CZ21711U1 - Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení - Google Patents

Description

Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení

Oblast techniky

Technické řešení se týká souboru nanočástic o různé velikosti a/nebo různém prvkovém složení, které lze použít k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologíc5 kých strukturách (zejména buňkách a tkáních), k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v těchto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, přičemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou během imunocytochemické detekce. Dosavadní stav techniky io V současné době se pro imunoznačení používají téměř výhradně zlaté nanočástice a standardní transmisní elektronové mikroskopy (TEM). Z důvodů různých technických omezení to umožňuje současné citlivé značení pouze dvou molekul v buňce, což již dnešní molekulární biologii nepostačuje.

Molekulární a buněčná biologie je v současnosti jedním z nejdynamičtěji se rozvíjejících se věd15 nich oborů, který zasahuje do poznání podstaty fungování organismů včetně člověka a který má ohromné množství aplikačních výstupů např. do medicíny humánní i veterinární, zemědělství, bio- a nano-technologií. Poté, co došlo k osekvenování řady genomů včetně lidského, je k dispozici obrovský objem genetických dat, teprve se ale orientujeme ve fungování jednotlivých proteinů a pozvolna se vytváří mapy složitých struktumě-regulačních vztahů mezi jednotlivými makromolekulami (zejména proteiny). Právě proto pozorujeme obrovský nárůst požadavků na imunocytochemickou analýzu distribuce antigenů v buňkách či tkáních a popis jejich interakcí. Vývoj nových technologií světelné mikroskopie začal v relativně nedávné době umožňovat studium takových interakcí in šitu. V současné době jsme schopni pomocí fluorescenčních značek a vícekanálových konfokálních mikroskopů identifikovat různé makromolekuly zároveň a sledovat dynamiku reakcí v prostoru i čase. K identifikaci makromolekul se používají protilátky (nejčastěji imunoglobuliny typu IgG), které specificky rozeznávají jednotlivé antigeny (obvykle to jsou právě proteiny). K protilátce je navázána fluorescenční značka, která nám v mikroskopu umožní zjistit lokalizaci proteinu, který zkoumáme, v buňce či tkáni. Kombinace fluorescenčních značek dává možnost identifikovat zároveň více proteinů. Obr. 1 ukazuje na příkladu buněčného jádra fluorescenční lokalizaci tří antigenů najednou.

Tyto techniky ale mají jedno zásadní omezení - fyzikální zákony limitují rozlišení světelných mikroskopů na ~200 nm. Přitom právě makromolekulami komplexy, které jsou zodpovědné za hlavní buněčné děje, jako je např. čtení genetické informace či její zdvojování před buněčným dělením mají velikost mezi 30 až 100 nm. Nezbytností je tedy zkoumání pomocí elektronové mikroskopie, která se s novými postupy kryoprezervace vzorků, ultrastrukturální tomografie a imunoznačení stala opět nesmírně perspektivní technikou v poznávání funkční mikroarchitektury buněk a tkání - zejména v korelaci s fluorescenční mikroskopií živých buněk (pro přehled viz např. Lucie et al., 2005; Giepmans et al., 2006). Klasická transmisní elektronová mikroskopie dnes dosahuje rozlišení kolem 0,1 nm, tedy pro naprostou většinu biologických preparátů lepší, než potřebnou. Pro rozpoznání makromolekul musíme podobně jako v imunofluorescenci použít protilátky, na které bude umístěna vhodná značka. V elektronové transmisní mikroskopii se používají zlaté koloidní částice, které jsou elektrondensní a zobrazují se tedy jako tmavé částice (Roth 1996; Zuber et al., 2005). Obvykle se používá sendvičový způsob značení (Obr. 2), kdy primární protilátka rozeznává konkrétní antigen, který studujeme; sekundární protilátka, nesoucí zlatou partikuli, se pak váže na tuto primární protilátku. Dosud jedinou možností, jak rozlišit více antigenů, je použití směsi sekundárních protilátek, nesoucích zlaté částice o různé velikosti. Komerčně lze pořídit částice o velikostech kolem 5, 10, 15 a 20 nm již s navázanými sekundárními protilátkami - pochopitelně vždy s určitou fluktuací ve velikosti (Obr. 3). Tento způsob vícenásobného značení ale strádá zásadními problémy: při použití partikuli větších než 12 nm se dra-1CZ 21711 Ul maticky snižuje značící schopnost nejspíše v důsledku vzájemného odpuzování zlatých partikulí při vazbě protilátek na antigeny ležící blízko sebe a kvůli hmotnosti zlatých partikulí. Důsledkem je faktická nemožnost úspěšného provedení citlivého imunoznačení s ultrastrukturálním rozlišením pro více než dva antigeny.

