CZ304250B6 - Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení - Google Patents
Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304250B6 CZ304250B6 CZ2010-647A CZ2010647A CZ304250B6 CZ 304250 B6 CZ304250 B6 CZ 304250B6 CZ 2010647 A CZ2010647 A CZ 2010647A CZ 304250 B6 CZ304250 B6 CZ 304250B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- solution
- size
- preparation
- palladium
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 203
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 82
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 64
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 51
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 22
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 19
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 229910020599 Co 3 O 4 Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 5
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 4
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 claims description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 claims description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- CUXKZYSCZCNPNX-UHFFFAOYSA-N tetradecan-1-amine;hydrobromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[NH3+] CUXKZYSCZCNPNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000428 cobalt oxide Inorganic materials 0.000 claims 6
- IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N cobalt(ii) oxide Chemical compound [Co]=O IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N (fluoren-9-ylideneamino) n-naphthalen-1-ylcarbamate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1=NOC(=O)NC1=CC=CC2=CC=CC=C12 PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000005083 Zinc sulfide Substances 0.000 claims 4
- FQDSYGKTHDFFCM-UHFFFAOYSA-N beryllium sulfide Chemical compound S=[Be] FQDSYGKTHDFFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- CJOBVZJTOIVNNF-UHFFFAOYSA-N cadmium sulfide Chemical compound [Cd]=S CJOBVZJTOIVNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229910052980 cadmium sulfide Inorganic materials 0.000 claims 4
- 229910003446 platinum oxide Inorganic materials 0.000 claims 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims 2
- AQCDIIAORKRFCD-UHFFFAOYSA-N cadmium selenide Chemical compound [Cd]=[Se] AQCDIIAORKRFCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910003445 palladium oxide Inorganic materials 0.000 claims 2
- UKGBSHWRVFPDKV-UHFFFAOYSA-N selanylideneberyllium Chemical compound [Se]=[Be] UKGBSHWRVFPDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N zinc;sulfide Chemical compound [S-2].[Zn+2] DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 claims 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims 1
- 229910001923 silver oxide Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 14
- 238000000445 field-emission scanning electron microscopy Methods 0.000 description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000286 energy filtered transmission electron microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 7
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 5
- 239000010944 silver (metal) Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 238000004098 selected area electron diffraction Methods 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 2
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 2
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 2
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- -1 beryllium sulfides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical group [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- SBIBMFFZSBJNJF-UHFFFAOYSA-N selenium;zinc Chemical compound [Se]=[Zn] SBIBMFFZSBJNJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- IZFHEQBZOYJLPK-SSDOTTSWSA-N (R)-dihydrolipoic acid Chemical group OC(=O)CCCC[C@@H](S)CCS IZFHEQBZOYJLPK-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000366596 Osiris Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOYKPPXKLRXDBR-UHFFFAOYSA-N [O].[Co].[Co] Chemical compound [O].[Co].[Co] HOYKPPXKLRXDBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005285 chemical preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000010415 colloidal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- IZFHEQBZOYJLPK-UHFFFAOYSA-N dihydrolipoic acid Chemical group OC(=O)CCCCC(S)CCS IZFHEQBZOYJLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000724 energy-dispersive X-ray spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005293 physical law Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001350 scanning transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000003346 selenoethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- GGCZERPQGJTIQP-UHFFFAOYSA-N sodium;9,10-dioxoanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)C3=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C3C(=O)C2=C1 GGCZERPQGJTIQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Manufacture Of Metal Powder And Suspensions Thereof (AREA)
Abstract
Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic o různé velikosti, tvaru a/nebo různém prvkovém složení, které lze použít k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách, k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v těchto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, přičemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou během imunocytochemické detekce.
Description
Vynález se týká souboru nanočástic o různé velikosti, tvaru a/nebo různém prvkovém složení, které lze použít k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách (zejména buňkách a tkáních), k imunocytochemické analýzy distribuce antigenů v těchto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, přičemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou během imunocytochemické detekce. Dále toto citlivé značení v biologických strukturách nazýváme vícenásobné ultrastrukturální značení. Vynález se taktéž týká způsobu přípravy vhodného souboru nanočástic a způsobu konjugace protilátek na nanočástice tak, aby byl celý soubor použitelný pro vícenásobné ultrastrukturální značení.
Dosavadní stav techniky
V současné době se pro imunoznačení používají téměř výhradně zlaté nanočástice a standardní transmisní elektronové mikroskopy (TEM). Z důvodů různých technických omezení to umožňuje současné citlivé značení pouze dvou molekul v buňce, což již dnešní molekulární biologii nepostačuje.
Molekulární a buněčná biologie je v současnosti jedním z nejdynamičtěji rozvíjejících se vědních oborů, který zasahuje do poznání podstaty fungování organismů včetně člověka a který má ohromné množství aplikačních výstupů např. do medicíny humánní i veterinární, zemědělství, bio- a nano-technologií. Poté, co došlo k osekvenování řady genomů včetně lidského, je k dispozici obrovský objem genetických dat, teprve se ale orientujeme ve fungování jednotlivých proteinů a pozvolna se vytváří mapy složitých strukturně-regulačních vztahů mezi jednotlivými makromolekulami (zejména proteiny). Právě proto pozorujeme obrovský nárůst požadavků na imunocytochemickou analýzu distribuce antigenů v buňkách či tkáních a popis jejich interakcí. Vývoj nových technologií světelné mikroskopie začal v relativně nedávné době umožňovat studium takových interakcí in sítu. V současné době jsme schopni pomocí fluorescenčních značek a vícekanálových konfokálních mikroskopů identifikovat různé makromolekuly zároveň a sledovat dynamiku reakcí v prostoru i čase. K identifikaci makromolekul se používají protilátky (nejčastěji imunoglobuliny typu IgG), které specificky rozeznávají jednotlivé antigeny (obvykle to jsou právě proteiny). K protilátce je navázána fluorescenční značka, která nám v mikroskopu umožní zjistit lokalizaci proteinu, který zkoumáme, v buňce či tkáni. Kombinace fluorescenčních značek dává možnost identifikovat zároveň více proteinů. Obr. 1 ukazuje na příkladu buněčného jádra fluorescenční lokalizaci tří antigenů najednou.
