CZ295118B6 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Farmaceutický prostředek pro léčení Alzheimerovy choroby obsahuje kombinaci cliochinolu a vitaminu B.sub.12.n.. Při použití této kombinace je možno využít účinnosti cliochinolu proti příznakům Alzheimerovy choroby a současně se vyvarovat vzniku nežádoucích vedlejších účinků, obvykle spojených s podáváním této látky.ŕ

Description

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického prostředku pro léčení Alzheimerovy choroby.

Dosavadní stav techniky

Alzheimerova choroba je chronické neurodegenerativní onemocnění, které převážně primárně postihuje starší lidi.

Klinická diagnóza Alzheimerovy choroby je podporována existencí a nahromaděním amyloidních ložisek v mozku. Amyloid se nachází většinou v termálních oblastech neuronů jako morfologicky heterogenní ložiska, uváděná také jako senilní plaky. Jejich tvorba souvisí s přítomností příznaků choroby, včetně poruch paměti. Po vytvoření těchto ložisek se v tělech nervových buněk vytvoří shluky neurofíbril. Tvorba shluků neurofíbril znamená zhoršení poruch paměti a všech dalších příznaků demence.

Hlavní složkou amyloidních ložisek je polypeptid, označovaný Abeta (amyloid-beta). Jde o složku, za obvyklých podmínek rozpustnou v mozkomíšním moku, kde se nachází v koncentraci přibližně 3 až 5 nM. Abeta může obsahovat 39 a 43 aminokyselin, typicky 40 aminokyselin v úplné formě a je odvozen jako produkt proteolytického štěpení bílkoviny z buněčného povrchu, označované jako prekurzorová bílkovina amyloidu, APP podle publikace Kang a další, 1987, Nátuře 325, 733 až 736. Normální funkce Abeta není v současné době známa, může však jít o tvorbu kationtoselektivních kanálků přes buněčné membrány podle Kawahara M., Arispe N., Kuroda Y., Rojas E., 1997, Biophysical Joumal, 73/1, 67 až 75.

Bylo prokázáno, že ke složení syntetického Abeta může dojít působením různých faktorů,například nízkého pH, vysoké koncentrace solí a přítomnosti kovů, například zinku, mědi a rtuti podle Bush A.I., Moir R. D., Rosenkranz K. M. a Tanzi R.E., 1995, Science, 268, 1921 až 1923. Bylo uváděno, že Abeta specificky do nasycení váže zinek s vysokou afinitou vazby (K_D =107 nM) při molárním poměru zinku a Abeta 1:1 podle Bush A. I., Pettingell Jr., W. H., Paradis M. D. a Tanzi R. E., 1994, J. Biol. Chem., 269, 12152 až 12158. K této vazbě dochází při fyziologických koncentracích zinku podle publikace Bush A. I., Pettungell Jr. W. H., Multheup G., Paradis M. D., Vonsattel J. P., Gusella J. F., Beyreuther K., Masters C. L. a Tanzi R. E., 1994, Science 265, 1464-1467.

Existují opodstatněné předpoklady, že odstraněním amyloidních ložisek u nemocných, trpících Alzheimerovou chorobou, by mohlo dojít ke zmírnění příznaků tohoto onemocnění. Z tohoto důvodu byly vyvíjeny snahy nalézt účinnou látku pro odstranění amyloidních ložisek.

V mezinárodní patentové přihlášce WO 93/10459 se popisuje způsob léčení Alzheimerovy choroby podáváním látek, schopných vázat zinek. Z výhodných látek je možno uvést kyselinu fytovou, desferriosamin, citronan sodný, EDTA, l,2-diethyl-3-hydroxypyridin-4-on a 1-hydroxyethyl-3-hydroxy-2-methylpyridin-4-on.

V DE 39 32 338 se popisuje použití chelačního činidla, například 8-hydroxychinolinu pro léčení Alzheimerovy choroby.

Podle US 5 373 021 je možno použít disulfiram a jeho soli a analogy, schopné proniknout mozkomíšní bariérou, ke snížení neurologického poškození v průběhu Alzheimerovy choroby.

Až dosud známé látky, navrhované pro léčení Alzheimerovy choroby, mají různé nevýhody, které zabránily jejich širšímu využití. Například většina uvedených látek neproniká mozkomíšní bariérou a nemůže se tedy dostat do oblastí, v nichž je uložen amyloid. Disulfiram, který touto bariérou může projít, má jinou nevýhodu, spočívající ve vytlačování alkoholů.