V porovnání se světelnou mikroskopií je tedy současný stav v TEM mikroskopii značně omezující - zejména pokud si uvědomíme, s jakou různorodostí antigenů/proteinů dnes potřebuje molekulární biologie pracovat a zjišťovat jejich vzájemné interakce. Ideální situace spočívá v možnosti provádět citlivé ultrastrukturální imunoznačení s částicemi o velikostech blízkých 10 nm, které by se daly spolehlivě odlišit v elektronovém mikroskopu. V klasické elektronové mikroskopii by bylo ideální používat částice s různým tvarem. Ve speciálních technikách transmisní elektronové mikroskopie (zejména v technikách EFTEM, TEM/EDX, případně i STEM/HAADF, kde zkratka EFTEM označuje TEM mikroskopii s energiovou filtrací elektronů, TEM/EDX označuje TÉM mikroskopii s moderním výkonným systémem pro energiově disperzní analýzu paprsků X a STEM/HAADF označuje řádkovací TEM mikroskopii s detektorem elektronů rozptýlených do velkých úhlů) a řádkovací elektronové mikroskopie (zejména FESEM, kde zkratka FESEM označuje SEM mikroskopii s autoemisní tryskou a speciálními detektory zpětně odražených elektronů) je pro identifikaci možno využít různého prvkového složení partikulí. Velkým pokrokem by bylo vyvinout diagnostický systém, umožňující alespoň trojnásobné nebo čtyřnásobné citlivé značení. V posledních letech navrhovatelé z Ústavu molekulární genetiky (ÚMG) vyvíjeli algoritmy, které umožňují popis prostorových interakcí proteinů - zejména klastrování molekul (např. dimerizace molekul, vytváření homokomplexů), kolokalizace (vytváření heterokomplexů, účast různých proteinů v rámci jednoho funkčního komplexu), či mapování proteinů v rámci buňky (Philimonenko et al,, 2000; Schófer et al., 2004). Již jednoduchá kombinatorika ukazuje, že dvojnásobné značení molekul A a B umožňuje v jednom preparátu popsat pouze jednu interakci mezi různými molekulami (A-B) a dvě mezi shodnými molekulami (A-A, B-B). Simultánní značení čtyř antigenů by však umožnilo popis šesti interakcí mezi různými molekulami a čtyř interakcí mezi shodnými molekulami. Celkem tedy bychom v jednom preparátu namísto tří interakcí mohli najednou sledovat deset interakcí mezi biomolekulami. Názorným výstupem pak může být např. mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - příklad takového výsledku je uveden na obr. 4, kdy byla simulována identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra. Takovýto výsledek by se již vyrovnal v možnostech kombinace konfokálnímu obrazu z Obr. 1 a přitom by jej neporovnatelně předčil svým ultrastrukturálním rozlišením.

Dalším typem elektronové mikroskopie, kterou je možné díky značnému rozvoji v posledních letech spojenému se zvýšením její rozlišovací schopnosti použít k imuno lokalizaci, je skenovací elektronová mikroskopie (dále SEM). V tomto případě je možné značit antigeny na povrchu biologických vzorků a k detekci značky (markéru) v podobě koloidního zlata využít signálu zpětně odražených elektronů. U skenovacích elektronových mikroskopů s autoemisní tryskou (FESEM) vybavených speciálními detektory zpětně odražených elektronů, k nimž patří např. Autratův YAG detektor, byla prokázána schopnost detekovat kovové částice velikosti jednotek nm (Hermann R. et al., 1991). Další výhodou je citlivost signálu zpětně odražených elektronů na změny v prvkovém složení vzorku. Nanočástice tvořené různými těžkými kovy je možné pomocí tohoto signálu velmi dobře rozlišit (Erlandsen S. et al., 2003).

Metoda imunolokalizace v SEM je založena stejně jako v případě TEM na detekci antigenů pomocí protilátky, která je připojena na značku. A stejně jako v případě TEM se nejčastěji používá jako značek částic koloidního zlata. Na rozdíl od TEM, kde se zlaté nanočástice zobrazují jako denzní body, v případě FESEM je kontrast opačný - částice výrazně na povrchu preparátu svítí. Pro vícenásobné značení lze v současnosti použít maximálně dvou zlatých partikulí s výrazně rozdílným mediánem velikosti, aby bylo možné je v FESEM rozlišit.

Způsob přípravy biologických vzorků před vlastním prohlížením v elektronovém mikroskopu velmi ovlivňuje výsledek imunoznačení. Vzhledem k vysokému vakuu v FESEM je nezbytné biologický materiál dokonale zbavit vody. V případě použití skenovací ho elektronového mikro-2CZ 21711 Ul skopu vybaveného kryonástavcem lze tento problém vyřešit velmi jednoduše - voda v preparátu se rychle zmrazí během tzv. kryofixace a vlastní pozorování vzorku se děje v mikroskopu při velmi nízkých teplotách okolo -130 °C. Imunoznačení při tomto způsobu přípravy preparátu se provádí na odhaleném povrchu nativního vzorku před vlastním zmrazením, což je velmi výhodné z hlediska zachování schopnosti vázat značenou protilátku ve srovnání s chemickými způsoby přípravy.

