CZ285686B6

CZ285686B6 - Protinádorový prostředek

Info

Publication number: CZ285686B6
Application number: CZ953248A
Authority: CZ
Inventors: Haim I. Bicher
Original assignee: Haim I. Bicher
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1999-10-13
Also published as: WO1994028909A1; AU6959694A; EP0707480A4; US5624908A; US5449663A; JPH09501411A; EP0707480A1; CZ324895A3

Abstract

Předkládaný vynález popisuje protinádorové prostředky obsahující chirální monosacharidy. Prostředky vykazují cytostatické a cytotoxické vlastnosti vůči nádorovým buňkám jsou tvořeny za použití L-izomerních forem monosacharidů. Výhodné provedení předkládaného vynálezu využívá L-izomerní formu glukozy s farmaceuticky přijatelným nosičem. Prostředky lze použít samotné nebo jako doplňky jiných forem nádorové terapie. Lze je použít v kombinaci se všemi hlavními formami nádorové terapie včetně operativního zákroku, biologických a chemických terapií, terapie ozařováním a hypertemie. Kromě zvýšení úmrtnosti nádorových buněk mohou tyto prostředky redukovat možnost nádoru metastázovat a zpomalují růst zhoubného nádoru. ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití vybraných chirálních sacharidů v nádorové terapii a způsobů jejich aplikace. Týká se zvláště použití L-izomerů monosacharidů s cytotoxickými a cytostatickými vlastnostmi. Vybrané sloučeniny lze použít samotné nebo jako doplněk k ostatním formám nádorové terapie. Jsou výhodné v kombinaci s hlavními formami nádorové terapie včetně operativního zákroku, biologické a chemické terapie, terapie ozařováním a hypertermie. Podávání terapeuticky účinných množství L-monosacharidů zvyšuje náchylnost nádorových buněk k toxickým elementům. Kromě zvýšení úmrtnosti nádorových buněk snižují tyto prostředky možnost nádoru metastázovat a zpomalují růst zhoubného nádoru.

Dosavadní stav techniky

Bylo odhadnuto, že v roce 1993 bude diagnostikováno přes jeden milion nových případů rakoviny a více než 5 000 000 lidí této nemoci podlehne. Příčiny vzniku rakoviny jsou komplexní a zahrnují vypracování vzájemného působení faktorů životního prostředí, účastníci se vzniku nádorů, mohou být chemické, fyzikální nebo biologické povahy. Mezi faktory životního prostředí patří tři hlavní fyzikální karcinogeny, tj. ionizující záření, ultrafialové záření a přítomnost cizorodých tělísek, jako je azbest. Chemické karcinogeny, přírodní i syntetické, mohou vést ke vzniku sloučenin, které se přímo komplexují s DNA a během replikace vnášejí chyby do sekvence bází DNA. Biologické faktory zahrnují viry, parazity a hormony, u kterých již byla prokázána účast při karcinogenezi savců.

Rakovina je onemocnění, které se vyvine, jestliže se uspořádaný poměr mezi dělením buněk a diferenciací buněk poruší. V normálních systémech savců je proliferace buněk omezena na nediferencované kmenové buňky, které se normálně reprodukují za nahrazení maturovaných diferenciovaných buněk. Proliferující kmenová buňka, která diferencuje, ztrácí schopnost dělení a reprodukce. Naopak v systému rakovinných buněk dělící se buňky obecně ztrácejí schopnost diferenciace a spolu s tím jakékoliv přirozené tlaky na jejich schopnost se reprodukovat.

Rakoviny, vznikající v tkáních ektodermálního nebo endodermálního původu, jsou obecně nazývané karcinomy, zatímco pocházející ze žláz jsou nazývány adenokarcinomy. Rakoviny, vznikající v tkáních, pocházejících z mesodermu, jsou nazývány sarkomy, zatímco Iymfhematopoietického původu jsou lymfomy a leukémie. Ačkoliv jsou pozorovány v mnoha odlišných typech tkání a vykazují odlišné charakteristiky, primárními znaky, sdílenými většinou zhoubných nádorů, jsou anaplazie, invaze a metastáze.

