CZ306254B6

CZ306254B6 - Transportér nukleotidových struktur

Info

Publication number: CZ306254B6
Application number: CZ2015-585A
Authority: CZ
Inventors: Vladimír Král; Reddy Chinnappareddy Bhupendra; Milla Vasina; Erkki Kolehmainen; Elina Sievänen
Original assignee: University of Jyväskylä, Department of Chemistry; Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority date: 2015-08-30
Filing date: 2015-08-30
Publication date: 2016-11-02
Also published as: CZ2015585A3

Abstract

Transportér nukleotidových struktur sestavený z guanidinem substituovaných žlučových kyselin použitelný především jako nosič či transportní systém řetězců či fragmentů RNA a DNA přes syntetické či biologické membrány.

Description

Transporter nukleotidových struktur

Oblast techniky

Vynález představuje jednoduchou syntézu guanidinových substituovaných žlučových kyselin. Syntetizovány byly sloučeniny guanidinových derivátů kyseliny cholové, chenodeoxycholové, deoxycholové a lithocholové. Vytvořené guanidinové deriváty se ukázaly být vysoce efektivními transportéry jak RNA, tak DNA do buněk, jak bylo prokázáno in vitro experimenty pomocí PAMPA (paralelní analýza perbeability umělou membránou).

Dosavadní techniky

RNA interference (RNAi) je nově vznikající technologie, která revolučně mění řadu strategických přístupů k biochemické analýze, vývoji nových léčiv a v terapii (Leung KM, Whittaker PA (2005) RNA interference: From gene silencing to genespecific Therapeutics. Pharmacol Ther 107:222-239: Lares MR, Rossi JJ, Ouellet DL (2010) RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications. Trends Biotechnol 28:570-579: Pecot CV, Calin GA, Coleman RL, Lopez-Berestein G, Sood AK (2011) RNA interference in the clinic: Challenges and future directions. Nat Rev Cancer 11:59-67: Castanotto D, Rossi JJ (2009) The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nature 457:426-433: Davidson BL, McCray PB (2011) Current prospects for RNA interference-based therapies. Nat Rev Genet 12:329-340: Aagaard L, Rossi JJ (2007) RNAi therapeutics: Principles, prospects, and challenges. Adv Drug Deliv Rev 59:75-86). RNAi je mechanismus umožňující endogenní tlumení genů na základě selektivního rozpoznání sekvencí, který je znám z řady organismů. (Hannon GJ. RNA interference. Nature 2002; 418:244-51: Sharp PA. RNA interference—200LGenes Dev 2001; 15:485-90: Zámoře PD. RNA interference: Listening to the sound of silence. Nat Struct Biol 2001; 8:74650.) V rámci RNAi dráhy, malé interferující RNA (siRNA) indukují posttranskripční, sekvenčně specifické tlumení aktivity genu s využitím endogenního intracelulárního mechanismu, který by selektivně potlačoval genovou expresi, a tím snížil syntézu cílového proteinu (Elbashir SM, et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-498). Výsledný efekt je ekvivalentní inhibicí proteinu bez použití nízkomolekulámích inhibitorů. Specifičnost RNAi také umožňuje syntetizovat inhibitory proti původně neléčitelným onemocněním. Všudypřítomnost RNAi drah uvnitř těla a snadnost s jakou siRNA mohou být použity k potlačení konkrétních genů učinily z siRNA slibnou třídu molekul pro léčbu rakoviny, virových infekcí, očních a genetických chorob. I když se tyto molekuly jeví jako silný nástroj pro ovlivnění toho, zda se příslušný tělu škodlivý gen bude projevovat či nikoli, mají značná omezení pro reálnou aplikaci. Neexistují uspokojivé mechanismy dopravy siRNA do buněk, mají vedlejší účinky v důsledku tlumení genů, narušují fyziologické funkce buněčného systému zapojeného do umlčení genu a indukují vrozenou imunitní odpověd. (E.Miele, G. P. Spinelli, E. D. Fabrizio, E. Ferretti, S. Tomao, and A. Gulino, (2012) “Nanoparticle-based delivery of small interfering RNA: challenges for cancer therapy,” International Journal of Nanomedicine, vol. 7, pp. 3637-3657). Pro aktivní distribuci léku, jeho vložení do nosiče a cílení léku v nosiči je třeba vyvinout spolehlivé transportní systémy. V poslední době se zvyšuje potřeba nových menších transportních systémů, které splňují požadovaný specifický design (R. K. Upadhyay(2014) “Drug Delivery Systems, CNS Protection, and the Blood Brain Barrier“,Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International, vol.,. Art. ID 869269, pp.37).

