů
Primární leukemické buňky (PLC) - 200 μτη 4T1 byly inkubovány 2 hodiny s novými transportními látkami C (0,1/1/10 mM). Výsledky testů prováděné na několika buněčných liniích (PLC-4T1) neprokázaly žádný výrazný cytotoxický účinek transportérů na testované buňky (obr. 3), což znamená, že připravené transportéry nejsou toxické a jsou vhodné pro in vitro a in vivo použití.
Průmyslová využitelnost
Vynález je využitelný ve farmaceutickém průmyslu, jako efektivní komplex RNA-transportér na bázi hydrazonů, použitelný především jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii.
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití 2,3-dihydroxybenzyliden hydrazidů obecného vzorce I,HO'OH (I), kde Rje cholyl nebo 2,3-dihydroxybenzoyl,OH cholylOH O 2,3-dihydroxybenzoyl pro přípravu transportérů nukleotidových struktur, kde nukleotidovými strukturami j sou řetězce a fragmenty RNA nebo DNA.
- 2. Použití transportérů podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro nádorovou imunoterapii.
- 3. Použití transportérů podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčbu onkologických onemocnění.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-331A CZ308447B6 (cs) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2018-331A CZ308447B6 (cs) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2018331A3 CZ2018331A3 (cs) | 2020-01-15 |
| CZ308447B6 true CZ308447B6 (cs) | 2020-08-26 |
Family
ID=69140724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2018-331A CZ308447B6 (cs) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308447B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12398176B2 (en) | 2018-08-27 | 2025-08-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of Raman spectroscopy in downstream purification |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3928795A1 (en) * | 2020-06-26 | 2021-12-29 | Jacobs University Bremen gGmbH | Use of a boron cluster compound as transmembrane carrier |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006115312A1 (en) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Postech Foundation | Molecular transporters based on sugar and its analogues and processes for the preparation thereof |
| US20070009889A1 (en) * | 2003-05-02 | 2007-01-11 | Centrum Mikrobiologh I Wirusologii Polskiej Akadem | Nucleoside derivative, modifed oligonucleotide, method for their syntesis and applicantions thereof |
| CZ304112B6 (cs) * | 2012-05-18 | 2013-10-30 | Vysoká skola chemicko-technologická v Praze | Konjugáty hydrazonu s kyselinou cholovou jako nová cytostatika |
| CZ305607B6 (cs) * | 2014-05-06 | 2016-01-06 | Vysoká škola chemicko- technologická v Praze | Cholylhydrazony a jejich použití k léčbě nádorových onemocnění a leukémií |
| CZ306254B6 (cs) * | 2015-08-30 | 2016-11-02 | University of Jyväskylä, Department of Chemistry | Transportér nukleotidových struktur |
-
2018
- 2018-07-04 CZ CZ2018-331A patent/CZ308447B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070009889A1 (en) * | 2003-05-02 | 2007-01-11 | Centrum Mikrobiologh I Wirusologii Polskiej Akadem | Nucleoside derivative, modifed oligonucleotide, method for their syntesis and applicantions thereof |
| WO2006115312A1 (en) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Postech Foundation | Molecular transporters based on sugar and its analogues and processes for the preparation thereof |
| CZ304112B6 (cs) * | 2012-05-18 | 2013-10-30 | Vysoká skola chemicko-technologická v Praze | Konjugáty hydrazonu s kyselinou cholovou jako nová cytostatika |
| CZ305607B6 (cs) * | 2014-05-06 | 2016-01-06 | Vysoká škola chemicko- technologická v Praze | Cholylhydrazony a jejich použití k léčbě nádorových onemocnění a leukémií |
| CZ306254B6 (cs) * | 2015-08-30 | 2016-11-02 | University of Jyväskylä, Department of Chemistry | Transportér nukleotidových struktur |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HONG H. et al.: „Polyion complex micelles composed of pegylated polyasparthydrazide derivatives for siRNA delivery to the brain," Journal of Colloid and Interface Science, vol. 447, 2015, str. 8 - 15, ISSN 0021-9797 * |
