CZ2010647A3 - Soubor vzájemne rozlišitelných nanocástic, zpusob jejich prípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální znacení - Google Patents
Soubor vzájemne rozlišitelných nanocástic, zpusob jejich prípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální znacení Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010647A3 CZ2010647A3 CZ20100647A CZ2010647A CZ2010647A3 CZ 2010647 A3 CZ2010647 A3 CZ 2010647A3 CZ 20100647 A CZ20100647 A CZ 20100647A CZ 2010647 A CZ2010647 A CZ 2010647A CZ 2010647 A3 CZ2010647 A3 CZ 2010647A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- solution
- size
- ultrastructural
- preparation
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 204
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 52
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 44
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 claims abstract description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910000428 cobalt oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract 8
- IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N cobalt(ii) oxide Chemical compound [Co]=O IVMYJDGYRUAWML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 8
- 229910003446 platinum oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract 4
- 229910003445 palladium oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract 3
- 229910001923 silver oxide Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 80
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 22
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 8
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 5
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 4
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 3
- 229910002666 PdCl2 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 2
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 2
- PIBWKRNGBLPSSY-UHFFFAOYSA-L palladium(II) chloride Chemical compound Cl[Pd]Cl PIBWKRNGBLPSSY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 150000003346 selenoethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- CUXKZYSCZCNPNX-UHFFFAOYSA-N tetradecan-1-amine;hydrobromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[NH3+] CUXKZYSCZCNPNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N (fluoren-9-ylideneamino) n-naphthalen-1-ylcarbamate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1=NOC(=O)NC1=CC=CC2=CC=CC=C12 PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000005083 Zinc sulfide Substances 0.000 claims 4
- FQDSYGKTHDFFCM-UHFFFAOYSA-N beryllium sulfide Chemical compound S=[Be] FQDSYGKTHDFFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- CJOBVZJTOIVNNF-UHFFFAOYSA-N cadmium sulfide Chemical compound [Cd]=S CJOBVZJTOIVNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229910052980 cadmium sulfide Inorganic materials 0.000 claims 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims 2
- AQCDIIAORKRFCD-UHFFFAOYSA-N cadmium selenide Chemical compound [Cd]=[Se] AQCDIIAORKRFCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- UKGBSHWRVFPDKV-UHFFFAOYSA-N selanylideneberyllium Chemical compound [Se]=[Be] UKGBSHWRVFPDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N zinc;sulfide Chemical compound [S-2].[Zn+2] DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 claims 1
- ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N beryllium atom Chemical compound [Be] ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- JRTYPQGPARWINR-UHFFFAOYSA-N palladium platinum Chemical compound [Pd].[Pt] JRTYPQGPARWINR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JBJWASZNUJCEKT-UHFFFAOYSA-M sodium;hydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[Na+] JBJWASZNUJCEKT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 13
- 229910001922 gold oxide Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 238000000445 field-emission scanning electron microscopy Methods 0.000 description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 20
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 238000000286 energy filtered transmission electron microscopy Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 7
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 6
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 5
- 239000010944 silver (metal) Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 238000004098 selected area electron diffraction Methods 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 2
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 2
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 2
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- -1 beryllium sulfides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical group [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- IZFHEQBZOYJLPK-SSDOTTSWSA-N (R)-dihydrolipoic acid Chemical group OC(=O)CCCC[C@@H](S)CCS IZFHEQBZOYJLPK-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000366596 Osiris Species 0.000 description 1
- 229910021120 PdC12 Inorganic materials 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOYKPPXKLRXDBR-UHFFFAOYSA-N [O].[Co].[Co] Chemical compound [O].[Co].[Co] HOYKPPXKLRXDBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005285 chemical preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000010415 colloidal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- IZFHEQBZOYJLPK-UHFFFAOYSA-N dihydrolipoic acid Chemical group OC(=O)CCCCC(S)CCS IZFHEQBZOYJLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000724 energy-dispersive X-ray spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005293 physical law Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001350 scanning transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- SBIBMFFZSBJNJF-UHFFFAOYSA-N selenium;zinc Chemical compound [Se]=[Zn] SBIBMFFZSBJNJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- GGCZERPQGJTIQP-UHFFFAOYSA-N sodium;9,10-dioxoanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)C3=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C3C(=O)C2=C1 GGCZERPQGJTIQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Manufacture Of Metal Powder And Suspensions Thereof (AREA)
Abstract
Soubor vzájemne rozlišitelných nanocástic, zpusob jejich prípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální znacení. Soubor vzájemne rozlišitelných nanocástic zlata, stríbra, paladia, platiny a oxidu kobaltu o ruzné velikosti, tvaru a/nebo ruzném prvkovém složení, které lze použít k soucasnému vysoce citlivému imunoznacení trí nebo více oblastí v biologických strukturách, k imunocytochemické analýze distribuce antigenu v techto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, pricemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou behem imunocytochemické detekce.
Description
Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení
Oblast techniky
Vynález se týká souboru nanočástic o různé velikosti, tvaru a/nebo různém prvkovém složeni, které lze použít k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách (zejména buňkách a tkáních), imunocytochemické analýze distribuce antigenů v těchto biologických strukturách a k popisu jejich interakcí pomocí metod elektronové mikroskopie, přičemž antigenem se zde rozumí libovolná molekula, kterou chceme studovat a jejíž strukturní motiv je specificky rozeznáván protilátkou během imunocytochemické detekce. Dále toto citlivé značení v biologických strukturách nazýváme vícenásobné ultrastrukturální značení. Vynález se taktéž týká způsobu přípravy vhodného souboru nanočástic a způsobu konjugace protilátek na nanočástice tak, aby byl celý soubor použitelný pro vícenásobné ultrastrukturální značení.
Dosavadní stav techniky
V současné době se pro imunoznačení používají téměř výhradně zlaté nanočástice a standardní transmisní elektronové mikroskopy (TEM). Z důvodů různých technických omezení to umožňuje současné citlivé značení pouze dvou molekul v buňce, což již dnešní molekulární biologii nepostačuje.
Molekulární a buněčná biologie je v současnosti jedním z nejdynamičtěji se rozvíjejících se vědních oborů, který zasahuje do poznání podstaty fungování organismů včetně člověka a který má ohromné množství aplikačních výstupů např. do medicíny humánní i veterinární, zemědělství, bio- a nano-technologií, Poté, co došlo k osekvenování řady genomů včetně lidského, je k dispozici obrovský objem genetických dat, teprve se ale orientujeme ve fungování jednotlivých proteinů a pozvolna se vytváří mapy složitých strukturně-regulačních vztahů mezi jednotlivými makromolekulami (zejména proteiny). Právě proto pozorujeme obrovský nárůst požadavků na imunocytochemickou analýzu distribuce antigenů v buňkách či tkáních a popis jejich interakcí. Vývoj nových technologií světelné mikroskopie začal v relativně nedávné době umožňovat studium takových interakcí in sítu. V současné době jsme schopni pomocí fluorescenčních značek a vícekanálových konfokálních mikroskopů identifikovat různé makromolekuly zároveň a sledovat dynamiku reakcí v prostoru i čase. K identifikaci makromolekul se používáj í protilátky rozeznáváj í proteiny). K imunoglobuliny typu jednotlivé antigeny protilátce je navázána nám v mikroskopu umožní zjistit zkoumáme, v dává možnost igG), které specificky (obvykle to j sou právě fluorescenční značka, lokalizaci proteinu, buňce či tkáni. Kombinace fluorescenčních identifikovat zároveň více proteinů. Obr. 1 která který značek ukazuje na příkladu buněčného jádra fluorescenční lokalizaci tří antigenů najednou.
Tyto techniky ale mají jedno zásadní omezení - fyzikální zákony limitují rozlišení světelných mikroskopů na -200 nm. Přitom právě makromolekulární komplexy, které jsou zodpovědné za hlavní buněčné děje, jako je např. čtení genetické informace či její zdvojování před buněčným dělením mají velikost mezi 30 - 100 nm.
