KR20160057500A - 클리오퀴놀을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물에 대한 것이다.

Description

클리오퀴놀을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING CLIOQUINOL FOR TREATING AUTISM SPECTRUM DISORDERS}

본 발명은 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물 및 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물에 대한 것이다.

자폐증 스펙트럼 장애(autism spectrum disorders, ASD)는 사회적 상호작용 및 의사소통의 장애, 한정적이고 반복적인 행동, 관심 및 활동으로 특징되는 신경 발달 장애를 나타낸다. ASD는 인구의 ~1%에 영향을 끼치고 있으며, 유전적 인자들로부터 강하게 영향 받는다고 생각되고 있다. ASD와 연관된 많은 유전적 변형들이 최근에 확인되었고, ASD가 장애의 유전적 이질 집단을 나타낸다는 것을 보여주고 있다. 유전적 변형들 중 일부는 시냅스 전달, 전사조절 및 염색질 리모델링을 포함하는 공통된 경로/기능을 따른다. 이와 더불어, 이 변이를 가지고 있는 ASD의 마우스 모델을 사용하는 연구에서 ASD의 발병의 기저에 깔려 있는 가능한 메커니즘, 즉 글루타민산염 기능 장애 및 흥분적 및 억제적 시냅스간의 불균형에 대해 제안하기 시작했다.

영양, 독소 및 독, 약품, 감염 및 스트레스 등의 환경적 영향들이 정신 질환에 상당한 영향을 끼친다고 알려져 있다. ASD에서는, 잘 알려진 환경적 영향의 예로 태어나기 전 또는 분만기에서의 바이러스 또는 발프로익산 및 탈리도마이드와 같은 기형 발생 물질에 대한 노출 등이 있다. 하지만, 추가적인 환경적 영향들과 기저에 깔려 있는 메커니즘에 대한 연구는 초기 단계에 있다. 이는 ASD에 대한 유전적 인자의 기여에 대해 늘어나고 있는 증거와 대비된다. 환경적 요인들이 ASD 증상의 종류, 심각성 및 궤적을 판단하기 위한 ASD의 유전적 변형들과 상호 작용할 가능성이 높기 때문에, ASD 연구에 ASD 증상의 궤적, 유전적 및 환경적 요인들간의 균형이 필요하다.

인간의 영양과 건강에 매우 중요한 역할을 하며, 두 번째로 풍부한 미량원소인 아연(Zn)은 다양한 세포 과정과 단백질 기능을 조정한다. 아연 결핍은 알츠하이머병, 파킨슨병, 주의력 결핍 및 행동 장애, 정신분열, 간질, 기분장애 등의 다양한 신경 및 정신 장애의 원인으로 알려져 왔다. 아연과 ASD와의 연관성은 최근 어린이 대집단과 더불어 아연 결핍 실험 동물들의 외적 형질을 포함하는 ASD를 갖는 아연 결핍인 개인들에 근거하여 제안된 바 있다. 이러한 연관성은 ADS 치료에 아연 보충을 통한 잠재적 치료 가치에서 더욱 뒷받침 되고 있다. 그러나, 아연 결핍과 ASD간의 연관성을 뒷받침 하는 강한 증거를 대체로 얻을 수 없고, 연관성에 깔려 있는 메커니즘은 아직도 불분명하다.

시냅스에서, 아연 이온들의 주집단은 아연이 밀리몰 범위에 있는 시냅스 전 소낭인데 반해, 시냅스 후 위치들은 더욱 적은 양의 아연을 함유하고 있다(피코몰 범위). 시냅스 전 자유 아연은 뉴런 활동 중에 글루타민산염과 공동 방출되고, 시냅스 클레프트 안의 NMDA 수용체(NMDAR)를 억제한다. 아연 이온 중 일부는 칼슘 채널, NMDA 수용체들 및 칼슘 투과성 AMPA 수용체들(AMPAR)을 통해 시냅스후 위치(postsynaptic sites)에 들어가고, NMDAR 및 TrkB 수용체와 같은 타겟 단백질을 Src 패밀리 키나아제(SFK)와 연관된 것을 포함하는 메커니즘을 통하여 조절한다. 또 다른 시냅스 후 아연의 반응기(effector)는 3개의 공지된 구성원(Shank 1/2/3)을 가진 흥분성 시냅스 후 골격 단백질의 패밀리인 Shank(ProSAP으로도 알려져 있음)이다. 아연은 Shank 2/3과 결합되어 그것들의 시냅스 후 안정화를 향상시켜 흥분성 시냅스 형성과 성숙을 촉진시킨다.

시냅스 후 골격 단백질들의 Shank 패밀리의 구성원인 Shank 2/3(ProSAP1/2로도 알려져 있음)은 인간 유전 연구들과 마우스 모델/배양 뉴런 연구들을 통하여 ADS와 연관되어 왔다. Shank2/3 돌연변이를 갖는 마우스들은 글루타민산염(glutamate) 시냅스들에서 다양한 기능 장애를 보인다. 주목할 만한 변화 중 하나는 Shank2^-/-(엑손 6 + 7 결실) 쥐에서 관찰된 NMDAR 기능의 감소이다.

한편, 클리오퀴놀(5-클로로-7-아이오도-8-하이드록시퀴놀린)은 하이드록시-퀴놀린들에 속하는 화합물이다. 클리오퀴놀은 아메바증 치료제, 전염성 설사증 치료제, 항비만제, 알츠하이머 치료제 등의 용도가 알려져 있다(WO 1998/06403).

본 발명자들은 자폐증 스펙트럼 장애를 연구하던 중 클리오퀴놀의 투여가 자폐증 스펙트럼 장애의 모델 마우스들에서 자폐증 스펙트럼 장애로 인한 행동들을 개선하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 자폐증 스펙트럼 장애의 치료능 및 개선능을 갖는다.