Schopnost léčiva nebo sondy překročit biologické bariéry byla historicky považována za funkci jeho fyzikálních vlastností. Tento pohled z velké části omezuje návrh struktur a typů léčiv na výběr aktivních látek v úzkém rozmezí. Molekulární transportní systémy nabízejí strategii, jak tato omezení obejít.

V případě guanidiniových transportérů (GRTs), typicky ve vodě vysoce rozpustných konjugátů, bylo zjištěno, že snadno prochází nepolární membránou buňky a některé i tkáňovými bariérami. Látky, které vykazují špatnou biologickou dostupnost jsou metabolizovány atp. Právě proto jsou právě hledány vhodné transportní systémy, které by tyto účinné látky donesly skrz buněčné membrány. Pro mnoho aplikací, se připravuje pro-léčivo, kdy konjugátem je transportér-léčivo s linkerem, který je chemicky nebo biochemicky odštěpen po průchodu přes překážku, což umožňuje uvolňování volného léčiva v cílových buňkách nebo tkáních. Guanidiniové skupiny jsou vhodné pro vazbu na buněčné povrchy s centry záporně nabitých funkčních skupin. Vytvořené komplexy by umožnily uvolnění léčiva po vstupu do vnitřního buněčného prostoru.

Guanidiniové transportéry disponují více mechanismy prostupu do buněk, např. endocytózou. Také byly provedeny experimenty studující uvolňování léčiva endosomální inhibicí (Wender, P. A.; Galliher, W. C.; Goun, E. A.; Jones, L. R.; Pillow, T. H. (2008)The design of guanidiniumrich transporters and their internalization mechanisms. Adv. Drug Delivery Rev., 60, 452—472).

Pro tkáňové selektivní vazby je schopnost GRTs vstoupit do tkáně kritickým parametrem. Podobné studie ukázaly, že pro zlepšení vstupu GRTs do tkáně tenkého nebo tlustého střeva myší, byly injekčně podány roztoky biotinylovaného oligoargininu ( L.R. Wright, J.B. Rothbard, P.A. Wender, (2003) Guanidinium rich peptide transporters and drug delivery, Curr. Protein Pept. Sci. 4 105-124). GRTs ukázaly, že pronikají do mnoha typů tkání, otázkou však je, s jakou selektivitou. Jedna strategie pro dosažení selektivity je použití lokální distribuce. To má potenciálně široké uplatnění podávání léku do plic, do očí nebo do kůže. GRTs vykazují vychytávání v plicních tkáních při vdechnutí a při průniku do epidermálních a dermálních vrstev při topické aplikaci. Kromě místního podání, může být použit i cílený transportní systém. Tento přístup byl demonstrován na strategii s pro-léčivem, ve kterém je přechodně transportéru vypnuta intramolekulámí interakce s polykarboxylátem připojeným k transportéru prostřednictvím peptidu. Peptid je vybrán jako substrát pro extracelulámí proteázy, který je lokalizován v cílové tkáni.

Tyto guanidinem bohaté molekulární transportní systémy mohou zlepšit prostupnost různých látek přes biologické bariéry, kterými jsou například buněčné membrány. ( Wender PA, Cooley CB, Geihe EG (2012) Beyond cell penetrating peptides: Designed molecular transporters. Drug Discov Today Technol 9:e49-e55: Wender PA, Galliher WC, Goun EA, Jones LR, Pillow TH (2008) The design of guanidinium- rich transporters and their internalization mechanisms. Adv Drug Delivery Rev 60:452-472).

Byly hledány účinné transportéry pro RNA a DNA. Nejdříve byly testovány guanidiniové transportéry, u kterých se funkčnost transportu do buněk očekávala. Z polyaniontu DNA a RNA byla tvorbou komplexu s molekulami guanidinu vytvořena elektroneutrální molekula, která však přes buněčnou membránu neprocházela. Transport RNA fragmentu do buněk je velmi neefektivní díky náboji a hydrofilicitě. Samotná nábojová neutralizace např. kationty typu kvartérní amoniové soli nestačí tento trend zvrátit. Proto bylo nutné hledat jiné systémy, které by byly schopné sloužit jako nosiče DNA a RNA molekul přes buněčné membrány.