Tyto techniky ale mají jedno zásadní omezení - fyzikální zákony limitují rozlišení světelných mikroskopů na ~200 nm. Přitom právě makromolekulámí komplexy, které jsou zodpovědné za hlavní buněčné děje, jako je např. čtení genetické informace či její zdvojování před buněčným dělením mají velikost mezi 30 až 100 nm. Nezbytností je tedy zkoumání pomocí elektronové mikroskopie, která se s novými postupy kryoprezervace vzorků, ultrastrukturální tomografie a imunoznačení stala opět nesmírně perspektivní technikou v poznávání funkční mikroarchitektury buněk a tkání - zejména v korelaci s fluorescenční mikroskopií živých buněk (pro přehled viz např. Luic et al., 2005; Giepmans et al., 2006). Klasická transmisní elektronová mikroskopie dnes dosahuje rozlišení kolem 0,1 nm, tedy pro naprostou většinu biologických preparátů lepší, než potřebnou. Pro rozpoznání makromolekul musíme podobně jako v imunofluorescenci použít protilátky, na které bude umístěna vhodná značka. V elektronové transmisní mikroskopii se používají zlaté koloidní částice, které jsou elektrondensní a zobrazují se tedy jako tmavé částice
- 1 CZ 304250 Bó (Roth 1996; Zuber et al., 2005). Obvykle se používá sendvičový způsob značení (Obr. 2), kdy primární protilátka rozeznává konkrétní antigen, který studujeme; sekundární protilátka, nesoucí zlatou partikulí, se pak váže na tuto primární protilátku. Dosud jedinou možností, jak rozlišit více antigenů, je použití směsi sekundárních protilátek, nesoucích zlaté částice o různé velikosti. Komerčně lze pořídit částice o velikostech kolem 5, 10, 15 a 20 nm již s navázanými sekundárními protilátkami - pochopitelně vždy s určitou fluktuací ve velikosti (Obr. 3). Tento způsob vícenásobného značení ale strádá zásadními problémy: při použití partikulí větších než 12 nm se dramaticky snižuje značící schopnost - nejspíše v důsledku vzájemného odpuzování zlatých partikulí při vazbě protilátek na antigeny ležící blízko sebe a kvůli hmotnosti zlatých partikulí. Důsledkem je faktická nemožnost úspěšného provedení citlivého imunoznačení s ultrastrukturálním rozlišením pro více než dva antigeny.
V porovnání se světelnou mikroskopií je tedy současný stav v TEM mikroskopii značně omezující - zejména pokud si uvědomíme, s jakou různorodostí antigenů/proteinů dnes potřebuje molekulární biologie pracovat a zjišťovat jejich vzájemné interakce. Ideální situace spočívá v možnosti provádět citlivé ultrastrukturální imunoznačení s částicemi o velikostech blízkých 10 nm, které by se daly spolehlivě odlišit v elektronovém mikroskopu. V klasické elektronové mikroskopii by bylo ideální používat částice s různým tvarem. Ve speciálních technikách transmisní elektronové mikroskopie (zejména v technikách EFTEm, TEM/EDX, případně i STEM/HAADF, kde zkratka EFTEM označuje TEM mikroskopii s energiovou filtrací elektronů, TEM/EDX označuje TEM mikroskopii s moderním výkonným systémem pro energiově disperzní analýzu paprsků X a STEM/HAADF označuje řádkovací TEM mikroskopii s detektorem elektronů rozptýlených do velkých úhlů) a řádkovací elektronové mikroskopie (zejména FESEM, kde zkratka FESEM označuje SEM mikroskopii s autoemisní tryskou a speciálními detektory zpětně odražených elektronů) je pro identifikaci možno využít různého prvkového složení partikulí. Velkým pokrokem by bylo vyvinout diagnostický systém, umožňující alespoň trojnásobné nebo čtyřnásobné citlivé značení. V posledních letech navrhovatelé z Ústavu molekulární genetiky (ÚMG) vyvíjeli algoritmy, které umožňují popis prostorových interakcí proteinů - zejména klastrování molekul (např. dimerizace molekul, vytváření homokomplexů), kolokalizace (vytváření heterokomplexů, účast různých proteinů v rámci jednoho funkčního komplexu), či mapování proteinů v rámci buňky (Philimonenko et al., 2000; Schófer et al., 2004). Již jednoduchá kombinatorika ukazuje, že dvojnásobné značení molekul A a B umožňuje vjednom preparátu popsat pouze jednu interakci mezi různými molekulami (A-B) a dvě mezi shodnými molekulami (A-A, B-B). Simultánní značení čtyř antigenů by však umožnilo popis šesti interakcí mezi různými molekulami a čtyř interakcí mezi shodnými molekulami. Celkem tedy bychom vjednom preparátu namísto tří interakcí mohli najednou sledovat deset interakcí mezi biomolekulami. Názorným výstupem pak může být např. mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - příklad takového výsledku je uveden na obr. 4, kdy byla simulována identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra. Takovýto výsledek by se již vyrovnal v možnostech kombinace konfokálnímu obrazu z Obr. 1 a přitom by jej nepozorovatelně předčil svým ultrastrukturálním rozlišením.
Dalším typem elektronové mikroskopie, kterou je možné díky značnému rozvoji v posledních letech spojenému se zvýšením její rozlišovací schopnosti použít k imunolokalizaci, je skenovací elektronová mikroskopie (dále SEM). V tomto případě je možné značit antigeny na povrchu biologických vzorků a k detekci značky (markéru) v podobě koloidního zlata využít signálu zpětně odražených elektronů. U skenovacích elektronových mikroskopů s autoemisní tryskou (FESEM) vybavených speciálními detektory zpětně odražených elektronů, k nimž patří např. Autratův YAG detektor, byla prokázána schopnost detekovat kovové částice velikosti jednotek nm (Hermann R. et al., 1991). Další výhodou je citlivost signálu zpětně odražených elektronů na změny v prvkovém složení vzorku. Nanočástice tvořené různými těžkými kovy je možné pomocí tohoto signálu velmi dobře rozlišit (Erlandsen S. et al., 2003).
Metoda imunolokalizace v SEM je založena stejně jako v případě TEM na detekci antigenu pomocí protilátky, která je připojena na značku. A stejně jako v případě TEM se nejčastěji použí-2 CZ 304250 B6 vájako značen částic koloidního zlata. Na rozdíl od TEM, kde se zlaté nanočástice zobrazují jako denzní body, v případě FESEM je kontrast opačný - částice výrazně na povrchu preparátu svítí.
Pro vícenásobné značení lze v současnosti použít maximálně dvou zlatých partikul í s výrazně rozdílnou průměrnou velikostí, aby bylo možné je v FESEM rozlišit.
Způsob přípravy biologických vzorků před vlastním prohlížením v elektronovém mikroskopu velmi ovlivňuje výsledek imunoznačení. Vzhledem k vysokému vakuu v FESEM je nezbytné biologický materiál dokonale zbavit vody. V případě použití skenovacího elektronového mikroskopu vybaveného kryonástavcem lze tento problém vyřešit velmi jednoduše - voda v preparátu se rychle zmrazí během tzv. kryofixace a vlastní pozorování vzorku se děje v mikroskopu při velmi nízkých teplotách okolo -130 °C. Imunoznačení při tomto způsobu přípravy preparátu se provádí na odhaleném povrchu nativního vzorku před vlastním zmrazením, což je velmi výhodné z hlediska zachování schopnosti vázat značenou protilátku ve srovnání s chemickými způsoby přípravy.
