CZ293162B6

CZ293162B6 - Nové neuroaktivní steroidy, způsob jejich výroby a použití

Info

Publication number: CZ293162B6
Application number: CZ20001888A
Authority: CZ
Inventors: Alexander Kasal; Barbora Slavíková; Zdenka Krištofíková
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2004-02-18
Also published as: CZ20001888A3

Abstract

Nové neuroaktivní steroidy - 3.alfa.-hydroxy-5.alfa.-pregnan-12,20-dion vzorce VI a 3.alfa.-fluor-5.alfa.-pregnan-12,20-dion vzorce VII. Tyto deriváty lze připavit z 3.beta.-hydroxy-5.alfa.-pregnan-12,20-dionu vzorce VIII převedením na aktivní intermediáty, které se rozkládají s inverzí konfigurace buď na zmíněný 3.alfa.-hydroxyderivát vzorce VI nebo na 3.alfa.-fluorderivát vzorce VII a které jsou schopny modulovat .gama.-aminomáselnou kyselinu.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových steroidních derivátů, které modulují aktivitu nervového přenašeče kyseliny γ-aminomáselné.

Dosavadní stav techniky

Neuroaktivní steroidy jsou použitelné v řadě lékařských aplikací do anestetik přes hypnotika až k antiepileptikům (Besson J. M.: Lancet 353, 1610, (1999). Jejich účinek je vysvětlován tak, že svou vazbou na specifické receptorové místo allostericky zvyšují účinek nervového přenašeče na vodivost chloridového kanálu. Hlavním problémem klinického používání přirozeného neurosteroidu 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu vzorce I je jeho malá stabilita v těle. Poločas jeho inaktivace v

těle je 16 minut. Sloučenina I je totiž inaktivována oxidací na neúčinný diketon Π a následnou redukcí poskytuje rovněž neúčinný 3P-hydroxy-5a-pregnan-20-on vzorce ΙΠ (El-Etr M., Akwa Y., Robel P., Baulieu E. E.: Brain Res. 790, 334 338, 1998).

(III)

Nízkou stabilitu sloučeniny vzorce I řeší různí autoři různě, někteří kontinuální aplikací steroidu I, jiní změnou reaktivity jejich derivátů. Např. někteří výrobci zavedením methylové skupiny do polohy 3 (Carter R. B., Wood P. L., Wieland S., Hawkinson J. E., Belelli D., Lambert J. J., White H. S., Wolf Η. H., Mirsadeghi S., Tahir S. H., BolgerM. B., Lan N. C., Gee K. W.: J. Pharmacol. Pharmacol. Exp. Ther. 280, 1284-95 (1997) za vzniku sloučeniny vzorce IV zamezí oxidovatelnost pro aktivitu esenciální 3a-hydroxyskupiny:

(IV).

-1 CZ 293162 B6

Jiným způsobem, jak zvýšit stabilitu neuroaktivních steroidů v těle, byla náhrada 3-hydroxylové skupiny fluorem (Kasal A., Slavíková B., Chodounská H., Kohout L., Krištofiková Z., Uhlířová L. a Kršiak M.: Nové neuroaktivní steroidy, způsoby jejich přípravy a použití. PV 4214/1999).

Nejznámějším neuroaktivním steroidem blízkým 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu je jeho 11-oxoderivát vzorce V, který pod názvem „alphaxolone“ (česky alfaxolon) byl používán jako anestetikum. I tento steroid trpí výše zmíněným nedostatkem - rychlým metabolismem v těle. Navíc jeho syntetická dostupnost je ztížena tím, že k přípravě je nezbytné použití ekonomicky náročné mikrobiální hydroxylace.

Podstata vynálezu

Výše zmíněné nedostatky řeší dva nové neuroaktivní steroidy, založené na 3a-substituovaných derivátem 5a-pregnan-12,20-dionu vzorců VI a VII

(VII), které se od alfaxolonu liší polohou oxoskupiny: ta byla přesunuta do polohy 12. Derivát vzorce VH se vyznačuje mnohem vyšší stabilitou 3-substituentu, protože v ní je 3-hydroxylová skupina nahrazena atomem fluoru.