도 1 내지 도 7은 클리오퀴놀(CQ) 치료가 Shank2^-/- 마우스에서의 사회적 상호작용을 급격히 개선시킨다는 것을 보여준다.
도 1 내지 도 3
클리오퀴놀은 Shank2^-/- (KO) 마우스에서의 사회적 상호작용을 개선시키지만, 야생형(WT) 마우스에게는 영향이 없었다 (도 1 및 도 2). 야생형(WT) 및 Shank2^-/- 마우스에서의 사회적 신규 인식 수준이 비슷하며, 클리오퀴놀(CQ)이 이들 마우스의 사회적 신규 인식에 영향을 주지 않았다(도 3). 마우스에게 행동 시험 2시간 전에 클리오퀴놀(30 mg/kg; 복강내) 또는 비히클을 주사하였다. (도 1)의 열 지도(heat map)는 마우스 움직임의 예를 나타낸다. 사회적 선호도 인덱스는 두 개의 대상들을 탐험하는데 소요하는 시간 간의 차이(S1/낯선 동물 대 O/물체, 또는 S2/신규 낯선 동물 대 S1/기존 낯선 동물)를 총 소요 시간으로 나누고 100을 곱한 값을 나타낸다. (야생형, 비히클(vehicle)(WT-V)군 및 야생형, 클리오퀴놀(WT-C)군의 경우 n=18, 넉아웃(knockout), 비히클(KO-V)군 및 넉아웃, 클리오퀴놀(KO-C)군의 경우 n=16, NS는 “유의하지 않음(not significant)”을 가리킴, ***p < 0.001, Dunn의 사후 검정과 Kruskal-Wallis 일원 분산 분석(ANOVA))
도 4 및 도 5
클리오퀴놀(CQ)은 Shank2^-/- 마우스에서의 점핑 또는 털 손질에 영향이 없었다. (WT-V 및 WT-C의 경우 n=10, KO-V 및 KO-C의 경우 n=11, *p < 0.05, 이원분산분석 및 Dunn의 사후 검정과 Kruskal-Wallis 일원 분산 분석(ANOVA))
도 6 및 도 7
클리오퀴놀(CQ)은 Shank2^-/- 마우스에서의 활동 과잉을 개선시키지 못했다. (WT-V 및 WT-C는 n=23, KO-V 및 KO-C는 n=21, *p < 0.001, 이원분산분석 및 Dunn의 사후 검정과 Kruskal-Wallis 일원 분산 분석(ANOVA)) 데이터는 평균± SEM로 제공되었다.
도 8 내지 도 19는 클리오퀴놀(CQ)이 Shank2^-/- 마우스에서 사회적 상호작용을 개선시킨다는 것을 보여준다.
도 8
약 투여의 전형적인 예를 나타낸다. 동물들을 2개의 실험 그룹으로 나누었다: 한 그룹은 비히클을 먼저 받고, 그리고 CQ를 두번째로 받았고, 다른 그룹은 CQ를 먼저 받고, 그리고 비히클을 두번째로 받았다. 마우스는 첫 주사를 맞고 2시간 후에 시험하였다(비히클 또는 30mg/kg의 CQ; 복강내 투여) 단일 우리에서 6일간의 휴식 기간 후에, 마우스는 상호 치료를 받았고 재시험하였다.
도 9 내지 19
클리오퀴놀(CQ)은 Shank2^-/- (KO) 마우스에서 사회적 상호작용(도 9 내지 도 15)를 개선시켰지만 사회적 신규 인식(도 16 내지 도 19)에 영향이 없었거나 야생형(WT) 마우스에서 사회적 상호작용과 사회적 신규 인식에 영향이 없었고 이는 대상(S1/낯선 동물 대 O/물체, 또는 S2/신규 낯선 동물 대 S1/기존 낯선 동물)을 탐험/냄새를 맡는데 소용된 시간으로 확인하였다. (도 16)에서의 열 지도는 마우스 움직임의 예를 보여준다. 데이터는 야생형(WT) 및 넉아웃(KO) 그룹 내 또는 캐리오버 효과를 최소화하기 위하여 비히클 우선 및 CQ 우선 그룹 내에서의 CQ(전과 후)의 효과에 대해 짝지은 대비(paired comparisons)로 분석하였다. (WT-V 및 WT-C(비히클 우선)는 n=9, KO-V 및 KO-C (비히클 우선)는 n=8, WT-V 및 WT-C(CQ 우선)는 n=9, KO-V 및 KO-C (CQ 우선)는 n=8, NS는 “유의하지 않음(not significant)”을 가리킴, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 스튜던트티-검정)
도 20 내지 도 22는 자유 아연 레벨이 야생형(WT)과 Shank2^-/-뇌에서 비슷하고, CQ는 ZnT3 단백질 레벨에 영향이 없다는 것을 보여준다.
도 20
야생형(WT)과 Shank2^-/-(8주)간 자유 아연의 총 레벨에 대한 차이가 없었고 이는 자유 아연 결합 형광 염색인 TFL-Zn을 이용하여 확인하였다. (WT 및 넉아웃(KO)은 3마리의 동물들로부터 n=15 해마교련 슬라이스, NS는 “유의하지 않음(not significant)”을 가리킴, 스튜던트티-검정) ROI는 관심영역(resion of interest)를 가리킴)
도 21
CQ 치료는 WT와 Shank2^-/- 마우스(8주)에서의 전체 뇌 천연 시냅토솜 부분의 총 레벨에 영향이 없었다. 마우스는 샘플 준비와 면역 블롯 2시간 전에 CQ로 급성 주사하였다(30 mg/kg; 복강내 투여). (각 그룹을 n=4, NS는 “유의하지 않음(not significant)”을 가리킴, 일원분산분석)
도 22
자유 아연은 ZnT3^-/- 뇌(출생 후 23일)에서 검출되지 않았고 이는 TFL-Zn에서 확인되었다.
도 23 내지 도 27은 클리오퀴놀(CQ)이 Shank2^-/- 마우스에서 반복적 행동과 불안 유사 상태를 개선하지 못했다는 것을 보여준다.
도 23 내지 도 26
시험 2시간 전에 주사한 CQ(30 mg/kg; 복강내 투여)는 Shank2^-/-마우스의 점핑을 개선시키지 못했고 털 손질에 영향이 없었다. (WT-V 및 WT-C는 n=10, KO-V 및 KO-C는 n=11, NS는 “유의하지 않음”을 가리킴, *p < 0.05, 스튜던트 티-검정)
도 27
CQ는 WT와 Shank2^-/- 마우스에서 오픈 필드 아레나의 중앙 영역에서 보낸 시간에 대해 영향이 없었다. (WT-V 및 WT-C는 n=10, KO-V 및 KO-C는 n=11, NS는 “유의하지 않음”을 가리킴, *p < 0.05, 이원분산분석 및 Kruskal-Wallis 일원분산분석과 Dunn의 사후검증)
도 28 내지 도 33은 클리오퀴놀(CQ)이 Shank2^-/- 시냅스에서 NMDAR(NMDA 수용체(receptor)) 기능을 회복시킨다는 것을 가리킨다.
도 28
클리오퀴놀(4uM)은 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 NMDA/AMPA 비율을 정규화하고 이는 NMDA- 및 AMPA-eEPSC으로 측정하였다. 대표적 eEPSC 흔적은 -70 mV 및+ 40 mV에서 기록되었다. NMDA-eEPSC는 자극 60ms 후에 +40 mV 의 홀딩 전압에서 측정되었다. (WT-V는 n=14 세포들(10마리의 동물로부터), WT-C는 n=11세포들(7마리 동물들로부터), KO-V는 n=12 세포들 (8 마리 동물들로부터), 및 KO-C는 n=12 세포들 (7 마리 동물들로부터), *p < 0.05, Tukey 사후검정과 일원분산분석)
도 29
CQ(4uM)는 fEPSP으로 측정한 바와 같이 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 파상풍 (100Hz)으로 유도된 LTP를 회복시켰다. (WT-V는 n=13 슬라이스 (8마리의 동물로부터), WT-C는 n=12(5 마리의 동물로부터), KO-V는 n=13(7 마리의 동물로부터), 그리고 KO-C는 n=11(5 마리의 동물로부터), NS, 유의하지 않음, *p < 0.05, Tukey 사후검정과 일원분산분석)
도 30 및 도 31
CQ(4uM, 20분)는 NMDA-fEPSP으로 측정한 바와 같이 WT 및 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 기능을 향상시켰다. (WT는 n=8 슬라이스 (7마리의 동물), KO는 n=8(7 마리의 동물), *p < 0.01, 스튜던트티-검정) a 및 b 표지는 각각 CQ 전 5분의 기간 및 기록의 마지막을 나타낸다.
도 32 및 도 33
CQ(4uM, 20분)는 WT 및 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 기능을 향상시키고 -40 mV에서 NMDA- 및 AMPA-eEPSC의 동시 측정으로 확인하였다, NMDA-eEPSC는 자극 후 60ms에서 측정하였다. D-AP5 (50uM, 10분)이 NMDAR 의존성을 시험하는데 사용되었다. a, b 및 c 표지는 각각 CQ 전 5분 기간, CQ 후 5분 기간 및 기록의 마지막을 나타낸다. (WT는 n=4 세포 (3개의 슬라이스), KO는 n=5(4 개의 슬라이스), NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, CQ전 5분 기간과 비교한 스튜던트티-검정) 데이터는 평균± SEM로 제공되었다.
도 34 내지 도 37은 클리오퀴놀(CQ)이 AMPA-fEPSP, 입력-출력 비율, 또는 쌍펄스 비율에 효과가 없었지만 Shank2^-/- 시냅스에서의 eEPSC의 NMDA/AMPA 비율을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 34
