CZ295411B6 - Deriváty kumarinu a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Bezpečné a účinné sloučeniny a látky odvozené z citrusů inhibující efekt prvního průchodu. Formulace obsahující sloučeniny a způsoby jejich výroby.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sloučenin účinkujících proti efektu prvního průchodu, prostředků a způsobů jejich použití, jejich výroby, syntézy a formulace. Sloučeniny a prostředky podle vynálezu jsou s výhodou ve formě doplňků k výživě nebo jako léčiva potravin nebo ve formě některého jiného typu potravinářského produktu nebo jako léčivo, farmaceutický nebo léčivý prostředek nebo v některé jiné fyzikální formě. Navíc k jiným funkcím mají sloučeniny a prostředky podle vynálezu inhibiční účinky na efekt prvního průchodu u léčiv podávaných ústy. Předkládaný vynález může být užitečný pro zvířata, zvláště savce a zejména člověka, kterým jsou podávána léčiva apod. podléhající efektu prvního průchodu.

Dosavadní stav techniky

Efekt prvního průchodu „first-pass effect“ u orálně podávaných léčiv označuje proces degradace léčiva při průchodu léčiva od počátečního spolknutí až po cirkulaci v krevním řečišti. Jak se často diskutuje z hlediska „biologické dostupnosti“, není neobvyklé, že orálně podávaná látka se musí podat v pětinásobném nebo vyšším množství než je nezbytné, v důsledku degradace, která probíhá v těle pacienta po příjmu léku. Vliv efektu prvního průchodu je možno ukázat například u antihistaminika terfenadinu, kde je 99,5 % tablety podané ústy rychle změněno na metabolity; biologická dostupnost terfenadinu je tedy přibližně 0,5 % (D. Garteiz a další, Arzneim.-Forsch., 1982; 32:1185 - 1190). Dalším příkladem je cyklosporin A, který se podává pacientům s transplantací orgánů a který má střední biologickou dostupnost pří podávání ústy přibližně 30 % a u jednotlivých pacientů v rozmezí přibližně 8 až 92 %. Pro tyto velké rozdíly mezi jednotlivci v biologické dostupnosti cyklosporinu je nutné v průběhu zahájení léčby často monitorování koncentrací v krvi.

Inhibice konkrétního metabolismu xenobiotických látek jako mechanismus působení obecně stejně jako inhibice efektu prvního průchodu chemickými činidly specificky, jsou v oboru dobře známy delší dobu. Mezi příklady patří léčení otravy methanolem pomocí ethanolu a inhibice efektu prvního průchodu u cyklosporinu ketokonazolem, viz např. First, R. M. a další, The Lancet, 1198, 18, listopad 1989, který se zařazuje odkazem.

Ačkoliv činitel (činitelé) typ enzymu (enzymů), biologické pochody apod. odpovědné za efekt prvního průchodu nebyly ještě úplně identifikovány, výzkum se zaměřil na prostředky schopné inhibovat systém cotychromu P450. Inhibice systému P450 je in vitro modelem pro určení zvýšení biologické dostupnosti in vivo, pro úplnější popis systému P450 viz např. patenty US 5 478 723 a 5 567 592, oba zařazené odkazem. Jak se uvádí v A. Keogh a další (N. Engl. J. Med., díl 333, No. 10, str. 628, 1995) a S. Butman a další (J. Heart Lung Transpl., díl 10, No. 3, str. 351, 1991), dávka cyklosporinu nutná u pacientů s transplantací srdce by mohla být při souběžném podávání s ketokonazolem snížena přibližně o 85 %. Z ekonomického hlediska obě tyto reference odhadují, že úspory nákladů by byly přibližně 5000 USD na pacienta za rok. Mezi další léčiva, která podléhají efektu prvního průchodu a jejichž biologická dostupnost se zvyšuje inhibitory obecně podávanými člověku, patří midazolam (K. Olkkola a další, Clin. Pharmacol. Ther., 1993, 53: 298-305), terfenadin (Seldane®) (P. Honig a další, JAMA, díl 269, No. 12,1513, 1993) a triazolam (Varhe, A. a další, Clin. Pharmacol. Ther., 1994, 56: 601-7).

Navíc ke ketokonazolu byly jako inhibitory efektu prvního průchodu navíc k vlastním farmakologickým účinkům těchto látek identifikovány flukonazol, ritonavir, itrakonazol, mikonazol, erythromycin a troleandromycin. Tyto sloučeniny mají však antivirové, antimikrobiální nebo antifungální účinky. Protože jsou v současnosti zvýšené obavy ze skutečnosti, že nadměrné používání těchto látek může vést k rezistentním mikrobiálním kmenům, protože některé nebo

-1 CZ 295411 B6 většina účinných inhibitorů jsou antimikrobiální látky, a protože pacienti s transplantacemi a pacienti s infekcí HIV mají oslabený imunitní systém, použití těchto inhibitorů efektu prvního průchodu má podstatné nevýhody a například v případě ketokonazolu se účelové podávání tohoto inhibitoru s léčivy podléhajícími efektu prvního průchodu nerozšířilo. Objevování se rezistence na antifungální léčiva u pacientů s oslabenou imunitou je již známo (T. J. Walsh: „Emergence of Antifungal Drug Resistance in Immunocompromised Patients“, Seminář, National Institutes of Health, 7. únor 1996; Georgopapadakou, N. H., a další, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, únor 1996, str. 279-291).

Dietní doplňky, léčiva, sloučeniny, extrakty apod. založené na materiálech izolovaných z přírody se stále více studují a zpřístupňují spotřebitelům. Tento trend je z velké části způsoben tím, že se stalo rutinní získání patentové ochrany pro tyto látky (viz například patenty US 4 708 948 5 409 938, 5 314 899 5 591 770 a 5 654 432 všechny zařazeny odkazem). Nepřekvapuje, že tento směr se nyní rozšiřuje i na látky ovlivňující první průchod.

V roce 1991, uvedli Bailey a další (Bailey, D. G. a další, The Lancet, díl 337, 2. února 1991, str. 268, zařazeno odkazem), že grapefruitová šťáva zvýšila biologickou dostupnost felodipinu a ukázali, že jejich objevy by mohla vysvětlit inhibice enzymů cytochromu P450 bioflavonoidy. Identifikace bioflavonoidů jako účinné složky v grapefruitové šťávě byla ihned provedena autoiy R. Chayen a další (The Lancet, díl 337, 6. dubna 1991, str. 854), kteří navrhli, že aktivními složkami v grapefruitové šťávě, odpovědnými za inhibici efektu prvního průchodu, jsou seskviterpenoidní sloučeniny spíše než flavonoidy. Ačkoliv autorům Baileymu a Edgarovi byl udělen patent (patent US 5 229 116, zařazený odkazem) na způsob zvýšení biologické dostupnosti farmaceutického prostředku společným podáváním flavonoidu jako je naringin, jejich poslední práce vyvolala otázku přesnosti jejich počáteční identifikace flavonoidů jako účinné složky, viz např. Bailey a další, Clin. Pharmacokinet. 26 (2): 91 - 98, 1994, zvláště str. 95 a 96, viz také Edwards, D. J. a další, Life Sciences, díl 59, No. 13, str. 1025-1030, 1996.

Udávané účinky grapefruitové šťávy jako účinného inhibitoru efektu prvního průchodu vedly k početným výzkumným článkům týkajícím se inhibice prvního průchodu grapefruitovou šťávou, například u léčiv ze skupiny nifedipin, nitrendipin, nisoldipin, cyklosporin A, midazolam, triazolam, kumarin a kofein. Jak se tyto výsledky stávaly známější, tzv. „efekt grapefruitového džusu“ se stal předmětem novinových článků, zpráv a lékařských textů určených pro veřejnost, viz např. „The Medical Letter“, díl 37 (855) 18. srpen 1995, The Peoples Pharmacv, kapital 4 (St. Martnťs Press) 1996, str. 41, 19. únor 1991, novinový článek týkající se felodopinu a grapefruitové šťáva v listu New York Times (sekce C, str. 3, sloupec 1) a nedávný článek ve Washington Post (sekce A, str. 11, 8/30/96).

Přehled zveřejněných studií zabývajících se účinky grapefruitové šťávy také ukazují, že míra účinku se ve velkém rozmezí liší, a autoři předkládaného vynálezu se domnívají, že tato variace je způsobena různými zdroji šťávy. Výroba komerční citrusové šťávy obsahuje komplikovanou řadu faktorů, které zvyšují variabilitu složení hotového produktu. Mezi tyto faktory patří způsob vymačkávání, způsob koncentrace, původ ovoce, zralost ovoce při sklizni, míchání plodů lišících se původem a zralostí, míchání šťáv apod. Protože účinné látky v grapefruitové šťávě inhibují efekt prvního průchodu byly neznámé nebo chybně identifikované, vědci a zákazníci nemohli volit přípravu grapefruitového džusu a spoléhat se na její použitelnost pro inhibici efektu prvního průchodu.

Navíc je známo, že konkrétně grapefruitová šťáva a obecně citrusové výrobky obsahují fototoxické deriváty furokumarinu jako je například psoralen, xanthotoxin a bergapten. I když jsou tyto sloučeniny použitelné pro řízené klinické ošetření určitých dermatologických onemocnění včetně vitiliga, lupénky a houbových mykóz, je také známa jejich toxicita a zvláště fototoxicita. Vztah struktury a aktivity pro fototoxicitu furokumarinů byl jasně odvozen ze studií na lidech (např. L. Musajo a další, Herba Hungarica, 1971, Tom. 10, No. 2-3, str. 79-94), přičemž tyto

-2CZ 295411 B6 studie ukazují, že fotosenzitizační účinnost se odstraní hydroxylací kruhu nebo prodloužením délky alkylového řetězce etherových substituentů.

Opatrné vyhodnocení literatury ukazuje, že psoralen a některé furokumariny substituované ethery s nízkým počtem atomů uhlíku podávané člověku ve velkých dávkách inhibují cytochrom P450, viz např. D. Bickers a další. J. Investigative Dermatology, 79: 201-205, 1982, M. Tinel a další, Biochemical Pharmacology, díl. 36, No. 6, 951-955, 1987, H. Fouin-Fortunet a další, J. Pharm. Experimental Therapeutics, díl 236, No. 1, 237-247, 1986, a D. Mays a další, Clin. Pharmacol. Ther. 42: 621-626, 1987. Protože známé úspěšné inhibitory efektu prvního průchodu obecně inhibují cytochrom P450, nabízí se závěr, zvláště z hlediska nedávných zjištění Baileyho a jiných, že účinné inhibitory prvního průchodu v grapefruitové šťávě jsou tyto furokumariny s nízkou molekulovou hmotností, přítomné v citrusech. Autor vynálezu zjistil, jak bude podrobněji popsáno níže v souvislosti s předkládaným vynálezem, že tomu tak není. Protože autor vynálezu objevil specifické sloučeniny, které inhibují efekt prvního průchodu, je nyní možné vyrábět spolehlivý bezpečný prostředek, který jak inhibuje efekt prvního průchodu, tak je v případě potřeby založen na citrusech nebo je citrusového původu, a který neobsahuje žádné fototoxické furokumariny s nízkou molekulovou hmotností nebo obsahuje jejich snížená množství.