Stav techniky je rovněž součástí odborné literatury:

Bratlie KM, Lee H, Komvopoulos K, Yang P, Somorjai GA: Nano Lett. 2007, 7, 3097-3101 Erlandsen S, Chen Y, Frethem C, Detry J, Wells C.: J. Microsc. 2003, 211, 212-218 ίο Feng J, Zeng HC: Chem. Mater. 2003, 15, 2829-2835

Garcia B, Salomé M, Lemelle L, Bridot J-L, Gillet P, Perriat P, Roux S and Tillement O: Chem. Commun., 2005, 369 - 371

Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY: Science 2006, 312, 217-224 Lucie V, Forster F, Baumeister W.: Annu Rev Biochem. 2005, 74, 833-865

Philimonenko AA, Janáček J and Hozák P: J. Struct. Biol, 2005, 132, 201-210 Roth J.: Histochem Cell Biol. 1996, 106,1-8

Schófer Ch., Janáček J, Weipoltshammer K, Pourani J and Hozák P: J. Struct. Biol. 2004, 147, 128-135

Turkevich J, KimG: Science 1970, 169, 873-879

Vlčkova B, Matějka P, Šimonova J, Čermáková K, Pancoska P, Baumruk V: J. Phys. Chem. 1993, 97, 9719-9729

Zuber C, Fan J, Guhl B, Roth J: Ultrastruct Pathol. 2005, 29, 319-330

Podstata technického řešení

Podstatou technického řešení je soubor vhodných typů nanočástic pro současné citlivé imuno25 značení tří a více antigenů v biologických preparátech.

Částice pro imunodetekci musí splňovat několik podmínek: (a) velikost (střední hodnota distribuce velikostí E) ideálně v rozsahu 5 až 12 nm, pro částice lehčích prvků 5 až 20 nm, (b) úzká distribuce velikostí (nízká hodnota směrodatné odchylky distribuce velikostí D), (c) dostatečná stabilita nanočástic v roztoku před konjugací protilátek, (d) chemicky definovaný povrch, nezne30 čištěné stabilizátory, které by znemožňovaly konjugaci protilátek, (e) dostatečný kontrast v TEM a FESEM mikroskopu, (f) dostatečná stabilita v TEM a FESEM mikroskopu, (g) možnost vázat protilátky na povrch nanočástic. Podle dostupných informací i provedených experimentů žádné v současnosti komerčně dostupné kovové nanočástice (s výjimkou Au) nesplňují všechny shora uvedené požadavky (a až g) současně.

Proto byly modifikovány způsoby přípravy nanočástic v roztoku řízenou chemickou redukcí rozpustných solí kovů M, kde M = Ag, Pd, Pt, Co. Všechny přípravy nanočástic jsou založeny na společném reakčním schématu, který lze shrnout následovně:

A: rozpustná B: redoxní Činidlo _{C: rO}xtok nanočástic sul kovu M* další látky + optimalizované ^ovit M nebo oxidu M_xO_y c, V, pH a rychlosti mícháni

Konkrétní příklady syntéz s popisem látek A, B, C a reakčních podmínek lze najít níže (Příklady

1 a 2). Základní principy syntéz koloidních částic jsou již popsány (např. Vlčkova et al., 1993;

-3CZ 21711 Ul

Turkevich et al., 1970; Bratlie et al., 2007; Feng et al., 2003), ale popsané postupy je nutné podstatně modifikovat pro získání Částic požadované kvality. Modifikace všech postupů spočívala v optimalizaci výchozích koncentrací, objemů, pH a rychlostí míchání tak, aby bylo dosaženo požadované velikosti nanočástic dle bodu (a), co nej užší distribuce velikostí kovových nanočástic dle bodu (b) a přitom aby byly splněny všechny další požadavky dle bodů (c až g). Výsledné parametry nanočástic jsou uvedeny níže v tabulce 1, jejich rozměry a stabilita pod elektronovým paprskem je ilustrována na obrázku 5.

Shora popsanými postupy byly získány nové, v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF a/nebo v FESEM mikroskopu navzájem rozlišitelné typy nanočástic. U všech nově připravených nanočástic bylo experimentálně prokázáno, že současně splňují výše uvedené požadavky (a až g). Kromě komerčně dostupných zlatých nanočástic o velikosti ~5 nm (dále Au5s; písmenko s na konci značí, že jde o sférické nanoěástíce) a zlatých nanočástic ~10 nm (dále AulOs) tak nyní jsou k dispozici další typy nanočástic vhodné pro imunodetekci, které lze v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF nebo FESEM mikroskopu rozlišit podle velikostí, tvarů a/nebo chemického složení. Jedná se o nanočástice Ag, Pd, Pt a Co_?O₄ (tabulka 1). Celkem tedy existují dvě velikosti komerčních částic (Au5s, AulOs), které jsou navzájem rozlišitelné, protože zlaté částice s rozměry vyššími než 12 nm (např, Aul5s) už neposkytují v ultrastrukturální diagnostice dostatečně citlivé značení. Shora zmíněnou dvojici částic (Au5s, AulOs) lze rozšířit pomocí připravených nanočástic (Ag, Pd, Pt, Co₃O₄), které jsou vždy navzájem rozlišitelné podle chemického složení, popřípadě i podle velikosti (stejně jako u nanočástic Au) a/nebo tvaru (v případě, že mají částice kubické, tetraedrické, tyčkovité či jiné, od koule rozlišitelné tvary). Rozšířená řada částic je použitelná pro tří- a vícenásobné značení v ultrastrukturální diagnostice. Příklady nanočástic lze najít v tabulce 1 níže, princip detekce nanočástic v ultrastrukturální diagnostice byl popsán výše (viz sekce Dosavadní stav techniky a obr. 1 až 5).