Stav techniky je rovněž součástí odborné literatury:
Bratlie KM, Lee H, Komvopoulos K, Yang P, Somorjai GA: Nano Lett. 2007, 7, 3097-3101 Erlandsen S, Chen Y, Frethem C, Detry J, Wells C.: J. Microsc. 2003, 211, 212-218 Feng J, Zeng HC: Chem. Mater. 2003, 15, 2829-2835
Garcia B, Salomé M, Lemelle L, Bridot J-L, Gillet P, Perriat P, Roux S and Tillement O: Chem. Commun., 2005, 369 - 371
Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY: Sciece 2006, 312, 217-224
Lucie V, Forster F, Baumeister W.: Annu Rev Biochem. 2005, 74, 833-865
Philimonenko A. A., Janáček J. and Hozák P.: J. Struct. Biol. 2005, 132, 201-210
Roth J.: Histochem Cell Biol. 1996, 106, 1-8
Schófer Ch., Janáček J., Weipoltshammer K., Pourani J. and Hozák P.: J. Struct. Biol. 2004, 147, 128-135
Turkevich J, Kim G: Science 1970, 169, 873-879
Vlčkova B, Matějka P, Šimonova J, Čermáková K, Pancoska P, Baumruk V: J. Phys. Chem. 1993,97, 9719-9729
Zuber C, Fan J, Guhl B, Roth J.: Ultrastruct Pathol. 2005, 29, 319-330
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je soubor vhodných typů nanočástic pro současné citlivé imunoznačení tří a více antigenů v biologických preparátech; součástí vynálezu je způsob přípravy daného souboru nanočástic, způsob konjugace protilátek na daný soubor nanočástic a způsob použití souboru nanočástic podle tohoto vynálezu k ultrastrukturálnímu značení.
Částice pro imunodetekci musí splňovat několik podmínek: (a) velikost (střední hodnota distribuce velikosti E) ideálně v rozsahu 5 až 12 nm, pro částice lehčích prvků 5 až 20 nm, (b) úzká distribuce velikostí (nízká hodnota směrodatné odchylky distribuce velikostí D), (c) dostatečná stabilita nanočástic v roztoku před konjugací protilátek, (d) chemicky definovaný povrch, neznečištěné stabilizátory, které by znemožňovaly konjugaci protilátek, (e) dostatečný kontrast v TEM a FESEM mikroskopu, (f) dostatečná stabilita v TEM a FESEM mikroskopu, (g) možnost vázat protilátky na povrch nanočástic. Podle dostupných informací i provedených experimentů žádné v současnosti komerčně dostupné kovové nanočástice (s výjimkou Au) nesplňují všechny shora uvedené požadavky (a-g) současně.
-3CZ 304250 B6
Proto byly modifikovány způsoby přípravy nanočástic v roztoku řízenou chemickou redukcí rozpustných solí kovů M, kde M = Ag, Pd, Pt, Co. Všechny přípravy nanočástic jsou založeny na společném reakčním schématu, který lze shrnout následovně:
A: rozpustná B: redoxní činidlo C: roztok nanočástic sůl kovu Mn+ další látky + optimalizované kovu M nebo oxidu MxOy c, V, pH a rychlosti míchání
Konkrétní příklady syntéz s popisem látek A, B, C a reakčních podmínek lze najít níže (Příklady 1 a 2). Základní principy syntéz koloidních částic jsou již popsány (např. Vlčkova et al., 1993; Turkevich et al., 1970; Bratlie et al., 2007; Feng et al., 2003; Lim et al. 2009), ale popsané postupy je nutné podstatně modifikovat pro získání částic požadované kvality.
Modifikace všech postupů spočívala v optimalizaci výchozích koncentrací, objemů, pH a rychlostí míchání tak, aby bylo dosaženo požadované velikosti nanočástic dle bodu (a), co nejužší distribuce velikostí kovových nanočástic dle bodu (b) a přitom aby byly splněny všechny další požadavky dle bodů (c-g). U sférických nanočástic Pd spočívala modifikace postupu zejména v zavedení velmi intenzivního míchání celého roztoku, jinak nebylo možno částice se zvolenou velikostí reprodukovatelně připravovat (nutné ke splnění požadavků a, b). U sférických nanočástic Ag bylo nutné oproti původnímu receptu 5x snížit koncentraci výchozí stříbrné soli, jinak byly distribuce nanočástic příliš široké a syntézy nebyly reprodukovatelně (nutné ke splnění požadavku b). U kubických nanočástic Pd bylo nutné zavést speciální postup čištění nanočástic pomocí dialýzy (splnění požadavků c, d). U kubických nanočástic Pt bylo nezbytné optimalizovat koncentrace (splnění požadavků a, b) a vyvinout postup čištění výsledného koloidu pomocí dialýzy (splnění požadavků c, d). U sférických i kubických nanočástic CO3O4 bylo nutné optimalizovat způsob čištění výsledného koloidu (splnění požadavků c, d). Podrobný popis syntéz všech koloídů lze nalézt v příkladech 1 až 2.
Základní parametry nanočástic lze najít v tabulce 1. Mikrofotografie nanočástic dokumentující jejich stabilitu pod elektronovým paprskem demonstruje obrázek 5. Detailní popis přípravy nanočástic je obsahem příkladů 1 a 2. Detailní popis konjugace nanočástic je obsahem příkladu 3.
Tabulka 1
| Nanočástice | E 1 | D íf | -Stdhilfta | Čistota | Kontrast | Stabilita | ||
| Typ | Značka | Tvai | illlllt | iiiiiit | v ioztoku | povichu | TEM,SEM | TEM,SEM |
| Pd | Pd06s | sférický | 5-8 | <2 | ano | ano | ano | ano |
| Pd | Pd10s | sférický | 8-12 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| Pd | Pd14s | sférický | 12-15 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| Ag | Ag10s | sférický | 8-12 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| Pt | Pt10c | kubický | 8-12 | <3 | ano | dle úpravy | ano | ano |
| C03O4 | Co08s | sférický | 7-10 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| CO3O4 | Co16c | kubický | 15-18 | <3 | ano | ano | ano | ano |
* E = průměrná velikost částic = střed číselné distribuce velikostí; závisí na podm. přípravy C- šířka distribuce velikostí částic = směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí
Shora popsanými postupy byl získán nový soubor nanočástic, které jsou navzájem rozlišitelné v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF a/nebo v FESEM mikroskopu, konjugovatelné s protilátkami a tudíž využitelné pro vícenásobné ultrastrukturální značení.