Podstata vynálezu

Jedním předmětem vynálezu je poskytnutí chemických sloučenin a směsí, které inhibují efekt prvního průchodu a které mají formu koncentraci, čistotu apod., jiné než se vyskytují v přírodě nebo u komerčních výrobků.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí spolehlivého produktu založeného na citrusech nebo citrusového původu, který obsahuje jednu nebo více sloučenin podle vynálezu v množstvích, která se nevyskytují v přírodě ani v komerčních produktech a který inhibuje efekt prvního průchodu a který popřípadě neobsahuje nebo obsahuje pouze snížená množství (v porovnání s přírodním nebo komerčně se vyskytujícím množstvím) fototoxických a popřípadě první průchod neinhibujících furokumarinů s nízko molekulovou hmotností, který je použitelný jako doplněk potravin nebo diety, jako farmaceutický prostředek, léčivo atd.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout prostředek obsahující jednu nebo více sloučenin podle vynálezu účinných proti efektu prvního průchodu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí prostředku obsahujícího jednu nebo více sloučenin podle vynálezu a který neobsahuje nebo obsahuje pouze snížená množství ve srovnání s přírodními nebo komerčně se vyskytujícími množstvími fototoxických furokumarinů s nízkou molekulovou hmotností.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí prostředku, který obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle vynálezu a poskytuje konzistentní a spolehlivou aktivitu inhibující efekt prvního průchodu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí výše uvedených sloučenin a směsí jako složky výrobků a směsí poskytujících aktivní složky, terapeutické látky, léčiva apod. nebo jiné látky, které podléhají efektu prvního průchodu u lidí.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí sloučenin inhibujícím efekt prvního průchodu nazývaných také bioenhancery a jejich inhibitory ve formách, které se nevyskytují v přírodě ani v komerčních formách.

-3CZ 295411 B6

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí směsí jedné nebo více sloučenin podle vynálezu inhibujících efekt prvního průchodu s různými terapeutickými prostředky, účinnými látkami, léčivy nebo dalšími látkami (dále označovanými jaké „léčiva“), které podléhají efektu prvního průchodu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití sloučenin podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u lidí, zvířat apod. léčených látkami podléhajícími efektu prvního průchodu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob výroby výše popsaných prostředků, sloučenin, směsí apod.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob výroby prostředku založeného na citrusech nebo citrusového původu, který neobsahuje fototoxické a první průchod neinhibující furokumariny nebo obsahuje pouze snížená množství těchto látek ve srovnání s přirozeně a komerčně se vyskytujícími množstvími, s výhodou s použitím látek, které orgán US Food and Drug Administration považuje za použitelné pro výrobu potravin a léčiv, včetně materiálů gRAS (v této přihlášce termín „neinhibující první průchod“ zahrnuje aktivitu prvního průchodu, kterou poskytne koncentrace 2000 nM bergamotinu nebo imperatorinu podle uvedených protokolů C nebo C').

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí a použití sloučenin účinných na první průchod a prostředků obsahujících množství účinné na první průchod (v agregátu nebo jednotlivě) alespoň jedné sloučeniny podle vynálezu v izolované formě a/nebo apyrogenní formě a/nebo sterilní formě a/nebo v podstatě čisté formě a/nebo farmaceutické formě a/nebo chemicky čisté formě a/nebo ve formě obsahující vyšší koncentrace nebo čistotu sloučeninu podle vynálezu než se nachází v přírodě nebo komerčních produktech. Jak se zde používá, termín „komerční“ znamená výrobky vyráběné a prodávané místně, národně a mezinárodně, zvláště průmyslem zpracování citrusových plodů. Tyto formy, jak uvádějí jejich názvy, jsou odlišné od sloučenin podle vynálezu, jak se vyskytují v přírodě, například jako komerční citrusové výrobky a výrobky obsahující citrusy, jako jsou šťávy, za studená lisované oleje, koncentráty šťáv, silice atd.

Dalším předmětem vynálezu je použití sloučenin podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu při podávání alespoň jedné sloučeniny, prostředku apod. člověku.

Tyto a další předměty budou zřejmé odborníkům v oboru na základě vynálezu, jak bude popsán dále, s ohledem na výhodná provedení.

Podrobný popis výhodných provedení

Autor vynálezu objevil chemické sloučeniny, které inhibují efekt prvního průchodu u orálně podávaných léčiv u lidí. Autor vynálezu také objevil, že fototoxické nízkomolekulámí furokumariny a některé etherově substituované furokumariny, které jsou přirozeně přítomny v citrusových extraktech, šťávách, vedlejších produktech apod., mohou být z těchto výrobků odstraněny nebo může být snížena jejich koncentrace, aniž by došlo ke snížení inhibičního účinku na efekt prvního průchodu sloučenin obsažených v těchto produktech. Autor předkládaného vynálezu také objevil způsob výroby prostředků na bázi citrusů využívající pouze látky přijatelné FDA nebo USP. Předkládaný vynález je založen na těchto zjištěních a bude podrobněji popsán níže.

Chemické sloučeniny podle vynálezu inhibují efekt prvního průchodu u zvířat včetně lidí, jsou v jednom výhodném provedení sloučeniny podle následujících 20 vzorců I-IV:

-4CZ 295411 B6

(Π),

kde ve výše uvedených strukturách R je nezávisle H nebo popřípadě substituovaná C1-C15 alkylová skupina,

L je popřípadě substituovaná, C]-Ci₅ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina, popřípadě přerušená jedním nebo větším počtem nesousedících autorů síly nebo kyslíku a popřípadě zakončená na jednom nebo obou koncích atomem kyslíku,

HAr je popřípadě substituovaná C₆-C₂₄ aromatická skupina nebo heteroaromatická skupina popřípadě obsahující jeden nebo větší počet atomů kyslíku jako atomů kruhu, a E je skupina -OH, -COOH, -COOR (kde R je jak definováno výše) nebo popřípadě substituovaná Ci-C₈ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo větším počtem nesousedících atomů kyslíku nebo síry, nebo Eje C3-C₈ popřípadě substituovaná cyklická nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo větším počtem nesousedících atomů kyslíku nebo síry, nebo je E popřípadě substituovaná skupina HAr. Sloučeniny vzorců I-IV stejně jako sloučeniny popisované dále s výhodou neobsahují peroxidovou (O-O) skupinu. Disulfidické skupiny (S-S) nejsou přítomny, ale mohou být přítomny. Skupina E je s výhodou epoxidový nebo dihydroxylový radikál, jako je -CH(OH)₂.

E může být také kysele otevřená epoxidová skupina.

Sloučeniny podle vynálezu popisované výše nemají omezení týkající se stereochemie a izomerie E-Z, přičemž možné jsou všechny formy. Jsou také zahrnuty racemické směsi stejně jako všechny enantiomery a diastereomery. Výhodné stereochemické uspořádání je ukázáno dále.

-5CZ 295411 B6

Skupiny R, L, HAr a E mohou být popřípadě substituovány Ci-C₆ přímou, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinou, skupinou -OH. atomem halogenu, skupinou C]-C₅ alkoxy, skupinou C]-C₅ alkylkarbonyloxy, skupinou C1-C5 alkoxykarbonyl apod. Tyto substituenty mohou být také případně substituovány na kruhových strukturách vzorců I-IV bez ohledu na to, 5 jako substituenty se objeví na místě R, L, HAr nebo E.

Druhé výhodné provedení, chemické sloučeniny podle předkládaného vynálezu inhibující efekt prvního průchodu, mají obecné vzorce V-X:

-6CZ 295411 B6

-7CZ 295411 B6

-8CZ 295411 B6

Jak je uvedeno výše pro vzorce I-IV, vzorec V-X nejsou omezeny co se týče stereochemie, izomerie E-Z apod.

Nejvýhodnější sloučeniny podle předkládaného vynálezu, vykazující inhibiční účinky na efekt prvního průchodu, jsou látky podle druhého provedení předkládaného vynálezu, které mají následující stereochemické uspořádání (vzorec XI-XVI):

-9CZ 295411 B6

-10CL 295411 B6

-11 CZ 295411 B6

- 12CZ 295411 B6

Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu chemickou sloučeninu podle vynálezu s účinky na první průchod, s výhodou v množství účinném pro ovlivnění prvního průchodu. Prostředky na bázi citrusů podle vynálezu navíc obsahují extrakt odvozený z citrusů, koncentrát, kůru, šťávu, silici, vedlejší produkt apod. (dále bude označováno jako látky odvozené od citrusů) a mohou obsahovat jakékoliv kombinace těchto forem a mohou být odvozeny zvíce než jednoho druhu citrusového ovoce. Mezi použitelné citrusové plody zde patří grapefruit, citron, limeta a s výhodou jakýkoliv citrus přirozeně obsahující sloučeninu podle vynálezu inhibující efekt prvního průchodu nebo směs těchto sloučenin. Dosavadní výzkumy v této oblasti ukazují, že běžný typ pomeranče (Citrus sinensis) vliv na první průchod nemá. Citrusy obsahující jednu nebo více látek inhibujících efekt prvního průchodu spadají do rámce vynálezu včetně všech kříženců apod. a označují se zde jako „citrusy ovlivňují první průchod“ (first-pass citrus). Výhodným citrusem použitelným v předkládaném vynálezu je grapefruit.

Sloučeniny, látky a prostředky popisované v předkládaném vynálezu, ovlivňují první průchod, jsou materiály, které zabraňují nebo zpomalují degradaci orálně podávaných léčiv v těle. S výhodou zvyšují materiály účinné při ovlivňování prvního průchodu podle vynálezu látky, prostředky, směsi, sloučeniny podle vynálezu apod. biologickou dostupnost léčiva o alespoň 1 %, s výhodou o více než 5 % a nejvýhodněji o více než 15 % včetně 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300 atd. procent měřeno metodou oblasti pod křivkou (Area Under the Curve, AUC), viz patent US 5 567 592 zařazený odkazem. Aplikací předkládaného vynálezu není neobvyklé dosažení několikanásobného, včetně 5, 10, 15, 20 násobného apod. zvýšení biologické dostupnosti (tj. několik set nebo tisíc procent zvýšení AUC). Účinnost sloučenin, prostředků, směsí, materiálů apod. podle vynálezu na první průchod může být také měřena metodami a charakterizována způsoby popisovanými ve WO 97/15269, US 5 665 386 a PCT/US96/09607, a s výhodou může splňovat kritéria těchto metod.

Výhodnými látkami podle vynálezu odvozenými z citrusů jsou například za studená lisovaný citrusový olej, zvláště za studená lisovaný grapefruitový, limetový, citrónový apod. olej a citrusové vedlejší produkty, včetně zadinových podílů z továren zpracovávajících citrusy nebo citrusové šťávy. Za studená lisované citrusové olej včetně za studená lisovaného pomerančového (kromě Citrus sinensis), grapefruitového, limetového a citrónového oleje, jsou zemědělské plodiny popisované například v publikaci Food Chemicals Codex, čtvrté vydání, National Academy Press, Washington, D.C. 1996, který se zařazuje odkazem. Další látky odvozené od citrusů, použitelné v rámci vynálezu, jsou různé další citrusové oleje (destilované, esenciální, dezertní typy apod.) hořké za studená lisované oleje apod. Zeměpisný původ citrusů podle vynálezu poskytujících látek odvozené z citrusů, zde není důležitý. Je také možno použít citrusových šťáv nebo slupek stejně jako jakékoli pevné, polotuhé nebo kapalné části citrusu ovlivňujícího první průchod obsahující účinné látky ovlivňující první průchod. Je také možno použít směsí.

Látka odvozená z citrusů přítomná v prostředcích podle vynálezu může tvořit celý prostředek založený na citrusech nebo může tvořit pouze jeho část. Jestliže se tedy látka založená na citrusech připravuje tak, že obsahuje jednu nebo více sloučenin vzorců I-XVI v množství ovlivňujícím první průchod, není třeba přidávat žádnou další látku. V případě potřeby je možno přidávat potravinářsky nebo farmaceuticky přijatelná řediva, pomocné látky, nosiče atd.

Látka odvozená z citrusů, která je součástí prostředku podle vynálezu, se s výhodou upravuje tak, aby se snížilo množství fototoxických furokumarinů a popřípadě i furokumarinů neúčinných při ovlivňování prvního průchodu přirozeně přítomných v těchto materiálech. Tyto furokumariny se s výhodou odstraňují úplně, což znamená, že jsou odstraněny do té míry, že není možno jejich přítomnost detekovat kapalinovou a zvláště plynovou chromatografií.