Podstata vynálezu

Našli jsme struktury, které jsou schopné s nukleotidovými řetězci, tedy ribonukleovými a deoxyribonukleovými kyselinami tvořit stabilní komplex, který po průchodu přes membránu dovnitřního prostoru buněk molekuly RNA či DNA nebo jejich fragmenty opět uvolní. Tyto struktury sestávají z guanidinových derivátů žlučových kyselin. Tento komplex má lipofilní povahu, snadno prochází přes lipidovou dvoj vrstvu buněčných membrán a jeho guanidinový zbytek se váže na fosfodiesterovou vazbu DNA a RNA, proto nezáleží na tom jaké je řetezec délky, ani které dusíkaté báze obsahuje.

Zjistili jsme, že sloučenina, která efektivně vytváří komplex fosfodiester - gaunidin v kombinaci s lipofilním substituentem, nejlépe steroidem, představuje díky této unikátní kombinaci velmi efektivní a laditelný systém transportu RNA a DNA do buněk.

Tyto transportéry velice účinně přenášejí RNA a DNA přes buněčné membrány. Nově jsme syntetizovali guanidinem substituovanou kyselinu cholovou, chenodeoxycholovou, deoxycholovou a lithocholovou a připravili tak velmi efektivní transporter pro RNA a DNA molekuly. Jejich vlastnosti jsme testovali na syntetických buněčných membránách. Byly stanoveny koncentrace RNA a DNA, které jsou transportéry schopné přes membránu dopravit. Také byly stanoveny 10 konstanty stability kvantifikující sílu vazby molekuly v komplexu a jejich vyvázání po průchodu membránou.

Mechanismus transportu probíhá tak, že transporter je k molekule DNA či RNA vázán přes guanidinový zbytek na fosfodiesterovou vazbu a steroidní část struktury transportéru dále interaguje 15 šroubovici DNA či RNA. Takto molekuly transportéru v podstatě obalí molekulu RNA či DNA a díky lipofílitě a biologickému charakteru steroidních struktur tento komplex snadno prochází membránou, tudíž ani nezávisí na její velikosti. Je tedy možný transport jak fragmentů RNA či DNA, tak celých molekul.

Také bylo zjištěno, že velmi záleží na molámím poměru mezi transportérem a transportovanou RNA či DNA. Rostoucí desetinásobný a vyšší přebytek transportéru nemá pozitivní vliv na účinnost trasportu do buněk, naopak má negativní dopad na transportovatelnost vzniklého komplexu.

Naše nově navržené sloučeniny mají obecný vzorec:

R₄= H, CH₃, NH(CH2)2NH2,NH(CH₂)2N=C(NH2)2

R₂= H, OH, NH₂, N=C(NH₂)₂

Struktura obsahuje skupinu Rl, která je připojena ke kyslíku karboxylu. Skupina R2 je napojena v poloze C-3, C-7 a C-12. Struktura je tvořena sedmnácti uhlíkovými atomy spojenými čtyřmi 30 kruhy. Tři kruhy se skládají z šesti atomů uhlíku a jeden je z pěti uhlíkatého kruhu.

Kde skupina R, je H, CH₃, NH(CH₂)₂NH₂ a NH(CH₂)₂N=C(NH₂)₂ a skupina R₂ je H, OH, NH₂ a N=C(NH₂)₂. Studovali jsme dopravu RNA a DNA pomocí PAMPA testu s guanidinem substituovanými žlučovými kyselinami, RNA a DNA od krmných kvasnic a fosfátem pufrovaného fyzio35 logického roztoku (PBS). Dosáhli jsme velmi dobrých výsledků pro naše sloučeniny, které působí jako dobré transportéry.

Objasnění výkresů

Obr. 1: Výsledky PAMPA testu pro transport RNA dle příkladu 7

Obr. 2: Graf zobrazující efektivnost transportu RNA jednotlivých transportérů; SG-1, 2, 4, 5 a 6, číselné označení je označení příkladu, dle kterého byly připraveny

- 3 CZ 306254 B6

Obr. 3: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA jednotlivých transportérů při koncentraci 1 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.

Obr. 4: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA jednotlivých transportérů při koncentraci 10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.

Obr. 5: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA transportéru dle příkladu 6 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.

Obr. 6: Graf zobrazující efektivitu transportu RNA transportéru dle příkladu 4 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 RNA.

Obr. 7: Výsledky PAMPA testu pro transport DNA dle příkladu 8.