Nanočástic*

Typ	Značka	TvíM
Pd	Pd06s	sférický
Pd	PďlOs	sférický
Pd	Pd14s	sférický
Ag	Ag10s	sférický
Pt	PťlOc	kubický
COgOt	CoO8s	sférický
	Co16c	kubický

(nm)	(nm)	v roztoku
5-8	<2	ano
6-12	<3	ano
12-16	<3	ano
8-12	<3	ano
8-12	<3	ano
7-10	<3	ano
15-18	<3	ano

povtchu	TEM.SEM	TEM.SEM
ano	ano	ano
ano	ano	ano
ano	ano	ano
ano	ano	ano
dla úpravy	ano	ano
ano	ano	ano
ano	ano	ano

* E · průměrná velikost částic » střed číselné distribuce velikostí; závisí na podm. přípravy D ³ šířka distribuce velikostí částic - směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí

Nově připravené nanočástice obsažené v souboru pro imunoznačení mají tyto parametry:

- Ag = stříbrné nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm

- chemické složení: Ag

- směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm

- krystalická struktura: ccp

- tvar: přibližně sférické, isometrické nanočástice,

- Pd = paladiové nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm

- chemické složení: Pd

- směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm

- krystalická struktura: ccp

- tvar: přibližně sférické, isometrické nanočástice,

- Pt = platinové nanočástice s velikostí v rozsahu 5 až 15 nm

- chemické složení: Pt

- směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm

- krystalická struktura: ccp

-4CZ 21711 Ul

- tvar: přibližně sférické, isometrické nanočástice nebo při přesném dodržení reakčních podmínek částice kubického tvaru,

- nanočástice oxidů kovů, např. Co₃O₄ = nanočástice oxidu kovu s velikostí v rozsahu 5 až 20 nm

- chemické složení: Co₃O₄ = oxid kobaltnato-kobaltitý

- směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm

- krystalická struktura: kubická

- tvar: v případě CO3O4 menší částice (<10 nm) převážně sférické, s velikostí narůstá počet částic kubického tvaru, větší částice (>15 nm) převážně kubické.

K připravené sadě nanočástic lze s výhodou přidat komerčně dostupné nanočástice typu kvantová tečka (QD neboli Qdot neboli Quantum dot), které mají chemické složení sulfidů nebo selenidů kadmia, zinku či berylia (CdS, CdSe, ZnS, ZnSe, BeS, BeSe) a velikost v rozsahu 5 až 21 nm.

Všechny připravené částice lze s výhodou modifikovat pomocí dihydrolipoové kyseliny, DHLA, C₈H₁₆O₂S₂ (Garcia et al., 2005), což může usnadnit navazování proteinů na povrch nanočástic.

Nežádoucí příměsí mohou být povrchově aktivní látky, které by zabraňovaly konjugaci proteinů na povrch nanočástic.

Složení alternativ souborů nanočástic ke značení je následující:

Obecně lze celý soubor nanočástic (2 typy komerčních (Au, QD) + 4 typy nových (Ag, Pd, Pt, CO3O4)) charakterizovat následovně:

- Všechny nanočástice lze rozlišit podle chemického složení.

- U nanočástic stejného složení lze rozlišovat ještě podle velikostí; pro každou částici lze v imunoznačení rozlišit dvě velikosti (např. pro komerčně dostupné částice zlata lze pro imunoznačení použít a rozlišit 6 nm a 12 nm částice).

- Kubické nanočástice (např. Pt a Co₃O₄) lze od sférických nanočástic rozlišit též podle tvaru.

- Podle tvaru lze samozřejmě rozlišit i jiné typy částic z hlediska chemického (jiné složení, např. Ag, Pd) nebo morfologického (jiné vhodné tvary, např. tetraedry, oktaedry, tyčinky).

Konkrétních souborů nanočástic pro více než dvojnásobné značení je mnoho variant, např.:

- trojnásobné značení:

- 2 velikosti Au + kubické částice Co₃O₄; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM

- 2 velikosti Au + kubické částice Pt; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM

Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých mediánech velikosti lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou kubickou nanočástic! Co₃O₄ jedné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm a kubické nanočástice CO3O4 mohou být volitelně nahrazeny kubickými nanočásticemi platiny nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5 až 15 nm) s nesťérickou morfologií.

- Čtyřnásobné značení:

- 2 velikosti Au + 2 velikosti Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM nebo TEM/EDX

- 2 velikosti Au + Ag + Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM, FESEM, nebo TEM/EDX

Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých mediánech velikosti lišících se minimálně o 4 nm a alespoň dvěma nanočásticemi paladia o dvou různých mediánech velikosti lišících se minimálně o 4 nm, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nepřesahuje 3 nm a nanočástice paladia mohou být volitelně nahrazeny nanočásticemi stříbra nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5 až 15 nm) a odlišného chemického složení.