Způsob podle vynálezu pro odstraňování fototoxických furokumarinů s nízkou molekulovou hmotností ze složek podle vynálezu odvozených z citrusů s výhodou zahrnuje případné odstranění těkavých složek (složek, které se odstraní po 12 až 48 h při tlaku 1,33 až 0,133 Pa) a extrakci směsmi alespoň jednoho Cj-Cio alkoholu (s výhodou ethanolu) a vody, popřípadě

-13 CZ 295411 B6 v přítomnosti báze. V některých situacích je výhodné neodstraňovat těkavé složky jako jsou přírodní terpeny, ale spíše používat těchto těkavých látek jako rozpouštědla při dalším zpracování. Extrakční směs alkoholu a vody může být odvozen do odpadu a použije se zbytek. Výhodné jsou také C₂-C₅ alkoholy stejně jako C₂ a C₃ a C₄ alkoholy. Alkohol (ethanol) může být buď 100% alkohol nebo může být pohodlně dodávaný a používaný v běžně dostupných ředěních směsi alkohol - voda (například 95 % obj. ethanol/5 % obj. vody, atd.). Ve všech případech je alkohol (ethanol) s výhodou v čistotě podle lékopisu (USP) nebo lepší. Voda používaná pro extrahování látky (složky) odvozené z citrusů posle vynálezu je s výhodou destilovaná voda a je také s výhodou čistoty USP nebo lepší. Pro extrakci je zde možno použít jakékoli kombinace rozpouštědel nebo jediného rozpouštědla. Rozpouštědlo (rozpouštědla) jsou s výhodou přijatelné FDA pro výrobu potravin a léčiv.

Způsob odstraňování fototoxických nízkomolekulámích furakumarinů podle předkládaného vynálezu může zahrnovat postupné extrakce směsí alkohol (ethanol)/voda a následující směsi alkohol (ethanol)/voda mohou mít buď stejný objemový poměr, nebo různé objemové poměry. Výhodné objemové poměry alkohol (ethanol) : voda jsou v rozmezí 1:10 až 10:1,a výhodněji 1 : 1 (± 3 %, 5 %, 8 % nebo 10 %) a mohou být 20 až 80 nebo 45 až 60 % alkoholu (ethanolu) počítáno na poměr objem/objem včetně poměrů 2 : 1, 3 : 1, 1 : 2, 1 : 3 atd., stejně jako 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 40/60, 35/65, 30/70 atd. alkohol/voda. Extrakce je možno provádět jakýmkoliv způsobem známým v oboru, včetně extrakce kapalina - kapalina, kapalina - pevná látka, kontinuální extrakce atd. Jestliže je surovinou použitou pro výrobu extraktu odvozené z citrusů podle vynálezu například olej, směs alkohol (ethanol)/voda použitá pro extrakci může být k tomuto oleji jednoduše přidána, směs může být protřepána a rozdělena pomocí gravitace nebo centrifugy. Vhodná je i opakovaná extrakce jako je například kontinuální extrakce, například protiproudá extrakce atd.

Jak bylo uvedeno výše, s výhodou se používá při odstraňování fototoxických kumarinů báze, která může být přidána k vodě nebo alkoholu nebo oběma složkám. Výhodnými bázemi jsou hydroxidy a oxidy alkalických kovů a kovů alkalických zemin, nej výhodněji hydroxid sodný a hydroxid draselný. Báze je obvykle přítomna v množství od 0,01 do 80 g na litr směsi alkohol/voda.

Způsob podle vynálezu pro odstraňování fototoxických nízkomolekulámích furokumarinů s výhodou významně zmenšuje a ještě lépe úplně odstraňuje až po detekční limity kapalinové a s výhodou plynové chromatografíe methoxylovými skupinami substituované lineární a angulární furokumariny včetně xanthotoxinu (8-methoxypsoralen), bergaptenu (5-methoxypsoralen), izobergaptenu, izopimpinellinu apod. a nesubstituované lineární nebo angulámí furokumariny (psoralen, angelicin atd.). V případě potřeby mohou být také odstraněny furokumariny, u kterých bylo v předkládaném vynálezu jištěno, že nemá na efekt prvního průchodu vliv. Mezi tyto látky patří bergamottin, psoralen, angelicin, izopimpinellin, marmin, 6',7'-dihydroxybergamotin a imperatorin.

Látka odvozená z citrusů podle vynálezu, prostředky podle vynálezu, směsi podle vynálezu, farmaceutické prostředky podle vynálezu, směsi podle vynálezu, farmaceutické prostředky podle vynálezu apod. s výhodou obsahují množství účinné na první průchod alespoň jedné sloučeniny s účinkem na první průchod vzorců I - XVI výše. Alternativně může být přítomno několik sloučenin vzorců I - XVI, každá v množství nedosahujícím účinného množství pro ovlivnění prvního průchodu, jestliže průchod koncentrací uvedených sloučenin poskytne požadovanou účinnost na první průchod.

Navíc k výše uvedenému popisu může být jeden nebo více atomů vodíku znázorněných v těchto vzorcích (tj. vzorec I - XVI) nahrazen jednou nebo jakoukoliv kombinací dvou nebo více atomů vodíku, halogenu, přímou nebo rozvětvenou C]-C₄o uhlovodíkovou skupinou, C]-C₄₀ přímou nebo rozvětvenou skupinou etheru (-OR, kde R je přímý nebo rozvětvený uhlovodík), skupinou

- 14CZ 295411 B6

C1-C40 alkylhydroxy (-ROH, kde R je přímý nebo rozvětvený uhlovodík a skupina OH je navázána na primární, sekundární nebo terciární atom uhlíku) atd.

Jak se zde používá, termín „uhlovodík“ znamená rozvětvený a přímý alkyl a rozvětvený a přímý alkenyl. Alkenyl je jakýkoliv uhlovodík obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu včetně většího počtu konjugovaných a nekonjugovaných dvojných vazeb. Zahrnuty jsou také soli, zvláště farmaceuticky přijatelné soli a stereoizomery fyzikální formy atd. Sloučeniny popsané ve vzorcích I - XVI mohou být syntetizovány jakýmkoliv obecným způsobem známým v oboru a jejich syntéza spadá do obvyklé zkušenosti odborníka v oboru. Jestliže tyto sloučeniny byly nyní 10 identifikovány, mohou být také z látek odvozených z citrusů snadno izolovány, jak je ukázáno dále.

Výhodné způsoby pro výrobu sloučenin podle vynálezu vzorců I- XVI zahrnují následující schémata:

-15CZ 295411 B6

1) kys. 4-toluensulfonová

2) 133 Pa, 20 ’C

-16CZ 295411 B6

Tyto reakce patří do obvyklých znalostí v oboru, viz například Chemistry Letters, 2019 - 2022, 1990, Can. J. chem., 63: 2673 - 2678, 1985, Australian Joumal of Chemistry, 42: 1235 - 1248, 1989, východoněmecký patent DD 275687 a sovětský patent SU 1397449, všechny zařazeny odkazem. Ačkoliv každou z uvedených reakcí vzniká buď sloučenina vzorce I + II, nebo vzorce III + IV, každá metoda může poskytnout sloučeniny I - IV, pokud se použije vhodných reakčních činidel. Sloučeniny, látka odvozená z citrusů, směsi, farmaceutické prostředky apod. podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahují alespoň jednu sloučeninu vzorců I - XVI výše. Mohou být také použity směsi těchto látek.

Použití látky odvozené z citrusů, směsí, prostředků, inhibitorů, sloučenin apod. podle vynálezu není omezeno a uvedené látky mohou být podávány v množstvích 2 ng až 2 g a více na pacienta za den pro zvýšení biologické dostupnosti orálně podávaných léčiv u pacienta. Prostředky podle vynálezu mohou s výhodou obsahovat větší množství sloučenin podle vynálezu, než jaké je přirozeně přítomno v citrusových výrobcích. Dávky mohou snadno určit odborníci s obvyklou zkušeností v oboru a budou záviset na rozsahu, ve kterém podléhá například aktivní činidlo (léčivo) efektu prvního průchodu apod. Mezi dávkové formy patří formy pro orální podávání, formy pro místní podávání a formy pro injekce. Sloučeniny, látka odvozená z citrusů, prostředky, směsi apod. podle vynálezu mohou být popřípadě složkou nebo mohou být přidány k prostředkům na bázi citrusů nebo jiným jedlým materiálům, kterými jsou například příchuť maskující chuť léčiva, ovocná šťáva apod.

Látka odvozená z citrusů, směsi, prostředky a sloučeniny podle vynálezu inhibují efekt prvního průchodu u léčiv podávaných orálně lidem a jiným živočichům. Jako „množství účinné pro ovlivnění prvního průchodu“ materiálu podle vynálezu může být použito jakékoli množství, které zvyšuje orální biologickou dostupnost jakékoliv látky o jakékoli množství (například 1 %, 5 %, 10 % atd.; viz výše, kde se popisují metod AUC včetně všech hodnot a rozsahů mezi těmito hodnotami) ve srovnání s případem, kdy se v takové situaci materiál podle vynálezu nepodává. Látka odvozená z citrusů, směs, prostředek nebo sloučenina ovlivňující první průchod podle vynálezu je materiál, který inhibuje pozorovaný efekt prvního průchodu alespoň jednoho léčiva u živočicha, s výhodou u člověka, s výhodou efekt prvního průchodu způsobený systémem cytochromu P450. Tento účinek se zde také označuje jako účinek potlačující efekt prvního průchodu (anti-fírst-pass activity). Podání se s výhodou provádí současně, což znamená těsně před, těsně po nebo současně s léčivem, aktivní látkou, terapeutickou látkou, léčebnou potravinou apod., u kterých dochází k efektu prvního průchodu. Termíny „těsně před“ a „těsně po“ zahrnují všechny doby, ve kterých poskytuje materiál podle vynálezu prospěšný účinek inhibici efektu prvního průchodu. Výhodné formy podle vynálezu zahrnují sloučeniny podle vynálezu, látku odvozenou z citrusů, směs, prostředek apod. uvnitř například kapsle gelu nebo ve spojení s potravinářskými nebo farmaceuticky přijatelnými pojivý ředivy apod., které se popisují například v patentech US 5 576 448, 5 576 446, 5 576 437, 5 576 439, 5 576 438, 5 576 337, 5 576 339 a 5 576 336, které se všechny zařazují odkazem. Látka odvozená od citrusů, směsi, prostředky a sloučeniny podle vynálezu jsou s výhodou poskytovány v takovém množství, které poskytne konzistentní spolehlivý účinek nezávisle na šarži a formě, ve které se materiál poskytuje.

-17CZ 295411 B6

Termín „léčivo“ (drug), jak se zde používá, je definováno jako jakákoli chemická sloučenina, kterou je možno podat organismu, která modifikuje nebo mění fyziologii tohoto organismu. Výhodněji definuje slovo „léčivo“, jak se zde používá, jakoukoliv látku zamýšlenou pro použití při léčení nebo prevenci onemocnění, zvláště u lidí. Mezi léčiva patří syntetické a v přírodě se vyskytující toxiny a látky s biologickou účinností stejně jako uznávané farmaceutické látky, jako jsou látky uvedené v publikaci Měrek Index, dvanácté vydání, Měrek Research Laboratories, Whitehouse Station, NJ, 1996, „The Physicians Desk Reference“, 47. vydání, 1993, str. 101 — 321; „Goodman andgilmaďs The Pharmacological Basis of Therapeutics“, 8. vydání (1990), str. 84 - 1614 a 165 - 1715; a „The United States Pharmacopeia, The National Formulary“, USP XXII NF XVII (1990), přičemž sloučeniny z těchto publikací jsou zařazeny odkazem. Termín léčivo také zahrnuje sloučeniny, které mají uváděné vlastnosti, které však nejsou dosud objeveny nebo dostupné v USA. Termín léčivo zahrnuje i prekurzory, aktivované formy a metabolizované formy léčiv. Předkládaný vynález může být využíván s léčivy složenými z nabitých, nenabitých, hydrofilních, zwitteriontových nebo hydrofobních molekul stejně jako z jakékoliv kombinace těchto fyzikálních vlastností. Hydrofobní léčivo je definováno jako léčivo, které je ve své neionizované formě rozpustnější v lipidu nebo tuku než ve vod. S výhodou je hydrofobní léčivo definováno jako léčivo rozpustnější v oktanolu než ve vodě (viz patent US 5 567 592, zařazený odkazem). Vynález může být používán u lidí i živočichů jako jsou savci.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu a látky odvozené od citrusů mohou být společně formulovány s léčivy, s výhodou léčivy podléhajícími efektu prvního průchodu. Léčivo má s výhodou biologickou dostupnost 92 % nebo méně, výhodněji 50 % nebo méně. Mezi příklady patří navíc k látkám uvedeným výše jako referenční sakvinavir, indinavir, L-deprenyl, tacrolimus, cyklosporin A (Sandimmune®), cyklosporin A (Neoral®), nelfinavir, VX478/141W94, felodipin, nifedipin a sumatriptan. Tyto společné formulace obsahují látku odvozenou z citrusů podle vynálezu a/nebo jednu nebo více sloučenin v množstvích uvedených výše, typicky v menších množstvích než jsou v současnosti nutná u aktivních složek léčiv podléhajících efektu prvního průchodu. Mohou být také přidána pojivá, řediva apod. přijatelná pro farmaceutické použití. Odborník v oboru je schopen určit dávku sloučenin podle vynálezu na základě jednoduchých testovacích postupů dobře známých v oboru, včetně farmakologických experimentů, které určí množství léčiva v krevním řečišti v průběhu určitého časového období po podání.

