CZ304250B6 - Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení - Google Patents

Abstract

Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic o různé velikosti, tvaru a/nebo různém prvkovém složení, které lze použít k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách, k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v těchto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, přičemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou během imunocytochemické detekce.

Description

Vynález se týká souboru nanočástic o různé velikosti, tvaru a/nebo různém prvkovém složení, které lze použít k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách (zejména buňkách a tkáních), k imunocytochemické analýzy distribuce antigenů v těchto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, přičemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou během imunocytochemické detekce. Dále toto citlivé značení v biologických strukturách nazýváme vícenásobné ultrastrukturální značení. Vynález se taktéž týká způsobu přípravy vhodného souboru nanočástic a způsobu konjugace protilátek na nanočástice tak, aby byl celý soubor použitelný pro vícenásobné ultrastrukturální značení.

Dosavadní stav techniky

V současné době se pro imunoznačení používají téměř výhradně zlaté nanočástice a standardní transmisní elektronové mikroskopy (TEM). Z důvodů různých technických omezení to umožňuje současné citlivé značení pouze dvou molekul v buňce, což již dnešní molekulární biologii nepostačuje.

Molekulární a buněčná biologie je v současnosti jedním z nejdynamičtěji rozvíjejících se vědních oborů, který zasahuje do poznání podstaty fungování organismů včetně člověka a který má ohromné množství aplikačních výstupů např. do medicíny humánní i veterinární, zemědělství, bio- a nano-technologií. Poté, co došlo k osekvenování řady genomů včetně lidského, je k dispozici obrovský objem genetických dat, teprve se ale orientujeme ve fungování jednotlivých proteinů a pozvolna se vytváří mapy složitých strukturně-regulačních vztahů mezi jednotlivými makromolekulami (zejména proteiny). Právě proto pozorujeme obrovský nárůst požadavků na imunocytochemickou analýzu distribuce antigenů v buňkách či tkáních a popis jejich interakcí. Vývoj nových technologií světelné mikroskopie začal v relativně nedávné době umožňovat studium takových interakcí in sítu. V současné době jsme schopni pomocí fluorescenčních značek a vícekanálových konfokálních mikroskopů identifikovat různé makromolekuly zároveň a sledovat dynamiku reakcí v prostoru i čase. K identifikaci makromolekul se používají protilátky (nejčastěji imunoglobuliny typu IgG), které specificky rozeznávají jednotlivé antigeny (obvykle to jsou právě proteiny). K protilátce je navázána fluorescenční značka, která nám v mikroskopu umožní zjistit lokalizaci proteinu, který zkoumáme, v buňce či tkáni. Kombinace fluorescenčních značek dává možnost identifikovat zároveň více proteinů. Obr. 1 ukazuje na příkladu buněčného jádra fluorescenční lokalizaci tří antigenů najednou.

Tyto techniky ale mají jedno zásadní omezení - fyzikální zákony limitují rozlišení světelných mikroskopů na ~200 nm. Přitom právě makromolekulámí komplexy, které jsou zodpovědné za hlavní buněčné děje, jako je např. čtení genetické informace či její zdvojování před buněčným dělením mají velikost mezi 30 až 100 nm. Nezbytností je tedy zkoumání pomocí elektronové mikroskopie, která se s novými postupy kryoprezervace vzorků, ultrastrukturální tomografie a imunoznačení stala opět nesmírně perspektivní technikou v poznávání funkční mikroarchitektury buněk a tkání - zejména v korelaci s fluorescenční mikroskopií živých buněk (pro přehled viz např. Luic et al., 2005; Giepmans et al., 2006). Klasická transmisní elektronová mikroskopie dnes dosahuje rozlišení kolem 0,1 nm, tedy pro naprostou většinu biologických preparátů lepší, než potřebnou. Pro rozpoznání makromolekul musíme podobně jako v imunofluorescenci použít protilátky, na které bude umístěna vhodná značka. V elektronové transmisní mikroskopii se používají zlaté koloidní částice, které jsou elektrondensní a zobrazují se tedy jako tmavé částice

- 1 CZ 304250 Bó (Roth 1996; Zuber et al., 2005). Obvykle se používá sendvičový způsob značení (Obr. 2), kdy primární protilátka rozeznává konkrétní antigen, který studujeme; sekundární protilátka, nesoucí zlatou partikulí, se pak váže na tuto primární protilátku. Dosud jedinou možností, jak rozlišit více antigenů, je použití směsi sekundárních protilátek, nesoucích zlaté částice o různé velikosti. Komerčně lze pořídit částice o velikostech kolem 5, 10, 15 a 20 nm již s navázanými sekundárními protilátkami - pochopitelně vždy s určitou fluktuací ve velikosti (Obr. 3). Tento způsob vícenásobného značení ale strádá zásadními problémy: při použití partikulí větších než 12 nm se dramaticky snižuje značící schopnost - nejspíše v důsledku vzájemného odpuzování zlatých partikulí při vazbě protilátek na antigeny ležící blízko sebe a kvůli hmotnosti zlatých partikulí. Důsledkem je faktická nemožnost úspěšného provedení citlivého imunoznačení s ultrastrukturálním rozlišením pro více než dva antigeny.