-5CZ 21711 Ul

- vícenásobnější značení:

- 2 velikosti Au + Ag + Pd + Pt; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM, FESEM, nebo TEM/EDX

Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých mediánech velikosti lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou nanočásticí stříbra, paladia a platiny, kde každý z prvků je jedné průměrné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 - Ukázka buněčného jádra s fluorescenční lokalizací tří antigenů.

io Obr. 2 - Schéma sendvičového způsobu značení - primární protilátka rozeznává specificky antigen (červený trojúhelník), sekundární protilátka s navázanou značkou (nanočástice) se specificky váže na primární protilátku.

Obr. 3 - Obvyklá distribuce nanočástic zlata o středních velikostech 5, 10, 15 a 20 nm s navázanými sekundárními protilátkami. Je vidět, že překiyv se zvyšuje u větších částic, navíc částice větší než cca 10 nm se váží výrazně slaběji k primárním protilátkám.

Obr. 4 - Ideální mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - simulace identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra.

Obr. 5 - TEM mikrofotografie připravených částic Ag, Pd, Pt a Co₃O₄; zobrazené částice jsou AglOs, PdlOs, PtlOc, Co 16c, přičemž symbol označující částici se skládá z kovového prvku cha20 rakterizujícího nanočástic i, mediánu velikosti v částice v nanometrech a označení tvaru (.v pro převážné sférické a c pro převážně kubické nanočástice); detailnější popis částic viz tabulka 1. Obr. 6 - Kontrola kvality a kalibrace množství navazované protilátky pomocí SDS elektroforézy.

Obr. 7 - Příklady různých koloidů úspěšně konjugováných s protilátkami - detekce pomocí SDS elektroforézy.

Obr. 8 - Příklad kalibrace množství navazované protilátky pomocí fluorescenční metody ELIS A. První jamka je negativní kontrola bez přítomnosti nanočástic nebo protilátek, další dvě jamky obsahovaly 10 a 100 mikrolitrů koloidu nanočástic s konjugovanou protilátkou, dalších pět jamek obsahovalo protilátku ve zvyšujícím se množství, která sloužila ke kalibraci metody.

Obr. 9 - Rozlišení 2 nanočástic v SEM detekce (zpětně odražené elektrony - YAG, kryo-mod) 30 Au 10 nm a Co kostky 18 nm.

Obr. 10 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony - YAG, kryo-mod) - Au 6nm, Pt 10 nm a Co kostky 18 nm.

Obr. 11 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony - YAG, kiyo-mod) - QD 6 nm, Au 10 nm a Co kostky 18 nm.

Obr, 12 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace transmisní elektronové mikroskopie a prvkové analýzy.

Obr. 13 - Rozlišení nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu podle tvaru pomocí defokusace.

Obr. 14 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace STEM/HAADF a prvkové analýzy pomocí

EDX detektoru.

-6CZ 21711 Ul

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Příprava Pd nanočástic se sférickou morfologií a ladíte lnou velikostí v rozsahu 5 až 15 nm:

- Nanočástice PdlOs (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 10 nm a Šířkou distribuce velikostí <3 nm):

7,5 mL 9,3 x 10'⁴ M roztoku PdCl₂ (0,033 g bezvodého PdCl₂ rozpuštěno ve 4 mL 1N HC1 a doplněno vodou na 200 mL) smícháno s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody. Roztok byl zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem. Zásadní důležitost při přípravě hraje vysoká intenzita míchání v poměru k objemu roztoku. Při nedostatečném míchání nelze reprodukovatelně připravit částice s požadovanou velikostí a úzkou distribucí velikostí. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.

- Nanočástice Pd06s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 6 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):

analogická příprava jako u částic PdlOs s tím, že před zahrátím roztoku je zvýšeno pH původního roztoku (pH 6,25) o hodnotu 0,2 (pH = 6,45) pomocí 0,05% roztoku NaOH. Zásadní důležitost pro reprodu kováte lnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.

-Nanočástice Pdl4s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 14 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):

analogická příprava jako u částic PdlOs s tím, že oba roztoky (PdCl₂ i citrát sodný) byly třikrát koncentrovanější. Zásadní důležitost pro reproduko vatě lnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.

Příklad 2

Příprava dalších typů nanočástic s různým chemickým složením (Ag, Pt, Co₃O₄) a různou morfologií (sférická, kubická):

- Nanočástice AglOs (sférické nanočástice Ag s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):

nanočástice Ag se připraví redukcí vodného roztoku AgNO₃ pomocí Na[BH₄], Nejprve se rozpustí 3,5 mg suchého Na[BPLt] v 75 mL deionizované vody a vychladí v ledové lázni na 2 °C. Poté se k roztoku po kapkách přidá 9 mL 2,2 χ 10³ M vodného roztoku AgNO₃. Klíčem k syntéze nanočástic požadované kvality je přesná teplota roztoku Na[BH₄], rovnoměrné přidávání částic AgNO₃ a správný poměr celkového objemu a intenzity míchání. Při správném provedení má výsledný koloid jasně žlutou barvu.