Novost spočívá zejména ve vzájemné kombinaci nanočástic, která umožňuje jejich využití v ultrastrukturálním značení. Novost dále spočívá i v modifikovaném způsobu přípravy nanočás-4CZ 304250 B6 tic a způsobu konjugace nanočástic s protilátkami. U všech nově připravených nanočástic bylo experimentálně prokázáno, že současně splňují výše uvedené požadavky (a-g). Kromě komerčně dostupných zlatých nanočástic o velikosti ~5 nm (dále Au5s; písmeno s na konci značí, že jde o sférické nanočástice) a zlatých nanočástic ~10 nm (dále Aul Os) tak nyní jsou k dispozici další typy nanočástic vhodné pro imunodetekci, které lze v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF nebo FESEM mikroskopu rozlišit podle velikostí, tvarů a/nebo chemického složení. Jedná se o nanočástice Ag, Pd, Pt a CO3O4 (tabulka 1). Celkem tedy existují dvě velikosti komerčních částic (Au5s, Aul Os), které jsou navzájem rozlišitelné, protože zlaté částice s rozměry vyššími než 12 nm (např. Aul5s) už neposkytují v ultrastrukturální diagnostice dostatečně citlivé značení. Shora zmíněnou dvojicí částic (Au5s, Aul Os) lze rozšířit pomocí připravených nanočástic (Ag, Pd, Pt, Co3O4), které jsou vždy navzájem rozlišitelné podle chemického složení, popřípadě i podle velikosti (stejně jako u nanočástic Au) a/nebo tvaru (v případě, že mají částice kubické, tetraedrické, tyčkovité či jiné, od koule rozlišitelné tvary). Rozšířená řada částic je použitelná pro tří- a vícenásobné značení v ultrastrukturální diagnostice. Přehled jednotlivých nanočástic lze najít v tabulce 1, podrobné popisy syntéz, konjugací s protilátkami a detekce nanočástic v elektronových mikroskopech lze nalézt v příkladech 1-3.
Nově připravené nanočástice obsažené v souboru pro imunoznačení mají tyto parametry:
• Ag = stříbrné nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm o chemické složení: Ag o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: cep o tvar: přibližně sférické, izometrické nanočástice • Pd = paladiové nanočástice s velikostí v rozsahu 5-15 nm o chemické složená: Pd o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: cpp o tvar:
při redukci PdCb citrátem sodným přibližně sférické, izometrické nanočástice s velikostí laditelnou v rozsahu 5 až 15 nm při redukci Na^PdCU] kyselinou askorbovou v přítomnosti polyvinylpyrrolidonu kubické nanočástice o průměrné velikosti v rozsahu 8-12 nm • Pt = platinové nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm o chemické složení: Pt o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: ccp o tvar:
při standardní syntéze přibližně sférické, izometrické nanočástice při přesném dodržení reakčních podmínek částice kubického tvaru • nanočástice oxidů kovů, např. CO3O4 = nanočástice oxidu kovu s velikostí v rozsahu 5 až 20 nm o chemické složení: Co3O4 = oxid kobaltnato-kobaltitý o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: kubická
-5CZ 304250 B6 o tvar:
při syntéze menších částic CO3O4 (<10 nm) převážně sférické tvary při syntéze větších částic CO3O4 (> 10 nm) se postupně vyvíj i kubická morfologie, při větších velikostech (>15 nm) částice převážně kubické
K připravené sadě nanočástic lze s výhodou přidat komerčně dostupné nanočástice typu kvantová tečka (QD neboli Qdot neboli Quantum dot), které mají chemické složení sulfidů nebo selenidů kadmia, zinku či berylia (CdS, CdSe, ZnS, ZnSe, BeS, BeSe) a velikost v rozsahu 5-21 nm.
Všechny připravené částice lze s výhodou modifikovat pomocí dihydrolipoové kyseliny, DHLA, C8H]6O2S2 (Garcia et al., 2005), což může usnadnit navazování proteinů na povrch nanočástic. Nežádoucí příměsí mohou být povrchově aktivní látky, které by zabraňovaly konjugaci proteinů na povrch nanočástic.
Složení alternativ souborů nanočástic ke značení je následující:
Obecně lze celý soubor nanočástic (2 typy komerčních (Au, QD) + 4 typy nových (Ag, Pd, Pt, CO3O4)) charakterizovat následovně:
• Všechny nanočástice lze rozlišit podle chemického složení.
o U nanočástic stejného složení lze rozlišovat ještě podle velikostí; pro každou částici lze v imunoznačení rozlišit dvě velikosti (např. pro komerčně dostupné částice zlata lze pro imunoznačení použít a rozlišit 6nm a 12nm částice) • Nesférické nanočástice (např. Pd, Pt, CO3O4 a QD) lze od sférických nanočástic rozlišit též podle tvaru.
o Pokud je v souboru více částic stejné velikosti a tvaru (např. kubických nanočástic Pd, Pt), lze je samozřejmě dále rozlišovat podle chemického složení.
Konkrétních souborů nanočástic pro více než dvojnásobné značení je mnoho variant, např.:
• trojnásobné značení:
o 2 velikosti Au + kubické částice Co3O4; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM o 2 velikosti Au + kubické částice Pt; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM
Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou kubickou nanočásticí CO3O4 jedné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm a kubické nanočástice CO3O4 mohou být volitelně nahrazeny kubickými nanočásticemi platiny nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5-15 nm) s nesférickou morfologií.
• čtyřnásobné značení:
o 2 velikosti Au + 2 velikosti Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM nebo TEM/DEX o 2 velikosti Au + Ag + Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM, FESEM, nebo TEM/EDX
Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň dvěma nanočásticemi paladia o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nepřesahuje 3 nm a nanočástice paladia mohou být volitelně nahrazeny nanočásticemi stříbra nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5 až 15 nm) a odlišného chemického složení.
-6CZ 304250 B6 • vícenásobnější značení:
o 2 velikosti Au + Ag + Pd + Pt; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM,
FESEM, nebo TEM/EDX
Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou nanočásticí stříbra, paladia a platiny, kde každý z prvků je jedné průměrné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 - Ukázka buněčného jádra s fluorescenční lokalizací tří antigenů.
Obr. 2 - Schéma sendvičového způsobu značení - primární protilátka rozeznává specificky antigen (červený trojúhelník), sekundární protilátka s navázanou značkou (nanočástice) se specificky váže na primární protilátku:.
Obr. 3 - Obvyklá distribuce nanočástic zlata o středních velikostech 5, 10, 15 a 20 nm s navázanými sekundárními protilátkami. Je vidět, že překryv se zvyšuje u větších částic, navíc částice větší než cca 10 nm se váží výrazně slaběji k primárním protilátkám.
Obr. 4 - Ideální mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - simulace identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra.
Obr. 5 - TEM mikrofotografie připravených částic Ag, Pd, Pt a CO3O4; zobrazené částice jsou AglOs, PdlOs, PtlOc, Colóc, přičemž symbol označující částici se skládá z kovového prvku charakterizujícího nanočástici, průměrné velikosti částice v nanometrech a označení tvaru (5 pro převážné sférické a c pro převážně kubické nanočástice); detailnější popis částic viz tabulka 1. Obr. 6 - Kontrola kvality a kalibrace množství navazované protilátky pomocí SDS elektroforézy.
Obr. 7 - Příklady různých koloidů úspěšně konjugovaných s protilátkami - detekce pomocí SDS elektroforézy. Komerční zlaté nanočástice (Au British BioCell International) byly použity jako pozitivní kontrola podmínek konjugace.
Obr. 8 - Příklad kalibrace množství navazované protilátky pomocí fluorescenční metody ELISA. První jamka je negativní kontrola bez přítomnosti nanočástic nebo protilátek, další dvě jamky obsahovaly 10 a 100 mikrolitrů koloidu nanočástic s konjugovanou protilátkou, dalších pět jamek obsahovalo protilátku ve zvyšujícím se množství, která sloužila ke kalibraci metody.