• · ·
Nezbytností je tedy zkoumáni pomocí elektronové mikroskopie, která se s novými postupy kryoprezervace vzorků, ultrastrukturální tomografie a imunoznačeni stala opět nesmírně perspektivní technikou v poznávání funkční mikroarchitektury buněk a tkání zejména v korelaci s fluorescenční mikroskopií živých buněk (pro přehled viz např.
Lucie et al., 2005; Giepmans et al., 2006). Klasická transmisní elektronová mikroskopie dnes dosahuje rozlišení kolem 0,1 nm, tedy pro naprostou většinu biologických preparátů lepší, nez potřebnou. Pro rozpoznání makromolekul musíme podobně jako v imunofluorescenci použít protilátky, na které bude umístěna vhodná značka. V elektronové transmisní mikroskopii se používají zlaté koloidní částice, které jsou elektrondensní a zobrazují se tedy jako tmavé částice (Roth 1996; Zuber et al·.,
2005) . Obvykle se používá sendvičový kdy primární protilátka rozeznává konkrétní antigen, který nesoucí zlatou partikuli, studujeme; sekundární protilátka, se pak váže na tuto primární protilátku. Dosud jedinou možností, jak rozlišit více antigenů, je použití směsi sekundárních protilátek, nesoucích zlaté částice o různé velikosti.
Komerčně lze pořídit částice o velikostech kolem 5, 10, a 20 nm již navázanými sekundárními protilátkami pochopitelně vždy s určitou fluktuací ve velikosti (Obr.
vícenásobného značení ale strádá zásadními problémy: při použití partikuli větších než nm se dramaticky snižuje značící schopnost nej spíše v důsledku vzájemného odpuzování zlatých partikul! při vazbě protilátek na antigeny ležící blízko sebe a kvůli hmotnosti zlatých partikuli. Důsledkem je faktická nemožnost úspěšného provedení citlivého imunoznačeni s ultrastrukturálním rozlišením pro více než dva antigeny.
V porovnání se světelnou mikroskopii je tedy současný stav v TEM mikroskopii značně omezující - zejména pokud si uvědomíme, s jakou různorodostí antigenů/proteinů dnes potřebuje molekulární biologie pracovat a zjišťovat jejich vzájemné interakce. Ideální situace spočívá v možnosti provádět citlivé ultrastrukturální imunoznačení s částicemi o velikostech blízkých 10 nm, které by se daly spolehlivě odlišit v elektronovém mikroskopu. V klasické elektronové mikroskopii by bylo ideální používat částice s různým tvarem. Ve speciálních technikách transmisní elektronové mikroskopie (zejména v technikách EFTEM, TEM/EDX, případně i STEM/HAADF, kde zkratka EFTEM označuje TEM mikroskopii s energiovou filtrací elektronů, TEM/EDX označuje TEM mikroskopii s moderním výkonným systémem pro energiově disperzní analýzu paprsků X a STEM/HAADF označuje řádkovací TEM mikroskopii s detektorem elektronů rozptýlených do velkých úhlů) a řádkovací elektronové mikroskopie (zejména FESEM, kde zkratka FESEM označuje SEM mikroskopii s autoemisni tryskou a speciálními detektory zpětně odražených elektronů) je pro identifikaci možno využít různého prvkového složení partikulí. Velkým pokrokem by bylo vyvinout diagnostický systém, umožňující alespoň trojnásobné nebo čtyřnásobné citlivé značení. V posledních letech navrhovatelé z Ústavu molekulární genetiky (ÚMG) vyvíjeli algoritmy, které umožňují popis prostorových interakcí proteinů zejména klastrování molekul (např. dimerizace molekul, vytváření homokomplexů), kolokalizace (vytváření heterokomplexů, účast různých proteinů v rámci jednoho funkčního komplexu), či mapování proteinů v rámci buňky (Philimonenko et al. , 2000;
Schofer et al., 2004). Již jednoduchá kombinatorika ukazuje, že dvojnásobné značení molekul A a B umožňuje v jednom preparátu popsat pouze jednu interakci mezi různými molekulami (A-B) a dvě mezi shodnými molekulami (A-A, B-B) . Simultánní značení čtyř antigenů by však umožnilo popis šesti interakcí mezi různými * · molekulami a čtyř interakcí mezi shodnými molekulami. Celkem tedy bychom v jednom preparátu namísto tří interakcí mohli najednou sledovat deset interakcí mezi biomolekulami. Názorným výstupem pak může být např. mapa rozložení a interakcí čtyř různých makromolekul - příklad takového výsledku je uveden na obr. 4, kdy byla simulována identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra. Takovýto výsledek by se již vyrovnal v možnostech kombinace konfokálnímu obrazu z Obr. 1 a přitom by jej neporovnatelně předčil svým ultrastrukturálním rozlišením.
Dalším typem elektronové mikroskopie, kterou je možné díky značnému rozvoji v posledních letech spojenému se zvýšením její rozlišovací schopnosti použít k imunolokalizaci, je skenovací elektronová mikroskopie (dále
SEM). V tomto případě je možné značit antigeny na povrchu biologických vzorků a k detekci značky (markéru) v podobě koloidního zlata využít signálu zpětně odražených elektronů. U skenovacích elektronových mikroskopů s autoemisní tryskou (FESEM) vybavených speciálními detektory zpětně odražených elektronů, k nimž patří např. Autratův YAG detektor, byla prokázána schopnost detekovat kovové částice velikosti jednotek nm (Hermann R. et al., 1991). Další výhodou je citlivost signálu zpětně odražených elektronů na změny v prvkovém složení vzorku. Nanočástice tvořené různými těžkými kovy je možné pomocí tohoto signálu velmi dobře rozlišit (Erlandsen S. et al., 2003).
Metoda imunolokalizace v SEM je založena stejně jako v případě TEM na detekci antigenu pomoci protilátky, která je připojena na značku. A stejně jako v případě TEM se nejčastěji používá jako značek částic koloidního zlata. Na rozdíl od TEM, kde se zlaté nanočástice zobrazuji jako denzní body, v případě FESEM je kontrast opačný - částice výrazně na povrchu preparátu svítí.
Pro vícenásobné značeni lze v současnosti použit maximálně dvou zlatých partikulí s výrazně rozdílnou průměrnou velikostí, aby bylo možné je v FESEM rozlišit.
Způsob přípravy biologických vzorků před vlastním prohlížením v elektronovém mikroskopu velmi ovlivňuje výsledek imunoznačení. Vzhledem k vysokému vakuu v FESEM je nezbytné biologický materiál dokonale zbavit vody. V případě použití skenovacího elektronového mikroskopu vybaveného kryonástavcem lze tento problém vyřešit velmi jednoduše - voda v preparátu se rychle zmrazí během tzv. kryofixace a vlastní pozorování vzorku se děje v mikroskopu při velmi nízkých teplotách okolo -130°C. Imunoznačení při tomto způsobu přípravy preparátu se provádí na odhaleném povrchu nativního vzorku před vlastním zmrazením, což je velmi výhodné z hlediska zachování schopnosti vázat značenou protilátku ve srovnání s chemickými způsoby přípravy.
Stav techniky je rovněž součásti oborné literatury:
Bratlie KM, Lee H, Komvopoulos K, Yang P, Somorjai GA: Nano Lett. 2007, 7, 3097-3101
Erlandsen S, Chen Y, Frethem C, Detry J, Wells C.: J. Microsc. 2003, 211, 212-218
Feng J, Zeng HC: Chem. Mater. 2003, 15, 2829-2835
Garcia B, Salomé M, Lemelle L, Bridot J-L, Gillet P, Perriat P,
Roux S and Tillement O: Chem. Commun., 2005, 369 - 371
Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY: Science 2006, 312, 217-224
Lucie V, Forster F, Baumeister W.: Annu Rev Biochem. 2005, 74,
833-865 ♦ ·
Philimonenko A. A., Janáček J. and Hozák P.: J. Struct. Biol.