Nejprve vzniká rakovina u jedné buňky, která byla transformována pomocí nějakého externího faktoru. U některých buněk vede již jednoduchá mutace k neoplastické transformaci, ale pro většinu nádorů je zřejmé, že karcinogeneze je mnohastupňový proces. Zdá se, že velká většina lidských rakovin zahrnuje akumulaci genetického poškození a eventuální transformaci postižené tkáně. Následně po transformaci buňky začíná vznikat nádor spolu s vývojem klonálního shluku nezávisle proliferujících buněk. V této fázi není pozorován žádný rozpad tkáně, ale nádorové buňky jsou přítomny v místě svého zrodu. Nádorové buňky mohou asociovat za tvorby pevného nádoru, nebo mohou být rozšířeny ve fyziologických systémech, jako je kostní dřeň nebo lymfatické neoplazmy. V případě pevných nádorů může tkáň získat schopnost metastázovat a napadnout vzdálené části těla pomocí krevního řečiště nebo lymfatického systému.

Specifická histologie nádoru a progrese rakoviny často označují, jakou formu léčby nebo kombinaci léčeb bude možno použít k léčbě tohoto onemocnění. Hlavní přístupy k léčbě

-1 CZ 285686 B6 rakoviny zahrnují operativní zákrok, ozařování, chemoterapii, hypotermii a imunoterapii za použití biologických látek. Tyto formy se často doplňují navzájem a běžně se používají společně, což má synergní účinky. Operativní zákrok, ozařování a hypertermie jsou nejúčinnější při léčbě lokalizovaných nádorů a společně vedou k léčbě asi 40 % všech nově diagnostikovaných případů. Nelokalizované nádory a metastatické nádory určují použití chemoterapií nebo terapií, založených na biologických látkách, které působí v celém těle. Systematická podávání kombinace chemoterapeutických látek může léčit dalších 10 až 15% všech pacientů. Ale i když bylo za použití integrovaných terapeutických strategií dosaženo pokroků při léčbě rakoviny, stále ještě existují omezení účinku a výsledky léčby pacientů jsou často méně než uspokojivé.

Ukázalo se, že terapie ozařováním je účinná při sledování řady nádorů a používá se v případě více než poloviny všech nádorů. Navíc v kombinaci s operativním zákrokem často zahrnuje primární léčbu řady nádorových typů včetně rakoviny prsu, rakoviny hlavy a šíje, krčních nádorů, nádorů mozku, plic a určitých fází lymfomu. Obecně existují dva hlavní způsoby provedení ozařování: teleterapie, kde externí paprsek záření je zaměřen na místo nádoru, a brachyterapie, kde zdroje záření jsou umístěny uvnitř nebo blízko cíle. K usnadnění lokální kontroly růstu nádoru lze použít různé hladiny nebo zvláštní formy záření, z nichž každá má výhody pro specifické klinické situace. Jako takovou lze terapii ozařováním přizpůsobit s ohledem na typ nádoru nebo individuální potřeby pacienta.

Oproti těmto výhodám je použití terapie ozařováním ještě vynuceno omezeními, tkvícími v tomto procesu. Normální tkáně se velmi mnoho liší v množství záření, které mohou bezpečně tolerovat a tato tolerance omezuje celkovou přijatelnou dávku záření. Navíc záření zabíjí jenom takové nádorové buňky, které přijmou dostatečný lineární přenos energie v přítomnosti molekulárního kyslíku. Věří se, že ionizací kyslíku dochází ke vzniku volných radikálů, které jsou pro nádorové buňky toxické. Dále je mnoho nádorů přítomných v oblastech tkání, obsahujících buňky, které jsou slabě oxygenovány a projevily se jako relativně rezistentní vůči záření. Bylo referováno, že tyto hypoxické buňky mohou být méně citlivé na záření díky třem faktorům, uvedeným viz výše. Výsledkem je to, že senzitizery hypoxických buněk jsou testovány ve snaze zlepšit terapeutické účinky tolerovatelných dávek záření. Nicméně radiorezistence stále zůstává primární překážkou účinného výhodnějšího zabití nádorových buněk.