Obr. 9 - Rozlišení 2 nanočástic v SEM detekce (zpětně odražené elektrony - YAG, kryomod) Au 10 nm a Co kostky 18 nm.
Obr. 10 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony - YAG, kryo-mod) - Au 6 nm, Pt 10 nm a Co kostky 18 nm.
Obr. 11 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony - YAG, kryo-mod) - QD 6 nm, Au 10 nm a Co kostky 18 nm.
Obr. 12 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace transmisní elektronové mikroskopie a prvkové analýzy.
Obr. 13 - Rozlišení nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu podle tvaru pomocí defokusace.
-7CZ 304250 BÓ
Obr. 14 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace STEM/HAADF a prvkové analýzy pomocí
EDX detektoru.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava Pd nanočástic se sférickou morfologií a laditelnou velikostí v rozsahu 5 až 15 nm:
• Nanočástice PdlOs (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): 7,5 mL 9.3 χ I01 M roztoku PdCE (0.033 g bezvodého PdCE rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL) smícháno s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a
52,5 mL deionizované vody. Roztok byl zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem. Zásadní důležitost při přípravě hraje vysoká intenzita míchání v poměru k objemu roztoku (při objemu roztoku 75ml je třeba magnetické míchadlo o délce min 2 cm, rychlost nejméně 400 ot/min). Při nedostatečném míchání nelze reprodukovatelné připravit částice s požadovanou velikostí a úzkou distribucí velikostí. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.
• Nanočástice Pd06s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 6 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): analogická příprava jako u částic PdlOs stím, že před zahřátím roztoku je zvýšeno pH původního roztoku (pH = 6,25) o hodnotu 0,2 (pH = 6,45) pomocí 0,05% roztoku NaOH. Zásadní důležitost pro reprodukovatelnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku, stejně jako u nanočástic PdlOs. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.
• Nanočástice Pdl4s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 14 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): analogická příprava jako u částic PdlOs s tím, že oba roztoky (PdCl2 i citrát sodný) byly třikrát koncentrovanější. Zásadní důležitost pro reprodukovatelnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku, stejně jako u nanočástic PdlOs. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.
Příklad 2
Příprava dalších typů nanočástic s různým chemickým složením a/nebo morfologií (sférické nanočástice Ag, kubické nanočástice Pd, Pt, Co3O4):
• Nanočástice PdlOs (sférické nanočástice Ag s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): nanočástice Ag se připraví redukcí vodného roztoku AgNO3 pomocí Na[BH4], Nejprve se rozpustí 3,5 mg suchého Na[BH4] v 75 mL deionizované vody a vychladí v ledové lázni na 2 °C. Poté se k roztoku po kapkách přidá 9 mL 4,4x1 O^1 M vodného roztoku AgNO3. Klíčem k syntéze nanočástic požadované kvality je snížená koncentrace AgNO3, přesná teplota roztoku Na[BH4], rovnoměrné přidávání částic AgNO3 a správný poměr celkového objemu a intenzity míchání. Při správném provedení má výsledný koloid jasně žlutou barvu.
• Nanočástice PdlOc (kubické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): připraví se 11 mL vodného roztoku obsahujícího 56 mg Na2PdCl4 (17.4 mM), 60 mg kyseliny L-askorbové (31 mM), 106 mg polyvinylpyrrolidonu (PVP; M = 10 000 g/mol; c = 87 mM) a 301 mg KBr (230 mM). Roztok se zahřívá pod refluxem při teplotě 100 °C po dobu 3h. Po skončení syntézy zpravidla vznikne sraženina, která se následujícím postupem převede na koloid vhodný pro konjugace: roztok sraženiny se naředí destilova-8CZ 304250 B6 nou vodou v poměru 1:3, dvakrát přefdtruje přes filtr 0,2 pm a přečistí dialýzou proti destilované vodě (cut-off dialyzačního střeva je 3500 g/mol), čímž se odstraní nízkomolekulámí příměsi. Při správném provedení dostaneme zcela rozdispergovaný koloid hnědé barvy.
• Nanočástice PtlOc (kubické nanočástice Pt s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): smíchá se 4 mL 1 mM vodného roztoku K2[PtCl4] se 4 mL 100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a zahřeje na teplotu 50 °C, dokud se nevyčeří. Poté se přidá 2 mL ledově vychlazeného Na[BH4] (o teplotě 2 °C), doplní vodou do celkového objemu 10 mL a jehlou v septu se opouští vznikající H2 po dobu 10 min. Nakonec se vyjme jehla a roztok se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 6 h. Kvůli následné konjugaci se roztok TTAB odstraní dialýzou. Při správném provedení syntézy má výsledný koloid tmavě hnědou barvu.
• Nanočástice Co08s (sférické nanočástice Co3O4 s průměrnou velikostí 8 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): ve 100 mL vody se rozpustí 1,2 g NaOH a 90 g NaNO3. Roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min). Po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(NO3)2, přičemž se ihned vytvoří modrofialová sraženina. Poté se reakční směs zahřívá dalších 180 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem. Poté se reakce přeruší, koloid Co3O4 se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HCl. Následuje promytí, které vede k odstranění nezreagovaných látek a je klíčové pro úspěšnou přípravu nanočástic vhodných pro konjugace: v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu Co3O4 s roztokem HCl (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HCl a celý postup se 4x opakuje. V druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá po dobu nejméně 20 min při 6000 rpm. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.
• Nanočástice Co 16c (kubické nanočástice Co3O4 s průměrnou velikostí 16 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): postup je stejný jako u nanočástic Co08s popsaných výše s tím, že zahřívání roztoku po vzniku modrofíalové sraženiny trvá 240 min. Za přesného dodržení všech reakčních podmínek se částice oproti Co08s dvojnásobně zvětší a nabudou kubické morfologie. Promývání, které je nezbytné pro odstranění nezreagovaných látek a úspěšné konjugace, je stejné jako v případě nanočástic Co08s. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.
Příklad 3
Konjugace protilátek na nanočástice a testování kvality konjugace.
• Nejprve se upraví pH roztoků nanočástic a protilátek pomocí 0.1M K2CO3 na hodnotu pH 8.0-8.5. Roztok protilátky je pak přidán k sólu nanočástic a intenzivně míchán po dobu 1 až 2 minut. K zamezení nespecifické vazby a agregace konjugovaných částic se pak přidá polyetylénglykol (PEG) do konečně koncentrace 0.25% nebo BSA do konečné koncentrace 0.25 mg/ml, směs je míchána dalších 5 minut a bez míchání pak inkubována 2 hodiny nebo přes noc při 4 °C. K odseparování konjugovaných nanočástic od volných protilátek se používá odstředění při 15000-25000 g. Objem 0.5-1 ml se odstřeďuje 45 minut až 1.5 hodiny při 4 °C za použití glycerolového gradientu 20%/10%, supernatant se odstraní a pelet je resuspendován v 1% roztoku PEG nebo BSA v 0.01M Na3PO4 o pH 7 až 8 a směs je nadále skladována při 4 °C. Úspěšná separace konjugovaných nanočástic je klíčová pro následující imunoznačení. Známé metody separace bylo nutno modifikovat, zejména optimalizovat rychlost a délku odstřeďování. Obecně pro optimalizaci množství konjugovaného proteinu platí, že po konjugaci s cca 90 až 250 pg protilátky (dle typu a koncentrace nanočástic) dochází k saturaci vazby protilátky na částice. Ke konjugaci je doporučeno vybrat množství protilátky nižší o cca
-9CZ 304250 B6 %, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby. K tomu slouží testování množství navázané protilátky, popsané v tomto příkladu dále.