Nejdůkladněji sledovaným chelatačním činidlem je EDTA. Chelatační účinek této látky je však vzhledem k zinku a mědi poměrně slabý. Mimoto EDTA nemůže proniknout mozkomíšní bariérou a kromě toho se považuje za relativně toxickou látku.

Vynález si klade za úkol navrhnout pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení Alzheimerovy choroby takovou látku, která by byla schopná proniknout mozkomíšní bariérou, měla by dobrý chelatační účinek na těžké kovy, takže by nedocházelo ke shlukování amyloidů, a měla by být schopná znovu rozpouštět již vytvořená ložiska amyloidů.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutický prostředek pro léčení Alzheimerovy choroby, který jako účinek složky obsahuje cliochinol a vitamin Bi₂.

Pod pojmem „léčení Alzheimerovy choroby“ se rozumí prevence, léčení i zmírnění příznaků této choroby v jakémkoliv jejím stadiu a v průběhu jejího vzniku.

Cliochinol je 5-chlor-7-jod-8-hydroxychinolin a náleží tedy do skupiny hydroxychinolinu. Jde o látku, která se užívá místně proti různým infekcím, například proti amoebiáze a proti infekčním průjmům. Sloučenina je jen málo rozpustná ve vodě při pH 7 až 11. Mimo toto rozmezí pH je možno dosáhnout vyšší koncentrace.

Je známa chelatační schopnost cliochinolu pro železo, kobalt, nikl a zinek podle publikace Kidani Y. a další, 1974, Jap. Analyst, 23, 1375 až 1378, a také Tateioshi J. a další, 1973, Psychiat. Neurol. Jap., 75, 187 až 196. Při použití hmotové spektrometrie je koordinační číslo pro cliochinol v případě dvojmocného kobaltu, niklu, mědi a zinku rovno 2, kdežto koordinační číslo pro trojmocné železo je 3. Byly podány zprávy o tom, že injekční prostředky, obsahující cliochinol, pronikly mozkomíšní bariérou, koncentrace uvedené látky mozku byly řádu 20 mikrolitrů/ml v případě aplikace v dávkách 10 až 20 mg/kg podle svrchu uvedené publikace Tateishio a další, 1975 a podle publikace Tamura Z., 1975, Jap. J. Med. Sci. Biol. Suppl. 28, 69 a 77. Koncentrace cliochinolu je vysoká v takových oblastech mozku, jako hippocampu, který je bezprostředně ohrožen Alzheimerovou chorobou.

Při použití mikroautoradiografíckého postupu bylo prokázáno, že u opic cliochinol vytváří v hippocampu cheláty se zinkem. Cheláty s dvojnásobným zinkem byly nalezeny převážně v terminálních axodendritických zakončeních nervových vláken. Nekonjugovaný cliochinol velmi rychle proniká do nervového systému po nitrožilní aplikaci a mozkomíšní bariéra pro tuto látku prakticky neexistuje podle publikace Shirilogi H. a další, 1979, Handbook of Clinical Neurology, North Holland Publishing Company, 141 až 198.

Přesto že cliochinol má známý chelatační účinek a schopnost pronikat mozkomíšní bariérou, nemohlo být předem předpokládáno, že má také schopnost znovu rozpouštět Abeta, vysrážený zinkem. Na tomto zcela neočekávaném zjištění je založeno použití cliochinolu pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení Alzheimerovy choroby podle vynálezu.

V současné době se pokládá za ověřené, že cliochinol a Abeta mají kompetetivní chelatační účinek na zinku a další těžké kov. Cliochinol je považován za velmi silné chelatační činidlo, které přednostně váže ionty těžkých kovů. To znamená, že z komplexu zinku a Abeta bude Abeta znovu solubilizován do okolní kapaliny vzhledem k tomu, že cliochinol se sám naváže na zinečCZ 295118 B6 naté ionty. Komplex cliochinolu a zinku pak projde mozkomíšní bariérou a bude z organismu vyloučen.