V porovnání se světelnou mikroskopií je tedy současný stav v TEM mikroskopii značně omezující - zejména pokud si uvědomíme, s jakou různorodostí antigenů/proteinů dnes potřebuje molekulární biologie pracovat a zjišťovat jejich vzájemné interakce. Ideální situace spočívá v možnosti provádět citlivé ultrastrukturální imunoznačení s částicemi o velikostech blízkých 10 nm, které by se daly spolehlivě odlišit v elektronovém mikroskopu. V klasické elektronové mikroskopii by bylo ideální používat částice s různým tvarem. Ve speciálních technikách transmisní elektronové mikroskopie (zejména v technikách EFTEm, TEM/EDX, případně i STEM/HAADF, kde zkratka EFTEM označuje TEM mikroskopii s energiovou filtrací elektronů, TEM/EDX označuje TEM mikroskopii s moderním výkonným systémem pro energiově disperzní analýzu paprsků X a STEM/HAADF označuje řádkovací TEM mikroskopii s detektorem elektronů rozptýlených do velkých úhlů) a řádkovací elektronové mikroskopie (zejména FESEM, kde zkratka FESEM označuje SEM mikroskopii s autoemisní tryskou a speciálními detektory zpětně odražených elektronů) je pro identifikaci možno využít různého prvkového složení partikulí. Velkým pokrokem by bylo vyvinout diagnostický systém, umožňující alespoň trojnásobné nebo čtyřnásobné citlivé značení. V posledních letech navrhovatelé z Ústavu molekulární genetiky (ÚMG) vyvíjeli algoritmy, které umožňují popis prostorových interakcí proteinů - zejména klastrování molekul (např. dimerizace molekul, vytváření homokomplexů), kolokalizace (vytváření heterokomplexů, účast různých proteinů v rámci jednoho funkčního komplexu), či mapování proteinů v rámci buňky (Philimonenko et al., 2000; Schófer et al., 2004). Již jednoduchá kombinatorika ukazuje, že dvojnásobné značení molekul A a B umožňuje vjednom preparátu popsat pouze jednu interakci mezi různými molekulami (A-B) a dvě mezi shodnými molekulami (A-A, B-B). Simultánní značení čtyř antigenů by však umožnilo popis šesti interakcí mezi různými molekulami a čtyř interakcí mezi shodnými molekulami. Celkem tedy bychom vjednom preparátu namísto tří interakcí mohli najednou sledovat deset interakcí mezi biomolekulami. Názorným výstupem pak může být např. mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - příklad takového výsledku je uveden na obr. 4, kdy byla simulována identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra. Takovýto výsledek by se již vyrovnal v možnostech kombinace konfokálnímu obrazu z Obr. 1 a přitom by jej nepozorovatelně předčil svým ultrastrukturálním rozlišením.

Dalším typem elektronové mikroskopie, kterou je možné díky značnému rozvoji v posledních letech spojenému se zvýšením její rozlišovací schopnosti použít k imunolokalizaci, je skenovací elektronová mikroskopie (dále SEM). V tomto případě je možné značit antigeny na povrchu biologických vzorků a k detekci značky (markéru) v podobě koloidního zlata využít signálu zpětně odražených elektronů. U skenovacích elektronových mikroskopů s autoemisní tryskou (FESEM) vybavených speciálními detektory zpětně odražených elektronů, k nimž patří např. Autratův YAG detektor, byla prokázána schopnost detekovat kovové částice velikosti jednotek nm (Hermann R. et al., 1991). Další výhodou je citlivost signálu zpětně odražených elektronů na změny v prvkovém složení vzorku. Nanočástice tvořené různými těžkými kovy je možné pomocí tohoto signálu velmi dobře rozlišit (Erlandsen S. et al., 2003).

Metoda imunolokalizace v SEM je založena stejně jako v případě TEM na detekci antigenu pomocí protilátky, která je připojena na značku. A stejně jako v případě TEM se nejčastěji použí-2 CZ 304250 B6 vájako značen částic koloidního zlata. Na rozdíl od TEM, kde se zlaté nanočástice zobrazují jako denzní body, v případě FESEM je kontrast opačný - částice výrazně na povrchu preparátu svítí.

Pro vícenásobné značení lze v současnosti použít maximálně dvou zlatých partikul í s výrazně rozdílnou průměrnou velikostí, aby bylo možné je v FESEM rozlišit.

Způsob přípravy biologických vzorků před vlastním prohlížením v elektronovém mikroskopu velmi ovlivňuje výsledek imunoznačení. Vzhledem k vysokému vakuu v FESEM je nezbytné biologický materiál dokonale zbavit vody. V případě použití skenovacího elektronového mikroskopu vybaveného kryonástavcem lze tento problém vyřešit velmi jednoduše - voda v preparátu se rychle zmrazí během tzv. kryofixace a vlastní pozorování vzorku se děje v mikroskopu při velmi nízkých teplotách okolo -130 °C. Imunoznačení při tomto způsobu přípravy preparátu se provádí na odhaleném povrchu nativního vzorku před vlastním zmrazením, což je velmi výhodné z hlediska zachování schopnosti vázat značenou protilátku ve srovnání s chemickými způsoby přípravy.

Stav techniky je rovněž součástí odborné literatury:

Bratlie KM, Lee H, Komvopoulos K, Yang P, Somorjai GA: Nano Lett. 2007, 7, 3097-3101 Erlandsen S, Chen Y, Frethem C, Detry J, Wells C.: J. Microsc. 2003, 211, 212-218 Feng J, Zeng HC: Chem. Mater. 2003, 15, 2829-2835

Garcia B, Salomé M, Lemelle L, Bridot J-L, Gillet P, Perriat P, Roux S and Tillement O: Chem. Commun., 2005, 369 - 371

Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY: Sciece 2006, 312, 217-224

Lucie V, Forster F, Baumeister W.: Annu Rev Biochem. 2005, 74, 833-865

Philimonenko A. A., Janáček J. and Hozák P.: J. Struct. Biol. 2005, 132, 201-210

Roth J.: Histochem Cell Biol. 1996, 106, 1-8

Schófer Ch., Janáček J., Weipoltshammer K., Pourani J. and Hozák P.: J. Struct. Biol. 2004, 147, 128-135

Turkevich J, Kim G: Science 1970, 169, 873-879

Vlčkova B, Matějka P, Šimonova J, Čermáková K, Pancoska P, Baumruk V: J. Phys. Chem. 1993,97, 9719-9729

Zuber C, Fan J, Guhl B, Roth J.: Ultrastruct Pathol. 2005, 29, 319-330

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je soubor vhodných typů nanočástic pro současné citlivé imunoznačení tří a více antigenů v biologických preparátech; součástí vynálezu je způsob přípravy daného souboru nanočástic, způsob konjugace protilátek na daný soubor nanočástic a způsob použití souboru nanočástic podle tohoto vynálezu k ultrastrukturálnímu značení.