• Množství přidávané protilátky je třeba adjustovat dle typu koloidu a koncentrace nanočástic. Množství navázaných protilátek se testuje a případně optimalizuje pomocí proteinové elektroforézy nebo pomocí ELISA detekce. Před elektroforézou se imunoglobuliny odštěpí z částic ve vzorkovém pufru, (50 mM Tris-HCl, 10% glycerol, 2% SDS, 100 mM dithiothreitol a 0.01% bromophenolová modř, pH 6.8), povaří se 1 minutu a nanese se na 10% gel. Po průběhu elektroforézy se rozdělené proteiny v gelu obarví PageBlue (Fermentas) a obsah proteinu v jednotlivých proužcích se kvantifikuje v infračerveném spektru (LI-COR Biosciences, USA). Pro kalibraci množství proteinu se na gel paralelně ke vzorku nanáší koncentrační série volné protilátky stejného typu, která byla použita pro konjugaci s nanočásticemi. To pak umožňuje kvantifikovat množství na částice vázané protilátky (příklad je uveden na Obr. 6). Další příklady průkazu úspěšnosti konjugace protilátek na nanočástice s různým prvkovým složením jsou uvedeny v Obr. 7. Tento průkaz má výhodu, že kromě detekce samotné protilátky by na gelu byly vidět i případné proteinové nečistoty, které se na nanočástice navázaly, anebo degradované fragmenty protilátek.
• Alternativním způsobem testování množství na nanočástice navázaných protilátek je fluorescenční průkaz standardním testem ELISA. Použita je obvyklá 96jamková plastová destička, do níž je napipetován roztok nanočástic s navázanou protilátkou. Protilátky se po 1 hod. inkubace za mírného třepání absorbují na plast jamky, poté je provedena detekce absorbované protilátky pomocí fluorescenční protilátky, jež specificky rozeznává typ protilátky s navázanými nanočásticemi. V paralelních jamkách je provedena inkubace se známým množstvím protilátky, která slouží ke kalibraci metody a k určení množství protilátky, vázané k nanočásticím. Příklad je doložen na Obr. 8.
Příklad 4
Příklad sady vhodných koloidních nanočástic různých kovů nebo oxidů kovů, lišících se svým atomovým číslem, jejichž kombinace lze využít k současnému vícenásobnému značení 2 až 4 různých antigenů na povrchu suchých nebo lomových a řezných plochách vitrifikovaného biologického preparátu pomocí skenovacího elektronového mikroskopu s vysokým rozlišením v oblasti detekce zpětně odražených elektronů:
Ag- Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm
Příprava: modifikovaný protokol řízené chemické redukce rozpustných solí Ag (příklad 2) nebo komerčně dostupné
Stabilita roztoku nanočástic: dostatečná Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná
Testovací podmínky FESEMu JEOL 740IF: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm
Au - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm Příprava: komerčně dostupné Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá Konjugace: proveditelná a popsaná (Roth, 1996)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm
-10CZ 304250 B6
Pd - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm
Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pd podle (příklad 1)
Stabilita roztoku nanočástic: dobrá
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná
Testovací podmínky FESEMu JEOL 740IF: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.
Pt - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm (kubické nebo sférické částice)
Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pt (příklad 2)
Stabilita roztoku nanočástic: dobrá
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.
Nanočástice oxidů kovů, např. CO3O4
Rozsah vhodných velikostí: 5 až 21 nm (kubické nebo sférické částice)
Příprava: modifikovaný protokol řízené oxidace rozpustných solí Co (příklad 2)
Stabilita roztoku nanočástic: dobrá
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.
Nanočástice typu kvantová tečka - QD
Rozsah vhodných velikostí: 5 až 21 nm (sférické nebo eliptické částice)
Příprava: komerčně dostupné
Konkrétní příklad vhodné částice: QD 655, chemické složení CdS
Další vhodná chemická složení nanočástic QD: CdSe, ZnS, ZnSe, BeS, BeSe
Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá
Konjugace: proveditelná analogicky jako u Au (Roth, 1996)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.
Všechny nanočástice byly jednoznačně charakterizovány pomocí TEM v režimech BF (bright field; z obrazové analýzy TEM/BF mikrofotografií určena velikost), EDX (energiově disperzní analýza paprsků X; pomocí TEM/EDX spekter ověřena chemická čistota) a SAED (selected-area electron diffraction; pomocí TEM/SAED potvrzena krystalická struktura).
Konkrétní příklady různých kombinací výše uvedených nanočástic zobrazených pomocí FESEM jsou zachyceny na obr. 9 až 11:
• Obrázek 9: příklad rozlišení dvou různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.
• Obrázek 10: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic zvýše uvedené sady ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.
• Obrázek 11: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu; sada nanočástic je s výhodou rozšířena o nanočástice typu QD 655 (kde částice QD 655 jsou nanočástice typu kvantová tečka o prvkovém složení CdS).
- 11 CZ 304250 Bó
Příklad 5
Příklad rozlišení tří typů nanočástic v EFTEM mikroskopu: na obr. 12 je znázorněná směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a QD 655 (kde nanočástice QD byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + QD 655 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2 s energetickým filtrem elektronů (tj. EFTEM). Užité měřítko odpovídá 50 nm. Nejdříve byl pořízen obrázek v běžném módu transmisní elektronové mikroskopie (tj. TEM), následovně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí energetického filtru elektronů za účelem rozlišování mezi QD 655 a zlatými částicemi. Na obr. 12 je v části A popsán obrázek v módu transmisní elektronové mikroskopie. Zlaté částice jsou kulaté a denzní, QD 655 jsou světlejší, mají protáhlý tvar a v důsledku rozdílné orientace jsou tvarově velmi heterogenní. 12nanometrové zlaté částice jsou na tomto obrázku spolehlivě odlišitelné od menších (6 nanometrových) zlatých částic a od QD 655. Mezi ónanometrovými zlatými částicemi a QD 655 může však v některých případech dojít k záměně, jak ukazují šipky č. 1 a 2. Dalším problémem může být vizualizace samotných QD 655, které jsou světlejší a mohou se ztrácet na podkladu s nerovnoměrným kontrastem (šipky č. 3). V části B na obr. 12 je znázorněna prvková mapa stejného vzorku. QD jsou složeny z několika prvků, mezi majoritní patří např. kadmium nebo síra, které se dají zmapovat pomocí energetického filtru elektronů, a odlišit tak QD od zlatých částic. Je vidět, že QD dávají silný signál na rozdíl od malých zlatých částic (šipky č. 1 a 2, odpovídají části A obr. 12). Zároveň je překonán i problém rozlišování světlejších QD od pozadí - při vizualizaci touto metodou získávají mnohem větší specifický kontrast (např. šipky č. 3, odpovídají obrázku A) aje tak detekováno nejméně 98% QD. V části C na obr. 12 je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného immunoznačení.