| WENDER P. A. et al.: „Guanidinium-rich, glycerol-derived oligocarbonates: A new class of cell-penetrating molecular transporters that complex, deliver, and release siRNA," Molecular Pharmaceutics, vol. 12, no. 3, 2015, str. 742 - 750, ISSN 1543-8384 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12398176B2 (en) | 2018-08-27 | 2025-08-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of Raman spectroscopy in downstream purification |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2018331A3 (cs) | 2020-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Hyaluronic acid modification of RNase A and its intracellular delivery using lipid-like nanoparticles | |
| US20220273566A1 (en) | Nanomaterials containing constrained lipids and uses thereof | |
| Liu et al. | KRAS-enhanced macropinocytosis and reduced FcRn-mediated recycling sensitize pancreatic cancer to albumin-conjugated drugs | |
| Yin et al. | Smart nanoparticles with a detachable outer shell for maximized synergistic antitumor efficacy of therapeutics with varying physicochemical properties | |
| Huang et al. | Intercalation-driven formation of siRNA nanogels for cancer therapy | |
| Yuan et al. | Dendrimer-triglycine-EGF nanoparticles for tumor imaging and targeted nucleic acid and drug delivery | |
| Sparks et al. | Versatile cationic lipids for siRNA delivery | |
| WO2014201276A1 (en) | Polycation-functionalized nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing agents | |
| CA3101446A1 (en) | Composition and methods of controllable co-coupling polypeptide nanoparticle delivery system for nucleic acid therapeutics | |
| CN109069527B (zh) | 纳米颗粒、控释剂型和用于递送免疫治疗剂的方法 | |
| Massaad-Massade et al. | New formulation for the delivery of oligonucleotides using “Clickable” siRNA-polyisoprenoid-conjugated nanoparticles: application to cancers harboring fusion oncogenes | |
| Zhang et al. | Hollow carbon nanospheres as a versatile platform for co-delivery of siRNA and chemotherapeutics | |
| Shen et al. | Co-delivery of siRNA and paclitaxel into cancer cells by hyaluronic acid modified redox-sensitive disulfide-crosslinked PLGA–PEI nanoparticles | |
| Qu et al. | Drug-drug conjugates self-assembled nanomedicines triggered photo−/immuno-therapy for synergistic cancer treatments | |
| Ye et al. | Cellular uptake mechanism and comparative in vitro cytotoxicity studies of monomeric LMWP-siRNA conjugate | |
| Xiang et al. | Design of red-emitting 1D zinc coordination polymer for targeted drug delivery to nucleus | |
| Talamantez-Lyburn et al. | Gold nanoparticles loaded with cullin-5 DNA increase sensitivity to 17-AAG in cullin-5 deficient breast cancer cells | |
| CZ308447B6 (cs) | Transportéry nukleotidových struktur na bázi hydrazonů jako terapeutický nástroj pro cílení léku pro nádorovou imunoterapii | |
| Zhang et al. | Reactive oxygen species (ROS)-response nanomedicine through knocking down a novel therapeutic target NEDD8-conjugating enzyme UBC12 (UBE2M) in the treatment of liver cancer | |
| Li et al. | Development and in vitro evaluation of carmustine delivery platform: a hypoxia-sensitive anti-drug resistant nanomicelle with BBB penetrating ability | |
| Yang et al. | A Fluorescent Self-Reporting Vector with GSH Reduction Responsiveness for Nucleic Acid Delivery | |
| EP2547367A1 (en) | System for improved delivery of gene modulating compounds | |
| Wang et al. | Biomimetic polymer-templated copper nanoparticles stabilize a Temozolomide Intermediate for Chemotherapy against Glioblastoma Multiforme | |
| KR20210138350A (ko) | 암 세포 표면 단백질 결합 펩타이드가 컨쥬게이트된 항-miRNA 전달체 및 이의 용도 | |
| Li et al. | Alkylated Sulfonium Modification of Low Molecular Weight Polyethylenimine to Form Lipopolymers as Gene Vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20210704 |