Obr. 8: Graf zobrazující efektivnost transportu DNA jednotlivých transportérů; SG-1, 2, 4, 5 a 6, číselné označení je označení příkladu, dle kterého byly připraveny.

Obr. 9: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA jednotlivých transportérů při koncentraci 1 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.

Obr. 10: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA jednotlivých transportérů při koncentraci 10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.

Obr. 11: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA transportéru dle příkladu 6 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.

Obr. 12: Graf zobrazující efektivitu transportu DNA transportéru dle příkladu 4 při koncentraci 0,1/1/10 mmol/1 transportéru vůči 0,05 mmol/1 DNA.

Obr. 13: Graf závislosti absorbance na vlnové délce při rozdílných koncentracích RNA a transportéru pro stanovení konstanty stability transportéru dle příkladu 6.

Obr. 14: Graf závislosti absorbance na vlnové délce při rozdílných koncentracích RNA a transportéru pro stanovení konstanty stability transportéru dle příkladu 4.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1 prekurzor

0,3 g (0,77 mmol) 3-amino methyl lithocholátu bylo zpracováno ve 30 ml dichlormethanu (dále DCM) při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,23 g (0,85 mmol), 1,0 ekvivalentu N, Ν'-di (řerc-butoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,21 g (0,77 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,33 ml (2 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 2 hodiny při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml ethylacetátu (dále EtOAc) a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 95:5.

Byl získán methyl lithocholát substituovaný na C-3 Boc-chráněným guanidinem ve formě bíle látky o výtěžku 83 % a strukturním vzorci,

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: NMR (CDCfi, 500 MHz): 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (d, 7=10,5 Hz, 3H, CH3-21), 0,99 (s, 3H, CH3-19), l,50(s, 18H, Boc), 3,66 (s, 3H), 4,54 (s, 1H, CH-3); 8,9 (s, 1H, BocNH), 11,48 (s, 1H, BocNH). ¹³C NMR (126 MHz; CDCfi) : 12,04, 18,27, 21,06, 24,16, 24,96, 26,22, 26,76, 28,08, 28,09, 28,32, 30,67, 31,04, 31,24, 35,05, 35,35, 35,68, 37,86, 39,90, 40,10, 42,75, 51,43, 55,93, 56,43, 153,28, 157,07, 174,73. LCMS, (m/z): 633 [M+l]+ derivát

0,3 g (0,47 mmol) Boc-chráněný guanidinu substituovaný na C-3 methyl lithocholátu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak směs byla neutralizována přebytkem roztoku amoniaku a extrahována chloroformem. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán methyl lithocholát substituovaný na C-3 guanidinem ve formě bíle látky o výtěžku 67 % a strukturním vzorci,

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (CDCfi, 500 MHz): 0,69 (s, 3H, CH3-18), 0,92 (d, 7=5,0 Hz, 3H, CH3-21), 1,02 (s, 3H, CH3-19), 3,65 (s, 3H), 3,83 (s, 1H, CH-3). ^I3C NMR (126 MHz; MeOD): 12,44, 18,71,22,12,24,32,25,20,25,75,27,26,27,72, 29,19, 31,56, 31,85, 32,20, 36,06, 36,68, 37,01, 38,56, 41,14, 41,41, 43,90, 48,99, 49,62, 52,00, 57,41, 57,79, 157,77, 176,43. HRMS calcd. for C₂₆H₄₅N,O₂: 431,3512. Found: 432,3586 (M+H)

Příklad 2 prekurzor

0,3 g (0,74 mmol) 3-amino methyl deoxycholátu bylo zpracováno ve 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,22 g (0,81 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N'-di (terc-butoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,2 g (0,74 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,32 ml (2,3 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 3,5 hodiny při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 95:5. Byl získán methyl deoxycholát substituovaný na C-3 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 80 % o strukturním vzorci,

BocHN NHBoc který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (CDC1₃, 500 MHz): 0,68 (s, 3H, CH3-18), 0,97 (m, 6H, CH3-19, CH3-21), 1,50 (s, 18H, Boc), 3,66 (s, 3H), 3,98 (s,lH, C12), 4,49 (br s, 1H, CH-3); 8,9 (s, 1H, BocNH), 11,48 (s, 1H, BocNH), ^l3C NMR (126 MHz; CDCE) : 12,74, 17,34, 23,59, 23,86, 24,88, 25,91, 26,67, 27,40, 28,08, 28,29, 28,97, 30,62, 30,91, 31,06, 33,12, 34,60, 35,88, 37,85, 46,51, 47,36, 48,24, 51,47, 73,13, 152,63, 156,96, 174,67.LCMS, (m/z):649 [M+l]+ derivát