CQ(4uM)는 AMPA-fEPSP에 효과가 없었다. a 및 b 표지는 각각 CQ 전 5분 기간 및 기록의 마지막을 나타낸다. (WT는 n=5 슬라이스(4마리의 동물) 및 KO는 n=5(4 마리의 동물), NS는 유의하지 않음, 스튜던트티-검정)
도 35
CQ(4uM)는 WT 또는 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서의 입력-출력 관계에 효과가 없었고, 이는 AMPA-fEPSP의 초기 경사를 섬유 제사의 크기에 대비하여 작성함으로써 확인하였다. (WT-V는 n=9 슬라이스(7마리의 동물), WT-C는 n=9(7 마리의 동물), KO-V는 n=8(5 마리의 동물), KO-C는 n=9(6 마리의 동물), 일원분산분석)
도 36
CQ(4uM)는 WT와 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서의 쌍펄수 비율에 효과가 없었고, 이는 AMPA-fEPSP의 첫번째/두번째 초기 경사의 비율을 자극간 간격에 대비하여 작성하여 확인하였다. (WT-V는 n=9 슬라이스(7마리의 동물), 및 WT-C는 n=9(7 마리의 동물), KO-V는 n=8(5 마리의 동물), KO-C는 n=9(6 마리의 동물), 일원분산분석)
도 37
CQ(4uM)는 WT와 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 -40 mV에서의 eEPSC의 NMDA/AMPA 비율을 증가시켰다. (WT는 n=9 세포(3마리의 동물), 및 KO는 n=5 세포(4마리의 동물), *p < 0.05, 스튜던트티-검정)
도 38은 Ca-EDTA가 NMDAR 기능에 효과가 없었다는 것을 보여준다.
Ca-EDTA (2 mM)는 치료 중 및 후에 NMDAR 기능에 효과가 없었고, 이는 NMDA-fEPSP로 측정하였다. a, b 및 c 표지들은 각각 CQ 전 5분 기간, CQ 후 5분 기간 및 기록의 끝을 나타낸다. (WT는 n=8 슬라이스(5마리의 동물), 및 KO는 n=10(5마리의 동물), NS는 유의하지 않음, 스튜던트티-검정)
도 39 내지 도 44는 클리오퀴놀(CQ) 의존적 NMDAR 활성화가 시냅스 전부터 후까지의 위치에서 아연 이동을 필요로 한다는 것을 보여준다.
도 39 및 도 40
CQ(4uM, 20분)는 Ca-EDTA 또는 TPEN (CQ보다 더 강력한 아연 킬레이터)가 있을 때에는 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 기능을 향상시키지 못하였는데, 이는 NMDA-fEPSP으로 측정하였다. 기록하는 동안 Shank2^-/- 해마교련 슬라이스를 Ca-EDTA (2mM) 또는 TPEN (25uM)로 함침 배양하였다. a 및 b 표지는 각각 CQ 전 5분 기간 및 기록의 마지막을 나타낸다. (Ca-EDTA, WT는 n=6 슬라이스 (3마리의 동물), KO는 n=6 슬라이스 (3마리의 동물), NS는 유의하지 않음, 스튜던트티-검정, TPEN, KO 및 WT는 n=6 슬라이스(2마리의 동물), NS는 유의하지 않음, 스튜던트티-검정)
도 41
CQ는 ZnT3^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 기능을 향상시키지 못한다는 것을 보여준다. (n=7 슬라이스 (3마리의 동물), NS는 유의하지 않음, 스튜던트티-검정)
도 42 및 도 43
외인성으로 추가된 아연(0.25uM)이 WT에서의 NMDAR 기능을 향상시켰지만 Shank2^-/- synapses에서는 향상시키지 못했다. 기록하는 동안 추가된 아연은 함침 적용되었다. (WT에서 0uM는 n=8 슬라이스 (7마리의 동물), 0.25uM는 n=7(4 마리의 동물), KO에서 0uM는 n=8(5 마리의 동물), 0.25uM는 n=9(4 마리의 동물), NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, 스튜던트티-검정)
도 44
CQ는 Cu^{2 +}- 특정 킬레이터인 큐프리존이 있을 때에 NMDAR 기능을 향상시킨다는 것을 보여준다. (WT는 n=5 슬라이스 (3마리의 동물), KO는 n=5(4 마리의 동물), NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, 스튜던트티-검정) 데이터는 평균± SEM로 제공되었다.
도 45 내지 도 49는 트랜스 시냅스 아연 이동이 Src 패밀리 키나아제를 통해 NMDAR을 활성화시킨다는 것을 보여준다.
도 45 내지 도 47
CQ(4uM, 20분)는 PP2 또는 SU6656가 있을 때에는 Shank2^-/- SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 기능을 향상시키지 못하지만 PP2 유사체인 PP3이 있을 때에는 NMDAR 기능을 효과적으로 향상시키고 이는 NMDA-fEPSP으로 측정하였다. 기록하는 도중에 해마교련 슬라이스는 PP2(10uM) 또는 SU6656(10uM)로 함침 배양되었다. (PP2, WT는 n=7 슬라이스 (6마리의 동물), KO는 n=7(5 마리의 동물), SU6656, WT는 n=7(5 마리의 동물), KO는 n=7(4 마리의 동물), PP3, WT는 n=8(4 마리의 동물), KO는 n=8(5 마리의 동물), NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, 스튜던트티-검정)
도 48 및 도 49
CQ는 Src의 특정 펩티드 억제제인 Src(40-58)가 있을 경우에 Shank2^-/- SC-CA1 시냅스(도 49)에서의 NMDAR 기능을 향상시키지 못했지만, 펩티드의 스크램블된 버전인 sSrc(40-58)가 있을 경우에 NMDAR 기능을 효과적으로 향상시키고, 이는 -40 mV에서 NMDA- 및 AMPA-eEPSC의 동시 측정으로 확인하였다. NMDA-eEPSC는 자극 후 60ms에서 측정되었다. 도 49은 WT 마우스이며, 도 49는 Shank2^-/- 마우스이다. a 및 b 표지는 각각 CQ 전 5분 기간 및 기록의 마지막을 나타낸다. (Src(40-58), WT는 n=5 세포 (4마리의 동물), KO는 n=6(4 마리의 동물), sSrc(40-58), WT는 n=7(5 마리의 동물), KO는 n=7(6 마리의 동물), NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, 스튜던트티이검정, CQ 전 5분 기간과 비교하여) 데이터는 평균± SEM로 제공되었다.
도 50 내지 도 53은 Src 억제 펩티드가 CQ 의존적 NMDAR 활성화를 차단한다는 것을 보여준다.
Src 억제 펩티드인 Src(40-58)가 CQ 의존적 NMDAR 활성화를 차단하였지만 이의 스크램블된 버전인 sSrc(40-58)은 차단하지 못했고 이는 -40mV에서의 NMDA/AMPA 비율로 측정하였다. (Src(40-58), WT는 n=5 세포(4마리의 동물) 및 KO는 n=6(4 마리의 동물), sSrc(40-58), WT는 n=7(5 마리의 동물) 및 KO는 n=7(6 마리의 동물), NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, 스튜던트티-검정)
도 54 내지 도 59는 트랜스 시냅스 아연 이동이 Tbr1^+/- 마우스에서 사회적 상호작용을 개선시킨다는 것을 보여준다. CQ는 Tbr1^+/- 마우스에서 사회적 상호작용(도 54 내지 도 56)을 개선시키지만, 사회적 신규 인식(도 57 내지 도 59)은 개선시키지 못하였고, WT 마우스에서는 효과가 없었다. 대상을 탐험하는데 소요된 시간과 이들 결과들로부터 계산된 사회적 선호도 인덱스로 측정되었다. 도 54 및 도 57에 있는 열 지도(heat map)는 마우스 움직임의 예를 보여준다. (WT-V 및 WT-C는 n=10, HT-V 및 HT-C는 n=11, NS는 유의하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Tukey의 사후검증과 이원분산분석 및 일원분산분석) 데이터는 평균± SEM로 제공되었다.
도 60 내지 도 63은 클리오퀴놀(CQ)가 Tbr1^+/- (HT) 마우스에서 사회적 상호작용을 개선시키는 것을 보여준다. CQ는 Tbr1^+/- 마우스에서 사회적 상호작용(도 61)는 개선하였지만 사회적 신규 인식에 효과가 없었고(도 63), WT 마우스(도 60 및 도 62)에서 두 개의 파라미터(사회적 상호작용 및 사회적 신규 인식)에 효과가 없었고, 이는 대상(S1/낯선 동물 대 O/물체, 또는 S2/신규 낯선 동물 대 S1/기존 낯선 동물)들을 탐험하는데 소요하는 시간으로 확인하였다. WT 또는 HT내에서의 CQ(전과 후)의 효과에 대한 짝지은 비교는 캐리오버 효과를 최소화하기 위해 만들었다. (WT-V 및 WT-C는 n=10, HT-V 및 HT-C는 n=11, NS는 유의하지 않음, ***p < 0.001, 스튜던트티-검정).