Podobně jako u terapie ozařováním jsou chemoterapeutické látky toxické sloučeniny a uplatňují svůj největší protinádorový účinek, jsou-li použity v maximální tolerované dávce. K zabití nádorových buněk se používají odlišné třídy léčiv, a to odlišnými mechanismy, a jsou běžně používané k léčbě metastatických onemocnění nebo nelokalizovaných nádorů. U chemoterapeutik, stejně jako u terapie ozařováním, omezuje jejich toxicita pro normální tkáně množství, které lze bezpečně podávat. Hlavními faktory, omezujícími úspěch jakékoliv chemoterapie, je neschopnost doručit látku o adekvátní dávkové intenzitě a vytváření rezistence k léčivu. Teoreticky by mohlo malé zvýšení množství doručeného léčiva nebo zvýšená senzitivita maligních buněk významně zlepšit výsledky. Hlavním středem pozornosti výzkumu rakoviny je vývoj technik doručení chemoterapeutik o vyšší dávkové intenzitě. Protože tolerance zdravých buněk na léčivo omezuje absolutní množství chemoterapeutika, které lze doručit, byla většina úsilí zaměřena na senzitizaci nádorových buněk k léčivům.

Až dosud objevená chemoterapeutika jsou jen částečně selektivní vzhledem ke své toxicitě. Nejůčinnější látka je na překážku důležitým buněčným systémům, jako je syntéza DNA, porucha účinku kritických enzymů nebo dostupnost jejich substrátů. Většina nejúčinnějších látek je však dokonce omezena přirozenou rezistencí a nespecifickými účinky na zdravé buňky. Existence nádorů, rezistentních k léčivům, mohou být důsledkem slabého transportu léčiva do buňky, slabou aktivací léčiva, inaktivací léčiva nebo změnou rezerv kompetujících biochemických substrátů. Dále protože rozdíly mezi maligními a nemaligními buňkami jsou převážně kvantitativní, je určité poškození normální tkáně během léčby nevyhnutelné. Selektivní

-2CZ 285686 B6 senzitizací nádorových buněk by mohly být překonány oba tyto rozdíly a současná chemoterapie vykazuje mnohem větší účinek se zmenšením obtíží pacientů.

Spolu s terapií ozařováním a chemoterapií se i hypertermie ukázala být tumoricidní in vitro a in vivo a poskytla povzbudivé výsledky v klinických zkouškách. Zdá se, že selektivní destrukce nádorových buněk je výsledkem jejich senzitivity v důsledku jejich aktivního buněčného metabolismu. Kromě dalších účinků může hypertermie zapříčinit nevratné poškození respirace nádorové buňky a zamezit syntéze nukleových kyselin a proteinů. Hypertermie navíc často narušuje membránu nádorových buněk, což vede kjejich patrné autolytické destrukci. Předpokládá se, že následná modifikace okolního prostředí nádoru také přispívá k destrukci nádorového růstu.

Kromě přímých cytotoxických účinků hypertermie je známo i to, že teplo senzitizuje tkáň pro ionizující záření. Zatímco hypoxické buňky jsou tak senzitivní k hypertermii jako oxygenované buňky, může hypertermie inhibovat schopnost regenerace hypoxických nebo částečně hypoxických buněk ze subletálního poškození ozářením. Mnoho studií, používajících hypertermii při teplotě v rozsahu od 41 °C do 43 °C spolu s nízkou dávkou záření, dosáhlo významné regrese ve srovnání se samotnou hypertermii. Dále se ukazovalo, že hypertermie často zvyšuje účinnost protinádorových léčiv změnou buněčného okolí a následně metabolismu. Dále bylo uvedeno, že hypertermie může stimulovat imunologickou odpověď zvýšením expozice nádorových antigenů.