Zavedení 12-oxoskupiny do steroidní molekuly se docílí volbou výchozí látky, např. hekogeninacetátu vzorce

který je standardním postupem převeden na 3|3-hydroxy-5a-pregnan-12,20--dion vzorce VHI (Callow R. K., James V. Η. T.: J. Chem. Soc. 1956,4744-4749).

(VIII).

Změna konfigurace hydroxylové skupiny v poloze 3 β na 3 a se podle vynálezu provádí tak, že působením alkyl či arylsulfonylchloridu se docílí převedení na reaktivní intermediát (např. alkyl- či arylsulfonát), který se solvolyzuje v roztoku vodného dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu

(VII), při teplotách 75 až 150°Cza vzniku dosud nepopsaného 3a-hydroxy-5β-pregnan-l2,20-dionu vzorce VI. Solvolýzu je možné provádět v přítomnosti dusitanu sodného nebo draselného. Dalším možným postupem přípravy je formylace s inverzí působením roztoku kyseliny mravenčí v přítomnosti dialkylazodikarboxylátu a trifenylfosfinu a následná alkalická hydrolýza vzniklého 3a-formyloxy-5a-pregnan-l 2,20-dionu.

3a-fluor-5a-pregnan-12,20-dion vzorce VII se připraví tak, že alkyl či arylsulfonát se solvolyzuje bezvodým roztokem anorganického či organického fluoridu, s výhodou diethylaminosulfurtrifluoridu ve vhodném rozpouštědle při teplotách 25 až 100 °C.

Výše popsané deriváty vzorců VI a VII jsou použitelné v lékařství v případech, kdy je třeba modulovat aktivitu γ-aminomáselné kyseliny. V příkladu provedení 5 je tato aktivita doložena pokusem in vivo. Takový intermediát byl za jiných podmínek opět s inverzí konfigurace podle vynálezu převeden na 3a-fluor-5a-pregnan-12,20-dion vzorce VII, který překvapivě modulační aktivitu aminomáselné kyseliny vykazoval.

Příklady provedení

Příklad 1: Příprava receptorů γ-aminomáselné kyseliny.

Přední mozek byl homogenizován v 10 objemech ledové 0,32 M sacharózy. Homogenát byl 10 min centrifugován při 1000 g a vzniklý supematant opět stočen při 20 000 g (20 min). Pelety byly resuspendovány v 10 objemech ledové redestilované vody a centrifugovány při 8000 g (20 min). Vzniklý supematant byl stočen při 24 000 g (20 min). Pro dokonalé odstranění γ-aminomáselné kyseliny byly pelety zamraženy na 40 min, po rozmražení byly synaptické membrány resuspendovány v 10 objemech pufru (pH= 7,4; 20 mM KH₂PO₄ + 200 mM KC1) a opět centrifugovány při 24 000 g (20 min). Tato operace byla opakována třikrát.

-3CZ 293162 B6

Příklad 2: 3a-Hydroxy-5a-pregnan-12,20-dion (VI)

Z roztoku 33-hydroxy-5a-pregnan-12,20-dionu (120 mg, 0,38 mmol, ref. Callow R. K., James V. Η. T.: J. Chem. Soc. 1956, 4744 - 4749), trifenylfosfinu (300 mg, 1,14 mmol) ve směsi toluenu (10 ml) a benzenu (20 ml) byla rychle oddestilována azeotropická směs (10 ml). Směs byla míchána magnetickým míchadlem v ledové lázni a po 3 minutách byl za míchání přidán diethylazodikarboxylát (10 kapek, 1,43 mmol). Po dalších 8 min byla do žlutého roztoku přikapána bezvodá kyselina mravenčí (3 kapky, 1,43 mmol). Po 3 hod byla směs protřepána roztokem hydrogenuhličitanu draselného (7%, 5 ml) a vodou, vysušena bezvodým síranem sodným a odpařena ve vakuu k suchu. Odparek byl nanesen na tenkou vrstvu silikagelu (3 desky, 200 x 200 x 1 mm), která byla vyvíjena roztokem benzenu v etheru (50 %). Detekce produktu byla provedena inspekcí v UV světle (234 nm) po postřiku morinem (0,02 % v methanolu). Eluce lipofilního pásu etherem poskytla 106 mg (78 %) 3a-formiátu. T.t. 195 až 197 °C (aceton); [a]_D+178° (chloroform, c = 0,95). Ή NMR spektrum: 0,89 s, 3H (H-l9); 0,95 s 3H (H-l 8); 2,26 s, 3H (H-21); 3,32 t, 1H (J= 9,0 Hz, H-3,32 t, 1H (J= 9,0 Hz, H-ll); 5,18 m, 1H (W= 16 Hz, H-3); 8,05 s, 1H (HCOO). Pro C₂₂H₃₂O₄ (360,5) vypočteno: 73,30 % C, 8,95 % H; nalezeno: 73,23 % C, 9,0 % H.