Vzhledem k tomu, že cliochinol je poměrně silné chelatační činidlo, může také dojít k chelataci kovových iontů z enzymů nebo ochranných skupin. Může proto být žádoucí dodávat ionty stopových prvků nebo ochranné skupiny, zvláště při předpokladu delšího léčení cliochinolem.

Vitamin Bi₂ obsahuje kobalt. Studie, týkající se subakutní myelooptické neuropatie (SMPN) u japonských nemocných, jimž byl podáván cliochinol ve vyšších než doporučených dávkách po delší dobu, prokazují, souvislost mezi delším léčením cliochinolem a nedostatkem vitaminu Bi₂. Interakce mezi cliochinolem a vitaminem B₁₂ byla skutečně prokázána in vitro i in vivo. Může tedy být vhodné podávat také B]₂ společně s cliochinolem nebo následně tak, aby nedošlo k nedostatku vitaminu B_]2.

Cliochinol s vitaminem B_]2 je možno podat v jakémkoliv příslušném množství a v jakékoliv galenické formě najednou nebo v rozdělených dávkách.

Celkové denní množství cliochinolu se bude pohybovat v rozmezí 10 až 750 mg v závislosti na stavu nemocného. Typická denní dávka je 100 mg. Je také možno podávat 10 až 250 mg, s výhodou 100 mg cliochinolu 3x denně. Denní dávka až 750 mg po dobu dvou týdnů se považuje za dávku, při níž není riziko neurotoxicity nebo jiných vedlejších účinků.

Pro prevenci výskytu příznaků Alzheimerovy choroby nebo pro zpomalení vývoje příznaků již vzniklém onemocnění se podává 10 až 100 mg cliochinolu denně po dlouhou dobu, například až 10 let.

Podávané množství musí určit ošetřující lékař s ohledem na celou řadu faktorů, jako jsou věk nemocného, jeho celkový zdravotní stav a podobně. Svrchu uvedená množství jsou pouze rozmezím, v němž se obvykle dosahuje nej lepších výsledků.

V případě, že má být cliochinol podáván po delší dobu, s výhodou se tato látka podává přerušovaným způsobem. V prvním období je možno cliochinol podávat například 1 až 3 týdny, pak se podávání přeruší tak, aby se cliochinol vyloučil z organismu a odstranily se jakékoliv nežádoucí vedlejší účinky. Toto období, v němž se účinná látka nepodává, může trvat 1 až 4 týdny. V průběhu této doby je vhodné podávat vitamin B|₂, popřípadě další ochranné látky.

Při dlouhodobém přerušovaném podávání dochází k opětnému rozpouštění agregátů zinku a Abeta a také k zábraně tvorby dalších agregátů uvedeného typu.

Přerušované podávání cliochinolu sníží také toxicitu této látky a tak dovolí prodlouženou dobu podávání a zábranu vzniku příznaků onemocnění.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být jakoukoliv vhodnou galenickou formu pro enterální a parenterální podání, je pouze zapotřebí podávat dostatečnou koncentraci cliochinolu do mozkové tkáně. V případě, že je zapotřebí dosáhnout rychle vysoké koncentrace cliochinolinu v mozku, je vhodné nitrožilní podávání. Vzhledem k tomu, že je pohodlnější podávat farmaceutické prostředky perorálně, je možno použít tento způsob podávání v případě, že není nezbytné rychle dosáhnout vysoké koncentrace cliochinolu v mozkové tkáni. Farmaceutický prostředek může být podáván také nitrokožní cestou.

Farmaceutický prostředek, který obsahuje cliochinol a vitamin B_!2, může mimo to obsahovat ještě další účinné složky. Jde zvláště o stopové prvky a různé ochranné látky a/nebo o jakákoliv jiná léčiva, která je současně možno užít k léčení Alzheimerovy choroby k jejímu zlepšení nebo ke zmírnění jejích příznaků, nebo k oddálení vzniku některých příznaků této choroby. Tyto další

-3 CZ 295118 B6 účinné látky je samozřejmě možno podávat také ve formě oddělených farmaceutických prostředků spolu s prostředky, obsahujícími cliochinol.

Prostředky s obsahem cliochinolinu je tedy možno použít zejména k následujícím cílům:

1) k léčení nemocných, u nichž již byla diagnostikována Alzheimerova choroba v jakémkoliv klinickém stadiu,

2) k prevenci choroby u nemocných s časnými nebo prodromálními příznaky a/nebo

3) k oddálení nástupu příznaků nebo zhoršení příznaků Alzheimerovy choroby.