-Nanočástice PtlOc (kubické nanočástice Pt s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):

smíchá se 4 mL 1 mM vodného roztoku K₂[PtCl₄] se 4 mL 100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a zahřeje na teplotu 50 °C, dokud se nevyčeří. Poté se přidá 2 mL ledově vychlazeného Na[BH₄], doplní vodou do celkového objemu 10 mL a jehlou v septu se upouští vznikající H₂ po dobu 10 min. Nakonec se vyjme jehla a roztok se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 6 h. Při správném provedení syntézy má výsledný koloid tmavě hnědou barvu.

- Nanočástice Co08s (sférické nanočástice Co₃O₄ s průměrnou velikostí 8 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):

ve 100 mL vody se rozpustí 1,2 g NaOH a 90 g NaNO₃. Roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min). Po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co (NO₃)₂, přičemž se ihned vytvoří modrofíalová sraženina. Poté se reakční směs zahřívá dalších 180 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem. Poté se reakce přeruší, koloid Co₃O₄ se ochladí a

-7CZ 21711 Ul vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HC1. Postup promývání je následující: v prvním kroku se smíchá část roztoku koloidu CO3O4 s roztokem HC1 (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HC1 a celý postup se 4^X opakuje. V druhém kroku se predčištěný koloid 4* stejným způsobem jako výše protnyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá delší dobu a při 6000 rpm. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.

- Nanočástice Co 16c (kubické nanočástice Co₃O₄ s průměrnou velikostí 16 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):

postup je stejný jako u nanočástic Co08s popsaných výše s tím, že zahřívání roztoku po vzniku modrofialové sraženiny trvá 240 min. Za přesného dodržení všech reakčních podmínek se částice oproti Co08s dvojnásobně zvětší a nabudou kubické morfologie. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.

Příklad 3

Konjugace protilátek na nanočástice a testování kvality konjugace:

- Nejprve se upraví pH roztoků nanočástic a protilátek pomocí 0,1 M K₂CO₃ na hodnotu pH 9. Roztok protilátky je pak přidán k sólu nanočástic a intensivně míchán po dobu 2 až 5 minut. K zamezení nespecifické vazby a agregace konjugováných částic se pak přidá polyetylénglykol (PEG) do konečné koncentrace 0,25 %, směs je míchána dalších 15 minut a bez míchání pak inkubována přes noc při 4 °C. K odseparování konjugovaných nanočástic od volných protilátek se požívá odstředění při 50000 g. Objem 1 ml se odstřeďuje 8 hodin při 4 °C, supematant se odstraní a pellet je resuspendován v 1% roztoku PEG v 0,01 M Na₃PO₄ o pH 7 až 8 a směs je nadále skladována při 4 °C. Obecně pro optimalizaci množství konjugovaného proteinu platí, že po konjugaci s cca 50 až 90 mg protilátky (dle typu nanočástic) dochází k saturaci vazby protilátky na částice. Ke konjugaci je doporučeno vybrat množství protilátky nižší o cca 10 %, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby. K tomu slouží testování množství navázané protilátky, popsané v tomto příkladu dále.

- Množství přidávané protilátky je třeba adjustovat dle typu koloidu a koncentrace nanočástic. Množství navázaných protilátek se testuje a případně optimalizuje pomocí proteinové elektroforézy nebo pomocí ELIS A detekce. Před elektroforézou se imunoglobuliny odštěpí z částic ve vzorkovém pufru, (50 mM Tris-HCl, 10% glycerol, 2% SDS, 100 mM dithiothreitol a 0,01% bromophenolová modř, pH 6,8), povaří se 1 minutu a nanese se na 10% gel. Po průběhu elektroforézy se rozdělené proteiny v gelu obarví PageBlue (Fermentas) a obsah proteinu v jednotlivých kroužcích se kvantifikuje v infračerveném spektru (LI-COR Biosciences, USA). Pro kalibraci množství proteinu se na gel paralelně ke vzorku nanáší koncentrační série volné protilátky stejného typu, která byla použita pro konjugaci s nanočásticemi. To pak umožňuje kvantifikovat množství na částice vázané protilátky (příklad je uveden na Obr. 6). Další příklady průkazu úspěšnosti konjugace protilátek na nanočástice s různým prvkovým složením jsou uvedeny v Obr. 7. Tento průkaz má výhodu, že kromě detekce samotné protilátky by na gelu byly vidět i případné proteinové nečistoty, které se na nanočástice navázaly, anebo degradované fragmenty protilátek.

- Alternativním způsobem testování množství na nanočástice navázaných protilátek je fluorescenční průkaz standardním testem ELISA. Použita je obvyklá 96-jamková plastová destička, do níž je napipetován roztok nanočástic s navázanou protilátkou. Protilátky se po 1 hod, inkubace za mírného třepání absorbují na plast jamky, poté je provedena detekce absorbované protilátky pomocí fluorescenční protilátky, jež specificky rozeznává typ protilátky s navázanými nanočásticemi. V paralelních jamkách je provedena inkubace se známým množstvím protilátky, která slouží ke kalibraci metody a k určení množství protilátky, vázané k nanočásticím. Příklad je doložen na Obr. 8.