2005, 132, 201-210
Roth J.: Histochem Cell Biol. 1996, 106, 1-8
Schdfer Ch., Janáček J. , Weipoltshammer K., Pourani J. and
Hozák P.: J. Struct. Biol. 2004, 147, 128-135
Turkevich J, Kim G: Science 1970, 169, 873-879
Vlčkova B, Matějka P, Šimonova J, Čermáková K, Pancoska P,
Baumruk V: J. Phys . Chem. 1993, 97, 9719-9729
Zuber C, Fan J, Guhl B, Roth J.: Ultrastruct Pathol. 2005, 29,
319-330
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je soubor vhodných typů nanočástic pro současné citlivé imunoznačení tří a více antigenů v biologických preparátech; součásti vynálezu je způsob přípravy daného souboru nanočástic, způsob konjugace protilátek na daný soubor nanočástic a způsob použití souboru nanočástic podle tohoto vynálezu k ultrastrukturálnímu značení.
Částice pro imunodetekci musí splňovat několik podmínek: (a) velikost (střední hodnota distribuce velikostí E) ideálně v rozsahu 5-12 nm, pro částice lehčích prvků 5-20 nm, (b) úzká distribuce velikostí (nízká hodnota směrodatné odchylky distribuce velikostí D) , (c) dostatečná stabilita nanočástic v roztoku před konjugací povrch, neznečištěné protilátek, stabilizátory, (d) chemicky definovaný které by znemožňovaly kontrast v TEM a FESEM
TEM a FESEM mikroskopu, (g) možnost vázat protilátky na povrch nanočástic. Podle dostupných informaci i provedených experimentů žádné v současnosti komerčně dostupné kovové nanočástice (s výjimkou Au) nesplňuji všechny shora uvedené požadavky (a-g) současně.
Proto byly modifikovány způsoby přípravy nanočástic v roztoku řízenou chemickou redukcí rozpustných solí kovů M, kde M = Ag, Pd, Pt, Co. Všechny přípravy nanočástic jsou založeny na společném reakčním schématu, který lze shrnout následovně:
A: rozpustná B: redoxní činidlo C: roztok nanočástic sůl kovu M11* další látky + optimalizované kovu M nebo oxidu MxOy c, V, pH a rychlosti míchání
Konkrétní příklady syntéz s popisem látek A, B, C a reakčních podmínek lze najít níže (Příklady 1 a 2). Základní principy syntéz koloidních částic jsou již popsány (např. Vlčkova et al., 1993; Turkevich et al., 1970; Bratlie et al·., 2007; Feng et al., 2003; Lim et al. 2009), ale popsané postupy je nutné podstatně modifikovat pro získání částic požadované kvality.
Modifikace všech postupů spočívala v optimalizaci výchozích koncentrací, objemů, pH a rychlostí míchání tak, aby bylo dosaženo požadované velikosti nanočástic dle bodu (a) nejužší distribuce velikostí kovových nanočástic dle bodu (b) a přitom aby byly splněny všechny další požadavky dle bodů (c-g) .
U sférických nanočástic Pd spočívala modifikace postupu zejména v zavedení velmi intenzivního míchání celého roztoku, jinak nebylo možno částice se zvolenou velikostí reprodukovátělně připravovat (nutné ke splnění požadavků a,
b) . U sférických nanočástic
Ag bylo nutné oproti původnímu receptu
5x snížit koncentraci výchozí stříbrné soli, jinak byly distribuce
nanočástic příliš široké a syntézy nebyly reprodukovatelné (nutné ke splnění požadavku b) . U kubických nanočástic Pd bylo nutné zavést speciální postup čistění nanočástic pomoci dialýzy (splněni požadavků c, d) . U kubických nanočástic Pt bylo nezbytné optimalizovat koncentrace (splnění požadavků a, b) a vyvinout postup čištění výsledného koloidu pomocí dialýzy (splněni požadavků c, d). U sférických i kubických nanočástic C03O4 bylo nutné optimalizovat způsob čištění výsledného koloidu (splnění požadavků c, d). Podrobný popis syntéz všech koloidů lze nalézt v příkladech 1-2.
Základní parametry nanočástic lze najit v tabulce 1. Mikrofotografie nanočástic dokumentující jejich stabilitu pod elektronovým paprskem demonstruje obrázek 5. Detailní popis přípravy nanočástic je obsahem příkladů 1 a 2. Detailní popis konjugace nanočástic je obsahem příkladu 3.
Tabulka 1
| Nanočástice | E 4 | £) ” | Stabilita | Čistota | Kontrast | Stabilita | ||
| Typ | Značka | Tvai | (11110 | (nint | v loztoku | poviclni | TEM. SEM | TEM.SEM |
| Pd | PdOGs | sférický | 5-8 | <2 | ano | ano | ano | ano |
| Pd | Pd10s | sférický | 8-12 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| Pd | Pd14s | sférický | 12-15 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| Ag | Ag10s | sférický | 8-12 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| Pt | Pt1Oc | kubický | 8-12 | <3 | ano | dle úpravy | ano | ano |
| C03O4 | Co08s | sférický | 7-10 | <3 | ano | ano | ano | ano |
| C03O4 | Co16c | kubický | 15-18 | <3 | ano | ano | ano | ano |
* E = průměrná velikost částic = střed číselné distribuce velikostí; závisí na podm. přípravy ” D = šířka distribuce velikostí částic = směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí
Shora popsanými postupy byl získán nový soubor nanočástic, které jsou navzájem rozlišitelné v TEM, EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF a/nebo v FESEM mikroskopu, konjugovatelné s protilátkami a tudíž využitelné pro vícenásobné ultrastrukturální značení.
Novost spočívá zejména ve vzájemné kombinaci nanočástic, která umožňuje jejich využití v ultrastrukturálním značení. Novost dále spočívá i v modifikovaném způsobu přípravy nanočástic a způsobu konjugace nanočástic s protilátkami.
U všech nově připravených nanočástic bylo experimentálně prokázáno, že současně splňují výše uvedené požadavky (a-g).
Kromě komerčně dostupných zlatých nanočástic o velikosti ~5 písmenko s na konci značí, že jde o sférické nanočástice) a zlatých nanočástic ~10
AulOs) tak nyní jsou k dispozici další typy nanočástic vhodné pro imunodetekci, které lze v TEM,
EFTEM, TEM/EDX, STEM/HAADF nebo FESEM mikroskopu rozlišit velikosti, tvarů a/nebo chemického složení. Jedná podle se o nanočástice Ag, Pd, Pt a C03O4 (tabulka 1) . Celkem tedy existují dvě velikosti komerčních částic (Au5s, AulOs), které jsou navzájem rozlišitelné, protože než 12 nm (např. Aul5s) už diagnostice dostatečně citlivé zlaté částice s rozměry vyššími neposkytují v ultrastrukturální značení. Shora zmíněnou dvojici částic (Au5s, AulOs) lze rozšířit pomocí připravených nanočástic (Ag, Pd, Pt, C03O4), které jsou vždy navzájem rozlišitelné podle chemického složení, popřípadě i podle velikosti (stejně jako u nanočástic Au) a/nebo tvaru (v případě, že mají částice kubické, tetraedrické, tyčkovité či jiné, od koule rozlišitelné tvary). Rozšířená řada částic je použitelná pro tří- a vícenásobné značení v ultrastrukturální diagnostice. Přehled jednotlivých nanočástic lze najít v tabulce 1, podrobné popisy syntéz, konjugací s protilátkami a detekce nanočástic v elektronových mikroskopech lze nalézt v příkladech 1-3.