0,3 g (0,46 mmol) Boc-chráněného guanidinu substituovaného na C-3 methyl deoxycholátu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak směs byla neutralizována roztokem amoniaku a extrahována chloroformem. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na₂SO₄ a /koncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán methyl deoxycholát substituovaný na C-3 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 70 % o strukturním vzorci,

H₂N nh₂ který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (MeOD, 500 MHz): 0,74 (s, 3H, CH3-18), 1,01 (s, 3H, CH3-19), 1,02 (d, J=5,0 Hz, 3H, CH3-21), 3,67 (s, 3H), 3,84 (s,lH, C-12), 3,99 (br s, 1H, CH-3). ^I3C NMR (126 MHz; MeOD): 11,73, 16,12, 22,62, 23,39, 24,19, 25,67, 26,31, 27,22, 28,59, 30,09, 30,16, 30,46, 30,79, 32,72, 34,25, 35,31, 35,76, 37,21, 46,20, 46,51, 46,68, 47,50, 50,58, 72,58, 156,36, 175,07. HRMS calcd. for C₂₆H₄₅N₃O₃: 447,3461. Found: 448,3528 (M+H)

-6CZ 306254 B6

Příklad 3 prekurzor

0,3 g (0,71 mmol) 3-amino methyl cholátu bylo zpracováno ve 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloride rtuťnatého, což odpovídalo 0,21 g (0,78 mmol), 1,0 ekvivalentu N, Ν'-di (tercbutoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,197 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,3 ml (2,2 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 5 hodin při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a fdtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán methyl cholát substituovaný na C-3 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 76 % o strukturním vzorci,

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: ^]H NMR (CDC13, 500 MHz): 0,70 (s, 3H, CH3-18), 0,99 (m, 6H, CH3-19, CH3-21), 1,49 (d, J=4Hz, 18H, Boc), 3,66 (s, 3H), 3,86 (s, 1H, C-12), 3,98 (br s,lH, C-7), 4,41 (br s, 1H, CH-3); 8,89(s, 1H, BocNH), 11,48 (s, 1H, BocNH),¹³C NMR (126 MHz; CDC13) : 13,09, 17,83, 23,62, 23,70, 25,23, 26,62, 27,84, 28,50, 28,71, 29,09, 31,27, 31,43, 33,97, 34,62, 35,49, 37,66, 39,87, 42,31, 46,80, 47,42, 51,68, 68,33, 72,91, 152,65, 157,74, 173,87. LCMS, (m/z): 665 [M+l]+ derivát

0,3 g (0,45 mmol) Boc-chráněného guanidinu substituovaného na C-3 methyl cholátu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán methyl cholát substituovaný na C-3 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 65 % o strukturním vzorci,

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance:'H NMR (MeOD, 500 MHz): 0,69 (s, 3H, CH3-18), 0,96 (s, 3H, CH3-19), 0,97-0,98 (d, /=5,0 Hz, 3H, CH3-21), 3,66 (s, 3H), 3,86 (s,

1H, C-12), 3,98 (bs,lH, C-7), 4,41 (brs, 1H, CH-3). ^I3CNMR(126 MHz; MeOD): 11,73, 16,12, 22,62, 23,39, 24,19, 25,67, 26,31, 27,22, 28,59, 30,09, 30,16, 30,46, 30,79, 32,72, 34,25, 35,31, 35,76, 37,21, 46,20, 46,51, 47,50, 50,58, 68,32, 72,58, 156,36, 175,07.

Příklad 4 prekurzor

0,3 g (0,72 mmol) 26-amino lithocholyl ethyl amidu bylo zpracováno v 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,21 g (0,79 mmol), 1,0 ekvivalentu N, Ν'-di (/erobutoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,198 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,31 ml (2,2 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 4 hodiny při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán ethylamid lithocholát substituovaný na C-26 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 82 % o strukturním vzorci,