Příklad 6
Příklad rozlišení tří typů částic v TEM mikroskopu: sada nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a platinových částic o velikosti 12 nm ve tvaru krychle znázorněná na obr. 13 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2. Užité měřítko odpovídá 100 nm. V části A je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině fokusu. 6-nanometrové zlaté částice jsou spolehlivě odlišitelné podle velikostí, rozdíl mezi většími částicemi - 12 nanometrovým zlatém a 12 nanometrovou platinou není zřejmý (šipky č. 1 a 2). V části B je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině 6.5 mikrometrů nad fokusem. Jsou pozorovány difrakční jevy, kde krychlové platinové částice získávají „dutý“ vzhled a zřejmý čtvercový tvar (šipka 1), kulaté 12 nanometrové zlaté částice zůstávají tmavé (šipka 1). Malé zlaté částice se zobrazují také s bílým středem (šipka 3). V části C je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného imunoznačení.
Příklad 7
Příklad rozlišení tří typů nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu s EDX detektorem: na obr. 14 je znázorněna směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a Pd nanočástic (kde nanočástice Pd byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + Pd (10 nm) byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai Osiris s EDX detektorem. Užité měřítko odpovídá 200 nm. Nejdříve byl pořízen snímek pomocí STEM/HAADF, následně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí EDX detektoru za účelem rozlišení mezi zlatými a palladiovými částicemi. Na obr. 14 je v části a popsán obrázek v módu STEM/HAADF, kontrast je invertován pro lepší znázornění. Zlaté a paladiové částice jsou kulaté a denzní, malé zlaté částice jsou spolehlivě odlišitelné podle velikosti, velké zlaté částice a paladiové částice však v tomto módu se nedají odlišit. V části bac
- 12CZ 304250 B6 na obr. 14 jsou znázorněny prvkové mapy stejného vzorku, ukazující rozložení zlata a paladia.
V části d na obr. 14 je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného imunoznačení na základě jejich velikostí a prvkového složení.
Průmyslová využitelnost
Vynález slouží k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách (zejména ve virech, bakteriích, buňkách či tkáních nebo v jejich fragmentech) a popisu jejich interakcí, jehož výsledky jsou využitelné především v oblastech humánní a veterinární medicíny, zemědělství, bio- a nanotechnologií.
Claims (16)
1. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že soubor je tvořen z nejméně jednoho až dvou typů nanočástic zlata různé velikosti a jednoho nebo více typů nanočástic vybraných ze skupiny složené z nanočástic stříbra, paladia, platiny a oxidu kobaltu CO3O4, přičemž velikost nanočástic zlata, stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5 až 13 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 18 nm a šířka distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm, přičemž v případě nanočástic stejného složení se nanočástice liší průměrnou velikostí o nejméně 4 nm, a současně vždy jeden typ těchto nanočástic je nahraditelný nanočásticemi typu QD o prvkovém složení odpovídajícím vzorci sulfidu kadmia (CdS) nebo selenidu kadmia (CdSe) nebo sulfidu zinku (ZnS) nebo selenidu zinku (ZnSe) nebo sulfidu berylia (BeS) nebo selenidu berylia (BeSe), s průměrnou velikostí nanočástic typu QD v rozmezí 5 až 21 nm.
2. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že soubor je tvořen z nejméně jednoho typu sférických nanočástic stříbra a jednoho nebo více typů nanočástic vybraných ze skupiny složené z nanočástic paladia, platiny a oxidu kobaltu CO3O4, přičemž velikost nanočástic stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5 až 13 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 18 nm a šířka distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm, přičemž v případě nanočástic stejného složení se nanočástice liší průměrnou velikostí o nejméně 4 nm, a současně vždy jeden typ těchto nanočástic je nahraditelný nanočásticemi typu QD o prvkovém složení odpovídajícím vzorci sulfidu kadmia (CdS) nebo selenidu kadmia (CdSe) nebo sulfidu zinku (ZnS) nebo selenidu zinku (ZnSe) nebo sulfidu berylia (BeS) nebo selenidu berylia (BeSe), s průměrnou velikostí nanočástic typu QD v rozmezí 5 až 21 nm.
3. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic dle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že nejméně jeden typ nanočástic paladia a/nebo platiny a/nebo oxidu kobaltu CO3O4 má kubickou morfologii.
4. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nárok 1 až 3, vyznačující se tím, žek přípravě nanočástic paladia o průměrné velikosti 10 nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm je použito 7,5 mL 9.3 χ ΙΟ4 M roztoku PdCh (0.033 g bezvodého PdCb rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL), který je následně smíchán s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody, přičemž roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.
- 13 CZ 304250 B6
5. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, žekpřípravě nanočástic paladia o průměrné velikosti 6nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm je použito 7,5 mL 9.3 x 104 M roztoku PdCl2 (0.033 g bezvodého PdCl2 rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL), který má pomocí 0,05% roztoku NaOH upravené pH 6,45, je následně smíchán s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody, přičemž výsledný roztok je zahříván kvaru po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.
6. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic paladia o průměrné velikosti 14nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: smíchání
22,5 mL 9.3 x 10 4 M roztoku PdCl2 (0.033 g bezvodého PdCl2 rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL) se 45 mL 1% roztoku citrátu sodného a 7,5 mL deionizované vody, přičemž výsledný roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.
7. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nárokuj 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic stříbra o průměrné velikosti lOnm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: provedení redukce vodného roztoku AgNO3 pomocí Na[BH4], přičemž nejprve se rozpustí 3,5 mg suchého Na[BH4] v 75 mL deionizované vodě a vychladí se v ledové lázni na 2 °C a poté se k roztoku za intenzivního míchání po kapkách přidá 9 mL 4,4x10'4 M vodného roztoku AgNO3.
8. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic paladia o průměrné velikosti lOnm s kubickou sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: připraví se 11 mL vodného roztoku obsahujícího 56 mgNa2PdCl4 (17.4 mM), 60 mg kyseliny Laskorbové (31 mM), 106 mg polyvinylpyrrolidonu (PVP; M = lOOOOg/mol; c = 87 mM) a 301 mg KBr (230 mM), kde roztok se zahřívá pod refluxem při teplotě 100 °C po dobu 3h a po skončení syntézy se roztok sraženiny naředí destilovanou vodou v poměru 1:3, dvakrát přefiltruje přes filtr 0,2 gm a přečistí dialýzou proti destilované vodě (cut-off dialyzačního střeva 3500 g/mol).
9. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic platiny průměrné velikosti 1 Onm s kubickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: jsou smíchány 4 mL 1 mM vodného roztoku K2[PtCl4] se 4 mL 100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a roztok se zahřeje na teplotu 50 °C, dokud se nevyčeří, poté se přidá 2 mL roztoku Na[BH4] ledově vychlazeného na 2 °C, doplní vodou do celkového objemu 10 mL a jehlou v septu se po dobu 10 min upouští vznikající H2 po dobu lOmin, nakonec je vyjmuta jehla a roztok se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 6 h, přičemž z důvodu následné konjugace se roztok TTAB odstraní dialýzou.
10. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic oxidu kobaltu průměrné velikosti 8nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: ve 100 mL vody je rozpuštěno 1,2 g NaOH a 90 g NaNO3, roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min), po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(NO3)2, poté se reakční směs zahřívá dalších 180 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem, poté se reakce přeruší, koloid Co3O4 se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HCI, následuje promytí, přičemž v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu Co3O4 s roztokem HCI (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu
- 14 CZ 304250 B6 rozdisperguje v HCI a celý postup se 4x opakuje, v druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá nejméně 20 min při 6000 rpm.
11. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic oxidu kobaltu Co3O4 průměrné velikosti 16nm s kubickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: ve 100 mL vody je rozpuštěno 1,2 g NaOH a 90 g NaNO3, roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min), po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(NO3)2, poté se reakční směs zahřívá dalších 240 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem, poté se reakce přeruší, koloid Co3O4 se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HCI, následuje promytí, přičemž v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu Co3O4 s roztokem HCI (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HCI a celý postup se 4x opakuje, v druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá nejméně 20 min při 6000 rpm.
12. Způsob konjugace protilátek na soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že pH roztoků nanočástic a protilátek je upraveno pomocí 0.1M K2CO3 na hodnotu pH 8.0 až 8.5, roztok protilátky je poté přidán k sólu nanočástic a intenzivně míchán po dobu 1 až 2 minut, k zamezení nespecifické vazby a agregace konjugovaných částic je přidán polyetylénglykol (PEG) do konečné koncentrace 0.25% nebo BSA do konečné koncentrace 0.25 mg/ml, směs je míchána dalších 5 minut a bez míchání je poté inkubována 2 hodiny nebo přes noc při 4 °C, konjugované nanočástice jsou od volných protilátek odseparovány odstředěním při 15000 až 25000 g, objem 0.5 až 1 ml je odstřeďován po dobu 45 minut až 1.5 hodiny při 4 °C za použití glycerolového gradientu 20%/10%, supematant je odstraněn a pellet je resuspendován v 1% roztoku PEG nebo BSA v 0.01 M Na3PO4 o pH 7 až 8 a směs je nadále skladována při 4 °C.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že množství protilátky je nižší o 9 až 11 %, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby.
14. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách, zejména buňkách a tkáních.
15. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách.
16. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k popisu interakcí antigenů v biologických strukturách pomocí metod elektronové mikroskopie.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2010-647A CZ304250B6 (cs) | 2010-08-27 | 2010-08-27 | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2010-647A CZ304250B6 (cs) | 2010-08-27 | 2010-08-27 | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010647A3 CZ2010647A3 (cs) | 2012-03-07 |
| CZ304250B6 true CZ304250B6 (cs) | 2014-01-29 |
Family
ID=45768595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2010-647A CZ304250B6 (cs) | 2010-08-27 | 2010-08-27 | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ304250B6 (cs) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069962A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| JP2007183291A (ja) * | 2001-10-12 | 2007-07-19 | Molecular Probes Inc | 免疫標識のための抗体複合体および方法 |
-
2010
- 2010-08-27 CZ CZ2010-647A patent/CZ304250B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069962A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| JP2007183291A (ja) * | 2001-10-12 | 2007-07-19 | Molecular Probes Inc | 免疫標識のための抗体複合体および方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Erlandsen SL, Greet Bittermann A, White J, Leith A, Marko M.," High-resolution CryoFESEM of individual cell adhesion molecules (CAMs) in the glycocalyx of human platelets: detection of P-selectin (CD62P), GPI-IX complex (CD42A/CD42B alpha,B beta), and integrin GPIIbIIIa (CD41/CD61) by immunogold labeling and stereo imaging", J Histochem Cytochem. 2001 Jul;49(7):809-19. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2010647A3 (cs) | 2012-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ladj et al. | Individual inorganic nanoparticles: preparation, functionalization and in vitro biomedical diagnostic applications | |
| Xavier et al. | Protein-protected luminescent noble metal quantum clusters: an emerging trend in atomic cluster nanoscience | |
| US7238472B2 (en) | Non-alloying core shell nanoparticles | |
| Shang et al. | Ultrasmall fluorescent silver nanoclusters: protein adsorption and its effects on cellular responses | |
| Fokkema et al. | Fluorescently labelled silica coated gold nanoparticles as fiducial markers for correlative light and electron microscopy | |
| US20040086885A1 (en) | Magnetic nanomaterials and methods for detection of biological materials | |
| JP2007506084A (ja) | ナノ粒子コンジュゲート及びその製造方法 | |
| AU2003279899A1 (en) | Nano-sized optical fluorescence labels and uses thereof | |
| KR20180005164A (ko) | 지속 발광성 코어/쉘 나노플레이트렛 | |
| US11473152B2 (en) | Metal nanoshell-coated barcodes | |
| US20060275757A1 (en) | Magnetic nanomaterials and methods for detection of biological materials | |
| CN112391347B (zh) | 磁-光复合纳米结构、其制造方法以及检测、分离或成像分析物的方法 | |
| KR20130142145A (ko) | 면역학적 측정용 청색 금 나노 입자, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 측정 방법 | |
| JPWO2008032534A1 (ja) | 蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法 | |
| Zurbuchen et al. | Nanodiamond landmarks for subcellular multimodal optical and electron imaging | |
| Morita et al. | Controlled synthesis of gold nanoparticles on fluorescent nanodiamond via electron-beam-induced reduction method for dual-modal optical and electron bioimaging | |
| Philimonenko et al. | Simultaneous detection of multiple targets for ultrastructural immunocytochemistry | |
| US20180284110A1 (en) | Clustered precious metal nanoparticles in a stable colloidal suspension and biological applications using the same | |
| CZ304250B6 (cs) | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení | |
| Woolley et al. | From particle to platelet: Optimization of a stable, high brightness fluorescent nanoparticle based cell detection platform | |
| CZ21711U1 (cs) | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení | |
| Ma et al. | Light-induced self-assembly of bi-color CdTe quantum dots allows the discrimination of multiple proteins | |
| KR20110008400A (ko) | 코어―셀 구조의 타겟물질 표지용 나노복합체 및 이를 이용한 표지방법 | |
| US20180283995A1 (en) | Method and kit for multi-color cell imaging with dark field optical microscopy using conjugated noble metal nanoparticles as contrast agents | |
| JPWO2008032535A1 (ja) | 蛍光半導体微粒子、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識剤及びそれを用いたバイオイメージング法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190827 |