본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료 및 개선 방법에 대한 것이다.

또한 본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염의 자폐증 스펙트럼 장애의 치료 및 개선 용도에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

클리오퀴놀

본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물 및/또는 식품 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 클리오퀴놀은 시냅스후(postsynaptic) NMDA 수용체 기능을 향상시킴으로써 자폐증 스펙트럼 장애를 치료/개선한다. 바람직하게는 본 발명의 클리오퀴놀은 아연 이오노포어 활성을 통하여 NMDA 수용체 기능을 향상시키며, 클리오퀴놀은 Src 패밀리 타이로신 키나아제를 통하여 NMDA 수용체 기능을 향상시킨다. 또한 클리오퀴놀은 시냅스에서 아연 이동을 촉진하는데, 바람직하게는 클리오퀴놀은 시냅스 전 아연 저장소(pool)로부터 시냅스 후 위치로 아연이 이동하게 함으로서, Src 패밀리 타이로신 키나아제(SFK)를 통하여 NMDAR 기능이 향상되게 한다. 이로써 NMDAR의 기능이 정상화된다.

본 발명의 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 조성물을 환자에 투여함으로써 환자의 사회적 상호작용 결손이 개선된다.

자폐증 스펙트럼 장애

본 발명의 자폐증 스펙트럼 장애는 일반적으로 의약계에서 지칭되는 자폐증 스펙트럼 장애(Autism spectrum disorder)를 의미한다. 이는 사회적 상호작용 장애, 의사소통의 장애, 한정적 및 반복적 행동, 신경발달 장애 등을 수반한다.

클리오퀴놀을 포함하는 조성물

본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 대한 것이다. 상기 클리오퀴놀 및 그 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 일반적으로 사용되는 방법으로 수득되면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다.

약학적 조성물

본 발명의 약학적 조성물은 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 0.01 내지 80 중량% 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 65 중량% 포함할 수 있다. 그러나 이는 투약자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 식생활, 영양 상태, 병의 진행 정도, 염증의 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여 시 주사를 통한 피하 주입 또는 패치를 통한 경피 흡수 등이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 미성년자, 어린이 또는 유아의 경우와 같이 환자의 체중, 연령, 일반 건강 상태, 성별, 식이, 투여 경로 등에 따라 적절히 증감할 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다.

식품 조성물

본 발명은 클리오퀴놀 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 첨가하는 것도 포함된다.

본 발명의 식품 조성물은, 클리오퀴놀 또는 그 허용가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 클리오퀴놀 또는 그 허용가능한 염은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 그 허용가능한 염의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다. 상기 허용가능한 염은 약학적으로도 허용가능한 염을 의미한다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

환자

본 발명의 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 투여받는 환자는 자폐증 스펙트럼 장애로 진단되거나 자폐증 스펙트럼 장애가 의심되는 것으로 진단되는 환자를 의미한다. 상기 환자는 성인 또는 미성년자 등이 될 수 있으며, 인간이 아닌 포유동물이 될 수도 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법>

마우스

Shank2^-/- 마우스와 Tbr1^+/- 마우스는 자폐증 모델 동물로서 보고된 바 있다(Won H, et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature 486, 261-265 (2012), Huang TN, et al. Tbr1 haploinsufficiency impairs amygdalar axonal projections and results in cognitive abnormality. Nat Neurosci 17, 240-247 (2014)). 모든 마우스들은 C57BL/6 이력으로 역교배되었고, 한국과학기술원(KAIST, Shank2^-/- 마우스) 및 타이완 중앙연구원(Tbr1^+/-마우스)에 있는 마우스 사육장에서 수용되고 길러졌다. 새끼들은 출산 후 21일에 이유 때까지 어미와 같이 있도록 하였다. 이유 이후, 동물은 각 우리 별로 3 내지 5 마리의 마우스들로 구성된 혼합된 유전자형 그룹으로 수용하였고, 무작위로 전기 생리학적 및 행동학적 실험을 받게 하였다. 3 내지 5 주의 나이의 동물은 전기생리학적 실험에 사용되었고, 2 내지 4 개월의 나이의 수컷 동물은 행동 분석을 위해 사용되었다. TFL-Zn 염색을 위해, 8주된 수컷 동물(Shank2^-/- 마우스를 위해)을 사용하였다. 야생형 한배 새끼는 대조를 위해 사용되었다.

ZnT3^-/- 마우스는 보고된 바 있으며(Lee J-Y, Cole TB, Palmiter RD, Suh SW, Koh J-Y. Contribution by synaptic zinc to the gender-disparate plaque formation in human Swedish mutant APP transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences 99, 7705-7710 (2002)), KAIST 시설에서 유지하였다. 이들 마우스도 C57BL/6 이력으로 역교배되었다. 3 내지 5주의 수컷 및 암컷 동물은 전기 생리학적 실험과 TFL-Zn 염색에 사용되었다(P23).

모든 마우스는 KAIST와 타이완 중앙연구원의 동물 연구 요구사항에 따라 길러지고 유지되었고, 모드 절차들은 KAIST와 타이완 중앙연구원의 동물 연구 위원회에서 승인되었다. 마우스에게 표준 설치류 음식과 수돗물을 임의로 먹였고, 12 시간 명암 사이클에서 수용하였다(KAIST에서는 19:00 소등, 타이완 중앙연구원에서는 20:00 소등).

클리오퀴놀

클리오퀴놀(clioquinol)(Calbiochem)은 DMSO(Sigma)와 폴리에틸렌 글리콜(Aldrich)(DMSO : PEG = 1 : 9)에 최종 농도인 20g/L로 용해시켰다. 야생형 및 Shank2^-/- 마우스(또는 Tbr1^+/- 마우스)는 클리오퀴놀(30 mg/kg) 또는 같은 양의 DMSO-PEG 혼합물로 급성 복강내 주사를 받았다. 주사는 시설의 재량에 따라 행동 분석 2시간 전(Shank2^-/- 마우스 및 야생형 한배새끼) 또는 3시간 전(Tbr1^+/-마우스 및 야생형 한배새끼)에 실행하였다.

약품 치료 방식

우리는 일주일 washout 기간을 갖는 피험자내 설계를 고안하고(도 8), 캐리오버(carryover) 효과를 배제하기 위해서 동물들을 비히클-우선 및 클리오퀴놀-우선 그룹의 2개의 그룹으로 나누었다. 각 마우스는 비히클 또는 클리오퀴놀의 단일급성량을 받았고, 1주일에 1개의 단일 행동 과제를 겪게 하였다. 시험은 밝은 단계(3-챔버 시험)과 어두운 단계(반복적 행동 및 오픈 필드 시험)동안 행동 시험 전용 방에서 진행하였다.