Formiát (96 mg, 0,26 mmol) a hydrogenuhličitan draselný (50 mg, 0,36 mmol) byly zahřívány v roztoku methanolu (9 ml) a vody (1 ml) k varu. Po 10 min byla směs zahuštěna ve vakuu na čtvrtinu objemu a produkt byl vysrážen vodou. Krystalizace sraženiny ze směsi acetonu a heptanu poskytla derivát VI (71 mg, 80 %) o t.t. 199 až 201 °C, [a]_D +170° (c = 0,9). *H NMR spektrum: 0,87 s, 3H (H-19); 0,95 s, 3H (H-l8); 2,27 s, 3H (H-21); 2,461, 1H (J= 8 Hz, H-17); 3,31 t, 1H (J = 9,0 Hz, H-ll); 4,07 m, 1H (W= 16 Hz, H-3). Pro C₂iH₃₂O₃ (332,5) vypočteno: 75,86 % C, 9,70 % H; nalezeno: 75,86 % C, 9,65 % H.

Příklad 3: 3 a-Fluor-5a-pregnan-12,20-dion (VII)

Diethylaminosulfur-trifluor (96,7 mg, 0,60 mmol) byl přidán k roztoku 3|3-hydroxy-5apregnan-12,20-dionu (100 mg, 0,3 mmol) v dichlormethanu (1 ml) při 20 °C. Po dvou hodinách byla reakční směs nalita do 5% roztoku hydrogenuhličitanu draselného, produkt byl extrahován dichlormethanem, promyt vodou a sušen bezvodým síranem sodným. Zbytek po odpaření rozpouštědla byl chromatografován na dvou preparativních deskách silikagelu, eluce petroletherether (7:3) poskytla 3a-fluor-5a-pregnan-12,20-dion (36 mg, 36 %). T.t. 146 až 149 °C (aceton-heptan), [a]_D +166° (c 1,08). IČ spektrum: 1 702 (C=O), 992 (C-F). ^!H NMR spektrum: 0,87 s, 3H (H-19); 0,95 s, 3H (H-l8); 2,27 s, 3H (H-21), 2,48 t, 1H (J= 8 Hz, H-17); 3,321, 1H (J= 9 Hz, H-ll); 4,82 dm, 1H (J(F,H-3)= 49 Hz, H-3). Pro C₂iH₃iFO₂ (334,5) vypočteno: 75,41 % C, 9,34 % H, 5,68 % F; nalezeno: 75,29 % C, 9,36 % H, 5,49 % F.

Příklad 4: 3a-Fluor-5a-pregnan-12,20-dion (VTI)

K roztoku 3p-hydroxy-5a-pregnan-12,20-dionu (100 mg, 0,3 mmol) v pyridinu (1 ml) byl přidán 4-toluensulfonylchlorid (100 mg, 0,52 mmol) při 20 °C. Po 24 hodinách byla reakční směs nalita do vody, produkt byl extrahován chloroformem, promyt vodou, zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (5%), vodou, roztokem hydrogenuhličitanu draselného (5%) a vodou. Po vysušení bezvodým síranem sodným, bylo rozpouštědlo oddestilováno. K odparku byl přidán roztok tetrabutylamoniumfluoridu v tetrahydrofuranu (1M, 1,3 ml) a reakční směs byla ponechána v termostatu při 50 °C po dobu 4 dnů. Pak byla reakční směs nalita do vody, produkt byl extrahován etherem, organická vrstva byla promyta vodou, vysušena bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo bylo odpařeno. Zbytek byl chromatografován na 4 preparativních deskách silikagelu (petrolether:ether, 9:1) a bylo získáno 28 mg (28 %) 3a-fluor-5a-pregnan-12,20

-4CZ 293162 B6 dionu. T.t. 147 až 149 °C (aceton-heptan). Vzorek byl identický s produktem připraveným v předchozím příkladu.