Nově připravené nanočástice obsažené v souboru pro imunoznačení mají tyto parametry:
• Ag = stříbrné nanočástice s velikostí v rozsahu 5-15 nm ···♦ o chemické složeni: Ag o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: ccp o tvar: přibližně sférické, isometrické nanočástice
Pd = paladiové nanočástice s velikostí v rozsahu
5-15 nm chemické složení: Pd směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm krystalická struktura: ccp tvar:
při redukci PdC12 citrátem sodným přibližně sférické, isometrické nanočástice s velikostí laditelnou v rozsahu 5-15 nm při redukci kyselinou askorbovou v přítomnosti polyvinylpyrolidonu kubické nanočástice o průměrné velikosti v rozsahu 8- nm • Pt = platinové nanočástice s velikostí v rozsahu 5-15 nm o chemické složení: Pt o směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí (šířka číselné distribuce velikostí): <3 nm o krystalická struktura: ccp o tvar:
při standardní syntéze přibližně sférické, isometrické nanočástice při přesném dodržení reakčních podmínek částice kubického tvaru • nanočástice oxidů kovů, např. C03O4 = nanočástice oxidu kovu s velikostí v rozsahu 5-20 nm o chemické složení: Co304 = oxid kobaltnato-kobaltitý ·* ·*«· • * • « ·
• A ♦ ·
« ·· « * v ·♦ «· *
»« směrodatná odchylka číselné distribuce velikostí krystalická struktura: kubická tvar:
při syntéze menších částic Co304 (<10 převážně sférické tvary při syntéze větších částic C03O4 (>10 nm) s e postupně vyvíjí kubická morfologie, při větších částice převážně kubické
K připravené sadě nanočástic ze s výhodou přidat komerčně dostupné nanočástice typu kvantová tečka (QD neboli Qdot neboli
Quantum dot) , které mají chemické složení sulfidů nebo selenidů kadmia, zinku či berylia (CdS, CdSe, ZnS, ZnSe, BeS,
BeSe) a velikost v rozsahu 5-21
Všechny připravené částice lze s výhodou modifikovat pomocí dihydrolipoové kyseliny, DHLA, CgHigO2S2 (Garcia et al.,
2005), což může usnadnit navazování proteinů na povrch nanočástic.
Nežádoucí příměsí mohou být povrchově aktivní látky, které by zabraňovaly konjugaci proteinů na povrch nanočástic.
Obecně lze celý soubor nanočástic (2 typy komerčních (Au, QD) + typy nových (Ag, Pd, Pt, C03O4)) charakterizovat následovně:
• Všechny nanočástice lze rozlišit podle chemického složení.
o U nanočástic stejného složení lze rozlišovat ještě podle velikostí; pro každou částici lze v imunoznačení rozlišit dvě velikosti (např. pro komerčně dostupné «···
| 4 | « | ♦ 4 | * v * | |
| * | • * | 4 4 | ||
| J | * | * * | 4 · · | 4 · |
| 4 | • * | • * | ||
| ♦ · · · | 4 | ♦ 4 | *4 | K t* ♦ |
částice zlata lze pro imunoznačení použít a rozlišit 6nm a 12nm částice) • Nesférické nanočástice (např. Pd, Pt, C03O4 a QD) lze od sférických nanočástic rozlišit též podle tvaru.
o Pokud je v souboru více částic stejné velikosti a tvaru (např. kubických nanočástic Pd, Pt), lze je samozřejmě dále rozlišovat podle chemického složení.
Konkrétních souborů nanočástic pro více než dvojnásobné značení je mnoho variant, např.:
• trojnásobné značení:
o 2 velikosti Au + kubické částice C03O4; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM o 2 velikosti Au + kubické částice Pt; rozlišitelnost dle velikosti a tvaru v TEM a FESEM
Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou kubickou nanočástic! Co304 jedné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm a kubické nanočástice C03O4 mohou být volitelně nahrazeny kubickými nanočásticemi platiny nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5-15 nm) s nesférickou morfologií.
• čtyřnásobné značení:
o 2 velikosti Au + 2 velikosti Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složeni v EFTEM nebo TEM/EDX o 2 velikosti Au + Ag + Pd; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složení v EFTEM, FESEM, nebo TEM/EDX • v
Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň dvěma nanočásticemi paladia o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm, přičemž šířka číselné distribuce velikosti nepřesahuje 3 nm a nanočástice paladia mohou být volitelně nahrazeny nanočásticemi stříbra nebo jinými nanočásticemi vhodné velikosti (5-15 nm) a odlišného chemického složeni.
• vícenásobnější značení:
o 2 velikosti Au + Ag + Pd + Pt; rozlišitelnost dle velikosti a chemického složeni v EFTEM, FESEM, nebo TEM/EDX
Soubor nanočástic je zde tvořen alespoň dvěma nanočásticemi zlata o dvou různých průměrných velikostech lišících se minimálně o 4 nm a alespoň jednou nanočástic! stříbra, paladia a platiny, kde každý z prvků je jedné průměrné velikosti, přičemž šířka číselné distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 - Ukázka buněčného jádra s fluorescenční lokalizací tří antigenů.
Obr. 2 - Schéma sendvičového způsobu značeni - primární protilátka rozeznává specificky antigen (červený trojúhelník), sekundární protilátka s navázanou značkou (nanočástice) se specificky váže na primární protilátku.
• · · ·
Obr, 3 - Obvyklá distribuce nanočástic zlata o středních velikostech 5, 10, 15 a 20 nm s navázanými sekundárními protilátkami. Je vidět, že překryv se zvyšuje u větších částic, navíc částice větší než cca 10 nm se váží výrazně slaběji k primárním protilátkám.
Obr. 4 - Ideální mapa rozloženi a interakcí čtyř různých makromolekul - simulace identifikace čtyř proteinů se zakreslením do elektronmikroskopického obrazu buněčného jádra.
Obr. 5 - TEM mikrofotografie připravených částic Ag, Pd, Pt a C03O4; zobrazené částice jsou AglOs, PdlOs, PtlOc, Col6c, přičemž symbol označující částici se skládá z kovového prvku charakterizujícího nanočástici, průměrné velikosti částice v nanometrech a označení tvaru (s pro převážné sférické a c pro převážně kubické nanočástice); detailnější popis částic viz tabulka 1.
Obr. 6 - Kontrola kvality a kalibrace množství navazované protilátky pomocí SDS elektroforézy.
Obr. 7 Příklady různých koloidů úspěšně konjugovaných s protilátkami - detekce pomocí SDS elektroforézy. Komerční zlaté nanočástice (Au British BioCell Internátional) byly použity jako pozitivní kontrola podmínek konjugace.
Obr. 8 - Příklad kalibrace množství navazované protilátky pomocí fluorescenční metody ELISA. První jamka je negativní kontrola bez přítomnosti nanočástic nebo protilátek, další dvě jamky obsahovaly 10 a 100 mikrolitrů koloidu nanočástic s konjugovanou •
- 16 protilátkou, dalších pět jamek obsahovalo protilátku ve zvyšujícím se množství, která sloužila ke kalibraci metody.
Obr. 9 - Rozlišení 2 nanočástic v SEM detekce (zpětně odražené elektrony - YAG, kryomod) - Au 10 nm a Co kostky 18 nm.
Obr. 10 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony YAG, kryo-mod) - Au 6 nm, Pt 10 nm a Co kostky 18 nm.
Obr. 11 - Rozlišení 3 nanočástic (zpětně odražené elektrony YAG, kryo-mod) - QD 6 nm, Au 10 nm a Co kostky 18 nm.
Obr. 12 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace transmisní elektronové mikroskopie a prvkové analýzy.
Obr. 13 - Rozlišení nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu podle tvaru pomocí defokusace.
Obr. 14 - Rozlišení tří typů částic pomocí kombinace STEM/HAADF a prvkové analýzy pomocí EDX detektoru.
Příklady uskutečněni vynálezu
Příklad 1
Příprava Pd nanočástic se sférickou morfologií a laditelnou velikostí v rozsahu 5-15 nm:
• Nanočástice PdlOs (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou 7,5 mL 9.3 x 10~4 M roztoku rozpuštěno ve 4 mL 1N HC1 distribuce velikostí <3 nm):
PdCl2 (0.033 g bezvodého PdCls a doplněno vodou na 200 mL) «· ·**·
- 17 smícháno s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody. Roztok byl zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem. Zásadní důležitost při přípravě hraje vysoká intenzita míchání v poměru k objemu roztoku (při objemu roztoku 75 ml je třeba magnetické míchadlo o délce min 2 cm, rychlost nejméně 400 ot/min). Při nedostatečném míchání nelze reprodukovatelně připravit částice s požadovanou velikostí a úzkou distribucí velikostí. Při správném provedení má • Nanočástice Pd06s výsledný koloid žlutohnědou barvu.
(sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 6 nm šířkou distribuce velikostí <3 nm):
analogická příprava jako u částic PdlOs s tím, že před zahřátím roztoku je zvýšeno pH původního roztoku (pH
Zásadní hodnotu 0,2 důležitost (pH
6,45) pomocí 0,05% roztoku
NaOH.
pro reprodukovátelnou přípravu nanočástic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku, stejně jako u nanočástic PdlOs. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.
• Nanočástice Pdl4s (sférické nanočástice Pd s průměrnou velikostí 14 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):
analogická příprava jako u částic PdlOs s tím, že oba roztoky (PdC12 i citrát sodný) byly třikrát koncentrovanější. Zásadní důležitost pro reprodukovatelnou přípravu naiiočasLic dané velikosti má opět vysoká intenzita míchání roztoku, stejně jako u nanočástic PdlOs. Při správném provedení má výsledný koloid žlutohnědou barvu.
Příklad 2
Příprava dalších typů nanočástic s různým chemickým složením a/nebo morfologií (sférické nanočástice Ag, kubické nanočástice Pd, Pt, C03O4) :
«« ··»·
- 18 Nanočástice AglOs (sférické nanočástice
Ag průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm):
nanočástice Ag se připraví redukcí vodného roztoku AgNO3 pomocí Na[BH4] . Nejprve se v 75 mL deionizované vody a vychladí v ledové lázni na °C. Poté se k roztoku po kapkách přidá 9 mL vodného roztoku AgNO3. Klíčem k syntéze
4, 4xl0~4 M nanočástic požadované kvality je snížená koncentrace AgNO3, přesná teplota roztoku Na[BH4], rovnoměrné přidávání částic AgNO3 a správný poměr celkového objemu a intenzity míchání. Při správném provedení má výsledný koloid jasně žlutou barvu.
Nanočástice PdlOc nanočástice Pd s průměrnou velikostí nm šířkou připraví se 11 mL vodného roztoku obsahujícího 56 mg
Na2PdCl4 mg kyseliny L-askorbové (31
6 mg polyvinylpyrolidonu (PVP; M
10000 g/mol;
a 301 mg KBr (230 mM).
refluxem při teplotě 100 °C po dobu mM)
Roztok se zahřívá pod
3h. Po skončení syntézy zpravidla vznikne sraženina, která se následujícím postupem převede na koloid vhodný pro konjugace: roztok sraženiny se naředí destilovanou vodou v poměru 1:3, dvakrát přefiltruje přes filtr 0,2 μιη a přečistí dialýzou proti destilované vodě (cut-off dialyzačního střeva je 3500 g/mol), čímž se odstraní nízkomolekulární příměsi. Při správném provedení dostaneme zcela rozdispergovaný koloid hnědé barvy.
• Nanočástice PtlOc (kubické nanočástice Pt s průměrnou velikostí 10 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm) : smíchá se 4 mL 1 mM vodného roztoku K2[PtCl4] se 4 mL 100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a zahřeje na teplotu 50 °C, dokud se nevyčeří. Poté se přidá 2 mL ledově vychlazeného Na[BH4] (o teplotě 2°C), doplní vodou do celkového objemu 10 mL a jehlou v septu se upouští vznikající H2 po dobu 10 min. Nakonec se vyjme jehla a roztok se udržuje při teplotě 50 °C po dobu 6 h. Kvůli následné konjugaci se roztok TTAB odstraní dialýzou. Při správném provedení syntézy má výsledný koloid tmavě hnědou barvu.
• Nanočástice (sférické nanočástice Co304 s průměrnou velikostí 8 nm
100 mL vody se rozpustí 1,2 g NaOH a 90 g NaNCh. Roztok ve tříhrdlé baňce se refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min)
Po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá mL 1 M roztoku Co(N03)2, přičemž se ihned vytvoří modrotialová sraženina. Poté se reakční směs zahřívá dalších
180 min za neustálého míchání probublávání vzduchem.
Poté se reakce přeruší, koloid C03O4 se ochladí a vedlej ší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HC1.
Následuj e promytí, které vede k odstranění nezreagovaných látek a je klíčové pro úspěšnou přípravu nanočástic vhodných pro konjugace: v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu
C03O4 s roztokem HC1 centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HC1 a celý postup se 4x opakuje. V druhém kroku se předčištěný koloid
4x stejným
Γ7 nv O c/n. cm -í Izn Trý-op TrpHnn skutečnost, že centrifugace probíhá po dobu nejméně min při 6000 rpm. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.
• Nanočástice Col6c (kubické nanočástice C03O4 s průměrnou velikostí 16 nm a šířkou distribuce velikostí <3 nm) : postup je stejný jako u nanočástic Co08s popsaných výše s tím, že zahřívání roztoku po vzniku modrofialové sraženiny trvá 240 min. Za přesného dodržení všech
reakčních podmínek se částice oproti Co08s dvojnásobně zvětší a nabudou kubické morfologie. Promývání, které je nezbytné pro odstranění nezreagovaných látek a úspěšné konjugace, je stejné jako v případě nanočástic Co08s. Při správném provedení syntézy má koloid světle hnědou barvu.
Příklad 3
Konjugace protilátek na nanočástice a testování kvality konjugace.
• Nejprve se upraví pH roztoků nanočástic a protilátek pomocí
0.1M K2CO3 na hodnotu pH 8.0-8.5. Roztok protilátky je pak přidán k sólu nanočástic a intesivně míchán po dobu 1-2 minut. K zamezení nespecifické vazby a agregace konjugovaných částic se pak přidá polyetylénglykol (PEG) do konečné koncentrace 0.25% nebo BSA do konečné koncentrace 0.25 mg/ml, směs je míchána dalších 5 minut a bez míchání pak inkubována 2 hodiny nebo přes noc při 4°C. K odseparování konjugovaných nanočástic od volných protilátek se požívá odstředění při 15000-25000 g. Objem 0.5-1 ml se odstřeďuje 45 minut - 1.5 hodiny při 4°C za použití glycerolového gradientu 20%/10%, supernatant se odstraní a pellet je resuspendován v 1% roztoku PEG nebo BSA v 0.01M
Na3PO4 o pH
7-8 a směs je nadále skladována při 4°C. Úspěšná separace pro následující imunoznačení.
Známé metody separace bylo nutno modifikovat, zejména optimalizovat rychlost délku odstřeď ováni.
Obecně pro optimalizaci množství konj ugovaného proteinu platí, že po konjugaci s cca 90-250 pg protilátky (dle typu a koncentrace nanočástic) dochází k saturaci vazby protilátky na částice. Ke konjugaci je doporučeno vybrat množství protilátky nižší o cca 10%, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby. K tomu slouží »
*· · · testování množství navázané protilátky, popsané v tomto přikladu dále.
• Množství přidávané protilátky je třeba adjustovat dle typu koloidu koncentrace nanočástic.
Množství navázaných protilátek se testuje a případně optimalizuje pomocí proteinové elektroforézy nebo pomocí
ELISA detekce.
Před elektroforézou se imunoglobuliny odštěpí z částic ve vzorkovém pufru, (50 mM Tris-HCl, 10% glycerol, 2% SDS,
100 mM dithiothreitol a
0.01% bromophenolová modř, pH 6.8), povaří se 1 minutu a nanese se na 10% gel. Po průběhu elektroforézy se rozdělené proteiny v gelu obarví PageBlue (Fermentas) a obsah proteinu v jednotlivých proužcích se kvantifikuje v infračerveném spektru (LI-COR Biosciences, ke vzorku stejného kalibraci množství proteinu se na gel paralelně nanáší koncentrační série volné protilátky typu, která byla použita pro konj ugaci nanočásticemi.