Částice pro imunodetekci musí splňovat několik podmínek: (a) velikost (střední hodnota distribuce velikosti E) ideálně v rozsahu 5 až 12 nm, pro částice lehčích prvků 5 až 20 nm, (b) úzká distribuce velikostí (nízká hodnota směrodatné odchylky distribuce velikostí D), (c) dostatečná stabilita nanočástic v roztoku před konjugací protilátek, (d) chemicky definovaný povrch, neznečištěné stabilizátory, které by znemožňovaly konjugaci protilátek, (e) dostatečný kontrast v TEM a FESEM mikroskopu, (f) dostatečná stabilita v TEM a FESEM mikroskopu, (g) možnost vázat protilátky na povrch nanočástic. Podle dostupných informací i provedených experimentů žádné v současnosti komerčně dostupné kovové nanočástice (s výjimkou Au) nesplňují všechny shora uvedené požadavky (a-g) současně.

-3CZ 304250 B6

Proto byly modifikovány způsoby přípravy nanočástic v roztoku řízenou chemickou redukcí rozpustných solí kovů M, kde M = Ag, Pd, Pt, Co. Všechny přípravy nanočástic jsou založeny na společném reakčním schématu, který lze shrnout následovně:

A: rozpustná B: redoxní činidlo C: roztok nanočástic sůl kovu Mⁿ⁺ další látky + optimalizované kovu M nebo oxidu M_xO_y c, V, pH a rychlosti míchání

Konkrétní příklady syntéz s popisem látek A, B, C a reakčních podmínek lze najít níže (Příklady 1 a 2). Základní principy syntéz koloidních částic jsou již popsány (např. Vlčkova et al., 1993; Turkevich et al., 1970; Bratlie et al., 2007; Feng et al., 2003; Lim et al. 2009), ale popsané postupy je nutné podstatně modifikovat pro získání částic požadované kvality.

Modifikace všech postupů spočívala v optimalizaci výchozích koncentrací, objemů, pH a rychlostí míchání tak, aby bylo dosaženo požadované velikosti nanočástic dle bodu (a), co nejužší distribuce velikostí kovových nanočástic dle bodu (b) a přitom aby byly splněny všechny další požadavky dle bodů (c-g). U sférických nanočástic Pd spočívala modifikace postupu zejména v zavedení velmi intenzivního míchání celého roztoku, jinak nebylo možno částice se zvolenou velikostí reprodukovatelně připravovat (nutné ke splnění požadavků a, b). U sférických nanočástic Ag bylo nutné oproti původnímu receptu 5x snížit koncentraci výchozí stříbrné soli, jinak byly distribuce nanočástic příliš široké a syntézy nebyly reprodukovatelně (nutné ke splnění požadavku b). U kubických nanočástic Pd bylo nutné zavést speciální postup čištění nanočástic pomocí dialýzy (splnění požadavků c, d). U kubických nanočástic Pt bylo nezbytné optimalizovat koncentrace (splnění požadavků a, b) a vyvinout postup čištění výsledného koloidu pomocí dialýzy (splnění požadavků c, d). U sférických i kubických nanočástic CO3O4 bylo nutné optimalizovat způsob čištění výsledného koloidu (splnění požadavků c, d). Podrobný popis syntéz všech koloídů lze nalézt v příkladech 1 až 2.

Základní parametry nanočástic lze najít v tabulce 1. Mikrofotografie nanočástic dokumentující jejich stabilitu pod elektronovým paprskem demonstruje obrázek 5. Detailní popis přípravy nanočástic je obsahem příkladů 1 a 2. Detailní popis konjugace nanočástic je obsahem příkladu 3.

Tabulka 1

Nanočástice	E 1	D íf	-Stdhilfta	Čistota	Kontrast	Stabilita
Typ	Značka	Tvai	illlllt	iiiiiit	v ioztoku	povichu	TEM,SEM	TEM,SEM
Pd	Pd06s	sférický	5-8	<2	ano	ano	ano	ano
Pd	Pd10s	sférický	8-12	<3	ano	ano	ano	ano
Pd	Pd14s	sférický	12-15	<3	ano	ano	ano	ano
Ag	Ag10s	sférický	8-12	<3	ano	ano	ano	ano
Pt	Pt10c	kubický	8-12	<3	ano	dle úpravy	ano	ano
C03O4	Co08s	sférický	7-10	<3	ano	ano	ano	ano
CO3O4	Co16c	kubický	15-18	<3	ano	ano	ano	ano

* E = průměrná velikost částic = střed číselné distribuce velikostí; závisí na podm. přípravy C- šířka distribuce velikostí částic = směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí

Shora popsanými postupy byl získán nový soubor nanočástic, které jsou navzájem rozlišitelné v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF a/nebo v FESEM mikroskopu, konjugovatelné s protilátkami a tudíž využitelné pro vícenásobné ultrastrukturální značení.

Novost spočívá zejména ve vzájemné kombinaci nanočástic, která umožňuje jejich využití v ultrastrukturálním značení. Novost dále spočívá i v modifikovaném způsobu přípravy nanočás-4CZ 304250 B6 tic a způsobu konjugace nanočástic s protilátkami. U všech nově připravených nanočástic bylo experimentálně prokázáno, že současně splňují výše uvedené požadavky (a-g). Kromě komerčně dostupných zlatých nanočástic o velikosti ~5 nm (dále Au5s; písmeno s na konci značí, že jde o sférické nanočástice) a zlatých nanočástic ~10 nm (dále Aul Os) tak nyní jsou k dispozici další typy nanočástic vhodné pro imunodetekci, které lze v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF nebo FESEM mikroskopu rozlišit podle velikostí, tvarů a/nebo chemického složení. Jedná se o nanočástice Ag, Pd, Pt a CO3O4 (tabulka 1). Celkem tedy existují dvě velikosti komerčních částic (Au5s, Aul Os), které jsou navzájem rozlišitelné, protože zlaté částice s rozměry vyššími než 12 nm (např. Aul5s) už neposkytují v ultrastrukturální diagnostice dostatečně citlivé značení. Shora zmíněnou dvojicí částic (Au5s, Aul Os) lze rozšířit pomocí připravených nanočástic (Ag, Pd, Pt, Co₃O₄), které jsou vždy navzájem rozlišitelné podle chemického složení, popřípadě i podle velikosti (stejně jako u nanočástic Au) a/nebo tvaru (v případě, že mají částice kubické, tetraedrické, tyčkovité či jiné, od koule rozlišitelné tvary). Rozšířená řada částic je použitelná pro tří- a vícenásobné značení v ultrastrukturální diagnostice. Přehled jednotlivých nanočástic lze najít v tabulce 1, podrobné popisy syntéz, konjugací s protilátkami a detekce nanočástic v elektronových mikroskopech lze nalézt v příkladech 1-3.