Příklad provedení 5

Synaptické membrány z předního mozku 3měsíčního potkana samce kmene Wistar byly inkubovány s (³H)muscimolem (5 nM) nebo s (³⁵S)TBPS (2nM). Nespecifická vazba byla stanovena pomocí 1 mM kyseliny y-aminomáselné (40 % z totální vazby (³H)muscimolu) nebo 200 μΜ pikrotoxinu (33 % z totální vazby (³⁵S)TBPS). Steroidy byly rozpuštěny v koncentrovaném dimethylsulfoxidu, zředěny redestilovanou vodou a sonifikovány (konečná koncentrace rozpouštědla byla 3 %).

Výsledky stimulace vazby muscimolu (EC(50)):

nMpro derivát VI, 114 nMpro derivát VII.

Výsledky inhibice vazby TBPS (vazba při 100 nM koncentraci steroidu):

53,1 % pro derivát VI, 64,3 % pro derivát VII.

Průmyslová využitelnost

Steroidní deriváty podle vynálezu jsou využitelné pro výrobu léčiv.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. 3a-Substituované deriváty 5a-pregnan-12,20-dionu obecného vzorce IX («λ kde R znamená hydroxyl nebo fluor.

2. Způsob výroby derivátu podle nároku 1 obecného vzorce IX, kde R znamená hydroxyl, vyznačující se tím, že na sloučeninu vzorce VHI

-5CZ 293162 B6 (VIII) se působí alkyl či arylsulfonylchloridem a vzniklý alkyl či arylsulfonát se solvolyzuje v roztoku vodného dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu při teplotách 75 až 150 °C za vzniku 3a-hydroxy-5a-pregnan-12,20-dionu vzorce VI

3. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že solvolýza se provádí v přítomnosti dusitanu sodného nebo draselného.

4. Způsob přípravy derivátu podle nároku 1 obecného vzorce IX, kde R znamená hydroxyl, vyznačující se tím, že sloučenina shora uvedeného vzorce Vin se formyluje s inverzí působením roztoku kyseliny mravenčí v přítomnosti dialkylazodikarboxylátu a trifenylfosfínu a vzniklý 3a-formyloxy-5a-pregnan-12,20-dion se alkalicky hydrolyzuje na 3a-hydroxy-5apregnan-12,20-dion shora uvedeného vzorce VI.

5. Způsob přípravy derivátu podle nároku 1 obecného vzorce IX, kde R znamená fluor, vyznačující se tím, že na sloučeninu shora uvedeného vzorce VHI se působí alkyl či arylsulfonylchloridem a vzniklý alkyl či arylsulfonát se solvolyzuje bezvodým roztokem anorganického či organického fluoridu ve vhodném rozpouštědle při teplotách 25 až 100 °C za vzniku 3a-fluor-5a-pregnan-12,20-dionu vzorce VII

6. Způsob přípravy derivátu podle nároku 1 obecného vzorce IX, v němž R znamená fluor, vyznačující se tím, že na sloučeninu vzorce VHI

-6CZ 293162 B6 (VIII) se působí fluoračním činidlem, které nahradí 3|3-hydroxylovou skupinu atomem fluoru za vzniku 3a-fluor-5a-pregnan-12,20-dionu výše uvedeného vzorce VII.

5

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že fluoračním činidlem je diethylaminosulfurtrifluorid.

8. 3a-Substituované deriváty 5a-pregnan-12,20-dionu obecného vzorce IX, kde R znamená hydroxyl nebo fluor, pro použití jako neuroaktivních látek modulujících účinek kyseliny io γ-aminomáselné.