-8CZ 21711 Ul

Příklad 4

Příklad sady vhodných koloidních nanočástic různých kovů nebo oxidů kovů, lišících se svým atomovým číslem, jejichž kombinace lze využít k současnému vícenásobnému značení 2 až 4 různých antigenů na povrchu suchých nebo lomových a řezných plochách vitrifikováného biologického preparátu pomocí skenovacího elektronového mikroskopu s vysokým rozlišením v oblasti detekce zpětně odražených elektronů:

Ag - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm

Příprava: modifikovaný protokol řízené chemické redukce rozpustných solí Ag (příklad 2) nebo komerčně dostupné

Stabilita roztoku nanočástic: dostatečná

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná

Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Au - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm Příprava: komerčně dostupné Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá Konjugace: proveditelná a popsaná (Roth, 1996)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Pd - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm

Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pd (podle příkladu 1) Stabilita roztoku nanočástic: dobrá

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná

Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Pt - Rozsah vhodných velikostí: 5 až 15 nm (kubické nebo sférické částice)

Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pt (příklad 2)

Stabilita roztoku nanočástic: dobrá

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Nanočástice oxidů kovů, např. Co₃O₄

Rozsah vhodných velikostí: 5 až 21 nm (kubické nebo sférické částice)

Příprava: modifikovaný protokol řízené oxidace rozpustných solí Co (příklad 2)

Stabilita roztoku nanočástic: dobrá

Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Nanočástice typu kvantová tečka - QD

Rozsah vhodných velikostí: 5 až 21 nm (sférické nebo eliptické částice)

-9CZ 21711 Ul

Příprava: komerčně dostupné

Konkrétní příklad vhodné částice: QD 655, chemické složení CdS

Další vhodná chemická složení nanočástic QD: CdSe, ZnS, ZnSe, BeS, BeSe

Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá

Konjugace: proveditelná analogicky jako u Au (Roth, 1996)

Stabilita v elektronovém svazku: stabilní

Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezoluěním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 až 8 mm.

Všechny nanočástice byly jednoznačně charakterizovány pomocí TEM v režimech BF (bright ío field; z obrazové analýzy TEM/BF mikrofotografií určena velikost), EDX (energiově disperzní analýza paprsků X; pomocí TEM/EDX spekter ověřena chemická čistota) a SAED (selected-area electron diffraction; pomocí TEM/SAED potvrzena krystalická struktura).

Konkrétní příklady různých kombinací výše uvedených nanočástic zobrazených pomocí FESEM jsou zachyceny na obr. 9 až 11:

- Obrázek 9: příklad rozlišení dvou různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.

- Obrázek 10: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic z výše uvedené sady ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.

- Obrázek II: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic, které jsou s výhodou rozšířeny o nanočástice typu QD 655 (kde částice QD 655 jsou nanočástice typu kvantová tečka o prvkovém složení CdS).

Příklad 5

Příklad rozlišení tří typů nanočástic v EFTEM mikroskopu:

Na obr. 12 je znázorněná směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a QD 655 (kde nanočástice QD byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6nm) + QD 655 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2 s energetickým filtrem elektronů (tj. EFTEM). Užité měřítko odpovídá 50 nm. Nejdříve byl pořízen obrázek v běžném módu transmisní elektronové mikroskopie (tj. TEM), následovně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí energetického filt30 ru elektronů za účelem rozlišování mezi QD 655 a zlatými částicemi. Na obr. 12 je v části A popsán obrázek v módu transmisní elektronové mikroskopie. Zlaté částice jsou kulaté a denzní, QD 655 jsou světlejší, mají protáhlý tvar a v důsledku rozdílné orientace jsou tvarově velmi heterogenní. 12-nanometrové zlaté částice jsou na tomto obrázku spolehlivě odlišitelné od menších (6-nanometrových) zlatých částic a od QD 655. Mezi 6-nanometrovými zlatými částicemi a QD

655 může však v některých případech dojít k záměně, jak ukazují Šipky č. 1 a 2, Dalším problémem muže být vizualizace samotných QD 655, které jsou světlejší a mohou se ztrácet na podkladu s nerovnoměrným kontrastem (šipky č. 3). V části B na obr. 12 je znázorněna prvková mapa stejného vzorku. QD jsou složeny z několika prvků, mezi majoritní patří např, kadmium nebo síra, které se dají zmapovat pomocí energetického filtru elektronů, a odlišit tak QD od zlatých částic. Je vidět, že QD dávají silný signál na rozdíl od malých zlatých částic (šipky č. 1 a 2, odpovídají části A obr. 12). Zároveň je překonán i problém rozlišování světlejších QD od pozadí při vizualizaci touto metodou získávají mnohem větší specificky kontrast (např. šipky č. 3, odpovídají obrázku A) a je tak detekováno nejméně 98% QD. V části C na obr. 12 je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tri typů částic pro účely vícenásobného immunoznačení.