3- 챔버 사회적 상호작용 분석

Shank2 마우스(Shank2^-/- 마우스 및 야생형 한배새끼) 및 Tbr1 마우스(Tbr1^+/-마우스 및 야생형 한배새끼)에 대한 3개의 챔버 사회적 상호작용 분석을 수행하였다(Won H, et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature 486, 261-265 (2012), Huang TN, et al. Tbr1 haploinsufficiency impairs amygdalar axonal projections and results in cognitive abnormality. Nat Neurosci 17, 240-247 (2014)). 요약하면, 상기 분석은 10분 기간의 3개의 단계로 구성된다: 습관화, 사회적 상호작용(낯선 동물1 대 물체) 그리고 사회적 신규 인식 (낯선 동물 1 대 낯선 동물 2). 탐험은 야생형 또는 변이 마우스가 물체/낯선 동물의 냄새를 맡으려고 할 때 또는 물체/낯선 동물을 향해 코를 지향하고 가까이 가는 각 경우로 정의하였다. 개별 이동 추적은 Ethovision 10.0 (Noldus)로 분석하였고 주문 설계 소프트웨어인 MatLab (Mathworks)으로 열지도를 만들기 위해 조정하였다. 탐험에 소요된 시간은 대상 유전자자형을 모르는 연구원에 의해(Shank2 마우스), 또는 스마트 비디오 트래킹 시스템(Panlab, Tbr1 마우스)를 사용하여 분석하였다. 탐험 시간과 더불어, 대상들(낯선 동물1 대 물체, 또는 낯선 동물 1 대 낯선 동물 2)을 탐험하는데 소요한 시간 간의 수치적 차이를 두 개의 대상을 탐험하는데 소요한 총 시간을 나눈 값인 선호도 인덱스도 위에서 설명한 바와 같이 분석하였다(Won H, et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature 486, 261-265 (2012)).

반복적 행동

점핑과 털 손질을 포함하는 반복적인 행동에 소요한 시간을 측정하기 위하여, 침구가 없는 자신들의 집 우리에 있는 Shank2^-/-마우스와 그의 야생형 한배 새끼를 사용하였다. 이 때, 점핑은 우리, 즉 케이지의 코너에서, 또는 측벽을 따라 마우스가 뒷발로 딛고 앞발을 들어올리며 일어서서, 뒷발 두 개가 동시에 바닥에서 떨어지도록 뛰어오르는 것으로 정의하였다. 한편, 털 손질(grooming) 행동은 얼굴, 머리 또는 몸통을 두 앞발들로 쓰다듬거나 긁는 것, 또는 신체 일부분을 핥는 것으로 정의하였다. 실험과 분석은 맹검법으로 독립적으로 실행하였다.

오픈 필드 시험

오픈 필드 박스의 크기는 40 X 40 X 40 cm이고, 중앙 구역 선은 가장자리에서 13.3cm 떨어져 있다. 마우스는 시험 시작시 중앙에 위치하도록 하였고, 마우스의 움직임은 비디오 카메라로 60분 동안 녹화하였고, Ethovision 10.0 (Noldus)으로 분석하였다.

전기 생리학

전기 생리학적 실험을 위하여, Shank2^-/- 마우스(또는 ZnT3^-/-마우스)와 그들의 야생형 한배 새끼를 시상 해마교련 슬라이스(세포외 기록을 위해 400uM 두께, 세포내 기록을 위해 300uM 두께)를 212mM의 자당, 25mM의 NaHCO3, 5mM의 KCl, 1.25mM의 NaH2PO4, 0.5mM의 CaCl2, 3.5mM의 MgSO4, 10mM의 D-글루코오스, 1.25mM의 L-아스코르브산, 그리고 95% O2/5% CO2로 버블을 만든 2mM의 Na-피루빈산염을 포함하는 얼음 냉각된 절개 버퍼 내의 바이브라톰(Leica VT1200)을 사용하여 준비하였다. 간질형 활동을 방지하기 위하여 CA3을 제거하였다. 슬라이스는 정상 인공 CSF(ACSF)안에 32 ℃에서 1시간 동안 회복되었다(mM 단위로: 124 NaCl, 2.5 kCl, 1 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 10 글루코오스, 2 CaCl2,95% O2/5% CO2로 산소화된 2 MgSO4). 기록을 위해, 단일 슬라이스를 침지식 챔버로 옮겨서 28 °C로 유지하였고, 95% O2/5% CO2로 포화된 ACSF(2mL/min)로 계속적으로 살포하였다. 자극과 기록 피펫들은 마이크로피펫 전극 풀러(Narishege)를 이용한 붕규산 유리 모세혈관(Harvard Apparatus)으로부터 빼냈다.

세포외 기록들을 위해, 출생 후 21 내지 35일의 마우스 해마교련 슬라이스들이 사용되었다. 필드 흥분성 시냅스 후 포텐셜(fEPSP)은 ACSF(1 MΩ)으로 채워진 피펫들을 사용한 해마교련 CA1 영역의 방사층에서 기록되었다. fEPSP을 증폭하였고(Multiclamp 700B, Molecular Devices), 측정을 위해 디지털화하였다(Digidata 1440A, Molecular Devices). Schaffer 곁가지 경로를 CSF(0.3~0.5 MΩ)로 채워진 피펫들로 20초마다 자극하였다. 자극의 강도는 반 최고치 반응을 내도록 조절하였고, 세개의 연속적 반응을 평균하여 정규화된 기준선 대비하여 표현하였다. LTP를 유도하기 위해, 안정된 기준선을 얻은 후 고주파 자극(100 Hz, 1초)을 적용하였다. 클리오퀴놀(4 uM)은 전체 실험 과정중에 LTP 유도전과 후에 함침 적용하였다. NMDAR성 fEPSP를 격리하기 위하여, 2mM 칼슘, 0.1 mM 마그네슘, 그리고 AMPAR성 EPSP들을 억제하는 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione(10uM, DNQX, Tocris)을 사용하였다.

해마교련 CA1 추체 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 레코딩도 MultiClamp 700B 증폭기(Molecular Devices) 및 Digidata 1440A (Molecular Devices)를 이용하여 만들었다. 전체 세포 패치 클램프 레코딩 중에, 직렬 저항값을 각 스위프 마다 짧은 과분극 스텝 펄스(5 mV, 40 ms)에 반응하는 커패시터 전류의 피크 크기를 측정하여 모니터링하였다; <25%의 변화를 가진 세포들만 분석에 포함하였다. NMDA(N-Methyl-D-aspartate)/AMPA(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid) 비율 실험들을 위해, 출생 후 17~25일의 마우스 해마교련 슬라이스들을 사용하였다. 기록 피펫들 (2.5 내지 3.5 MΩ)는 다음(mM 단위)을 포함하는 내부 용액으로 충전되었다: 100 CsMeSO4, 10 TEA-Cl, 8 NaCl, 10 HEPES, 5 QX-314-Cl, 2 Mg-ATP, 0.3 Na-GTP, pH 7.25, 295 mOsm을 갖는 10 EGTA). CA1 추체 뉴런은 -70mV에서 전압 고정되었고, EPSC는 15초마다 유발되었다. AMPAR 매개 EPSC들은 -70mV에서 기록되었고, 30개의 연속적인 반응이 안정적인 기준선 후에 기록되었다. AMPAR성 EPSC들을 기록한 후에, 홀딩 전압은 NMDA 수용체 매개 EPSC들을 기록하기 위해 +40 mV로 변동하였다. NMDA 구성소자는 자극 후 60ms에서 측정되었다. NMDA/AMPA 비율은 30개의 EPSC들의 NMDA 구성 소자의 평균값을 30개의 AMPAR 매개 EPSC 피크 크기의 평균값으로 나누어서 알아냈다. 클리오퀴놀(4uM)은 전체 실험 과정중에NMDA/AMPA 비율 기록 20분 전과 도중에 함침 적용되었다. 클리오퀴놀 치료에서의 AMPAR 매개 및 NMDAR 매개 EPSC들을 함께 측정하기 위해, 추체(pyramidal) 뉴런은 -40 mV에 전압 고정되었고, EPSC들은 15초마다 유발되었다. AMPAR 매개 EPSC는 EPSC의 피크 크기에서 확인하였고, NMDAR 매개 EPSC는 자극 후 60ms에서 구성소자로 확인하였다. -40mV에서의 NMDA/AMPA 비율은 양 값들을 사용하여 계산하였고, 실험 과정 중에 모니터링하였다. Src 억제 펩티드, Src(40-58) 및 그의 유사체, 스크램블된 Src(40-58)( Lu YM, Roder JC, Davidow J, Salter MW. Src activation in the induction of long-term potentiation in CA1 hippocampal neurons. Science (New York, NY) 279, 1363-1367 (1998))들은 Peptron에서 구매하였고, 내부 용액 안에 0.03 mg/mL의 농도로 Src 억제제가 클리오퀴놀의 활동에 영향을 끼치는지 관찰하기 위해 주입하였다. 피크로톡신 (100uM)는 GABAA 수용체 매개 전류들을 차단하기 위해 항상 ACSF에 추가되었다.