Další produkty použitelné pro společné formulaci podle vynálezu jsou všechna léčiva, léčebné potraviny nebo jiné produkty, které podléhají efektu prvního průchodu. Příklady léčiv jsou uvedeny v publikaci Měrek Index, dvanácté vydání, Měrek Research Laboratories, Whitehouse Station, NJ, 1996, která je zařazena odkazem. Odborník v oboru může snadno určit, která látka podléhá efektu prvního průchodu.

Je výhodné, jestliže jsou materiály podle vynálezu chráněny před působením žaludeční kyseliny, například potahováním. Povlaky používané k tomuto účelu jsou v oboru dobře známé a patří sem enterosolventní povlaky atd., viz Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3. vydání, díl 17, str. 281 a dále, zařazená odkazem. Mohou být také použity další farmaceutické formy jako jsou formy (povlaky) s opožděným uvolňováním, tvrdé a měkké želatinové kapsle atd.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje výsledky inhibice pro různé inhibitory.

Obr. 2 ukazuje výsledky inhibice pro různé inhibitory.

-18CZ 295411 B6

Příklady provedení vynálezu

Syntéza spiro orthoesteru vzorce XVII

Benzyl 6,7-epoxygeranylether byl umístěn vevakuované komoře (13,3 Pa) přes noc pro odstranění vnější vody ze vzorku; bylo odváženo 190 mg (730 pmol). Tři ekvivalenty 7methoxykumarinu (0,386 g) byly rozpuštěny ve 3 ml CH2CI2 a tato kapalina byla převedena do uzavřené skleněné nádoby. Pro probublávání systému v průběhu reakce bylo použito helium, nádoba byla udržována při teplotě 5 až 6 °C, a reakční roztok byl míchán magneticky. Bylo přidáno 43 μΐ 1M roztoku SnCU v CH₂C1₂ a 16 pmol BF₃.Et₂O; po 5 min byl ve čtyřech stejných částech přidán epoxid rozpouštěný ve 4 ml CH₂C1₂; po každé části následovalo přidání 4 pmol BF2.Et2O. Reakční směs byla udržován při 5 až 6 °C a míchána 3,5 h a reakční aparatura byla potom rozebrána reakční směs byla ihned zpracována následujícím způsobem. Byla přidána směs obsahující celkem 75 pmol BF₃ a SnCl₄, takže byly přidány celkem 3 ekvivalenty pyridinu (225 pmol) (reakční směs byla udržována za míchání) při teplotě 5 až 6 °C) pro odstranění katalyzátorů Lewisových kyselin. Po 30 min míchání bylo rozpouštědlo odstraněno a zbytek byl rozpuštěn ve 3,16 ml 95% ethanolu; bylo přidáno 0,6 ml 50 % KOH ve vodě (hmotnost/objem) a roztok byl důkladně míchán. Byla přidána voda (2,24 ml) a roztok byl umístěn přes noc do zařízení Speed Vac pro odstranění ethanolu. Zůstalo přibližně 50 % původního objemu. Vodný roztok byl extrahován dvakrát 3 ml CH₂C1₂, a spojené extraktoiy CH2CI2 byly dvakrát extrahovány 10 ml 5% KOH ve vodě (hmotnost/objem) a dvakrát 10 ml 5% NaCl ve vodě (hmotnost/objem). CH₂C1₂ byl odstraněn a zbytek byl rozpuštěn v acetonitrilu.

Tento roztok v acetonitrilu může být přímo použit pro čištění spiro orthoesteru na HPLC za následujících výhodných podmínek. Pro eluci bylo použito lineárních gradientů, které byly vytvořeny mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B acetonitrilem (přístroj: Hewlet Packard). Eluční doby v minutách stejně jako koncentrace přítomného acetonitrilu ve smíchané mobilní fázi byly následující: 0, 55; 5, 55; 10, 90; 11, 98; 17, 98; 18, 55; 22, 55. Chromatografická kolona měla délku 250 mm x vnitřní průměr 4,6 mm, byla naplněna materiálem Cl8 navázaným na částice oxidu křemičitého 4 pm (množství naneseného uhlíku 9 %; firma YMC, lne.) a před kolonu byla zařazena ochranná kolona délky 23 mm x vnitřní průměr 4 mm obsahující stejný materiál, opatřená filtrem 0,5 pm; kolony byly udržovány při teplotě 40 ± 0,2 °C. Průtok byl v průběhu cyklu trvajícího 22 min 1,0 ml/min. Eluát z kolony z každého nástřiku 10 pl byl monitorován při 259 ± 2 nm a byl fřakcionován s použitím automatického sběrače frakcí (Gilson). Retenční čas sloučeniny vzorce XVII v tomto systému byl 13,4 min.

-19CZ 295411 B6 ^fH NMR δ (400 MHz, CD₃OD) 1,15, s 1,26, s a 1,39, s, 4'-Me (diastereomery); 1,64, s, 8'-Me; 1,6 - 1,9, m, H6', 6'; 2,0-2,3, m, H7'; 3,70, s, 7-OMe; 3,83, m a 4,20, t, H5' (diastereomeiy); 4,01, d, H10'; 4,45, s, H12'; 5,39, t, H9'; 5,45, d, H3; 6,40, s, H8; 6,49, d, H6; 6,71, d, H4; 7,06, d, H5; 7,20-7735, m, fenyl. Hmotnostní spektrum m/z (elektrorozprašování): MS, 437 (MEL); MS/MS, 261, 177, 153 (fragmenty MH⁺).

Předběžné zpracování za studená lisované grapefruitového oleje pro následující frakcionaci HPLC s reverzní fází

1. Připraví se směs 1 :1 ethanol : voda (objem/objem) obsahující 12,5 g KOH/1 s použitím denaturovaného alkoholu.

2. 1 1 za studená vylisovaného oleje a 330 ml bazického ethanolového roztoku se míchá ve 2 1 dělicí nálevky 2,0 min.

3. Směs se ponechá stát 5,0 min, potom se z nálevky odstraní spodní ethanolová fáze.

4. Kroky 2 a 3 se opakují čtyřikrát s použitím čerstvých podílů po 330 ml bazického ethanolového roztoku.

5. Ještě jednou se zopakují kroky 2 a 3 s použitím 330 ml roztoku 1 : 1 ethanol: voda bez KOH. Pokud není přítomen KOH, je nutno počkat několik hodin (s výhodou přes noc), aby došlo k jasnému odděleni fází. Testování spodní ethanolové fáze pH papírkem byl mělo ukázat, že pH roztoku je téměř neutrální (ve většině případů = 6).

6. Olejová fáze (výtěžek by měl být vyšší než 0,9 1) se vloží do vakuové komory a připojí se vakuum (66,5 Pa nebo lepší) na 3 až 4 dny. Proces je u konce, jestliže zatřepání viskózní kapalinou pod vakuem již nezpůsobí var.

7. Netěkavý materiál se promyje několika podíly acetonitrilu do celkového objemu 200 ml a materiál rozpustný v acetonitrilu a nerozpustný v acetonitirlu se rozdělí centrifugací (5 min při rychlosti 50, IEC model K2).

8. Z fáze rozpustné v acetonitrilu (krok 7) se odstraní acetonitril na zařízení Speed Vac, a zbytek se zváží (je možno očekávat 22 až 25 g).

9. Ke zbytku se přidá acetonitril tak, že každý podíl 5 ml obsahuje 1,5 g zbytku a roztok se rozdělí do částí po 5 ml.

10. Do každé 5 ml části se přidá 15 ml izooktanu, nádoba se uzavře, silně protřepe a směs se centrifuguje (2 min při rychlosti 35). Horní izooktanová fáze se odlije.

11. Krok 10 se devětkrát opakuje; příležitostně by sed měl přidávat acetonitril, aby byl zajištěn objem dolní fáze přibližně 5 ml.

12. Acetonitril se za spodní fáze (krok 11) odstraní na zařízení Speed Vac a zbytek se zváží (je možno očekávat přibližně 20 % původní hmotnosti z kroku 8).

13. Zbytek (krok 12) se rozpustí v acetonitrilu tak, aby se získal roztok 0,25 až 0,30 g/ml, tento roztok se zfíltruje přes teflonovou patronu 0,2 pm a skladuje se při -20 °C.

Předběžné zpracování za studená lisovaného grapefruitového oleje pro další použití jako doplňku dietní potraviny, léčiva, složky společné formulace apod.

-20CZ 295411 B6

1. Připraví se roztok 70 : 30 voda : ethanol (objem/objem) obsahující 5 % hydroxidu draselného (hmotnost/objem) s použití lékopisného ethanolu, KOH s čistotou NF/FCC a čištěné vody.

2. Ethanolový roztok připravený v kroku 1 se smíchá s ekvivalentním objemem (nebo mírným nadbytkem) úplného nezpracovaného za studená lisovaného grapefruitového oleje (vyhovujícího Food Chemicals Codex), a směs se převede do nádoby určené pro potraviny odolávající zvýšené teplotě a tlaku.

3. Uzavřená nádoba se udržuje při 95 až 100 °C 1 h. Nádoba se ochladí, ethanolová fáze (spodní fáze dvoufázového systému) se odstraní a přidá se čerstvá část ethanolového roztoku (ekvivalent objemu použitého v kroku 2).

4. Cyklus vaření se opakuje (krok 3), dokud se nedosáhne požadovaného stupně čistoty vzorku. Deset cyklů odstraní >99 % polárních kumarinů a furokumarinů, >90 % převažujících nepolárních kumarinů a furokumarinů (tj. epoxyaurapten, epoxybergamottin), a významně nesníží množství inhibičních spiro orthoesterů.

5. Olej se promývá čištěnou vodou, dokud není pH odpadní vody neutrální.

6. Olejová fáze se umístí pod vakuum (13,3 až 39,9 Pa), dokud se již ze vzorku neuvolňují těkavé materiály (zjišťováno například kontrolou prázdného jímače par zařazeného v potrubí, udržovaného při teplotě -60 až 90 °C). Obecně se v tomto kroku odstraní přibližně 95 % objemu vzorku.

7. Produkt z kroku 6 se smíchá s ekvivalentním objemem USP ethanolu a směs se centrifuguje. Postup se opakuje, dokud není spodní fáze v podstatě prostá spiro orhoesterových inhibitorů. Touto metodou se odstraní z olejového netěkavého preparátu materiály rozpustné v ethanolu.

8. S výhodou, i když to není nutné, se umístí spojené ethanolové extrakty z kroku 7 do vakua, dokud nedojde k odstranění v podstatě veškerého ethanolu (například 99 %) nebo snížení jeho obsahu (například 10 %).