Selektivní stimulace imunitního systému pacienta vůči agresivnímu nádoru se stává neustále silnější zbraní s tím, jak v posledních letech vzrostly objevy nádorově specifických antigenů. Imunoterapie, zahrnující humorální i buněčné zprostředkované odpovědi, lze stimulovat obecně nebo je lze řídit pomocí vybraných antigenů, specifických pro nádorové buňky. Jakmile nádorová buňka exprimuje rozpoznávatelný antigen, protilátky, fagocyty, NK buňky (přirození zabíječi), cytotoxické T-lymfocyty a lymfokin-aktivované zabíječské buňky mohou být všechny využity k eliminaci tohoto odhaleného nádoru. Zatímco imunoterapie byla při léčbě nelokalizovaných nádorů, jako je leukémie, velmi úspěšná, neprojevila se účinně při léčbě pevných nádorů. Proto je imunoterapie často používána v kombinaci s dalšími léčbami nebo k potlačení metastáz s následným odstraněním lokalizovaného nádoru.

Ať už je vybrána kterákoliv forma léčby nebo jejich kombinace, je založena na využívání rozdílů mezi zdravými buňkami a nádorovými buňkami. Transformované buňky vykazují množství biochemických a regulačních anomálií ve srovnání se zdravými buňkami a poskytují přístup pro nechirurgické léčby rakoviny. Například transformované buňky často exprimují na buněčném povrchu anomální glykoproteiny, což vede k nedostatečné okolní modulaci jejich aktivit. Tyto modifikované proteiny mohou již předem zamezit normální kontaktní inhibici a tkáňovému rozpoznání, takže umožní rozšíření rakoviny. Současně mohou také vytvářet specifický povrchový antigen. Takové antigeny slouží jako ukazatele a velmi dobře usnadňují detekci a odstranění zhoubného nádoru. Jinou důležitou terapeutickou výhodou je relativně rychlé dělení nádorových buněk a odpovídající zrychlení buněčného metabolismu. Kromě imunoterapie vede často většina léčeb nádorových onemocnění k využití některých aspektů této zesílené reprodukce k selektivnímu omezení funkcí nádorových buněk.

Jako podporu této zvýšené reprodukční rychlosti podstupují i buněčné metabolické procesy odpovídající zvýšení svého tempa. Je dobře doloženo, že transportní systémy, použité k příjmu tak potřebných živin, jako jsou sacharidy, aminokyseliny a nukleosidy, často fungují při vyšší kapacitě v transformovaných buňkách. Transport glukózy, jejich nemetabolizovatelných analogů dioxyglukózy a 3-0-metylglukózy, mannózy, galaktózy a glykocyaminu se zvyšuje s transformací. Kromě toho se zvyšuje transport určitých aminokyselin, jako je glutamin, arginin a kyselina glutamová. Dokonce i analogy, které nejsou inkorporovány do proteinů, jako je

-3CZ 285686 B6 cykloleucin a α-aminoizomáselná kyselina, také vykázaly zvýšený příjem po transformaci kultivovaných buněk. Tento masivní přísun živin se zdá pokračovat i přes účinek buněčných reakcí nebo aktuální rychlosti produkce esenciálních buněčných složek.

Například rakovinné buňky jsou známé tím, že spotřebovávají velké množství glukózy jako zdroje energie, dovolující zvýšené využití aminokyselin a nukleosidů při syntéze DNA. Dále se ukázalo, že mnoho zhoubných nádorů je kvůli jejich energetickým nárokům téměř zcela závislých na glukóze. Za využití této vlastnosti dodáváním přebytku glukózy může být aerobní glykolýza nádorových buněk stimulována in vivo až do velké míry. Ovšem vzhledem k nedostatkům substrátu se zdá, že mnoho nádorových buněk přijímá mnohem víc glukózy, než dovede účinně metabolizovat a v důsledku toho vylučuje velké množství kyseliny mléčné. To vede ke snížení hodnoty pH v nádorových buňkách, což může zvýšit citlivost nádoru k různým terapiím.