To pak umožňuje kvantifikovat množství na částice vázané protilátky (příklad je uveden na Obr.
Další příklady průkazu úspěšnosti konjugace protilátek na nanočástice s různým prvkovým složením jsou uvedeny v Obr.
7. Tento průkaz má výhodu, že kromě detekce samotné protilátky by na gelu byly vidět i případné proteinové nečistoty, které se na nanočástice navázaly, anebo /—] r·--r y· —> r] ’τη ví cy učcji ci v cílit:
Alternativním způsobem testování množství na nanočástice navázaných protilátek je fluorescenční průkaz standardním testem ELISA. Použita je obvyklá
96-jamková plastová destička, do níž je napipetován roztok nanočástic s navázanou protilátkou.
Protilátky se po 1 hod.
inkubace za mírného třepání absorbují na plast jamky, poté je provedena detekce absorbované protilátky pomocí fluorescenční protilátky, jež specificky rozeznává typ
protilátky s navázanými nanočásticemi. V paralelních jamkách je provedena inkubace se známým množstvím protilátky, která slouží ke kalibraci metody a k určení množství protilátky, vázané k nanočásticím. Příklad je doložen na Obr. 8.
Přiklad 4
Příklad sady vhodných koloidních nanočástic různých kovů nebo oxidů kovů, lišících se svým atomovým číslem, jejichž kombinace lze využít k současnému vícenásobnému značení 2 až 4 různých antigenů na povrchu suchých nebo lomových a řezných plochách vitrifikovaného biologického preparátu pomoci skenovacího elektronového mikroskopu s vysokým rozlišením v oblasti detekce zpětně odražených elektronů:
Ag - Rozsah vhodných velikostí: 5-15 nm
Příprava: modifikovaný protokol řízené chemické redukce rozpustných solí Ag (příklad 2) nebo komerčně dostupné Stabilita roztoku nanočástic: dostatečná
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná
Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 2Ω uA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1-8 mm
Au - Rozsah vhodných velikostí: 5-15 nm
Příprava: komerčně dostupné
Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá
Konjugace: proveditelná a popsaná (Roth, 1996) Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1-8 mm
Pd - Rozsah vhodných velikostí: 5-15 nm
Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pd podle (příklad 1)
Stabilita roztoku nanočástic: dobrá
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: dostatečná
Testovací podmínky FESEMu JEOL 7401F; urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1 - 8 mm.
Pt - Rozsah vhodných velikostí: 5-15 nm (kubické nebo sférické částice)
Příprava: modifikovaný protokol řízené redukce rozpustných solí Pt (příklad 2)
Stabilita roztoku nanočástic: dobrá
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 μΑ, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1-8 mm.
Nanočástice oxidů kovů, např. Co304
Rozsah vhodných velikostí: 5-21 nm (kubické nebo sférické částice)
Příprava: modifikovaný protokol řízené oxidace rozpustných solí Co (příklad 2)
Stabilita roztoku nanočástic: dobrá
Konjugace: proveditelná (podle příkladu 3)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F: urychlovací napětí 15 kV, proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1-8 mm.
Nanočástice typu kvantová tečka - QD
Rozsah vhodných velikostí: 5 - 21nm (sférické nebo eliptické částice)
Příprava: komerčně dostupné
Kokrétní příklad vhodné částice: QD 655, chemické složení CdS
Další vhodná chemická složení nanočástic QD: CdSe, ZnS,
ZnSe, BeS, BeSe
Stabilita roztoku nanočástic: velmi dobrá
Konjugace: proveditelná analogicky jako u Au (Roth, 1996)
Stabilita v elektronovém svazku: stabilní
Testovací podmínky kryoSEMu JEOL 7401F; proudová hustota svazku 20 pA, detekce vysokorezolučním BSE detektorem, pracovní vzdálenost 7,1-8 mm.
Všechny nanočástice byly jednoznačně charakterizovány pomocí TEM v režimech BF (bright field; z obrazové analýzy TEM/BF mikrofotografii určena velikost), EDX (energiově disperzní analýza paprsků X; pomocí TEM/EDX spekter ověřena chemická čistota) a SAED (selected-area electron diffraction; pomocí TEM/SAED potvrzena krystalická struktura).
Konkrétní příklady různých kombinací výše uvedených nanočástic zobrazených pomocí FESEM jsou zachyceny na obr. 9-11:
• Obrázek 9: příklad rozlišení dvou různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.
• Obrázek 10: příklad rozlišeni tří různých typů nanočástic z výše uvedené sady ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu.
• Obrázek 11: příklad rozlišení tří různých typů nanočástic ve FESEM podle velikosti, tvaru a kontrastu; sada nanočástic je s výhodou rozšířena o nanočástice typu QD 655 (kde částice QD 655 jsou nanočástice typu kvantová tečka o prvkovém složení CdS) .
Přiklad 5
Příklad rozlišení tří typů nanočástic v EFTEM mikroskopu: na obr. 12 je znázorněná směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a QD 655 (kde nanočástice QD byly popsány výše v příkladu 4) . Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + QD 655 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2 s energetickým filtrem elektronů (tj . EFTEM) . Užité měřítko odpovídá 50 nm. Nejdříve byl pořízen obrázek v běžném módu transmisní elektronové mikroskopie (tj . TEM), následovně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí energetického filtru elektronů za účelem rozlišování mezi QD 655 a zlatými částicemi. Na obr. 12 je v části A popsán obrázek v módu transmisní elektronové mikroskopie. Zlaté částice jsou kulaté a denzní, QD 655 jsou světlejší, mají protáhlý tvar a v důsledku rozdílné orientace jsou tvarově velmi heterogenní. 12-nanometrové zlaté částice jsou na tomto obrázku spolehlivě odlišitelné od menších (6nanometrových) zlatých částic a od QD 655. Mezi 6-nanometrovými zlatými částicemi a QD 655 může však v některých případech dojít k záměně, jak ukazují šipky č. 1 a 2. Dalším problémem muže být vizualizace samotných QD 655, které jsou světlejší a mohou se ztrácet na podkladu s nerovnoměrným kontrastem (šipky č. 3) . V části B na obr. 12 je znázorněna prvková mapa stejného vzorku.
·*
QD jsou složeny několika prvků, kadmium nebo síra které se dají filtru elektronů, odlišit tak
QD ze QD dávají silný signál na a 2, odpovídáj i překonán i problém rozlišováni vizuali zaci touto metodou kontrast (např. šipky č.
detekováno nejméně 98% QD.
• · •· *· ♦ ·· · * mezi majoritní patří např.
zmapovat pomocí energetického od rozdíl části zlatých částic. Je vidět, od malých zlatých částic
A obr.
světlejších QD získávají mnohem
3, odpovídají
V části C na výsledek, tj . spolehlivé rozlišování tří vícenásobného immunoznačení.
Příklad 6
Příklad rozlišení tří typů částic v
12) . Zároveň je od pozadí větší obrázku A) typu
TEM při specifický a je tak je částic znázorněn pro účely mikros kopu:
sada nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a platinových částic o velikosti 12 nm ve tvaru krychle znázorněná na obr. 13 byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai 20 G2. Užité měřítko odpovídá
100 nm. V části A je zobrazení v módu transmisní elektronové mikroskopie v rovině fokusu. 6-nanometrové zlaté částice jsou spolehlivě odlišitelné podle velikostí, rozdíl mezi většími částicemi
12-nanometrovým zlatém a 12-nanometrovou platinou není zřejmý části B je zobrazení v módu mikroskopie v rovině
6.5 mikrometrů nad fokusem. Jsou pozorovány difrakční jevy, kde krychlové platinové částice získávají „dutý vzhled a zřejmý čtvercový tvar tří kulaté 12-nanometrové zlaté částice zůstávají tmavé (šipka
Malé zlaté
V části C typů částic
Příklad 7 částice se zobrazují také je znázorněn výsledek, tj.
s bílým středem (šipka spolehlivé rozlišování pro účely vícenásobného immunoznačení.