Protože v průmyslu potravin, příchutí a aromat dochází k falšování surovin, měly by být složky odvezené od citrusů podle vynálezu, včetně za studená lisovaných citrusových olejů, s výhodou testování před jejich dalším použitím při výrobě například prostředků dietních doplňků, obsahujících množství jedné nebo více sloučenin vzorců I-XVI účinné pro ovlivnění prvního průchodu. Jednou strategií je příprava vzorku (Protokol A; Protokol A'), s následnou chromatografíí (Protokol B; Protokol B'; Protokol B) a porovnání se standardy získanými v minulosti. Tímto testováním lze získat stále stejné šarže.

Následující protokoly jsou použitelné při přípravě různých provedení podle vynálezu.

Protokol A

Příprava citrusových olejů pro další chromatografícké zpracování nebo pro podávání člověku odstraněním toxických nízkomolekulámích furokumarinů.

Jeden objem za studená lisovaného citrusového oleje (odpovídající Food Chemicals Codex) byl převeden do nádoby a byly odstraněny veškeré těkavé látky. Ačkoliv pro odstraňování těkavých látek existuje několik metod (například destilace, destilace za sníženého tlaku, odpařování za pokojové teploty), výhodná metoda využívá koncentrátu Speed Vac (Savant Instruments; proces vyžaduje 12 až 24 h a tlaky 1,33 až 0,133 Pa a systém pracuje bez dodávání tepla), protože tato metoda je mírná a rychlá. Výtěžek netěkavého produktu je obecně 0,04 až 0,1 násobek počátečního objemu viskózní kapaliny.

-21 CZ 295411 B6

Fototoxické furokumariny s nízkou molekulovou hmotností byly z netěkavého preparátu odstraňovány extrakcí kapalina - kapalina: šestnáctinásobek objemu viskózní kapaliny směsi 1 : 1 ethanol: voda (objem/objem, obě látky v čistotě USP), byl přidán k netěkavému preparátu, nádoby byla uzavřena, roztok důkladně promíchán a potom centrifugován (Intemational Equipment Company, model K-2, 5 min při nastavení 35) a vrchní ethanolová fáze byla odlita. Tato extrakce byla dvakrát opakována. Nadbytečná voda a ethanol mohou být z preparátu v případě potřeby odstraněny, například na zařízení Speed Vac. Produkt z tohoto postupu je možno použít pro podávání člověku, například po naplnění do kapslí.

Protokol A'

Předběžné zpracování citrusových olejů před chromatografií.

Většina citrusových olejů není přímo vhodná pro dlouhodobou preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií, protože obsahuje podstatné množství látek, které mají špatnou rozpustnost ve výhodných systémech mobilní fáze. Proto se před chromatografií používá protokol pro přípravu vzorku, kteiý je popsán dále.

Za studená vylisovaný citrusový olej (vyhovující Food Chemicals Codex) se převede do vhodné nádobky a za sníženého tlaku (1,33 až 0,133 Pa, 3 až 4 dny) se odstraní většina těkavých materiálů. Výtěžek netěkavého produktu je obecně pouze 5 až 10 % původního objemu. Netěkavé látky citrusů se smísí s acetonitrilem v poměru 2 : 1 (hmotnost/hmotnost), směs se centrifugu] e (Intemational Equipment Company, model K-2, 5 min při nastavení 35) a horní fáze s obsahem acetonitrilu se odstraní. Extrakce acetonitrilem se jednou opakuje, spodní fáze se odlije, první a druhá acetonitrilová fáze se spojí a acetonitril se odstraní koncentrátorem Speed Vac (Savant Instruments; 12 h při 1,33 až 0,133 Pa bez přívodu tepla). Netěkavý materiál se smíchá s ethanolovým roztokem báze (1 : 1 ethanol : voda {objem/objem; obě látky USP} obsahující 12,5 g hydroxidu draselného/1) v poměru 1 :4 (hmotnost/objem), směs se centrifuguje 5 min při nastavení 35 a ethanolová fáze se oddělí a vylije. Netěkavý materiál se promyje ještě devětkrát ethanolovým roztokem báze a potom jednou směsí 1 : 1 ethanol: voda (obj./obj.). Zbytek se dvakrát extrahuje dostatečným objemem acetonitrilu tak, že se odstraní veškeiý zbarvený materiál. Acetonitrilový roztok se šestkrát promyje dvěma objemy hexanu nebo izooktanu, přičemž každý hexanový extrakt (horní vrstva) se oddělí a vylije, a získaný acetonitrilový roztok se zfíltruje přes 0,2 pm membrána z materiálu Teflon® a odpaří se do sucha na koncentrátoru Speed Vac.

Konečný produkt výše uvedeného procesu byl měl mít vzhled viskózního, tmavě červeného oleje, ale sezónní změny výchozího materiálu (citrusových olejů) mohou způsobit zjevné změny jakosti a vzhledu produktu výše popsaného způsobu. Jestliže je například tmavě červený olej kontaminován větším množstvím oranžového krystalického materiálu, potom by se měl zvýšit počet dalších praní ethanolovým roztokem báze z 9 na 19.

Protokol B

Chromatografické metody použitelné na zpracované citrusové oleje

Produkt zvýše uvedeného protokolu A není vhodný pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii, protože obsahuje podstatné množství materiálů, které nejsou ve výhodných systémech mobilní fáze rozpustné. Proto se před chromatografií používá následující protokol přípravy vzorku. Jeden objem produktu získaného podle protokolu A se smíchá s čtyřmi objemy acetonitrilu, nádobka se uzavře, roztok se důkladně míchá, nádobka se centrifuguje (5 min, nastavení 35) a horní acetonitrilová vrstva se filtruje přes 0,2 pm membránu z materiálu Teflon®. Zfiltrovaný roztok se skladuje v uzavřené nádobce při -20 °C 2 dny nebo dále a potom se za chladu zfíltruje přes filtrační papír pro odstranění většího množství sraženiny. Krok srážení a filtrace se jednou opakuje. Zaznamená se objem acetonitrilového roztoku a acetonitril se odstraní

-22CZ 295411 B6 na zařízení Speed Vac. Zbytek se rozpustí v polovině původního objemu acetonitrilu, přičemž se dbá o to, aby nedošlo ke zvíření krystalické sraženiny a roztok může být takto použit pro testování HPLC. Jestliže je nutná preparativní frakcionace promyté netěkavé části citrusového oleje, potom jsou výhodné následující podmínky HPLC. Pro eluci se používá lineárních gradientů, které se vytvářejí mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B složenou z acetonitrilu (přístroj: Hewlett Packard). Eluční časy v minutách a procenta acetonitrilu přítomného ve smíchané mobilní fázi jsou následující: 0, 75; 5, 75; 10, 90; 11, 98; 17, 98; 18, 75; 22, 75. Chromatografícká kolona má délku 250 mm x vnitřní průměr 4,6, je naplněna materiálem C18 navázaným na částice oxidu křemičitého 4 pm (obsah naneseného uhlíku 9 % ODS-L80, YMC, lne), a je chráněna před kolonou o délce 23 mm a vnitřním průměru 4 mm obsahující stejný materiál a 0,5 μΜ filtr, přičemž kolony se udržují při teplotě 40 ± 0,2 °C. Průtok se při cyklu trvajícím 22 min udržuje na hodnotě 1,0 ml/min. Eluát z kolony z každého nástřiku 25 μΐ se monitoruje při 400 ± 200 nm a při 310 ± 2 nm a k frakcionaci se používá automatického jímače frakcí (Gilson).

Jestliže se požadují kvalitativní nebo kvantitativní stanovení citrusových olejů, jejich frakcí nebo referenčních standardů, potom se s výhodou použije následujících podmínek HPLC. Pro eluci se používá lineárních gradientů vytvořených mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B složené z acetonitrilu (přístroj: Hewlett Packard). Doba eluce v minutách stejně jako procenta acetonitrilu přítomného ve směsné mobilní fázi jsou následující: 0, 10; 5, 10; 30, 80; 40, 80; 41, 95; 53, 10; 60, 10. Chromatografícká kolona má délku 150 mm x vnitřní průměr 2,0 mm, je naplněna materiálem Cl8 navázaných na částice oxidu křemičitého 4 pm (14% naneseného uhlíku; ODS-M80, YMC, lne.), je chráněna kolonou o vnitřním průměru 2 mm s patentově chráněnou náplní (Prism, Keystone, Scientifíc, lne.) a opatřenou filtrem PTFE, přičemž kolony jsou udržovány při teplotě 35 ± 0,2 °C. Průtok je v průběhu cyklu trvajícího 60 min 0,20 ml/min. Eluát z kolony z každého nástřiku 10 μΐ se monitoruje na absorbanci při 400 ± 200 nm a 310 ± 2 nm a fluorescenci s excitační vlnovou délkou 229 nm, emisní vlnovou délkou 450 nm a pásmovou filtrací při 370 nm.

Protokol B'

Chromatografické metody zpracování citrusových olejů

Jestliže je nutná preparativní frakcionace promyté netěkavé části citrusového oleje (produkt protokolu A'), jsou výhodné podmínky HPLC uvedené níže. Pro eluci se používá lineárních gradientů vytvořených mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B složenou z acetonitrilu (přístroj: Hewlett Packard). Eluční doba v minutách a příslušná procenta acetonitrilu přítomného ve smíchané mobilní fázi jsou následující: 0, 75; 5, 75; 10, 90; 11, 98; 17, 98; 18, 75, 22, 75. Chromatografícká kolona má rozměry 250 mm délka x 4,6 mm vnitřní průměr, je naplněna materiálem Cl8 navázaným na částice oxidu křemičitého 4 pm (9% naneseného uhlíku; ODS-L80 YMC, lne.) a je chráněna kolonou délky 23 mm x vnitřní průměr 4 mm obsahující stejný materiál a 0,5 pm filtr. Kolony jsou temperovány na 40 ± 0,2 °C. Průtok je v průběhu cyklu o délce 22 min 1,0 ml/min. Eluát z kolony z každého nástřiku 25 μΐ roztoku v acetonitrilu získaného v protokolu A' se monitoruje při 400 + 200 nm a 310 ± 2 nm a frakce sejímají na automatickém jímači frakcí (Gilson).

Jestliže jsou nutná kvalitativní nebo kvantitativní stanovení citrusových olejů, jejich frakcí nebo referenčních standardů, jsou výhodné podmínky HPLC uvedené níže. Pro eluci se používá lineárních gradientů vytvořených mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B složenou z acetonitrilu (přístroj: Hewlett Packard). Eluční doba v minutách a procenta acetonitrilu přítomného ve smíchané mobilní fázi jsou následující: 0, 10; 5, 10; 30, 80; 40, 80; 41, 95; 50, 95; 53, 10; 60, 10. Chromatografícká kolona má délku 150 mm x vnitřní průměr 2,0 mm a je naplněna materiálem Cl8 navázaným na částice oxidu křemičitého 4 pm (naneseno 14 % uhlíku; ODS-M80, YMC, lne.), a je chráněna před kolonou s vnitřním průměrem 2 mm patentově

-23 CZ 295411 B6 chráněnou náplní (Prism, Kyestone Scientifíc, lne.) a opatřenou filtrem PTFE a teplota kolony je udržována na 35 + 0,2 °C. Průtok se udržuje na 0,20 ml/min v průběhu cyklu 60 min. Eluát z kolony z každého nástřiku 10 μΐ se monitoruje na absorbanci při 400 ± 200 nm a 310 ± 2 nm a fluorescenci s excitační vlnovou délkou 229 nm, emisní vlnovou délkou 450 nm a pásmovou filtrací při 370 nm.