Výhoda prostředku podle vynálezu spočívá v tom, že kombinací obsažených látek je možno vyloučit vznik nežádoucích vedlejších účinků, pozorovaných po podávání cliochinolu.

Popis výkresu

Na obr. 1 je znázorněna solubilizace amyloidu beta působením cliochinolu.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

5,3 g cliochinolu se za míchání uvede do suspenze ve 200 ml n-dekanu. Nerozpuštěný materiál se nechá usadit. Zvážením usušeného nerozpuštěného cliochinolu po odpaření děkanu je možno prokázat, že se rozpustilo pouze 2 % množství cliochinolu. 100 ml světležlutého supematantu se míchá spolu se 100 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem, PBS o pH 7,4 a pak se fáze nechají oddělit. Spodní fáze PBS se oddělí a zfiltruje k odstranění zbytku, vytvořeného na rozhraní fází extrakcí s organickým rozpouštědlem. Za předpokladu, že se 2 % cliochinolu rozpustí v ndekanu a koeficient dělení je 1/1750 při použití PBS a děkanu s cliochinolem v poměru 1:1, je koncentrace cliochinolu v PBS rovna 800 nM.

Vzorky moku byly připraveny jako obvykle pro histopatologickou diagnózu Alzheimerovy choroby. Byly připraveny ve dvojím provedení vzorky po 0,5 g neocortexu z čelního laloku. Vzorky byly homogenizovány ve 3 ml roztoku cliochinolu v PBS s koncentrací 100 %, 10 % a 1 % výsledného extraktu PBS s cliochinolem, mimoto byl použit samotný PBS.

Homogenáty byly odstředěny při 150 000 g po dobu 30 minut a supematanty byly uloženy do ledu jako frakce S. Usazeniny byly homogenizovány stejným způsobem a rovněž stejným způsobem odstředěny a výsledné supematanty byly opět uloženy jako frakce P.

K 1 ml každého supematantu bylo přidáno 200 mikrolitrů ledem vychlazeného 10% roztoku kyseliny trichloroctové TCA k vysrážení všech bílkovin včetně Abeta. Výsledná sraženina byla promyta 100% ethanolem a znovu uvedena do suspenze ve 100 mikrolitrech TBS (tris 20 mM, chlorid sodný 150 mM, pH 7,4).

7,5 mikrolitrů vzorku S nebo P se 5 minut vařilo ve stejném objemu tris-tricinového pufru, obsahujícího 4 % dodecylsulfátu sodného SDS a pak byl materiál nanesen na 10 až 20% tris-tricinový gel (Novex) a pak byl proveden Westernův přenos na nitrocelulózovou membránu. Signál pro

-4CZ 295118 B6

Abeta byl prokazován při použití protilátky mAb WO2 (proti zbytkům 5 až 16 Abeta) a vizualizován pomocí elektronicky vyvolané chemiluminiscence ECL. Citlivost tohoto detekčního systému je 5 až 10 pg.

nro Áketa ee nríJá I eywtetiéUL ÁUu 1J 40 k i ml

PBS s obsahem 10 % BSA a roztok se zpracovává svrchu uvedeným způsobem. Signál pro Abeta bylo možno prokázat ve vysráženém materiálu, avšak nikoliv vsupematantu.

Výsledky uvedených zkoušek jsou znázorněny na obr. 1. Z tohoto výkresu je zřejmé, že cliochinol účinně vyvolával solubilizaci Abeta ve zkoumané koncentraci. Mimoto bylo prokázáno, že optimální koncentrace této látky byla 10 %, což prokazuje, že jedna z forem Abeta ve shlucích, pravděpodobně dimer, je v PBS rozpustnější než jiné formy.

Na obr. 1 jsou znázorněny výsledky pouze projeden vzorek. Údaje pro 19 dalších vzorků prokazovaly tutéž tendenci, takže bylo možno potvrdit, že cliochinol je schopen vyvolávat solubilizaci Abeta.

Příklad 2

V tomto příkladu byla srovnávána chelatační schopnost cliochinolu a EDTA.