BocHN

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: 'H NMR (500 MHz; CDCfi): 0,62 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (br s, 6H, CH3-19, CH3-21), 1,50 (s, 18H,Boc), 3,42 (m, 2H, NH2CH2), 3,61 (m, 3H, NHCH2, CH-3), 7,29 (s, 1H, CH2-NH), 8,76 (s, 1H, Boc-NH), 11,43 (s, 1H, BocNH). ¹³C NMR (126 MHz; CDC1₃): 12,04, 18,40, 20,83, 23,38, 24,22, 26,43, 27,21, 28,03, 28,25, 30,56, 31,71, 33,56, 34,59, 35,36, 35,56, 35,87, 36,49, 40,19, 40,44, 40,88, 42,12, 42,74, 56,14, 56,16, 71,86, 84,21, 152,88, 157,06, 174,03. calcd. for C₃7H₆₄N₄O₆Na⁺: 683,47181. Found: 683,4717 (M+Na) derivát

0,3 g (0,45 mmol) Boc-chráněného guanidinu substituovaného na C-3 lithocholyl ethylamidu se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán lithocholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 65 % o strukturním vzorci,

-8CZ 306254 B6

N NH₂ který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: δΗ (500 MHz; CDCI₃): 0,7l(s, 3H,

CH3-18), 0,96 (br s, 3H, CH3-19), 1,02 (d, J=5,0, 3H, CH3-21), 3,1 (t, 2H, NH2CH2), 3,2 (t, 2H, NHCH2), 4,45 (m, CH-3). ^I3C NMR (126 MHz; MeOD): 11,06, 17,44, 20,53, 22,51, 23,85, 26,24, 26,94, 27,88, 28,65, 29,77, 31,87, 32,66, 34,26, 35,06, 35,46, 35,83, 35,95, 38,55, 40,12, 40,48, 42,12, 42,51, 56,01, 56,53, 70,99, 175,30, 175,79. LCMS, (m/z): 462 [M+H]⁺

Příklad 5

0,3 g (0,69 mmol) 26-amino deoxycholyl ethylamidu bylo zpracováno v 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloridu rtuťnatého, což odpovídalo 0,206 g (0,76 mmol), 1,0 ekvivalentu N, Ν'-di (terc-butoxykarbonyl) thiomočoviny, což odpovídalo 0,191 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,32 ml (2,1 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 6 hodin při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na₂SO4 a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán deoxycholyl ethylamid substituovaný na C-26 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 78 % o strukturním vzorci, který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance:'H NMR (500 MHz; CDC1₃): 0,66 (s, 3H, CH3-18), 0,90 (s, 3H, CH3-19), 0,98 (d, J=6.0 3H, CH3-21), 1,50 (s, 18H,Boc) 3,42 (m, 2H, NH2CH2), 3,63 (m, 3H, NHCH2, CH-12), 3,95-3,97 (m, 1H, C-3 ), 7,41 (s, 1H, CH2-NH), 8,84 (s, 1H, Boc-NH), 11,42 (s, 1H, Boc-NH). ^I3C NMR (126 MHz; CDC1₃): 12,73, 17,45, 23,12, 23,65, 26,12, 27,12, 27,48, 28,00, 28,21, 28,55, 30,46, 31,571, 33,45, 33,62, 34,12, 35,26, 36,02, 36,42, 40,71, 42,08, 46,52, 47,33, 48,21, 71,79, 73,15, 84,16, 152,75, 156,96, 174,12.calcd. for C₃₇H64N₄O7: 677,48478. Found: 677,4860 (M+H) derivát

0,3 g (0,45 mmol) deoxycholyl ethylamidu substituovaného na C-26 Boc-chráněném guanidinem se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán

-9CZ 306254 B6 deoxycholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 63 % o strukturním vzorci,

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: δΗ (500 MHz; CDCI₃) ): 0,71 (s, 3H, CH3-18), 0,96 (s, 3H, CH3-19), 0,98 (d, .7=5,0 3H, CH3-21), 3,02 (m, 4H, NH2CH2), 3,56 (m, 1H, C-12); 4,97 (m, 1H, C-3 ). ^I3C NMR (126 MHz; MeOD): 11,06, 17,43, 20,52, 22,22, 23,83, 25,72, 26,06, 27,88, 29,77, 31,35, 31,72, 32,53, 34,26, 35,05, 35,83, 37,99, 39,97, 40,48, 41,80, 42,11, 42,49, 56,301, 56,53, 70,98, 79,34, 157,51, 176,41. LCMS, (m/z): 478 [M+H]⁺