Protokol B”

Čištění sloučenin podle vynálezu s použitím chirální kolony MPLC

Spojené zbytky získané z frakcionace oblasti 11 až 12,5 min (protokol B nebo B') a odstranění rozpouštědel (Speed Vac, bez přívodu tepla) se čistí chirální kapalinovou chromatografíí. Použije se izokratické eluce (mobilní fáze obsahuje 3,4 1 izooktanu, 0,6 1 95% ethanolu {zbytek tvoří voda}, a 0,2 1 izopropanolu) pro eluci inhibitorů XI - XVI z kolony (250 x 4,6 mm, Keystone Scientifíc, lne., Chiral DNB {S}) v méně než 34 minutách (přístroj: Hewlett Packard). Průtok se udržuje na 1,0 ml/min a kolona se udržuje při teplotě 40 ± 0,2 °C. Eluát z kolony z každého nástřiku 25 μΐ (zbytek rozpouštěný v mobilní fázi) se monitoruje při 400 ± 200 nm a 310 ± 2 nm a frakcionuje se v automatickém jímači frakcí (Gilson).

Protokol C

Testování biotransformace zprostředkované lidským cytochromem P450

Proces přípravy inkubačních směsí začíná smícháním 10 μΐ ethanolu nebo ethanolového roztoku obsahujícího inhibitor se 100 μΐ bovinního sérového albuminu s koncentrací 100 mg/ml (Sigma) rozpouštěného v reakčním pufru při pokojové teplotě. Reakční pufr je složen z 0,10 M fosforečnanu sodného. 1,0 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové a 5,0 mM chloridu hořečnatého pH 7,4 (všechna činidla: Fisher Scientifíc). Jako inhibiční látky byly použity ketokonazol (Research Diagnostice, lne.) mikonazol, bergapten, xanthotoxin (tyto tři látky od firmy Sigma), bergamotin, imperatorin, izopimpinellin, psoralen, angelicin (předchozí pět látek firmy Indofine Chemical Company, lne.) a frakce sraženin pocházejících z protokolů A, A', B nebo B výše. Pokud bylo možno, konečné koncentrace inhibitorů byly vyjádřeny jako hodnota molarity výpočtem z hmotnosti materiálu nebo interpolací z kalibračních křivek HPLC připravených pomocí referenčních materiálů; jinak se koncentrace vyjadřují jako hmotnost na objem. Zkumavky se vzorky jsou umístěny při přípravě nebo při následující manipulaci z ledu. Přidá se dostatečné množství reakčního pufru, aby objem v každé zkumavce dosáhl 500 μΐ, přidá se 5 μΐ stonásobného koncentrátu pro vytvoření redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (takže úplná reakční směs obsahuje 1,0 mM koncentraci nikotinamidadenindinukleotidfosfátu, 1 U/ml glukóza-6-fosfát dehydrogenázy a 10 mM glukóza-6-fosfát; všechny reagencie firmy Sigma), a potom se rozmrazí lidský jatemí S9 (Anatomie gifi Foundation) a přidá v dostatečných množstvích pro vytvoření snadno detekovatelných množství metabolitů v kontrolních reakcích (množství nutně mezi jednotlivým vzorky kolísá, ale typicky je 10 μΐ). Reakce se předinkubují 3 min při 37 °C ve vodní lázni typu Dubnoff, reakční směs se doplní přidáním 10 ml 100 μΜ terfenadinu (Sigma) rozpouštěného ve 15 směsi 1 : 1 acetonitril : voda a mírně se zamíchá a vzorky se inkubují 15 min při 37 °C a reakce se zastaví vložením zkumavky do ledu a přidáním 2,5 ml 300 nM sloučeniny A příbuzné terfenadinu (vnitřní standard: US Pharmacopeia) rozpuštěné v acetonitrilu.

Vzorky připravené výše se připraví pro stanovení HPLC s použitím následujícího protokolu. Každá zkumavka se silně promíchá a centrifuguje 10 min při nastavení 35, získaný supematant se převede do čisté zkumavky a kapalina se odpaří s použitím zařízení Speed Vac. Zbytek v každé zkumavce se nejprve rozpustí ve 40 μΐ směsi 1 : 1 acetonitril: voda, přidá se 2,5 ml acetonitrilu a opakují se kroky centrofugace - převedení - a odpaření popsané výše.

-24CZ 295411 B6

Suchý zbytek získaný ve výše popsaných experimentech a protokolu přípravy vzorku může být analyzován na metabolity terfenadinu použitím HPLC metody popsané dále a může být také použit pro kvantifikaci inhibičních chemikálií, které byly do reakční směsi přidány (viz protokol B a B'). Pro eluci se používá lineárních gradientů vytvořených mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B složené z 0,025 % objem/objem) kyseliny mravenčí v acetonitrilu (přístroj: Hewlett Packard). Eluční čas v minutách a odpovídající procenta mobilní fáze B přítomná ve smíchané mobilní fázi a průtok (ml/min) jsou následující: 0, 10, 0,10; 2, 10, 0,10; 3,5, 10, 0,20; 4, 10, 0,25; 5, 10, 0,26; 30, 55, 0,25; 32, 98, 0,25; 33, 98, 0,40; 39,8, 98, 0,40; 40, 98, 0,25; 45,25, 10, 0,20; 50, 10, 0,20; 50,25, 10, 0,10. Chromatografícká kolona má délku 150 mm, vnitřní průměr 2,1 mm a je naplněna materiálem Prism Keystone Scientific. Inc., a je chráněna kolonou o vnitřním průměru 2 mm obsahující stejný materiál a opatřenou filtrem PTFE, přičemž kolony jsou udržovány při teplotě 35 ± 0,2 °C. Zbytek suchého vzorku se míchá s 60 μΐ směsi 1 : 1 acetonitril: voda a potom s 40 μΐ vody těsně před každým cyklem a trvání 50,25 min. Eluát z kolony z každého nástřiku 10 μΐ se monitoruje na fluorescenci s excitací 228 nm, emisí 291 nm a pásmovou filtrací při 280 nm. Za těchto podmínek jsou retenční časy alkoholového metabolitu terfenadinu, karboxylového metabolitu terfenadinu a vnitřního standardu 16,2 min, 17,4 min a 22,2 min.

Protokol C'

Testování biotransformace zprostředkované lidským cytochromem P450

Způsob přípravy inkubačních směsí začíná smícháním 10 μΐ ethanolu (kontrolní reakce) nebo ethanolového roztoku obsahujícího inhibitor se 100 μΐ bovinního sérového albuminu s koncentrací lOOmg/ml (Sigma) rozpuštěného vreakčním pufru při pokojové teplotě. Reakční pufr se skládá z 0,10 M fosforečnanu sodného, 1,0 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové a5,0mM chloridu hořečnatého, pH 7,4 (všechny reagencie: Fisher Scientific). Jako inhibiční chemikálie se používají ketokonazo (Research Diagnostics, Inc.), Ritonavir (Norvir™, Abbott Laboratories), inhibiční látky popsané v protokolu C a frakce získané z protokolu B výše. Konečné koncentrace inhibitoru byly vyjádřeny jako molámí koncentrace výpočtem z hmotnosti materiálu nebo použitím Beerova zákona. Reakční zkumavky se vloží při přípravě na následující manipulace do ledu. Přidá se dostatečné množství reakčního pufru, takže konečný objem v každé zkumavce bude 500 μΐ, 5 μΐ stonásobného koncentrátu pro vytvoření redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (takže úplná reakční směs obsahuje koncentraci 1,0 mM nikotinamidadenindinukleotidfosfátu, 1 U/ml glukóza-6-fosfát dehydrogenázy a 10 mM glukóza-6-fosfát; vše od firmy Sigma); a potom se rozmrazí lidský jatemí S9 (Anatomie Gift Foundation) a přidá se v dostatečném množství pro získání snadno detekovatelných množství metabolitů vytvořených v kontrolních reakcích (množství se u jednotlivých vzorků liší, ale typicky je 10 μΐ). Reakce se předinkubují 3 min při 37 °C ve vodní lázni typu Dubnoff, reakční směs se doplní přidáním 10 μΐ 500 μΜ saquinaviru (Invirase™, Roche Laboratories) rozpouštěného ve směsi 1 : 1 ethanol : voda a mírně se zamíchá, vzorky se inkubují 15 min při 37 °C a reakce se zastaví vložením zkumavky do ledu a přidáním 2,5 ml acetonitrilu.

Výše připravené vzorky se připraví pro testování HPLC podle následujícího protokolu. Každá zkumavka se důkladně promíchá a centrifuguje 10 min při nastavení 35, získaný supematant se převeden do čisté zkumavky a kapalina se odpaří na zařízení Speed Vac. Zbytek v každé zkumavce se nejprve rozpustí ve 40 μΐ směsi 1 : 1 acetonitril: voda, přidá se 2,5 ml acetonitrilu a krok centrifugace - převedení - odpaření se znovu opakuje. Suchý zbytek získaný výše popsanými experimenty a protokolem pro přípravu vzorků může být analyzován na obsah saquinaviru a metabolitů saquinaviru použitím metody HPLC popsané níže a může být také použit pro kvantifikaci inhibičních sloučenin, které byly do reakční směsi přidány (viz protokol B a B'). Pro eluci se používá lineárních gradientů vytvářených mícháním mobilní fáze A složené z vody s mobilní fází B složenou z acetonitrilu (přístroj: Hewlett Packard). Eluční čas v minutách a procenta mobilní fáze B přítomná ve smíchané mobilní fázi jsou následující: 0, 10; 5, 10; 30,

-25CZ 295411 B6

80; 31, 95; 40, 95; 43, 10; 48, 10. Průtok je v průběhu celé analýzy 0,2 ml/min. Chromatografická kolona má délku 150 mm x vnitřní průměr 2,1 mm, s patentově chráněnou náplní (Prism, Keystonem Scientifíc, lne.), a je chráněna kolonou o vnitřním průměru 2 mm obsahující stejný materiál a opatřenou filtrem PTFE a kolony se udržují při teplotě 35 ± 0,2 °C. Pro minimalizace degradace analytů se zbytek suchého vzorku smíchá s 50 μΐ směsi 1 : 1 acetonitrol: voda těsně před každým analytickým cyklem v trvání 48 min. Eluát z kolony z každého nástřiku 10 μΐ se monitoruje na absorbanci při 239 ± 2 nm. Za těchto podmínek jsou retenční časy hlavního metabolitu A saquinaviru, hlavního metabolitu B saquinaviru a saquinaviru 24,2 min, 26,0 min a 30,0 min.

Demonstrace účinnosti

Pro demonstraci účinnosti předkládaného vynálezu na první průchod byly prováděny experimenty se sloučeninami podle vynálezu a látkami odvozenými z citrusů podle vynálezu podle protokolu C' popsaného výše, při kterém byla měřena tvorba metabolitů saquinaviru v přítomnosti různých koncentrací inhibitoru. Látky odvozené z citrusů podle předkládaného vynálezu byly připravovány podle protokolu A', B' a B výše a byly porovnávány se známým inhibitorem ketokonazolem. Obr. 1 ukazuje výsledky pro sloučeniny podle vynálezu vzorců XI a XIII a také ukazuje, že bergamottin a imperatorin jsou jako inhibitory prvního průchodu v podstatě neúčinné. Obr. 2 ukazuje srovnání sloučenin podle vynálezu se známými inhibitory ritonavirem a ketokonazolem.

U sloučenin podle vynálezu je výhodné, že poloha furanového kroku furokumarinových kruhů nemusí být vůbec substituována.

Co se týče metod čištění a zpracování, jsou výhodná následující provedení:

A. Způsob zpracování citrusů a selektivní odstraňování fototoxických furokumarinů z látky odvozené z citrusů účinné na první průchod, který zahrnuje krok extrakce uvedené látky odvozené z citrusů směsí alespoň jednoho C₂-C₄ alkoholu, vody a případně báze, přičemž látka odvozená od citrusů s účinky na první průchod si zachovává po této extrakci účinky na potlačení efektu prvního průchodu.

B. Způsob podle provedení A, ve kterém je látka odvozená z citrusů, za studená lisovaný citrusový olej.

C. Způsob podle provedení A, kde uvedenou směsí ethanolu a vody je směs ethanolu a vody v poměru 30/70 objem/objem, popřípadě obsahující 1 až 10% hydroxid draselný (hmotnost/objem).