Vzorky 10 ng syntetického Abeta byly uloženy do vyhloubení mikrotitračních ploten a byl vyvolán vznik agregátů přidáním 25 mikromol chloridu zinečnatého. Agregáty pak byly přeneseny filtrací na nylonovou membránu s průměrem otvorů 2 mikrometry. Po promytí 200 mikrolitrů TBS, TBS s obsahem 2 mikrometrů EDTA a TBS s obsahem 2 mikromol cliochinolu byly membrány fixovány a pak byla jako sonda použita monoklonální protilátka 6E10 proti EBETA a materiál byl exponován na ECL-filmu. Pak byla měřena propustnost ECL-filmu a relativní síla signálu byla vypočítána v poměru signálu pro TBS, považovanému za 100 %. Relativní síla signálu pro EDTA byla 66 % a pro cliochinol 49 %.

Z výsledků tohoto pokusu je zřejmé, že cliochinol je pro zinkem vysrážený Abeta výhodnějším chelatačním činidlem než EDTA.

Příklad 3

V tomto příkladu byl prokazován resolubilizační účinek cliochinolu.

Roztok 2,5 mikromol Abeta v TBS o pH 7,4 byl připraven tak, že 95 % Abeta se nacházelo v rozpustném stavu. Po přidání 30 mikromol zinku došlo k vysrážení rozpustného Abeta a pouze 43 % této látky zůstalo v roztoku. Pak bylo ke sraženině zinku a Abeta přidáno 120 mikromol cliochinolu, čímž došlo ke zvýšení rozpuštěného Abeta na 70 %.

Výsledky tohoto pokusu prokazují, že cliochinol má schopnost znovu rozpouštět Abeta, vysrážený zinkem.

Příklad 4

V tomto příkladu byl sledován vliv cliochinolu na vitamin B12 in vitro při použití NMR-spektroskopie.

Vzhledem k tomu, že cliochinol je ve vodě prakticky nerozpustný při pH v rozmezí 7 až 11, byly pokusy prováděny při pH 13. Byly připraveny tři zkumavky. První obsahoval 1 mg cliochinolu v 0,5 ml objemu, druhá obsahovala 1,4 mg kyanokobalaminu B₁₂ v 0,5 ml a třetí obsahovala 0,5 mg cliochinolu a 0,7 mg kyanokobalaminu v 0,5 ml objemu, molární poměr obou látek byl 3:1.

'H-NMR-spektrum bylo zaznamenáváno na spektrofotometru DRX při 400 MHz a teplotě 20 °C. Srovnáním spektra, získaného pro materiál v jednotlivých zkumavkách bylo prokázáno, že ve třetí zkumavce došlo k posunu rezonance ve srovnání s první a druhou zkumavkou, takže je možno předpokládat, že dochází k interakci mezi cliochinolem a vitaminem Bi₂.

Příklad 5

V tomto příkladu byl sledován vliv cliochinolu na vitamin Bj₂ in vivo.

Myším samcům ve stáří 6 týdnů byl nejprve 3 dny podáván cliochinol v denní dávce 50 mg/kg. Myši byly rozděleny do dvou skupin, šlo o kontrolní skupinu o pokusnou skupinu, jíž byl podán injekčně kyanokobalamin, značený ⁵⁷Co. Po 48 hodinách od injekčního podání, byla zvířata usmrcena, načež byla tkáň mozku, jater a ledvin sledována na obsah radioaktivního materiálu při použití počítače gama-záření, výsledky byly uváděny v 1000 impulzů/g tkáně (vlhká hmotnost) ± SEM. Radioaktivity pro jednotlivé skupiny tkání jsou uvedeny v následující tabulce 1.

Tabulka 1 skupina_______________mozek________________játra__________________ledviny______________ kontrola 9,4 ± 0,9 97 ± 8 895 ± 207 ⁵⁷Co-B₁₂ 8,4 ± 1,5 85 ±21 252 ± 61

Ze srovnání výsledků je zřejmé, že nedošlo k významným změnám v množství nahromaděných radioaktivních látek v mozku a v játrech. Snížení množství vitaminu Bi₂, zachyceného v ledvinách, je nesporné. Je možné uzavřít, že cliochinol má vliv na koncentraci vitaminu B_[2 v některých orgánech u myší.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek pro léčení Alzheimerovy choroby, vyznačující se tím, že jako účinné složky obsahuje cliochinol a vitamin B_]2.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 250 mg cliochinolu v dávkové jednotce.