Příklad 6

0,3 g (0,66 mmol) 26-amino cholyl ethyl amidu bylo zpracováno v 30 ml DCM při 0 °C s 1,1 ekvivalentem chloride rtuťnatého, což odpovídalo 0,198 g (0,73 mmol), 1,0 ekvivalentu N, N'-di (Zerc-butoxykarbonyl) thiomoěoviny, což odpovídalo 0,184 g (0,71 mmol) a 3,1 ekvivalentu triethylaminu, což odpovídalo 0,3 ml (2,0 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě 0 °C po dobu 1 h a 8 hodin při teplotě místnosti. Následně se reakční směs zředila 10 ml EtOAc a filtrovala se přes vrstvu celitu, aby se odstranil vytvořený sulfid rtuťnatý. Filtrační koláč byl promyt 5 ml EtOAc. Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a potom roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml), následně byla sušena bezvodým Na₂SO₄ a zkoncentrována za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsi DCM:MeOH v poměru 90:10. Byl získán cholyl ethylamid substituovaný na C-26 Boc-chráněným guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 77 % o strukturním vzorci,

BocHN

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: ^]H NMR (500 MHz; CDC13): 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,87 (s, 3H, CH3-19), 0,98 (d, .7=5.0 3H, CH3-21), 1,50 (s, 18H,Boc) 3,38 (m, 3H, NH2CH2, CH-12), 3,53 (m, 2H, NHCH2), 3,82 (br s, 1H, C-7), 3,95 (m, 1H, C-3 ), 7,48 (s, 1H, CH2-NH), 8,59 (s, 1H, Boc-NH), 11,42 (s, 1H, Boc-NH). ^I3C NMR (126 MHz; CDC13): 12,88, 17,78, 22,05, 23,65, 26,12, 27,12, 27,48, 28,00, 28,21, 28,85, 30,46, 29,14, 29,81, 33,22, 34,72, 35,77, 40,19.02, 41,16, 41,63, 46,38, 46,52, 47,33, 48,21, 68,41, 71,79, 73,03, 79,45, 83,46, 152,98, 157,24, 174,43.calcd. for C₂₆H₄₅N₃O₃: 447,3461. Found: 448,3528 (M+H) derivát

0,3 g (0,45 mmol) cholyl ethylamidu substituovaného na C-26 Boc-chráněném guanidinem se nechal reagovat s 15 ml 50% roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu za intenzivního míchání po dobu 3 hodin. Pak byl neutralizován roztokem amoniaku a extrahován chloroformem.

- 10CZ 306254 B6

Organická fáze byla promyta nejprve vodou (2 x 30 ml) a následně roztokem chloridu sodného (1 x 30 ml). Vzniklý produkt byl sušen bezvodým Na2SO4 a zkoncentrován za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil pomocí silikagelu elucí směsí DCM:MeOH v poměru 85:15. Byl získán cholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem ve formě bílé látky o výtěžku 60 % o strukturním vzorci,

který byl potvrzen pomocí nukleární magnetické rezonance: δΗ (500 MHz; CDCft): 0,64 (s, 3H, CH3-18), 0,85 (s, 3H, CH3-19), 0,91 (d, >6.5 3H, CH3-21), 3,33 (m, 3H, NH2CH2, CH-12), 3,53 (m, 2H, NHCH2), 3,82 (br s, 1H, C-7), 4,97 (m, 1H, C-3). ¹³C NMR (126 MHz; MeOD): 12,58, 18,07, 23,09, 24,22, 26,35, 26,89, 27,59, 28,22, 31,35, 31,00, 32,54, 32,86, 33,67, 34,94, 35,59, 35,80, 39,39, 42,08, 42,84, 43,32, 46,39, 50,87, 72,14, 80,12, 82,82, 158,93, 177,47. LCMS, (m/z): 494 [M+H]⁺

Příklad 7

Test účinnosti transportéru lithocholyl ethylamid substituovaný na C-26 guanidinem, připraveného dle příkladu 4 pro RNA

V této studii byla použita PAMPA metoda (= parallel artificial membrane permeability assay). Tato in vitro metoda určuje propustnost látek prostřednictvím fosfolipidové vrstvy. Skládá se z několika jamek, které tvoří donorové a akceptorové mikrotitrační desky. Celá sestava se běžně označuje jako sendvič. Na začátku testuje látka přidána do donorové části. Do níž se vloží akceptorová destička s fosfolipidovou membránou na dně. Během inkubace dochází k transportu RNA pomocí transportérů RNA do akceptorové části. Po ukončení inkubace je proměřena koncentrace RNA v akceptorové i donorové destičce. Čímž se kvantifikuje množství transportované RNA.