Další výhodná provedení:

D. Látka odvozená z citrusů účinná na první průchod, která byla extrahována směsí alespoň jednoho C₂-C₄ alkoholu a vody, takže bylo sníženo množství fototoxických furokumarinů v této směsi.

E. Látka odvozená z citrusů podle provedení D, kde touto látkou je za studená lisovaný citrusový olej.

F. Látka odvozená z citrusů podle provedení D, která byla extrahována směsí ethanolu a vody v poměru 30/70 (objem/objem), popřípadě obsahující 1 až 10% hydroxid draselný (hmotnost/objem).

-26CZ 295411 B6

G. Způsob inhibice efektu prvního průchodu orálně podávané látky pacientovi, kde tato látka podlého efektu prvního průchodu, který zahrnuje krok společného podávání látky odvozené z citrusů, ovlivňují první průchod podle některého z provedení A a D.

Prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují inhibiční materiál (sloučeninu atd.) podle vynálezu (buď samostatně, ve směsi s léčivem (léčivy), a/nebo ředivem (ředivy) a/nebo nosičem (nosiči) apod.), takže inhibují biotransformaci saquinaviru podle protokolu C' popsaného výše, lépe než čistý ketokonazol ve stejné molámí (s výhodou) nebo hmotnostní koncentraci. Alternativně poskytují sloučeniny, prostředky, směsi, formulace apod. (materiály) s výhodou hodnoty na ose Y u protokolu C' (viz obr. 1) méně než 0,5, s výhodou 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,22, 0,2, 0,18, 0,15, 0,12, 0,1, 0,8, 0,05 nebo 0,03 nebo méně při rozpuštění nebo rozdělení 0,01 až 0,25 mg, včetně 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,18, 0,2, 0,22 a 0,24 a všech rozmezí mezi uvedenými hodnotami materiálu podle vynálezu v jednom litru vody.

Komerční formou citrusů obsahujících sloučeniny podle vynálezu je za studená lisovaný grapefruitový olej, který obsahuje celkovou koncentraci sloučenin vzorců XI - XVI v rozmezí až do 0,15 až 0,25 mg/ml. Těchto šest sloučenin má následující zastoupení: XI + XII + XII + XIV tvoří přibližně 50 %, sloučeniny XV a XVI zbytek. Pro zastoupení látek XI až XIV platí, že jejich poměr je 3 : 2 : 2 : 1, a u látek XV:XVI přibližně 2:1. Prostředky podle předkládaného vynálezu tedy v jednom provedení s výhodou obsahují vyšší koncentrace sloučenin podle vynálezu (tj. celková koncentrace všech obsažených sloučenin podle vynálezu), než jaká by se mohla vyskytnout v přírodě a v komerčních formách citrusů. Tyto koncentrace se označují jako „koncentrovaná množství“. Příklady výhodných koncentrací jsou více než 0,25 mg/ml, 0,3, 0,8, 1, 2, 5, 8, 32, 128, 200 mg/ml atd. Co se týče sloučenin podle vynálezu, sloučeniny v jednom provedení vynálezu jsou v odlišné formě od sloučenin nalézaných v přírodě nebo v komerčních materiálech v důsledku jejich čistoty. Termín „v podstatě čistý“ a „v podstatě čistá forma“ označuje čistotu vyšší než se nachází u komerčních výrobků a v přírodě z hlediska sloučenin podle vynálezu. Tyto koncentrace a formy mohou odborníci v oboru snadné určit a autor vynálezu identifikoval aktivní sloučeniny odpovědné za „grapefruitový efekt“. Jiné formulace, slovní spojení apod. použitelné pro popis provedení předkládaného vynálezu, které je rozlišují z hlediska patentovatelnosti i jinak od v přírodě se vyskytujících forem nebo komerčních forem, jsou obsaženy v následujících patentech: patenty US 4 708 948, 5 409 938, 5 455 251,4 977 244, 5 462 956, 5 314 899, 5 104 977, 5 484 889, 5 591 770, 5 599 839, 5 672 607, 5 674 900, 5 648 354, 5 691 386, 5 681 829 a 5 654 432. Další popis možného využití vynálezu, množství a způsobů podávání se uvádí v US 5 665 386, WO 97/15269 a WO 96/40192. Odkazem se zařazují také následující patentové přihlášky apod., 60/956 382, 60/048 183, 60/043 878, 08/764 081 a 08/673 800 (referenční čísla zástupce 7552-001-99, 7552-004-99, 7552-005-99, 7552-006-99 a 7552-007-99) a referenční číslo zástupce 7552-008-99, přihláška číslo 08/997 259 podaná 23. prosince 1997.

Další použitelné sloučeniny jsou popsány následujícími vzorci, kde R, L, A a HAr mají výše uvedený význam. Stejně jako je tomu u výše popsaných sloučenin, také tyto sloučeniny zahrnují všechny stereoizomery, izomery E-Z apod. Tam, kde se tyto sloučeniny vyskytují v přírodě nebo komerčně, jsou s výhodou ve výše popsaných formách co se týče čistoty, koncentrace atd. Tyto sloučeniny, které mohou být případně substituovány jako sloučeniny vzorců I až XVI, jsou:

-27CZ 295411 B6

-28CZ 295411 B6

-29CZ 295411 B6

U sloučenin podle vynálezu zahrnuje výhodná skupina případně dalších substituentů následující skupiny: atom vodíku, Ci-C₄ alkyl, -S(Ci-C₄ alkyl), -O(Ci-C₄ alkyl), -NH₂, -NH(C]-C₄ alkyl)— N(Ci-C₂alkyl)(Ci-C₄ alkyl), hydroxy, -O(Ci-C₂ alkyl), fluor, Ci-C₆ alkyl, chlor, brom, jod, C,-C₄ alkoxy, -CF₃, -C(=O)O-(Ci-C₄) alkyl, -OC(=O)(Ci-C₄ alkyl), -OC(=O)N(Ci-C₄ alkyl)(Ci-C₂ alkyl), -NHCO(C,-C₄ alkyl), -COOH, -COO(Ci~C₄ alkyl), -CONH(Ci-C₄ alkyl), -CON(Ci-C₄ alkyl)(C]-C₂ alkyl), -S(C,-C₄ alkyl), -CN, -NO₂, -SOCQ-Q alkyl), -SO₂(C!-C₄ alkyl), -SO₂NH(C]-C₄ alkyl) a -SO₂N(C]-C₄ alkyl)(Ci-C₂ alkyl).

Další skupinou výhodných případných dalších substituentů jsou následující skupiny: C|-Ci₂ alkyl, aiyl, (C1-C4 alkylen)aryl, fenyl, nafityl, thienyl, benzothienyl, pyridyl, chinolyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, imidazolyl, furanyl, benzofuranyl, benzothiazolyl, izothiazolyl, pyrazolyl, pyrrolyl, indoly 1, pyrrolopyridyl, oxazolyl a benzoxazolyl, C₃-C₈ cykloalkyl nebo (Cj-C₆ alkylen)(C₃-C₈ cykloalkyl), Ci-C₄ alkyl, benzyl, C1-C4 alkanoyl, Ci-C₆ alkoxy, -OC(=O)(Ci-C₆ alkyl), -OC(=O)N(Ci-C₄ alkyl) (Ci-C₂ alkyl), -S(Ci-C₆ alkyl), amino, -NH(Ci-C₂ allcyl), -N(Cj-C₂ alkyl)(Ci-C₂ alkyl) (C1-C4 alkyl), -N(C,-C₄ alkyl)-CO-<Ci-C₄ alkyl), -NHCOCQ-Q alkyl), -COOH, -COOH, -COO(Ci-C₄ alkyl), -CONH(Ci-C₄ alkyl), -CON(C]-C₄ alkyl)(Ci-C₂ alkyl), -SH, -SO(Cj-C₄ alkyl), -SO₂(Ci-C₄ alkyl), -SO₂NH(Ci-C₄ alkyl) a -SO₂N(Ci-C₄ alkyl)(Ci-C₂ alkyl).

Třetí skupinou výhodných případných dalších substituentů jsou následující skupiny: -S(C]-C₄ alkyl) nebo -SO₂(C]-C₄ alkyl) (C]-C₆ alkyl), -N(C]-C₄ alkyl) (Ci-C₂ alkyl), -S(C!-C₄ alkyl), -SO(Cj-C₄ alkyl), -CO(Ci-C₄ alkyl), -C(=O)H, -C(=O)O(Ci-C₄ alkyl), C,-C₃ alkoxy, dimethy lamino, methylamino, ethy lamino, -NHC(=O)CH₃, Cj-C₃ thioalkyl, -COOH, -C(=O)O(C]-C₄ alkyl), -C(=O)O(C,-C₄ alkyl), -N0₂, fenyl, naftyl, thienyl, benzothienyl, pyridyl, chinolyl, parazinyl, furanyl, benzofuranyl, benzothiazolyl, benzizothiazolyl, benzizoxazolyl, benzimidazolyl, indolyl, benzoxazolyl nebo C₃-C₈ cykloalkyl, chlor, Ci-C₆ alkyl, -O(Ci-C₆ alkyl), brom, jod, formyl, -CN, -CF₃, -N0₂, -NH₂, -NH(C|-C₄ alkyl), -N(C,-C₂ alkyl)(Cj-C₆ alkyl), -C(=O)O(Ci-C₄ alkyl), -C(=0) (Cj-C₄ alkyl), -COOH, -SO₂NH(Ci-C₄ alkyl), -SO₂N(Ci-C₂) alkyl)(C]-C₄ alkyl), -SO₂NH₂, -NHSO₂(C!-C₄ alkyl), -S(C]-C₆ alkyl) a -SO₂(Ci-C₆ alkyl), fluor, hydroxy, amino, methylamino, dimethylamino, acetyl, atom vodíku, Ci-C₄ alkyl, halo (například chlor, fluor, jod nebo brom), hydroxy, -O(Ci-C₄ alkyl), -C(=0) (Cí-C₄ alkyl), -C(=O)O(Ci~C₄ alkyl), -OCF₃, -CF₃, -CH₂OH, nebo -CH^Q-Cj alkyl) hydroxy, methoxy a fluor.

-30CZ 295411 B6

Do těchto skupin výhodných substituentů patří také specifické příklady HAr (tj. C6-C24 aromatické skupiny nebo heteroaromatické skupiny). Do předkládaného vynálezu jsou zahrnuty také prekurzory a aktivní metabolity sloučenin, prostředků apod. podle vynálezu. Těmito prekurzory jsou sloučeniny, které po podání savci jako je člověk, poskytnou sloučeninu podle 5 vynálezu. Účinné metabolity jsou sloučeniny vytvořené po podání sloučeniny, prostředku apod.

podle vynálezu savci, s výhodou člověku, které mají účinky na první průchod. Některé příklady prekurzorů a metabolitů podle vynálezu jsou:

-31 CZ 295411 B6

HAr

Sloučeniny, metabolity, prekurzoiy apod. podle vynálezu mohou být s výhodou substituovány deuteriem a/nebo fluorem pro zvýšení doby zdržení v organismu pacienta/živočicha apod.

-32CZ 295411 B6

Farmaceutické nosiče, řediva, pomocné látky apod. jsou odborníkům v oboru známy. Příklady se uvádějí v několika výše uvedených patentech a publikacích.