Podstata vynálezu

V souladu s tím je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout prostředky k vyvolání cytotoxických a cytostatických účinků v nádorové tkáni bez poškození zdravých buněk.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je zesílení cytotoxických a cytostatických účinků nádorových terapií.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je také poskytnout prostředky, využitelné k redukci nebo eliminaci nádorové tkáně v nádorovém systému.

Shrnutí obsahu vynálezu

Obecně předkládaný vynález zdokonaluje výše popsané účely tím, že poskytuje prostředky, obsahující enantiomemí formy běžně se vyskytujících sacharidů. Zvláště překvapivé bylo zjištění, že podávání L-izomerů vybraných monosacharidů má cytotoxické a cytostatické účinky na nádorovou tkáň. Navíc se zdá, že podávání těchto látek v terapeuticky účinných množstvích způsobuje malé nebo žádné poškození nezhoubných buněk. Takže lze L-izomery vybraných monosacharidů, a zvláště L-glukózy, použít jako klinicky využitelné protirakovinné látky pro různé lokalizované a nelokalizované zhoubné nádory. Vybrané sloučeniny lze použít samotné nebo jako doplněk dalších forem nádorové terapie. Neočekávaně bylo zjištěno, že podávání terapeuticky účinných množství izomemích monosacharidů zvyšuje citlivost nádorových buněk k toxickým faktorům. Proto jsou buňky různých lokalizovaných a nelokalizovaných nádorů následně po podání těchto L-izomerů selektivně senzitizovány pro doplňkové terapie. Izomemí sloučeniny jsou výhodné v kombinaci s hlavními formami nádorové terapie včetně operativního zákroku, biologických a chemických terapií, terapie ozařováním a hypertermie. L-izomery jsou navíc účinné vůči vybraným nádorům včetně některých typů karcinomů, adenokarcinomů, sarkomů, lymfomů a leukémií. Kromě zvýšení úmrtnosti nádorových buněk redukují tyto látky možnost nádoru metastázovat a zpomalující růst zhoubného nádoru.

Dalším důležitým aspektem předkládaného vynálezu je to, že nejsou vykazovány toxické vedlejší účinky, což poskytuje schopnost redukovat nebo eliminovat nepříjemnosti, související s běžnými nádorovými terapiemi. Léčby, zahrnující ozařování nebo chemoterapeutické procedury, jsou obecně spojeny s velkým množstvím nevyhnutelné bolesti a potíží, způsobených poškozením zdravých buněk. Oproti tomu se použití L-izomemích forem monosacharidů ukázalo jako netoxické pro zdravé tkáně a při podávání terapeuticky účinných množství nezpůsobuje žádné potíže. Dokonce jsou-li monosacharidy podle předkládaného vynálezu podávány v souladu

-4CZ 285686 B6 s běžnými terapiemi, dovoluje jejich použití snížení dávky škodlivého záření nebo chemoterapeutika. Prostředky a způsoby, zahrnuté v předkládaném vynálezu, jsou proto schopné eliminovat nebo přinejmenším redukovat pacientovy obtíže při nádorové terapii.

Souhrnně terapeutická nádorová léčba podle předkládaného vynálezu sestává z:

podávání terapeuticky účinného množství nejméně jednoho L-izomeru monosacharidu hostiteli— savci, obsahujícímu jednu nebo více transformovaných buněk.

Aktivní složkou podle předkládaného vynálezu je konkrétněji jakýkoliv L-izomer hexozy nebo pentozy. V závislosti na jejím použití může být izomemí sloučenina tvořena právě jen nosičem nebo i jinými chemickými nebo biologickými látkami. L-izomer lze navíc podávat buď ve formě nerozvětveného řetězce nebo v cyklické formě bez nepříznivých vlivů na účinnost léčby. Technika doručení, použitá při léčbě, není kritická a může sestávat z libovolného počtu způsobů včetně orálního podávání a intravenózní a intramuskulámí injikace. Lze použít i injikace přímo do nádoru.

Další cíle, rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé osobám, obeznámeným s technikou z úvah v následujícím popisu vynálezu za předpokladu kombinace s následujícími obrázky.