Nově připravené nanočástice obsažené v souboru pro imunoznačení mají tyto parametry:

• Ag = stříbrné nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm o chemické složení: Ag o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: cep o tvar: přibližně sférické, izometrické nanočástice • Pd = paladiové nanočástice s velikostí v rozsahu 5-15 nm o chemické složená: Pd o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: cpp o tvar:

při redukci PdCb citrátem sodným přibližně sférické, izometrické nanočástice s velikostí laditelnou v rozsahu 5 až 15 nm při redukci Na^PdCU] kyselinou askorbovou v přítomnosti polyvinylpyrrolidonu kubické nanočástice o průměrné velikosti v rozsahu 8-12 nm • Pt = platinové nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm o chemické složení: Pt o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: ccp o tvar:

při standardní syntéze přibližně sférické, izometrické nanočástice při přesném dodržení reakčních podmínek částice kubického tvaru • nanočástice oxidů kovů, např. CO3O4 = nanočástice oxidu kovu s velikostí v rozsahu 5 až 20 nm o chemické složení: Co₃O₄ = oxid kobaltnato-kobaltitý o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: kubická

-5CZ 304250 B6 o tvar:

při syntéze menších částic CO3O4 (<10 nm) převážně sférické tvary při syntéze větších částic CO3O4 (> 10 nm) se postupně vyvíj i kubická morfologie, při větších velikostech (>15 nm) částice převážně kubické

K připravené sadě nanočástic lze s výhodou přidat komerčně dostupné nanočástice typu kvantová tečka (QD neboli Qdot neboli Quantum dot), které mají chemické složení sulfidů nebo selenidů kadmia, zinku či berylia (CdS, CdSe, ZnS, ZnSe, BeS, BeSe) a velikost v rozsahu 5-21 nm.

Všechny připravené částice lze s výhodou modifikovat pomocí dihydrolipoové kyseliny, DHLA, C₈H_]6O₂S₂ (Garcia et al., 2005), což může usnadnit navazování proteinů na povrch nanočástic. Nežádoucí příměsí mohou být povrchově aktivní látky, které by zabraňovaly konjugaci proteinů na povrch nanočástic.

Složení alternativ souborů nanočástic ke značení je následující:

Obecně lze celý soubor nanočástic (2 typy komerčních (Au, QD) + 4 typy nových (Ag, Pd, Pt, CO3O4)) charakterizovat následovně:

• Všechny nanočástice lze rozlišit podle chemického složení.

o U nanočástic stejného složení lze rozlišovat ještě podle velikostí; pro každou částici lze v imunoznačení rozlišit dvě velikosti (např. pro komerčně dostupné částice zlata lze pro imunoznačení použít a rozlišit 6nm a 12nm částice) • Nesférické nanočástice (např. Pd, Pt, CO3O4 a QD) lze od sférických nanočástic rozlišit též podle tvaru.

o Pokud je v souboru více částic stejné velikosti a tvaru (např. kubických nanočástic Pd, Pt), lze je samozřejmě dále rozlišovat podle chemického složení.

Konkrétních souborů nanočástic pro více než dvojnásobné značení je mnoho variant, např.:

• trojnásobné značení:

o 2 velikosti Au + kubické částice Co₃O₄; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM o 2 velikosti Au + kubické částice Pt; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM

Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou kubickou nanočásticí CO3O4 jedné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm a kubické nanočástice CO3O4 mohou být volitelně nahrazeny kubickými nanočásticemi platiny nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5-15 nm) s nesférickou morfologií.

• čtyřnásobné značení:

o 2 velikosti Au + 2 velikosti Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM nebo TEM/DEX o 2 velikosti Au + Ag + Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM, FESEM, nebo TEM/EDX

Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň dvěma nanočásticemi paladia o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nepřesahuje 3 nm a nanočástice paladia mohou být volitelně nahrazeny nanočásticemi stříbra nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5 až 15 nm) a odlišného chemického složení.

-6CZ 304250 B6 • vícenásobnější značení:

o 2 velikosti Au + Ag + Pd + Pt; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM,

FESEM, nebo TEM/EDX

Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou nanočásticí stříbra, paladia a platiny, kde každý z prvků je jedné průměrné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 - Ukázka buněčného jádra s fluorescenční lokalizací tří antigenů.

Obr. 2 - Schéma sendvičového způsobu značení - primární protilátka rozeznává specificky antigen (červený trojúhelník), sekundární protilátka s navázanou značkou (nanočástice) se specificky váže na primární protilátku:.

Obr. 3 - Obvyklá distribuce nanočástic zlata o středních velikostech 5, 10, 15 a 20 nm s navázanými sekundárními protilátkami. Je vidět, že překryv se zvyšuje u větších částic, navíc částice větší než cca 10 nm se váží výrazně slaběji k primárním protilátkám.

Obr. 4 - Ideální mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - simulace identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra.

Obr. 5 - TEM mikrofotografie připravených částic Ag, Pd, Pt a CO3O4; zobrazené částice jsou AglOs, PdlOs, PtlOc, Colóc, přičemž symbol označující částici se skládá z kovového prvku charakterizujícího nanočástici, průměrné velikosti částice v nanometrech a označení tvaru (5 pro převážné sférické a c pro převážně kubické nanočástice); detailnější popis částic viz tabulka 1. Obr. 6 - Kontrola kvality a kalibrace množství navazované protilátky pomocí SDS elektroforézy.

Obr. 7 - Příklady různých koloidů úspěšně konjugovaných s protilátkami - detekce pomocí SDS elektroforézy. Komerční zlaté nanočástice (Au British BioCell International) byly použity jako pozitivní kontrola podmínek konjugace.