Výhodný způsob extrakce se formou příkladů uvádí v příkladové části výše, kde se popisuje předběžné zpracování za studená lisovaného grapefruitového oleje pro další použití jako doplňku dietních potravin, léčiv apod. V takové situaci je výhodné, pokud se odstraní polární kumariny a furokumariny (viz výše) jako působením tepla tak i působením bází, ačkoliv oba způsoby nemusí být nutné zařazeny. Je také výhodné používat více vody než C₂-C₄ alkoholu, přičemž. nejvýhodnější je směs 70 : 30 (objem/objem) voda : ethanol. Navíc je výhodné neodstraňovat při počáteční extrakci těkavé látky přítomné v látce odvozené z citrusů s účinky na první průchod (látky odvozené z citrusů obsahující alespoň jednu sloučeninu, metabolit, prekurzor apod. podle vynálezu). Výhodnou látkou odvozenou z citrusů je za studená lisovaný grapefruitový olej. Pokud se používá zahřívání, je výhodná teplota 40 až 120 °C, výhodnější 60 až 110 °C a nejvýhodnější 80 až 105 °C, včetně teplot 80, 85, 90, 95, 100 a 105 °C. Při extrakci se směs alkohol/voda uvede do styku s látkou odvozenou z citrusů s účinky na první průchod jednou nebo více než jednou, způsobem známým v oboru, například s použitím zahřívání (tj. při zvýšené teplotě). Mohou být použity báze jako je NaOH, KOH nebo jakákoliv jiná báze, která se rozpouští ve směsích alkohol/voda, v množstvích 1 až 15 %, s výhodou 3 až 10 %, výhodněji 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 % (hmotnost/objem), vztaženo na celkový objem vody a alkoholu.

Jeden ze způsobů pro zjištění, zda je již extrahovaný produkt připravený pro další použití, je monitorování pH prací směsi, s výhodou použití samotné vody. Výhodné jsou hodnoty blízké neutrální oblasti (6 až 7,5). Je možno použít látek pro nastavení pH jako jsou například kyseliny přijatelné z farmaceutického hlediska a vhodné pro potravinářské účely. Míra odstranění furokumarinů, kumarinů apod. může být monitorována jako bylo popsáno výše, použití HPLC, GC apod. Jeden z způsobů jak zajistit, aby se vyčištěném extraktu podle vynálezu nebyly přítomny materiály nerozpustné v alkoholu, je míchání nebo extrakce alkoholem s následující centrifugám' pro odstranění nerozpustných materiálů.

Claims (44)

1. NÁROKY

   1. Derivát kumarinu vzorců I-IV:

   kde v každé z výše uvedených struktur

   R znamená nezávisle atom vodíku nebo popřípadě substituovanou Cj-Cu alkylovou skupinu;

   L je popřípadě substituovaná, C1-C15 přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina, popřípadě zakončená na jednom nebo obou koncích atomem kyslíku;

   HAr je popřípadě substituovaná C₆-C₂4 aromatická skupina nebo heteroaromatická skupina obsahující jeden nebo více atomů kyslíku jako atomů kruhu, a

   E je skupina -OH, -COOH, -COOR kde R je definováno výše nebo popřípadě substituovaná Ci-C₈ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, nebo je skupina E C3-C8 popřípadě substituovaná cyklická nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, neboje E popřípadě substituovaná skupina HAr,

   -34CZ 295411 B6 přičemž případné substituenty skupin R, L, HAr a E jsou zvoleny ze skupiny Ci-C₆ přímé, rozvětvené nebo cyklické alkylové skupiny, skupiny -OH, halogen, C1-C5 alkoxy, Ci-C₅ alkylkarbonyloxy a C1-C5 alkoxykarbonyl.
2. 2. Derivát kumarinu podle nároku 1, obecného vzorce I.
3. 3. Derivát kumarinu podle nároku 1, obecného vzorce II.
4. 4. Derivát kumarinu podle nároku 1, obecného vzorce III.
5. 5. Derivát kumarinu podle nároku 1, obecného vzorce IV.
6. 6. Použití derivátu kumarinu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u léčiv přijímaných orálně člověkem, při společném orálním podávání léčiva podléhajícího efektu prvního průchodu a derivátu kumarinu podle nároku 1 člověku.
7. 7. Prostředek s účinky na efekt prvního průchodu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden derivát kumarinu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
8. 8. Derivát kumarinu vzorce kde

   R znamená nezávisle atom vodíku nebo popřípadě substituovanou C1-C15 alkylovou skupinu;

   L je popřípadě substituovaná, Cj-Ci₅ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina, popřípadě zakončená na jednom nebo obou koncích atomem kyslíku;

   HAr je popřípadě substituovaná C6-C24 aromatická skupina nebo heteroaromatická skupina obsahující jeden nebo více atomů kyslíku jako atomů kruhu, a

   E je skupina -OH, -COOH, -COOR, kde R je jak definováno výše nebo popřípadě substituovaná C]-C₈ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, nebo je skupina E C3-C8 popřípadě substituovaná cyklická nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, neboje E popřípadě substituovaná skupina HAr,

   -35CZ 295411 B6 přičemž případné substituenty skupin R, L, HAr a E jsou zvoleny ze skupiny Ci-C₆ přímé, rozvětvené nebo cyklické alkylové skupiny, skupiny -OH, halogen, Cj-C₅ alkoxy, Ci-C₅ alkylkarbonyloxy a C]-C₅ alkoxykarbonyl.
9. 9. Použití derivátu kumarinu podle nároku 8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u léčiv přijímaných orálně člověkem, při společném orálním podávání léčiva podléhající efektu prvního průchodu a derivátu kumarinu podle nároku 8 člověku.
10. 10. Derivát kumarinu vzorce kde

    R znamená nezávisle atom vodíku nebo popřípadě substituovanou C1-C15 alkylovou skupinu;

    L je popřípadě substituovaná, C1-C15 přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina, popřípadě zakončená na jednom nebo obou koncích atomem kyslíku;

    HAr je popřípadě substituovaná C6-C24 aromatická skupina nebo heteroaromatická skupina obsahující jeden nebo více atomů kyslíku jako atomů kruhu, a

    E je skupina -OH, -COOH, -COOR, kde R je jak definováno výše nebo popřípadě substituovaná C]-C₈ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, nebo je skupina E C₃-C₈ popřípadě substituovaná cyklická nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, neboje E popřípadě substituovaná skupina HAr, přičemž případné substituenty skupin R, L, HAr a E jsou zvoleny ze skupiny C]-C₆ přímé, rozvětvené nebo cyklické alkylové skupiny, skupiny -OH, halogen, C1-C5 alkoxy, C1-C5 alkylkarbonyloxy a C]-C₅ alkoxykarbonyl.
11. 11. Použití derivátu kumarinu podle nároku 10 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u léčiv přijímaných orálně člověkem, při společném orálním podávání léčiva podléhajícího efektu prvního průchodu a derivátu kumarinu podle nároku 10 člověku.

    -36CZ 295411 B6
12. 12. Derivát kumarinu vzorce kde

    R znamená nezávisle atom vodíku nebo popřípadě substituovanou C]-Ci₅ alkylovou skupinu;

    L je popřípadě substituovaná, C1-C15 přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina, popřípadě zakončená na jednom nebo obou koncích atomem kyslíku;

    HAr je popřípadě substituovaná C₆-C₂₄ aromatická skupina nebo heteroaromatická skupina obsahující jeden nebo více atomů kyslíku jako atomů kruhu, a

    E je skupina -OH, -COOH, -COOR, kde R je jak definováno výše nebo popřípadě substituovaná Ci-C₈ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, nebo je skupina E C3-C8 popřípadě substituovaná cyklická nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy kyslíku nebo síry, neboje E popřípadě substituovaná skupina HAr, přičemž případné substituenty skupin R, L, HAr a E jsou zvoleny ze skupiny Ci-Q přímé, rozvětvené nebo cyklické alkylové skupiny, skupiny -OH, halogen, C1-C5 alkoxy, C1-C5 alkylkarbonyloxy a C1-C5 alkoxykarbonyl.
13. 13. Použití derivátu kumarinu podle nároku 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u léčiv přijímaných orálně člověkem, při společném orálním podávání léčiva podléhajícího efektu prvního průchodu a derivát kumarinu podle nároku 12 člověku.
14. 14. Prostředek s účinky na efekt prvního průchodu, vyznač u j í cí se tím, že obsahuje alespoň jeden derivát kumarinu podle některého z nároků 8, 10 a 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.
15. 15. Derivát kumarinu vzorců I-IV podle nároku 1, kde v každé z výše uvedených struktur

    R je nezávisle atom vodíku nebo popřípadě substituovaná C1-C15 alkylová skupina;

    L je popřípadě substituovaná C1-C15 přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo větším počtem nesousedících atomů síry nebo kyslíku a popřípadě zakončená na jednom nebo obou koncích atomem kyslíku;

    -37CZ 295411 B6

    HAr je popřípadě substituovaná C₆-C₂₄ aromatická skupina nebo heteroaromatická skupina obsahující jeden nebo více atomů kyslíku jako atomů kruhu, a

    5 E je skupina -OH, -COOH, -COOR, kde R je jak definováno výše, nebo popřípadě substituovaná Cj-C₈ přímá nebo rozvětvená, nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo větším počtem nesousedících atomů kyslíku nebo síry, nebo je E C₃-C_g popřípadě substituovaná cyklická nasycená, mononenasycená nebo polynenasycená alkylová skupina popřípadě přerušená jedním nebo více nesousedícími atomy 10 kyslíku nebo síry, nebo je E popřípadě substituovaná skupina HAr.
16. 16. Derivát kumarinu podle nároku 15 vzorce V
17. 17. Derivát kumarinu podle nároku 15 vzorce VI

    -38CZ 295411 B6
18. 18. Derivát kumarinu podle nároku 15 vzorce VII
19. 19. Derivát kumarinu podle nároku 15 vzorce VIII

    -39CZ 295411 B6
20. 20. Derivát kumarinu podle nároku 15 vzorce IX
21. 21. Derivát kumarinu podle nároku 15 vzorce X

    5
22. 22. Použití derivátu kumarinu zvoleného ze skupiny sloučenin vzorců V až X podle některého z nároků 16 až 21 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u léčiv přijímaných orálně člověkem, při společném orálním podávání léčiva podléhajícího efektu prvního průchodu a derivátu kumarinu zvoleného ze skupiny sloučenin vzorců V až X člověku.

    10
23. 23. Použití podle nároku 22, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce V.
24. 24. Použití podle nároku 22, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce VI.

    -40CZ 295411 B6
25. 25. Použití podle nároku 22, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce VII.
26. 26. Použití podle nároku 22, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce VIII.

    5
27. 27. Použití podle nároku 22, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce IX.
28. 28. Použití podle nároku 22, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce X.
29. 29. Prostředek s účinky na efekt prvního průchodu, vyznačující se tím, že obsahuje io alespoň jeden derivát kumarinu podle některého z nároků 16 až 21 a farmaceuticky přijatelný nosič.
30. 30. Derivát kumarinu zvolený ze skupiny sloučenin vzorců XI-XVI:

    -41 CZ 295411 B6

    O
31. 31. Derivát kumarinu podle nároku 30 vzorce XI.
32. 32. Derivát kumarinu podle nároku 30 vzorce XII.
33. 33. Derivát kumarinu podle nároku 30 vzorce XIII.
34. 34. Derivát kumarinu podle nároku 30 vzorce XIV.

    -42CZ 295411 B6
35. 35. Derivát kumarinu podle nároku 30 vzorce XV.
36. 36. Derivát kumarinu podle nároku 30 vzorce XVI.
37. 37. Prostředek s účinky na efekt prvního průchodu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden derivát kumarinu podle nároku 30 a farmaceuticky přijatelný nosič.
38. 38. Použití derivátu kumarinu zvoleného ze skupiny sloučenin vzorců XI až XVI podle nároku 30 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici efektu prvního průchodu u léčiv přijímaných orálně Člověkem, při společném orálním podávání léčiva podléhajícího efektu prvního průchodu a derivát kumarinu zvoleného ze skupiny sloučenin vzorců XI až XVI člověku.
39. 39. Použití podle nároku 38, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce XI.
40. 40. Použití podle nároku 38, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce XII.
41. 41. Použití podle nároku 38, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce XIII.
42. 42. Použití podle nároku 38, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce XIV.
43. 43. Použití podle nároku 38, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce XV.
44. 44. Použití podle nároku 38, kde uvedeným derivátem kumarinu je sloučenina vzorce XVI.