Sendvičová struktura byla tvořena 96-jamkovou mikrotitrační destičkou a 96-jamkovou filtrační destičkou (IPVH, 125 pm tlustý filtr 0,45 pm pórů). Zásobní roztoky nosiče vzorků byly připraveny při 50 °C, následně byly smíchány s methanolem a uloženy při teplotě 0 °C. Nejprve byl zásobní roztok zředěn pufrem, aby se dosáhlo konečné koncentrace vzorků 10 až 50 pM a snížení koncentrace methanolu pod 5 % (objem / objem) a poté byl roztok pipetován do jamek.

Donorová destička byla naplněna 300 pl zředěného nosiče o třech koncentracích (Ccarrier = 0,1/1/10 mmol/1) + RNA (RNA, C = 0,05 mmol/1). Přičemž koncentrace RNA byla vztažena na monomemí jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 pl roztoku pufru. Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části. Takto propojené destičky fodofolipidovou membránou byly inkubovány při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 5 h bez míchání. Po uplynutí doby se sendvičové desky oddělily. Množství koncentrací RNA v jamkách donorových a akceptorových destiček byly měřeny na základě porovnání experimentálního spektra s UV spektrem (220 až 400 nm) získaným z referenčních standardů.

- 11 CZ 306254 B6

Příklad 8

Test účinnosti transportéru cholyl ethylamidu substituovaný na C-26 guanidinem, připraveného dle příkladu 6 pro DNA

Donorová destička byla naplněna 300 pl zředěného nosiče o třech koncentracích (Ccarrier = 0,1/1/10 mmol/l) + DNA (DNA, C = 0,05 mmol/l). Přičemž koncentrace DNA byla vztažena na monomemí jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 pl roztoku pufru. Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části. Takto propojené destičky fodofolipidovou membránou byly inkubovány při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 5,5 hodiny bez míchání. Poté se sendvičové desky oddělily. Množství DNA v jamkách donorových a akceptorových destiček bylo měřeno pomocí UV (220 až 400 nm) spektrofotometrie, koncentrace byla odečítána z naměřené absorbance.

Příklad 9

Test účinnosti transportéru lithocholyl ethylamidu substituovaného na C-26 guanidinem, připraveného dle příkladu 4 pro siRNA

Sendvičová struktura byla tvořena 96-jamkovou mikrotitrační destičkou a 96-jamkovou filtrační destičkou (IPVH, 125 pm tlustý fdtr 0,45 pm pórů). Zásobní roztoky vzorků nosiče byly připraveny při 50 °C, následně byly smíchány s methanolem a uloženy při teplotě 0 °C. Nejprve byl zásobní roztok zředěn pufrem, aby se dosáhlo konečné koncentrace vzorků 10 až 50 pM a snížení koncentrace methanolu pod 5 % (objem / objem) a poté byl roztok pipetován do jamek.

Donorová destička byla naplněna 300 pl zředěného transportéru o třech koncentracích (Ctransportér = 0,1/1/10 mmol/l) + siRNA (siRNA, C = 0,05 mmol/l). Byla použita siRNA o 21 nukleotidech, přičemž koncentrace siRNA byla vztažena na monomerní jednotku. Akceptorové jamky byly naplněny 200 pl roztoku pufru. Donorová destička byla vložena do akceptorové destičky ve spodní části. Takto propojené destičky fodofolipidovou membránou byly inkubovány při teplotě 25 °C v uzavřené nádobě po dobu 5,5 hodiny bez míchání. Poté se sendvičové desky oddělily. Množství siRNA v jamkách donorových a akceptorových destiček bylo měřeno pomocí UV (220 až 400 nm) spektrofotometrie, koncentrace byla odečítána z naměřené absorbance.

Průmyslová využitelnost

Ve farmaceutickém průmyslu jako nosiče RNA a DNA ajejich fragmentů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Transportér nukleotidových struktur obecného vzorce,

kde R] je ze skupiny H, CH₃, NH(CH₂)₂NH(CH₂)₂N=C(NH₂)₂ a

R₂ je ze skupiny H, OH, NH₂, N=C(NH₂)₂.
2. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
4. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:

- 13 CZ 306254 B6
5. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
6. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
7. Transportér nukleotidových struktur podle nároku 1 o struktuře:
8. Použití transportéru nukleotidů podle nároku 1 jako nosičů řetezců či fragmentů RNA a DNA přes syntetické či biologické membrány.