Příklad 6

Příklad rozlišení tri typů částic v TEM mikroskopu:

Sada nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a platinových částic o velikosti 12 nm ve tvaru krychle znázorněná na obr. 13 byla analyzována na

-10CZ 21711 Ul transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2. Užité měřítko odpovídá 100 nm. V části A je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině fokusu. 6-nanometrové zlaté částice jsou spolehlivě odliŠitelné podle velikostí, rozdíl mezi většími částicemi - 12-nanometrovým zlatém a 12-nanometrovou platinou není zřejmý (šipky č. 1 a 2). V části B je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině 6,5 mikrometrů nad fokusem. Jsou pozorovány difrakční jevy, kde krychlové platinové částice získávají „dutý“ vzhled a zřejmý čtvercový tvar (šipka 1), kulaté 12-nanometrové zlaté částice zůstávají tmavé (šipka 1). Malé zlaté částice se zobrazují také s bílým středem (šipka 3). V části C je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného immunoznačení.

io Příklad 7

Příklad rozlišení tří typů nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu s EDX detektorem:

Na obr. 14 je znázorněna směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a Pd nanočástic (kde nanočástice Pd byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + Pd (10 nm) byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu

Technai Osiris s EDX detektorem. Užité měřítko odpovídá 200 nm. Nejdříve byl pořízen snímek pomocí STEM/HAADF, následně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí EDX detektoru za účelem rozlišení mezi zlatými a paladiovými částicemi. Na obr. 14 je v části a popsán obrázek v módu STEM/HAADF, kontrast je invertován pro lepší znázornění. Zlaté a paladiové částice jsou kulaté a denzní, malé zlaté částice jsou spolehlivě odliŠitelné podle velikosti, velké zlaté částice a paladiové částice však v tomto módu se nedají odlišit. V Části b a c na obr. 14 jsou znázorněny prvkové mapy stejného vzorku, ukazující rozložení zlata a paladia. V Části d na obr. 14 je znázorněn výsledek, tj. spolehlivé rozlišování tri typů částic pro účely vícenásobného imunoznačení na základě jejich velikostí a prvkového složení.

Průmyslová využitelnost

Technické řešení slouží k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách (zejména ve virech, bakteriích, buňkách či tkáních nebo v jejich fragmentech) a popisu jejich interakcí, jehož výsledky jsou využitelné především v oblastech humánní a veterinární medicíny, zemědělství, bio- a nano-technologií.

Claims (6)

1. 30 1. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že je tvořen alespoň ze dvou typů nanočástic složených ze stříbra a/nebo paladia a/nebo platiny a/nebo oxidu kobaltu Co₃O₄, přičemž velikost nanočástic stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5 až 18 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 21 nm, a přičemž v případě nanočástic stejného prvkového složení se tyto nanočástice liší prů35 měrnou velikostí nejméně o 4 nm.
2. 2. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že je tvořen alespoň jedním typem nanočástic zlata a alespoň jedním typem nanočástic složených ze stříbra a/nebo paladia a/nebo platiny a/nebo oxidu kobaltu CO3O4, přičemž velikost nanočástic zlata, stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5 až 18 nm a

   40 velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 21 nm, a přičemž v případě nanočástic stejného prvkového složení se tyto nanočástice liší průměrnou velikostí nejméně o 4 nm.
3. 3. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, zeje tvořen alespoň jedním typem nanočástic zlata a dále alespoň

   - 11 CZ 21711 Ul jedním typem kubických nanočástic složených ze stříbra a/nebo paladia a/nebo platiny a/nebo oxidu kobaltu Co₃O₄, přičemž velikost nanočástic z lata, stříbra, paladia a platiny jev rozmezí 5 až 18 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5 až 21 nm, a přičemž v případě nanočástic stejného prvkového složení se tyto nanočástice liší průměrnou velikostí nejméně o
4. 4 nm.
5. 5 4. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic podle nároků laž3, vyznačující se tím, že alespoň jeden typ nanočástic je nahrazen nejméně jedním typem nanočástic typu QD, jejichž prvkové složení odpovídá sulfidu kadmia (CdS) a průměrná velikost je v rozmezí 5 až 21 nm, přičemž v případě stejného prvkového složení se daný typ nanočástic liší průměrnou velikostí nejméně o 4 nm.

   10 5. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic podle nároku 4, vyznačující se tím, že alespoň jeden typ nanočástic typu QD vykazuje odlišné prvkové složení odpovídající vzorci CdSe, ZnS, ZnSe, BeS nebo BeSe a průměrnou velikost v rozmezí 5 až 21 nm, přičemž v případě stejného prvkového složení se daný typ nanočástic liší průměrnou velikostí nejméně o 4 nm.
6. 6. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic podle nároků laž5, vyznačující se

   15 tím, že nanočástice jsou povrchově modifikovány pomocí dihydrolipoové kyseliny (DHLA, C₈H₁₆O₂S₂).