데이터는 Clampex 10.2 (Molecular Devices)로 얻었고 Clampfit 10 (Molecular Devices)으로 분석하였다. 약품들은 Tocris사(DNQX, TPEN, PP2, PP3, and D-AP5) 및 Sigma사(피크로톡신, Ca-EDTA, 쿠프리존, 및 SU6656)에서 구매하였다.

TFL - Zn 염색

뇌 부분들(10 uM 두께)은 인산염 버퍼된 염분(pH 7.2)에 용해된 아연 특정 염색인 TFL-Zn(N-(6-Methoxy-8-quinolyl)-p-carboxybenzoylsulfonamide; 0.1 mM, Calbiochem)으로 고정하지 않고 염색되었고, 형광 현미경(Olympus IX71; 여기, 330-385 nm; 2색성, 400 nm; 배리어, 420 nm)에 연결된 디지털 카메라로 촬영하였다. 형광 신호들은 이미지 프로그램((Image-Pro Insight, Media Cybernetics, Silver Spring, MD)을 이용하여 얻었다. 개별 뇌의 다섯개의 연속적 해마교련 슬라이스들의 이미지들은 MetaMorph (Molecular Devices)를 이용하여 수량화하였다. 관심영역(ROI)은 야생형 및 Shank2^-/- 해마교련 DG, CA3, 및 CA1 영역들(각각 5, 3, 및 5개의 정사각형)에서 3개에서 5개의 정사각형(50 x 50 um2)으로 정의되었다. 수량화를 위해, Shank2^-/- ROI로부터의 총 형광량은 등가의 야생형 ROI로부터 정규화되었다.

미가공( crude ) 시냅토솜

Shank2^-/- 마우스들로부터의 미가공(crude) 시냅토솜을 준비하였다(Won H, et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature 486, 261-265 (2012)). 즉, 마우스 뇌들(2개월의 나이)을 얼음만큼 차가운 균질화 버퍼(0.32M 수크로스, 10mM HEPES pH7.4, 2mM EDTA, 프로테아제 억제제, 포스파타아제 억제제)로 균질화하였다. 균질액들은 900 X g로 10분간 원심 분리되었다. 얻어진 상청액은 다시 12,000 X g로 15분간 원심분리되었다. 펠릿은 균질화 버퍼에서 다시 현가되었고 13,000 X g로 15분간 원심분리되었다(얻어진 펠릿은 P2; 미가공 시냅토솜)

통계적 분석

통계적 분석은 Prism GraphPad (Version 5.03) 소프트웨어를 이용하여 실행하였다.

<실험예 1> Shank2^-/- 마우스들의 사회적 상호작용 평가

Shank2^-/- 마우스들의 복강내(i.p.)에 혈액 뇌 관문을 쉽게 건너면서 아연을 이동시켜 농도 기울기만큼 낮추는 이오노포어(ionophore)이자 친유성 아연 킬레이터(Kd

10^-7)인 클리오퀴놀(CQ)(30mg/kg)를 전신 투여법으로 주사하였다(Bareggi SR, Cornelli U. Clioquinol: review of its mechanisms of action and clinical uses in neurodegenerative disorders. CNS Neurosci Ther 18, 41-46 (2012)). CQ를 처치하고 2 시간 후에, 낯선 마우스와 새로운 무생물에 대한 마우스의 선호도를 비교하기 위해, 마우스들에 대해 3-챔버 사회적 상호작용 시험을 실시하였다.

그 결과, 클리오퀴놀로 치료하지 않은 Shank2^-/- 및 야생형 (WT) 마우스에서의 기존 결과들과 일관되게, 비히클 처리된 마우스에서의 탐험/냄새를 맡는 시간 및 파생된 사회적 선호도 지수(상세한 설명은 도면의 간단한 설명 참고)에서 판단된 바와 같이(도 1 및 도 2, 도 8 내지 도 15) Shank2^-/- 마우스들이 야생형(WT) 마우스들과 비교하여 저감된 사회적 상호작용을 나타내는 것을 확인하였다. 이 장애는 클리오퀴놀 치료로 개선되었다. 반대로, 야생형 마우스들에서의 사회적 상호작용은 클리오퀴놀의 영향을 받지 않았다.

사회적 신규 인식이 3-챔버 시험에서 결정되었을 때, 마우스의 기존에 만났던 낯선 마우스와 새로운 낯선 마우스간의 선호도를 측정함으로써, Shank2^-/-마우스가 야생형 마우스에 대응하는 사회적 신규 인식의 수준을 보여 주었다(도 3, 도 16 내지 도 19). 또한, 클리오퀴놀은 야생형 및 Shank2^-/- 마우스 모두에 대해 사회적 신규 인식에 영향을 주지 않았다.

야생형 및 Shank2^-/- 마우스에서의 사회적 상호작용의 차별적 클리오퀴놀 의존적 개선은, 형광염료인 TFL-Zn으로 측정된 자유(free) 아연의 총 레벨이 다르지 않았기 때문에, 이 마우스에서 클리오퀴놀 결합을 위한 가용 자유 아연의 양의 차이로부터 기인한다고 볼 수 없다(도 20). 또한, 아연이 뇌에서의 자유 아연의 주 저장소인 시냅스 전 소낭 안에 전송되는데 필요한 단백질인 아연 전송기 3(ZnT3)(Cole TB, Wenzel HJ, Kafer KE, Schwartzkroin PA, Palmiter RD. Elimination of zinc from synaptic vesicles in the intact mouse brain by disruption of the ZnT3 gene. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 1716-1721 (1999))의 레벨들은 유전자형 간에 비슷하였다(도 21).

반복적 행동 분석에서, 비히클 처리된 Shank2^-/- 마우스는 비히클 처리된 야생형 마우스와 상대적으로 자신들의 집 우리에서 증가된 점프 행동을 보였지만, 정상적인 털 손질을 보였다. 이들 행동들은 클리오퀴놀로부터 영향을 받지 않았다(도 4 및 도 5, 도 23 내지 도 26). 비슷하게, 클리오퀴놀은 야생형 마우스에서의 반복적 행동에 영향을 주지 않았다.

오픈 필드 시험에서, 기존에 보고된 바와 같이, Shank2^-/- 마우스는 야생형 마우스에 상대적으로 증가된 운동 활동을 보였다. 이 활동과잉 행동은 클리오퀴놀에 의하여 약화되지 않았다(도 6 및 도 7). 특히, Shank2^-/- 마우스는 불안 유사 행동의 척도인 개방 영역 아레나의 중앙 영역에서 적은 시간을 보냈다. 하지만, 클리오퀴놀은 이들 마우스에서 중앙 영역 시간에 대해 영향을 주지 않았다(도 27). 클리오퀴놀은 야생형 마우스에게 반복적 행동, 운동력 행동, 또는 불안 유사 행동에 대해 영향을 주지 않았다(도 23 내지 도 27). 종합하면, 이들 결과들은 클리오퀴놀이 Shank2^-/- 마우스에서 사회적 상호작용을 개선시키지만, 사회적 신규 인식, 반복적 행동, 과잉행동, 또는 불안유사 행동에 영향이 없다는 것을 의미한다.