Obr. 8 - Příklad kalibrace množství navazované protilátky pomocí fluorescenční metody ELISA. První jamka je negativní kontrola bez přítomnosti nanočástic nebo protilátek, další dvě jamky obsahovaly 10 a 100 mikrolitrů koloidu nanočástic s konjugovanou protilátkou, dalších pět jamek obsahovalo protilátku ve zvyšujícím se množství, která sloužila ke kalibraci metody.

Obr. 9 - Rozlišení 2 nanočástic v SEM detekce (zpětně odražené elektrony - YAG, kryomod) Au 10 nm a Co kostky 18 nm.

Obr. 10 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony - YAG, kryo-mod) - Au 6 nm, Pt 10 nm a Co kostky 18 nm.

Obr. 11 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony - YAG, kryo-mod) - QD 6 nm, Au 10 nm a Co kostky 18 nm.

Obr. 12 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace transmisní elektronové mikroskopie a prvkové analýzy.

Obr. 13 - Rozlišení nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu podle tvaru pomocí defokusace.

-7CZ 304250 BÓ

Obr. 14 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace STEM/HAADF a prvkové analýzy pomocí

EDX detektoru.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava Pd nanočástic se sférickou morfologií a laditelnou velikostí v rozsahu 5 až 15 nm:

• Nanočástice PdlOs (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): 7,5 mL 9.3 χ I0¹ M roztoku PdCE (0.033 g bezvodého PdCE rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL) smícháno s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a

52,5 mL deionizované vody. Roztok byl zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem. Zásadní důležitost při přípravě hraje vysoká intenzita míchání v poměru k objemu roztoku (při objemu roztoku 75ml je třeba magnetické míchadlo o délce min 2 cm, rychlost nejméně 400 ot/min). Při nedostatečném míchání nelze reprodukovatelné připravit částice s požadovanou velikostí a úzkou distribucí velikostí. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.

• Nanočástice Pd06s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 6 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): analogická příprava jako u částic PdlOs stím, že před zahřátím roztoku je zvýšeno pH původního roztoku (pH = 6,25) o hodnotu 0,2 (pH = 6,45) pomocí 0,05% roztoku NaOH. Zásadní důležitost pro reprodukovatelnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku, stejně jako u nanočástic PdlOs. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.

• Nanočástice Pdl4s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 14 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): analogická příprava jako u částic PdlOs s tím, že oba roztoky (PdCl₂ i citrát sodný) byly třikrát koncentrovanější. Zásadní důležitost pro reprodukovatelnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku, stejně jako u nanočástic PdlOs. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.

Příklad 2

Příprava dalších typů nanočástic s různým chemickým složením a/nebo morfologií (sférické nanočástice Ag, kubické nanočástice Pd, Pt, Co₃O₄):

• Nanočástice PdlOs (sférické nanočástice Ag s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): nanočástice Ag se připraví redukcí vodného roztoku AgNO₃ pomocí Na[BH₄], Nejprve se rozpustí 3,5 mg suchého Na[BH₄] v 75 mL deionizované vody a vychladí v ledové lázni na 2 °C. Poté se k roztoku po kapkách přidá 9 mL 4,4x1 O^¹ M vodného roztoku AgNO₃. Klíčem k syntéze nanočástic požadované kvality je snížená koncentrace AgNO₃, přesná teplota roztoku Na[BH₄], rovnoměrné přidávání částic AgNO₃ a správný poměr celkového objemu a intenzity míchání. Při správném provedení má výsledný koloid jasně žlutou barvu.

• Nanočástice PdlOc (kubické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): připraví se 11 mL vodného roztoku obsahujícího 56 mg Na₂PdCl₄ (17.4 mM), 60 mg kyseliny L-askorbové (31 mM), 106 mg polyvinylpyrrolidonu (PVP; M = 10 000 g/mol; c = 87 mM) a 301 mg KBr (230 mM). Roztok se zahřívá pod refluxem při teplotě 100 °C po dobu 3h. Po skončení syntézy zpravidla vznikne sraženina, která se následujícím postupem převede na koloid vhodný pro konjugace: roztok sraženiny se naředí destilova-8CZ 304250 B6 nou vodou v poměru 1:3, dvakrát přefdtruje přes filtr 0,2 pm a přečistí dialýzou proti destilované vodě (cut-off dialyzačního střeva je 3500 g/mol), čímž se odstraní nízkomolekulámí příměsi. Při správném provedení dostaneme zcela rozdispergovaný koloid hnědé barvy.

• Nanočástice PtlOc (kubické nanočástice Pt s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): smíchá se 4 mL 1 mM vodného roztoku K₂[PtCl₄] se 4 mL 100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a zahřeje na teplotu 50 °C, dokud se nevyčeří. Poté se přidá 2 mL ledově vychlazeného Na[BH₄] (o teplotě 2 °C), doplní vodou do celkového objemu 10 mL a jehlou v septu se opouští vznikající H₂ po dobu 10 min. Nakonec se vyjme jehla a roztok se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 6 h. Kvůli následné konjugaci se roztok TTAB odstraní dialýzou. Při správném provedení syntézy má výsledný koloid tmavě hnědou barvu.

• Nanočástice Co08s (sférické nanočástice Co₃O₄ s průměrnou velikostí 8 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): ve 100 mL vody se rozpustí 1,2 g NaOH a 90 g NaNO₃. Roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min). Po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(NO₃)₂, přičemž se ihned vytvoří modrofialová sraženina. Poté se reakční směs zahřívá dalších 180 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem. Poté se reakce přeruší, koloid Co₃O₄ se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HCl. Následuje promytí, které vede k odstranění nezreagovaných látek a je klíčové pro úspěšnou přípravu nanočástic vhodných pro konjugace: v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu Co₃O₄ s roztokem HCl (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HCl a celý postup se 4x opakuje. V druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá po dobu nejméně 20 min při 6000 rpm. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.

• Nanočástice Co 16c (kubické nanočástice Co₃O₄ s průměrnou velikostí 16 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm): postup je stejný jako u nanočástic Co08s popsaných výše s tím, že zahřívání roztoku po vzniku modrofíalové sraženiny trvá 240 min. Za přesného dodržení všech reakčních podmínek se částice oproti Co08s dvojnásobně zvětší a nabudou kubické morfologie. Promývání, které je nezbytné pro odstranění nezreagovaných látek a úspěšné konjugace, je stejné jako v případě nanočástic Co08s. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.