*· ···· • v
- 27 Příklad rozlišení tří typů nanočástic v transmisním elektronovém mikroskopu s EDX detektorem: na obr. 14 je znázorněna směs nanočástic koloidního zlata o velikosti 12 nm, koloidního zlata o velikosti 6 nm a Pd nanočástic (kde nanočástice Pd byly popsány výše v příkladu 4). Směs Au (12 nm) + Au (6 nm) + Pd (10 nm) byla analyzována na transmisním elektronovém mikroskopu Technai Osiris s EDX detektorem. Užité měřítko odpovídá 200 nm. Nejdříve byl pořízen snímek pomocí STEM/HAADF, následně na stejném místě vzorku bylo provedeno mapování prvků pomocí EDX detektoru za účelem rozlišení mezi zlatými a paladiovými částicemi. Na obr. 14 je v části a popsán obrázek v módu STEM/HAADF, kontrast je invertován pro lepší znázornění. Zlaté a paladiové částice jsou kulaté a denzní, malé zlaté částice jsou spolehlivě odlišitelné podle velikosti, velké zlaté částice a paladiové částice však v tomto módu se nedají odlišit. V části b a c na obr. 14 jsou znázorněny prvkové mapy stejného vzorku, ukazující rozložení zlata a paladia. V části d na obr. 14 je znázorněn výsledek, tj . spolehlivé rozlišování tří typů částic pro účely vícenásobného imunoznačení na základě jejich velikostí a prvkového složení.
Průmyslová využitelnost
Vynález slouží k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách (zejména ve virech, bakteriích, buňkách či tkáních nebo v jejich fragmentech) a popisu jejich interakcí, jehož výsledky jsou využitelné především v oblastech humánní a veterinární medicíny, zemědělství, bio- a nanotechnologií .
Claims (16)
- Patentově nároky1. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že je tvořen z jednoho až dvou typů nanočástic zlata různé velikosti a j ednoho nebo více typů nanočástic vybraných ze skupiny složené z nanočástic stříbra, paladia, platiny a oxidu kobaltuC03O4, přičemž velikost nanočástic zlata, stříbra, paladia platiny je v rozmezí 5-13 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5-18 nm a šířka distribuce velikosti nanočástic nepřesahuje 3 nm, přičemž v případě nanočástic stejného složení se nanočástice liší průměrnou velikostí o nejméně 4 nm, a současně vždy jeden typ těchto nanočástic je nahraditelný nanočásticemi typu QD o prvkovém složení odpovídajícím vzorci sulfidu kadmia (CdS) nebo selenidu kadmia (CdSe) nebo sulfidu zinku (ZnS) nebo selenidu zinku (ZnSe) nebo sulfidu berylia (BeS) nebo selenidu berylia (BeSe), s průměrnou velikostí nanočástic typu QD v rozmezí 5 až 21 nm.
- 2. Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že je tvořen z nsjméně jednoho typu sférických ncnočástic střibrs .¾ jednoho nebo více typů nanočástic vybraných ze skupiny složené z nanočástic paladia, platiny a oxidu kobaltu C03O4, přičemž velikost nanočástic stříbra, paladia a platiny je v rozmezí 5-13 nm a velikost nanočástic oxidu kobaltu je v rozmezí 5-18 nm a šířka distribuce velikostí nanočástic nepřesahuje 3 nm, přičemž v případě nanočástic stejného složení se nanočástice liší průměrnou velikostí o nejméně 4 nm, a současně vždy jeden typ těchto nanočástic je • · · * nahraditelný nanočásticemi typu QD o prvkovém složeni odpovídajícím vzorci sulfidu kadmia (CdS) nebo selenidu kadmia (CdSe) nebo sulfidu zinku (ZnS) nebo selenidu zinku (ZnSe) nebo sulfidu berylia (BeS) nebo selenidu berylia (BeSe) , s průměrnou velikostí nanočástic typu QD v rozmezí 5 až 21 nm.
- 3.Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic dle nároků1 a 2, vyznačený tím, že nejméně jeden typ nanočástic paladia a/nebo platiny a/nebo oxidu kobaltuC03O4 má kubickou morfologii.
- 4. Způsob přípravy nanočástic paladia pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že k přípravě nanočástic paladia o průměrné velikosti lOnm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm je použito 7,5 mL 9.3 x 104 M roztoku PdCl2 (0.033 g bezvodého PdCl2 rozpuštěno ve 4 mL 1N HC1 a doplněno vodou na 200 mL) , který je následně smíchán s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody, přičemž roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 4 0 0 o t/mi n.
- 5. Způsob přípravy nanočástic paladia pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že k přípravě nanočástic paladia o průměrné velikosti 6nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm je použito 7,5 mL 9.3 x ΙΟ“4 M roztoku PdCl2 (0.033 g bezvodého PdCl2 rozpuštěno ve 4 mL 1N HC1 a doplněno vodou na 200 mL) , který má pomocí 0,05% roztoku * ·- 31 NaOH upravené pH 6,45, je následně smíchán s 15 mL 1% roztoku citrátu sodného a 52,5 mL deionizované vody, přičemž výsledný roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.
- 6. Způsob přípravy nanočástic paladia pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že příprava nanočástic paladia o průměrné velikosti 14nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikosti menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: smíchání 22,5 mL 9.3 x 10~4 M roztoku PdCl2 (0.033 g bezvodého PdCl2 rozpuštěno ve 4 mL 1N HC1 a doplněno vodou na 200 mL) se 45 mL 1% roztoku citrátu sodného a 7,5 mL deionizované vody, přičemž výsledný roztok je zahříván k varu po dobu 6 h pod refluxem a míchání je při objemu roztoku 75 ml provedeno magnetickým míchadlem o délce min 2 cm a rychlostí nejméně 400 ot/min.
- 7. Způsob přípravy nanočástic stříbra pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že příprava nanočástic stříbra o průměrné velikosti lOnm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: provedení redukce vodného roztoku AgNCh pomocí Na [BH4] přičemž nejprve se rozpustí 3,5 mg suchého deionizované vodě a vychladí se v ledové lázni na 2 °C a poté se k roztoku za intenzivního míchání po kapkách přidá mL 4,4x10 4 M vodného roztokuAgNO3.
- 8. Způsob přípravy nanočástic paladia pro vícenásobné ultrastrukturální značeni, vyznačující se tím, že příprava nanočástic paladia o průměrné velikosti lOnm s kubickou morfologii a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: připraví se 11 mL vodného roztoku obsahujícího 56 mg Na2PdC14 (17.4 mM) , 60 mg kyseliny Laskorbové (31 mM) , 106 mg polyvinylpyrolidonu (PVP; M =10000 g/mol; c = 87 mM) a 301 mg KBr (230 mM) , kde roztok se zahřívá pod refluxem při teplotě 100 °C po dobu 3h a po skončení syntézy se roztok sraženiny naředí destilovanou vodou v poměru 1:3, dvakrát přefiltruje přes filtr 0,2 pm a přečistí dialýzou proti destilované vodě (cut-off dialyzačního střeva 3500 g/mol).