<실험예 2> 시냅스에서의 NMDAR 기능 평가

클리오퀴놀 처리가 시냅스에서의 NMDAR 기능에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, 크릴오퀴놀 치료는 AMPAR 발생된 흥분성 시냅스 후 전류들(AMPAR-evoked excitatory postsynaptic currents (eEPSCs))에 대한 NMADAR의 비율로부터 결정되는 NMDA/AMPA 비율로 측정되는 Shank2^-/- 해마교련 Schaffer 곁가지-CA1 추체(SC-CA1) 시냅스에서 NMDAR 기능을 정상 수준으로 회복시킨다는 것을 확인하였다(도 28). 그러나, 클리오퀴놀 처리는 야생형 시냅스에서는 영향이 없었다. 또한, 클리오퀴놀은 NMDAR 활동을 필요로 하는 것으로 알려져 있는 저감된 파상풍 유도 장기 상승 작용(LTP)를 Shank2^-/- SC-CA1 시냅스에서 반전시켰지만, 야생형 시냅스에서의 LTP에는 영향을 끼치지 않았다(도 29). 이들 결과들은 클리오퀴놀이 Shank2^-/- 해마교련 SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 기능을 회복시킨다는 것을 나타낸다.

그 다음으로, Shank2^-/- 시냅스에서의 NMDAR 기능에 있어서, 클리오퀴놀 의존적 증가의 시간 경과를 측정하였다.

이들 실험들에서, 우리는 클리오퀴놀 치료 전, 중 그리고 후에 NMDAR 매개 필드 흥분성 시냅스 후 포텐셜(NMDA-fEPSP)을 모니터하면서 Shank2^-/- 해마교련 슬라이스들을 클리오퀴놀로 20분 동안 처리하였다(위에서 설명한 실험들에서의 연속적인 함침 응용에 대비하여). 클리오퀴놀 치료로, 야생형 슬라이스에서 관찰된 것과 비슷한 반응인 Shank2^-/- SC-CA1 시냅스에서의 NMDA-fEPSP 초기 경사는 기준 수준의 ~150%까지 천천히 증가하였고, 상승된 상태를 유지하였다(도 30 및 도 31).

한편, NMDA-fEPSP와 반대로, AMPAR 매개 fEPSP(AMPA-fEPSP)는 클리오퀴놀 치료에 의하여 영향을 받지 않았다(도 34). 클리오퀴놀은 또한 SC-CA1에서의 AMPAR 관련 입력-출력 비율(섬유 발리(fiber volleys)에 대해 그려지는 AMPA-fEPSP 경사) 또는 쌍(paired)-펄스 비율에 영향을 끼치지 않았다(도 35 및 도 36)

클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화를 더 확인하기 위하여, 패치 클램프 기록을 이용하여 NMDA-와 AMPA-eEPSC를 동시에 측정하였다. -40mV의 홀딩 전압에서, 야생형 시냅스에서 관찰된 바와 비슷한 결과로, 클리오퀴놀이 Shank2^-/- SC-CA1 시냅스에서 NMDA-eEPSC를 증가시켰다(도 32 및 도 33). NMDAR 길항 물질 AP5는 NMDA-eEPSC를 상당히 감소시켰지만 AMPA-eEPSC는 감소되지 못했고, 이는 이 이벤트가 NMDAR 의존적이라는 것을 나타낸다. 반대로, AMPA-eEPSC들은 클리오퀴놀 치료에 영향을 받지 않았다(도 32 및 도 33). 이와 일관되게, 이 전류로부터 파생된 NMDA/AMPA 비율은 두개의 유전자형 모두에서 증가됐다(도 37). 종합하면, 이 결과는 클리오퀴놀이 Shank2^-/- 및 야생형 시냅스에서 NMDAR은 향상시키지만 AMPAR 기능은 향상시키지 못한다는 것을 나타낸다.

<실험예 3> 클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화에 있어 아연 이동화의 필요 여부 평가

클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화가 아연을 필요로 하는지 평가하였다. 이를 시험하기 위해, 클리오퀴놀보다 아연에 대한 친화력이 매우 높은 두 개의 서로 다른 아연 킬레이터들을 사용하였다: 막 비투과성인 Ca-EDTA (Kd

10^-13)과 막투과성인 TPEN (Kd

10^-15). NMDA-fEPSP에서 측정된 바와 같이 클리오퀴놀 처리 전에서의 Ca-EDTA를 갖는 슬라이스들의 전보온이 Shank2^-/- SC-CA1에서의 NMDAR 활동의 클리오퀴놀 의존적 증가를 제거 하였다(도 39). 대조실험에서, Ca-EDTA 자체만으로는 NMDA-fEPSP에 영향을 끼치지 않았는데, 이는 기존에 보고된 바와 같다(Vergnano AM, et al. Zinc dynamics and action at excitatory synapses. Neuron 82, 1101-1114 (2014), Izumi Y, Auberson YP, Zorumski CF. Zinc modulates bidirectional hippocampal plasticity by effects on NMDA receptors. J Neurosci 26, 7181-7188 (2006))(도 38). TPEN을 사용하여서도 비슷한 결과를 얻었다(도 40). 총괄적으로, 이 발견들은 클리오퀴놀이 NMDAR 활성화를 위해 아연을 필요로 한다는 것을 시사한다. 또한, Ca-EDTA 자체만으로 NMDA-fEPSP에 대한 영향이 없다는 것은 클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화가 시냅스 클래프트에서의 아연의 클리오퀴놀 매개 킬레이트화에 의한 NMDAR들의 탈억제 때문이 아닐 것이라는 것을 시사한다.

만약 CQ의 아연 이오노포어 활동이 NMDAR의 후보 매개자일 가능성이 더 많은 경우, NMDAR 활성화를 위한 아연의 원천은 무엇인지 확인하기 위하여 시험을 하였다. 하나의 가능성 있는 후보는 유지보수를 위해 ZnT3 전송기를 필요로 하는 뇌에서의 아연의 주요 공급원인 시냅스 전 신경 전달 물질 소낭의 아연 저장소이다. ZnT3 결핍(ZnT3^-/-) 마우스를 사용하여 이 가능성에 대한 시험을 한 결과, 클리오퀴놀이 ZnT3^-/- SC-CA1 시냅스에서 NMDAR 활동에 영향을 끼치지 않는다는 것을 확인하였는데(도 41) 이는 클리오퀴놀 효과를 위해 시냅스 전 아연 저장소가 필요하다는 것을 의미한다. 이와 관련한 대조 실험에서, 아연 신호가 ZnT3^-/- 해마교련에서 실질적으로 없다는 것을 확인하였다(도 22).

상기 결과들은 뇌 슬라이스에 아연의 외인성 추가 없이 실행한 실험에서 얻었는데, 이는 세포외 공간에 있는 자유 아연의 생리적 농도에 의존한다. 기존 연구들은, 더 높은 농도도 가능하겠지만, 중앙 신경시스템에서의 자유 아연 농도를 ~20nM로 보고 했다(Vergnano AM, et al. Zinc dynamics and action at excitatory synapses. Neuron 82, 1101-1114 (2014)). 이에, 본 발명자들은 세포외 아연 농도를 250nM로 증가시키는 것이 클리오퀴놀 의존 NMDAR 활성화에 영향을 끼치는지 시험하였다.

그 결과, NMDA-fEPSP에서 측정된 바와 같이, 250nM 아연은 Shank2^-/- SC-CA1 시냅스에서 클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화에 영향을 끼치지 않는다는 것을 확인하였다. 이 결과는 추가적인 아연은 Shank2^-/- 시냅스에서 클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화에 필요하지 않다는 것을 시사하는데, 이는 클리오퀴놀 의존적 NMDAR 활성화를 위해 생리적 조건하에서의 시냅스 전 아연 저장소가 충분하다는 것을 의미한다. 흥미롭게도, 250nM 아연은 야생형 시냅스에서 NMDA-fEPSP의 상당한 증가를 일으켰다(도 42 및 도 43).