Příklad 3

Konjugace protilátek na nanočástice a testování kvality konjugace.

• Nejprve se upraví pH roztoků nanočástic a protilátek pomocí 0.1M K₂CO₃ na hodnotu pH 8.0-8.5. Roztok protilátky je pak přidán k sólu nanočástic a intenzivně míchán po dobu 1 až 2 minut. K zamezení nespecifické vazby a agregace konjugovaných částic se pak přidá polyetylénglykol (PEG) do konečně koncentrace 0.25% nebo BSA do konečné koncentrace 0.25 mg/ml, směs je míchána dalších 5 minut a bez míchání pak inkubována 2 hodiny nebo přes noc při 4 °C. K odseparování konjugovaných nanočástic od volných protilátek se používá odstředění při 15000-25000 g. Objem 0.5-1 ml se odstřeďuje 45 minut až 1.5 hodiny při 4 °C za použití glycerolového gradientu 20%/10%, supernatant se odstraní a pelet je resuspendován v 1% roztoku PEG nebo BSA v 0.01M Na₃PO₄ o pH 7 až 8 a směs je nadále skladována při 4 °C. Úspěšná separace konjugovaných nanočástic je klíčová pro následující imunoznačení. Známé metody separace bylo nutno modifikovat, zejména optimalizovat rychlost a délku odstřeďování. Obecně pro optimalizaci množství konjugovaného proteinu platí, že po konjugaci s cca 90 až 250 pg protilátky (dle typu a koncentrace nanočástic) dochází k saturaci vazby protilátky na částice. Ke konjugaci je doporučeno vybrat množství protilátky nižší o cca

-9CZ 304250 B6 %, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby. K tomu slouží testování množství navázané protilátky, popsané v tomto příkladu dále.

• Množství přidávané protilátky je třeba adjustovat dle typu koloidu a koncentrace nanočástic. Množství navázaných protilátek se testuje a případně optimalizuje pomocí proteinové elektroforézy nebo pomocí ELISA detekce. Před elektroforézou se imunoglobuliny odštěpí z částic ve vzorkovém pufru, (50 mM Tris-HCl, 10% glycerol, 2% SDS, 100 mM dithiothreitol a 0.01% bromophenolová modř, pH 6.8), povaří se 1 minutu a nanese se na 10% gel. Po průběhu elektroforézy se rozdělené proteiny v gelu obarví PageBlue (Fermentas) a obsah proteinu v jednotlivých proužcích se kvantifikuje v infračerveném spektru (LI-COR Biosciences, USA). Pro kalibraci množství proteinu se na gel paralelně ke vzorku nanáší koncentrační série volné protilátky stejného typu, která byla použita pro konjugaci s nanočásticemi. To pak umožňuje kvantifikovat množství na částice vázané protilátky (příklad je uveden na Obr. 6). Další příklady průkazu úspěšnosti konjugace protilátek na nanočástice s různým prvkovým složením jsou uvedeny v Obr. 7. Tento průkaz má výhodu, že kromě detekce samotné protilátky by na gelu byly vidět i případné proteinové nečistoty, které se na nanočástice navázaly, anebo degradované fragmenty protilátek.

• Alternativním způsobem testování množství na nanočástice navázaných protilátek je fluorescenční průkaz standardním testem ELISA. Použita je obvyklá 96jamková plastová destička, do níž je napipetován roztok nanočástic s navázanou protilátkou. Protilátky se po 1 hod. inkubace za mírného třepání absorbují na plast jamky, poté je provedena detekce absorbované protilátky pomocí fluorescenční protilátky, jež specificky rozeznává typ protilátky s navázanými nanočásticemi. V paralelních jamkách je provedena inkubace se známým množstvím protilátky, která slouží ke kalibraci metody a k určení množství protilátky, vázané k nanočásticím. Příklad je doložen na Obr. 8.

Příklad 4

Příklad sady vhodných koloidních nanočástic různých kovů nebo oxidů kovů, lišících se svým atomovým číslem, jejichž kombinace lze využít k současnému vícenásobnému značení 2 až 4 různých antigenů na povrchu suchých nebo lomových a řezných plochách vitrifikovaného biologického preparátu pomocí skenovacího elektronového mikroskopu s vysokým rozlišením v oblasti detekce zpětně odražených elektronů:

Ag- Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm

Příprava: modifikovaný protokol řízené chemické redukce rozpustných solí Ag (příklad 2) nebo komerčně dostupné

Stabilita roztoku nanočástic: dostatečná Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná

Testovací podmínky FESEMu JEOL 740IF: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm

Au - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm Příprava: komerčně dostupné Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá Konjugace: proveditelná a popsaná (Roth, 1996)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm

-10CZ 304250 B6

Pd - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm

Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pd podle (příklad 1)

Stabilita roztoku nanočástic: dobrá

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná

Testovací podmínky FESEMu JEOL 740IF: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Pt - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm (kubické nebo sférické částice)

Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pt (příklad 2)

Stabilita roztoku nanočástic: dobrá

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Nanočástice oxidů kovů, např. CO3O4

Rozsah vhodných velikostí: 5 až 21 nm (kubické nebo sférické částice)

Příprava: modifikovaný protokol řízené oxidace rozpustných solí Co (příklad 2)

Stabilita roztoku nanočástic: dobrá

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Nanočástice typu kvantová tečka - QD

Rozsah vhodných velikostí: 5 až 21 nm (sférické nebo eliptické částice)

Příprava: komerčně dostupné

Konkrétní příklad vhodné částice: QD 655, chemické složení CdS

Další vhodná chemická složení nanočástic QD: CdSe, ZnS, ZnSe, BeS, BeSe

Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá

Konjugace: proveditelná analogicky jako u Au (Roth, 1996)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Všechny nanočástice byly jednoznačně charakterizovány pomocí TEM v režimech BF (bright field; z obrazové analýzy TEM/BF mikrofotografií určena velikost), EDX (energiově disperzní analýza paprsků X; pomocí TEM/EDX spekter ověřena chemická čistota) a SAED (selected-area electron diffraction; pomocí TEM/SAED potvrzena krystalická struktura).