- 9. Způsob přípravy nanočástic platiny pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že příprava nanočástic platiny průměrné velikosti lOnm kubickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky:jsou smíchány 4 mL 1 mM vodného roztoku K2[PtCl4] se4 mL100 mM vodného roztoku TTAB (tetradecylamonium bromid) a roztok se zahřeje na teplotu50 °C, dokud se nevyčeří, poté ledově vychlazeného na 2 °C,
objemu 10 mL a jehlou v septu vznikáj ící H2 po dobu lOmin, roztok se udržuj e při teplotě Z dUVOdU na s1edne ko Π j U 3. C Θ dialýzou.se přidá 2 mL roztoku Na [BH4] doplní vodou do celkového se po dobu 10 min upouští nakonec je vyjmuta jehla a50 °C po dobu 6 h, přičemž r* rx í ci 1/ T T1 7\ O o ί ·_- x c a cv ix i i Au cx <4 o x. cl i i _i_ - 10. Způsob přípravy nanočástic oxidu kobaltu C03O4 pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že příprava nanočástic oxidu kobaltu průměrné velikosti 8nm se sférickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky: ve 100 mL vody je rozpuštěno 1,2 g NaOH a 90 g NaNO3( roztok ve tříhrdlé baňce- 33 se zahřívá na olejové lázni (105 °C) pod refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min) , po 30 min se k reakční směsi po kapkách přidá 20 mL 1 M roztoku Co(N03)2, poté se reakční směs zahřívá dalších 180 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem, poté se reakce přeruší, koloid Co304 se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HC1, následuje promytí, přičemž v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu C03O4 s roztokem HC1 (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HC1 a celý postup se 4x opakuje, v druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše
- 11.
promyj e nejméně vodou až 20 min při na skutečnost, že 6000 rpm. centrifugace probíhá Způsob přípravy nanočástic oxidu kobaltu Co 3Ο4 pro vícenásobné ultras trukturální značení, vyznačuj ici se tím, že příprava nanočástic oxidu kobaltu C03O4 průměrné velikosti16nm s kubickou morfologií a šířkou distribuce velikostí menší než 3 nm zahrnuje tyto kroky:ve 100 mL vody j e rozpuštěno 1,2 gNaOH a 90NaNO3, roztok ve tříhrdlé baňce se zahřívá na olejové refluxem, přičemž se reakční směs probublává vzduchem (50 mL/min), po 30 min se srTiěsi po20 mL 1 M roztoku Co(N03)2, poté se reakční směs zahřívá dalších 240 min za neustálého míchání a probublávání vzduchem, poté se reakce přeruší, koloid C03O4 se ochladí a vedlejší produkty se odstraní rozpuštěním ve 2M HC1, následuje promytí, přičemž v prvním kroku promývání se smíchá část roztoku koloidu C03O4 s roztokem HC1 (1:1), centrifuguje se při 3000 rpm po dobu 10 min, kapalina se dekantuje, usazenina se znovu rozdisperguje v HC1 a celý postup se 4x opakuje, v druhém kroku se předčištěný koloid 4x stejným způsobem jako výše promyje vodou až na skutečnost, že centrifugace probíhá nejméně 20 min při 6000 rpm. - 12. Způsob konjugace vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení, vyznačující se tím, že pH roztoků nanočástic a protilátek je upraveno pomocí 0. 1M K2CO3 na hodnotu pH 8.0-8.5, roztok protilátky je poté přidán k sólu nanočástic a intensivně míchán po dobu 1-2 minut, k zamezení nespecifické vazby a agregace konjugovaných částic je přidán polyetylénglykol (PEG) do konečné koncentrace 0.25% nebo BSA do konečné koncentrace 0.25 mg/ml, směs je míchána dalších 5 minut a bez mícháni je poté inkubována 2 hodiny nebo přes noc při 4°C, konjugované nanočástice jsou od volných protilátek odseparovány odstředěním při 15000-25000g, objem 0.5-1 ml je odstřeďován po dobu 45 minut - 1.5 hodiny při 4°C za použití glycerolového gradientu 20%/10%, supernatant je odstraněn a pellet je resuspendován v 1% roztoku PEG nebo BSA v 0.01M Na3PO4 o pH 7-8 a směs je nadále skladována při 4°C.
- 13, Způsob konjugace vzájemně rozlišitelných nanočástic podle nároku 12 vyznačující se tím, že množství protilátky je nižší o 9 až 11%, než je hodnota, při níž dochází k saturaci vazby.
- 14. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k současnému vysoce citlivému imunoznačení tří nebo více oblastí v biologických strukturách, zejména buňkách a tkáních.
- 15. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k imunocytochemické analýze distribuce antigenů v biologických strukturách.
- 16. Použití souboru pro vícenásobné ultrastrukturální značení podle nároků 1 až 3 k popisu interakcí antigenů v biologických strukturách pomocí metod elektronové mikroskopie.2oťO
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2010-647A CZ304250B6 (cs) | 2010-08-27 | 2010-08-27 | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2010-647A CZ304250B6 (cs) | 2010-08-27 | 2010-08-27 | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010647A3 true CZ2010647A3 (cs) | 2012-03-07 |
| CZ304250B6 CZ304250B6 (cs) | 2014-01-29 |
Family
ID=45768595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2010-647A CZ304250B6 (cs) | 2010-08-27 | 2010-08-27 | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic, způsob jejich přípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální značení |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ304250B6 (cs) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069962A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| US8323903B2 (en) * | 2001-10-12 | 2012-12-04 | Life Technologies Corporation | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
-
2010
- 2010-08-27 CZ CZ2010-647A patent/CZ304250B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ304250B6 (cs) | 2014-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xavier et al. | Protein-protected luminescent noble metal quantum clusters: an emerging trend in atomic cluster nanoscience | |
| Salvati et al. | Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles | |
| Lian et al. | Ultrasensitive detection of biomolecules with fluorescent dye-doped nanoparticles | |
| Fokkema et al. | Fluorescently labelled silica coated gold nanoparticles as fiducial markers for correlative light and electron microscopy | |
| Shang et al. | Ultrasmall fluorescent silver nanoclusters: protein adsorption and its effects on cellular responses | |
| Bae et al. | Endocytosis, intracellular transport, and exocytosis of lanthanide-doped upconverting nanoparticles in single living cells | |
| CN112725343B (zh) | 联合金纳米探针和CRISPR-Cas的蛋白标志物检测试剂盒及检测方法 | |
| AU2003279899A1 (en) | Nano-sized optical fluorescence labels and uses thereof | |
| JP2007506084A (ja) | ナノ粒子コンジュゲート及びその製造方法 | |
| KR20180005164A (ko) | 지속 발광성 코어/쉘 나노플레이트렛 | |
| US20080118912A1 (en) | Raman-Enhancing, and Non-Linear Optically Active Nano-Sized Optical Labels and Uses Thereof | |
| Dey et al. | Quantum dot: Novel carrier for drug delivery | |
| US11473152B2 (en) | Metal nanoshell-coated barcodes | |
| Zurbuchen et al. | Nanodiamond landmarks for subcellular multimodal optical and electron imaging | |
| Gao et al. | An “on–off–on” fluorescent nanoprobe for recognition of Cu 2+ and GSH based on nitrogen co-doped carbon quantum dots, and its logic gate operation | |
| KR100979727B1 (ko) | 금 할로우 나노입자 및 광학 이미징 기술을 이용한 암세포판별법 | |
| Liu et al. | Using time-shared scanning optical tweezers assisted two-photon fluorescence imaging to establish a versatile CRISPR/Cas12a-mediated biosensor | |
| US20130123145A1 (en) | Methods. particles, and assay kits for identifying presence of biological parameters | |
| Izdebska et al. | Ultrastructural localization of F-actin using phalloidin and quantum dots in HL-60 promyelocytic leukemia cell line after cell death induction by arsenic trioxide | |
| Sukhanova et al. | Fluorescent nanocrystal quantum dots as medical diagnostic tools | |
| CZ2010647A3 (cs) | Soubor vzájemne rozlišitelných nanocástic, zpusob jejich prípravy a jejich použití pro vícenásobné ultrastrukturální znacení | |
| Woolley et al. | From particle to platelet: optimization of a stable, high brightness fluorescent nanoparticle based cell detection platform | |
| US20180283995A1 (en) | Method and kit for multi-color cell imaging with dark field optical microscopy using conjugated noble metal nanoparticles as contrast agents | |
| CZ21711U1 (cs) | Soubor vzájemně rozlišitelných nanočástic pro vícenásobné ultrastrukturální značení | |
| US20180003709A1 (en) | Heterodimeric core-shell nanoparticle in which raman-active molecules are located at a binding portion of a nanoparticle heterodimer, use thereof, and method for preparing same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190827 |