마지막으로, 클리오퀴놀이 아연과 더불어 Cu^{2 +} (Kd

10^-8.9)를 결합시킬 수 있기 때문에, 클리오퀴놀의 Cu^{2 +} - 결합 활성 역시 NMDAR 기능에 대한 영향에 기여했는지 여부를 시험하였다. 클리오퀴놀 처리 전, 선택적인 Cu^{2 +} 킬레이터인 큐프리존의 해마교련 슬라이스에의 적용은 NMDAR 활동의 클리오퀴놀 유도된 증가를 억제하지 못했는데(도 44), 이는 클리오퀴놀의 Cu 결합 활동이 NMDAR 활성화에 중요하지 않다는 것을 의미한다.

종합하면, 이들 결과들은 클리오퀴놀이 그것의 아연 이오노포어 활성을 통해 NMDAR 기능을 향상시키지만, 아연 킬레이트화 활성 또는 Cu^{2 +} - 결합 활성을 통해서는 NMDAR 기능이 향상되지 않으며, NMDAR 활성화를 위해 시냅스 전 아연 저장소(pool)를 주로 사용한다는 것을 가리킨다.

<실험예 4> 시냅스 간 아연 이동이 Src 패밀리 키나아제를 통하여 NMDAR를 활성화시키는지 여부

상기 <실험예 1> 내지 <실험예 3>의 결과들로 클리오퀴놀이 시냅스 전 소낭으로부터 시냅스 클레프트와 시냅스 후 시냅스 컴파트먼트로 아연을 이동화한다는 것을 알 수 있었다. 뉴런 활동중에 시냅스 전에 방출된 아연은 NMDAR들을 억제한다고 알려져 있기 때문에(Vergnano AM, et al. Zinc dynamics and action at excitatory synapses. Neuron 82, 1101-1114 (2014)) 시냅스 클레프트에 있는 아연은 NMDAR 활성화에 기여하기 어렵고, 본 발명자들은 Ca-EDTA가 NMDA-fEPSP들에 영향을 끼치지 않는다는 것을 확인하였다(도 38).

만약 시냅스 후 아연 전달이 중요한 인자라면 NMDAR 활성화를 위한 근본적인 메커니즘은 무엇인지 시험하였다. 기존의 연구들에서는 아연이 NMDAR을 인산화하고 활성화시키는 Src 패밀리 타이로신 키나아제(SFK)의 음성 조절기인 Csk(C 터미널 Src 키나아제)에 결합되고 Csk를 비활성화한다고 보여준 바 있다(Manzerra P, et al. Zinc induces a Src family kinase-mediated up-regulation of NMDA receptor activity and excitotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 11055-11061 (2001), Salter MW, Kalia LV. Src kinases: a hub for NMDA receptor regulation. Nat Rev Neurosci 5, 317-328 (2004)). 이와 관련한 실험들에서, 우리는 클리오퀴놀 처리 전에 해마교련 슬라이스에 적용된 두개의 독립적인 SFK 억제제인 PP2(도 45)와 SU6656(도 46)이 Shank2^-/- 및 야생형 SC-CA1 시냅스에서 NMDAR의 클리오퀴놀 활성화를 없애는 것을 확인하였다. 대조 실험에서, 비활성 PP2 유사체인 PP3는 NMDAR 활성화를 차단하는데 실패하였다(도 47).

클리오퀴놀이 SFK를 통해 NMDAR 기능을 향상시킨다는 것을 확인하고, SFK 활동의 세포내 위치가 확실히 시냅스 후라는 것을 확인하기 위하여, SFK를 Src 아미노산 잔기 40-58에 대응하는 염기서열을 가지는 펩티드인 Src 억제 펩티드 Src(40-58)로 억제하였다(Salter MW, Kalia LV. Src kinases: a hub for NMDA receptor regulation. Nat Rev Neurosci 5, 317-328 (2004)). 패치 클램프 레코딩 중에 이 펩티드를 패치 피펫에 포함시켰더니, 클리오퀴놀이 Shank2^-/- 및 야생형 시냅스에서 NMDAR 활성을 증가시키는 것을 방지하였고, 이는 NMDA-eEPSC들을 측정하여 판단하였다(도 48 및 도 49). 대조 실험에서, 스크램블된 Src 펩티드 변종(sSrc 40-58)은 NMDAR 활동의 클리오퀴놀 의존적 증가에 영향을 끼치지 못했다.

NMDAR들과는 반대로, 야생형 및 Shank2^-/- 시냅스 모두에서의 동시 기록으로부터 확인된 것처럼, AMPAR 기능은 Src 억제 펩티드로부터 영향을 받지 않았다 (도 48 및 도 49). 이와 일치하게, 이들 전류로부터 확인된 NMDA/AMPA 비율에서의 클리오퀴놀 의존적 증가는 Src 억제 펩티드로부터 차단되었지만 스크램블된 펩타이드로부터는 차단되지 않았다(도 50 내지 도 53). 이들 결과는 NMDAR 기능에서의 클리오퀴놀 유도된 증가는 SFK에 의존적이고, 이는 SFK 활동의 세포내 위치는 시냅스 후라는 것을 가리킨다.

<실험예 5> 트랜스 시냅스 아연 이동화에 의한 Tbr1^+/- 마우스에서 사회적 상호작용 개선 여부 평가

감소된 NMDAR이 자폐성 유사 행동과 연관되어 있는, ASD의 또다른 마우스 모델에서의 사회적 상호작용 결손을 클리오퀴놀이 개선할 수 있을지 평가하였다. 이러한 모델 중 하나는 최근에 개발되고 NMDAR 작용물질인 D-사이클로세린으로 정규화된 사회적 상호작용의 저감을 나타낸다고 보고된 Tbr1 단상부족(haploinsufficient)(Tbr1^+/-) 마우스이다(Huang TN, et al. Tbr1 haploinsufficiency impairs amygdalar axonal projections and results in cognitive abnormality. Nat Neurosci 17, 240-247 (2014)). 그러므로 클리오퀴놀이 상기 마우스에서도 사회적 상호 작용을 개선할 수 있는지 평가하였다.

Tbr1^+/- 마우스는 3-챔버 시험에서 야생형 마우스와 비교하여 저감된 사회적 상호작용을 보였다. 또한 3-챔버 시험전 3시간 전 클리오퀴놀를 급성 주사로(30mg/kg) 투여하자, 이는 야생형 마우스에게는 영향이 없었으나 Tbr1^+/- 마우스에서는 사회적 상호작용 결손을 개선하였다(도 54 내지 도 56, 도 60 및 도 61). 그러나 클리오퀴놀은 Tbr1^+/- 또는 야생형 마우스에서의 사회적 신규 인식에는 영향을 주지 못했는데, 이는 기존에 만난 낯선 마우스 대비 새로운 낯선 마우스들에 대한 선호도에 근거하여 확인되었다(도 57 내지 도 59, 도 62 및 도 63). 이 결과들은 클리오퀴놀이 Tbr1^+/- 마우스에서 사회적 상호작용 결손을 개선하지만, 사회적 신규 인식에는 영향이 없다는 것을 시사한다.

이를 Shank2^-/- 마우스에서 얻은 유사한 결과들과 종합하면, 이는 클리오퀴놀이 NMDAR 기능 저하의 특징을 갖는 ASD의 2개의 독립적인 마우스 모델들에서 사회적 상호작용 결손을 개선할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (10)

1. 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 클리오퀴놀은 시냅스후(postsynaptic) NMDA 수용체 기능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 클리오퀴놀은 아연 이오노포어 활성을 통하여 NMDA 수용체 기능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 클리오퀴놀은 Src 패밀리 타이로신 키나아제를 통하여 NMDA 수용체 기능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 클리오퀴놀은 시냅스에서 아연 이동을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서,
   사회적 상호 작용 결손을 개선시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 주사를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
8. 클리오퀴놀 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 자폐증 스펙트럼 장애의 개선용 식품 조성물.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 클리오퀴놀은 시냅스후(postsynaptic) NMDA 수용체 기능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
   
10. 제 8항에 있어서,
    사회적 상호 작용 결손을 개선시키는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
    

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