Konkrétní příklady různých kombinací výše uvedených nanočástic zobrazených pomocí FESEM jsou zachyceny na obr. 9 až 11:

• Obrázek 9: příklad rozlišení dvou různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.

• Obrázek 10: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic zvýše uvedené sady ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.

• Obrázek 11: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu; sada nanočástic je s výhodou rozšířena o nanočástice typu QD 655 (kde částice QD 655 jsou nanočástice typu kvantová tečka o prvkovém složení CdS).

- 11 CZ 304250 Bó

Příklad 5

Příklad rozlišení tří typů nanočástic v EFTEM mikroskopu: na obr. 12 je znázorněná směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a QD 655 (kde nanočástice QD byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + QD 655 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2 s energetickým filtrem elektronů (tj. EFTEM). Užité měřítko odpovídá 50 nm. Nejdříve byl pořízen obrázek v běžném módu transmisní elektronové mikroskopie (tj. TEM), následovně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí energetického filtru elektronů za účelem rozlišování mezi QD 655 a zlatými částicemi. Na obr. 12 je v části A popsán obrázek v módu transmisní elektronové mikroskopie. Zlaté částice jsou kulaté a denzní, QD 655 jsou světlejší, mají protáhlý tvar a v důsledku rozdílné orientace jsou tvarově velmi heterogenní. 12nanometrové zlaté částice jsou na tomto obrázku spolehlivě odlišitelné od menších (6 nanometrových) zlatých částic a od QD 655. Mezi ónanometrovými zlatými částicemi a QD 655 může však v některých případech dojít k záměně, jak ukazují šipky č. 1 a 2. Dalším problémem může být vizualizace samotných QD 655, které jsou světlejší a mohou se ztrácet na podkladu s nerovnoměrným kontrastem (šipky č. 3). V části B na obr. 12 je znázorněna prvková mapa stejného vzorku. QD jsou složeny z několika prvků, mezi majoritní patří např. kadmium nebo síra, které se dají zmapovat pomocí energetického filtru elektronů, a odlišit tak QD od zlatých částic. Je vidět, že QD dávají silný signál na rozdíl od malých zlatých částic (šipky č. 1 a 2, odpovídají části A obr. 12). Zároveň je překonán i problém rozlišování světlejších QD od pozadí - při vizualizaci touto metodou získávají mnohem větší specifický kontrast (např. šipky č. 3, odpovídají obrázku A) aje tak detekováno nejméně 98% QD. V části C na obr. 12 je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného immunoznačení.

Příklad 6

Příklad rozlišení tří typů částic v TEM mikroskopu: sada nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a platinových částic o velikosti 12 nm ve tvaru krychle znázorněná na obr. 13 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2. Užité měřítko odpovídá 100 nm. V části A je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině fokusu. 6-nanometrové zlaté částice jsou spolehlivě odlišitelné podle velikostí, rozdíl mezi většími částicemi - 12 nanometrovým zlatém a 12 nanometrovou platinou není zřejmý (šipky č. 1 a 2). V části B je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině 6.5 mikrometrů nad fokusem. Jsou pozorovány difrakční jevy, kde krychlové platinové částice získávají „dutý“ vzhled a zřejmý čtvercový tvar (šipka 1), kulaté 12 nanometrové zlaté částice zůstávají tmavé (šipka 1). Malé zlaté částice se zobrazují také s bílým středem (šipka 3). V části C je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného imunoznačení.

Příklad 7

Příklad rozlišení tří typů nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu s EDX detektorem: na obr. 14 je znázorněna směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a Pd nanočástic (kde nanočástice Pd byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + Pd (10 nm) byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai Osiris s EDX detektorem. Užité měřítko odpovídá 200 nm. Nejdříve byl pořízen snímek pomocí STEM/HAADF, následně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí EDX detektoru za účelem rozlišení mezi zlatými a palladiovými částicemi. Na obr. 14 je v části a popsán obrázek v módu STEM/HAADF, kontrast je invertován pro lepší znázornění. Zlaté a paladiové částice jsou kulaté a denzní, malé zlaté částice jsou spolehlivě odlišitelné podle velikosti, velké zlaté částice a paladiové částice však v tomto módu se nedají odlišit. V části bac

- 12CZ 304250 B6 na obr. 14 jsou znázorněny prvkové mapy stejného vzorku, ukazující rozložení zlata a paladia.

V části d na obr. 14 je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného imunoznačení na základě jejich velikostí a prvkového složení.

Průmyslová využitelnost

Vynález slouží k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách (zejména ve virech, bakteriích, buňkách či tkáních nebo v jejich fragmentech) a popisu jejich interakcí, jehož výsledky jsou využitelné především v oblastech humánní a veterinární medicíny, zemědělství, bio- a nanotechnologií.

Claims (16)

1. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že soubor je tvořen z nejméně jednoho až dvou typů nanočástic zlata různé velikosti a jednoho nebo více typů nanočástic vybraných ze skupiny složené z nanočástic stříbra, paladia, platiny a oxidu kobaltu CO3O4, přičemž velikost nanočástic zlata, stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5 až 13 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 18 nm a šířka distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm, přičemž v případě nanočástic stejného složení se nanočástice liší průměrnou velikostí o nejméně 4 nm, a současně vždy jeden typ těchto nanočástic je nahraditelný nanočásticemi typu QD o prvkovém složení odpovídajícím vzorci sulfidu kadmia (CdS) nebo selenidu kadmia (CdSe) nebo sulfidu zinku (ZnS) nebo selenidu zinku (ZnSe) nebo sulfidu berylia (BeS) nebo selenidu berylia (BeSe), s průměrnou velikostí nanočástic typu QD v rozmezí 5 až 21 nm.

2. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že soubor je tvořen z nejméně jednoho typu sférických nanočástic stříbra a jednoho nebo více typů nanočástic vybraných ze skupiny složené z nanočástic paladia, platiny a oxidu kobaltu CO3O4, přičemž velikost nanočástic stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5 až 13 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 18 nm a šířka distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm, přičemž v případě nanočástic stejného složení se nanočástice liší průměrnou velikostí o nejméně 4 nm, a současně vždy jeden typ těchto nanočástic je nahraditelný nanočásticemi typu QD o prvkovém složení odpovídajícím vzorci sulfidu kadmia (CdS) nebo selenidu kadmia (CdSe) nebo sulfidu zinku (ZnS) nebo selenidu zinku (ZnSe) nebo sulfidu berylia (BeS) nebo selenidu berylia (BeSe), s průměrnou velikostí nanočástic typu QD v rozmezí 5 až 21 nm.

3. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic dle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že nejméně jeden typ nanočástic paladia a/nebo platiny a/nebo oxidu kobaltu CO3O4 má kubickou morfologii.

4. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nárok 1 až 3, vyznačující se tím, žek přípravě nanočástic paladia o průměrné velikosti 10 nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm je použito 7,5 mL 9.3 χ ΙΟ⁴ M roztoku PdCh (0.033 g bezvodého PdCb rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL), který je následně smíchán s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody, přičemž roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.

- 13 CZ 304250 B6

5. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, žekpřípravě nanočástic paladia o průměrné velikosti 6nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm je použito 7,5 mL 9.3 x 10⁴ M roztoku PdCl₂ (0.033 g bezvodého PdCl₂ rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL), který má pomocí 0,05% roztoku NaOH upravené pH 6,45, je následně smíchán s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody, přičemž výsledný roztok je zahříván kvaru po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.

6. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic paladia o průměrné velikosti 14nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: smíchání

22,5 mL 9.3 x 10 ⁴ M roztoku PdCl₂ (0.033 g bezvodého PdCl₂ rozpuštěno ve 4 mL IN HCI a doplněno vodou na 200 mL) se 45 mL 1% roztoku citrátu sodného a 7,5 mL deionizované vody, přičemž výsledný roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.

7. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nárokuj 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic stříbra o průměrné velikosti lOnm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: provedení redukce vodného roztoku AgNO₃ pomocí Na[BH₄], přičemž nejprve se rozpustí 3,5 mg suchého Na[BH₄] v 75 mL deionizované vodě a vychladí se v ledové lázni na 2 °C a poté se k roztoku za intenzivního míchání po kapkách přidá 9 mL 4,4x10'⁴ M vodného roztoku AgNO₃.

8. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic paladia o průměrné velikosti lOnm s kubickou sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: připraví se 11 mL vodného roztoku obsahujícího 56 mgNa₂PdCl₄ (17.4 mM), 60 mg kyseliny Laskorbové (31 mM), 106 mg polyvinylpyrrolidonu (PVP; M = lOOOOg/mol; c = 87 mM) a 301 mg KBr (230 mM), kde roztok se zahřívá pod refluxem při teplotě 100 °C po dobu 3h a po skončení syntézy se roztok sraženiny naředí destilovanou vodou v poměru 1:3, dvakrát přefiltruje přes filtr 0,2 gm a přečistí dialýzou proti destilované vodě (cut-off dialyzačního střeva 3500 g/mol).

9. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic platiny průměrné velikosti 1 Onm s kubickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: jsou smíchány 4 mL 1 mM vodného roztoku K₂[PtCl₄] se 4 mL 100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a roztok se zahřeje na teplotu 50 °C, dokud se nevyčeří, poté se přidá 2 mL roztoku Na[BH₄] ledově vychlazeného na 2 °C, doplní vodou do celkového objemu 10 mL a jehlou v septu se po dobu 10 min upouští vznikající H₂ po dobu lOmin, nakonec je vyjmuta jehla a roztok se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 6 h, přičemž z důvodu následné konjugace se roztok TTAB odstraní dialýzou.

10. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic oxidu kobaltu průměrné velikosti 8nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: ve 100 mL vody je rozpuštěno 1,2 g NaOH a 90 g NaNO₃, roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min), po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(NO₃)₂, poté se reakční směs zahřívá dalších 180 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem, poté se reakce přeruší, koloid Co₃O₄ se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HCI, následuje promytí, přičemž v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu Co₃O₄ s roztokem HCI (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu

- 14 CZ 304250 B6 rozdisperguje v HCI a celý postup se 4x opakuje, v druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá nejméně 20 min při 6000 rpm.

11. Způsob přípravy vzájemně rozlišitelných nanočástic ze souboru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že příprava nanočástic oxidu kobaltu Co₃O₄ průměrné velikosti 16nm s kubickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: ve 100 mL vody je rozpuštěno 1,2 g NaOH a 90 g NaNO₃, roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min), po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(NO₃)₂, poté se reakční směs zahřívá dalších 240 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem, poté se reakce přeruší, koloid Co₃O₄ se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HCI, následuje promytí, přičemž v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu Co₃O₄ s roztokem HCI (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HCI a celý postup se 4x opakuje, v druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá nejméně 20 min při 6000 rpm.

12. Způsob konjugace protilátek na soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že pH roztoků nanočástic a protilátek je upraveno pomocí 0.1M K₂CO₃ na hodnotu pH 8.0 až 8.5, roztok protilátky je poté přidán k sólu nanočástic a intenzivně míchán po dobu 1 až 2 minut, k zamezení nespecifické vazby a agregace konjugovaných částic je přidán polyetylénglykol (PEG) do konečné koncentrace 0.25% nebo BSA do konečné koncentrace 0.25 mg/ml, směs je míchána dalších 5 minut a bez míchání je poté inkubována 2 hodiny nebo přes noc při 4 °C, konjugované nanočástice jsou od volných protilátek odseparovány odstředěním při 15000 až 25000 g, objem 0.5 až 1 ml je odstřeďován po dobu 45 minut až 1.5 hodiny při 4 °C za použití glycerolového gradientu 20%/10%, supematant je odstraněn a pellet je resuspendován v 1% roztoku PEG nebo BSA v 0.01 M Na₃PO₄ o pH 7 až 8 a směs je nadále skladována při 4 °C.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že množství protilátky je nižší o 9 až 11 %, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby.

14. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách, zejména buňkách a tkáních.

15. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách.

16. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k popisu interakcí antigenů v biologických strukturách pomocí metod elektronové mikroskopie.