Provedení vynálezu

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje grafickou reprezentaci účinků L-glukózy na růst nekancerogenních CHO buněk. Buňky byly rozrůstány v médiu s a bez L-glukózy.

Obr. 2 znázorňuje grafickou reprezentaci účinků L-glukózy na růst 9L nádorových buněk gliomu. Buňky byly rozrůstány v médiu s a bez L-glukózy.

Obr. 3 znázorňuje grafickou reprezentaci růstu 9L nádorových buněk gliomu při čtyřech různých koncentracích D-glukózy.

Obr. 4 ukazuje účinky D-glukózy a L-glukózy v různých koncentracích na růst 9L buněk gliomu. Celková koncentrace obou typů glukózy se pohybuje v rozmezí od 4 mM do 5 mM.

Obr. 5 znázorňuje účinky média, obsahujícího různá množství D-glukózy a L-glukózy, na růst 9L buněk gliomu. Celková koncentrace obou typů glukózy je 10 mM.

Obr. 6 znázorňuje účinky média, obsahujícího různá množství D-glukózy a L-glukózy, na růst 9L buněk gliomu. Celková koncentrace obou typů glukózy je 20 mM.

Obr. 7 znázorňuje cytostatické účinky na CaOv buňky, vykazované oběma stereoizomery glukózy během hypertermické léčby. Tepelná léčba byla prováděna po dobu dvou hodin při teplotě 41 °C za podmínek, kdy nebylo sníženo množství kyslíku.

Obr. 8 znázorňuje cytostatické účinky na CaOv buňky, vykazované oběma stereoizomery glukózy během hypertermické léčby. Tepelná léčba byla prováděna po dobu dvou hodin při teplotě 41 °C za sníženého množství kyslíku.

Obr. 9 znázorňuje cytotoxické účinky na CaOv buňky, vykazované oběma stereoizomery glukózy během hypertermické léčby. Tepelná léčba byla prováděna po dobu dvou hodin při teplotě 41 °C za podmínek, kdy nebylo sníženo množství kyslíku.

-5CZ 285686 B6

Obr. 10 znázorňuje cytotoxické účinky na CaOv buňky, vykazované oběma stereoizomery glukózy během hypertermické léčby. Tepelná léčba byla prováděna po dobu dvou hodin při teplotě 41 °C za sníženého množství kyslíku.

Obr. 11 znázorňuje synergický účinek L-glukózy v kombinaci s různými koncentracemi 5— fluoruracilu na růst CaOv nádorových buněk.

Obr. 12 znázorňuje synergický účinek L-glukózy v kombinaci s různými koncentracemi 5fluordeoxyuridinu.

Obr. 13 znázorňuje synergický účinek 6 mg/ml L-glukózy v kombinaci s terapií ozařováním. Na CaOv nádorové buňky bylo působeno různými dávkami gamma-záření, a to za přítomnosti nebo nepřítomnosti L-glukózy v buňkách.

Prostorové uspořádání skupin kolem asymetrického uhlíku určité stereoizomemí formy glyceraldehydu se podle definice nazývá D konfigurace, zatímco opačné uspořádání se nazývá L konfigurace. Význam označení D a L odpovídá pouze prostorové konfiguraci a není určením směru stáčení roviny polarizovaného světla sacharidem. Zmíněný uhlíkový atom, týkající se D nebo L konfigurace, je pro sacharidy, obsahující více než jeden asymetrický uhlíkový atom, 20 asymetrický uhlíkový atom, nejvzdálenější od aktivního místa sacharidu. To je nej vzdálenější uhlík od aldehydového nebo ketonového konce molekuly a přilehlý ke koncové skupině.

Glukóza nebo jakýkoliv jiný monosacharid může být izolován ve dvou krystalických formách, označených jako (+) a (-), které mají odlišné fyzikální vlastnosti. Mezi těmito rozdíly je 25 schopnost stáčet polarizované světlo. Vzorky, které stáčejí polarizované světlo vpravo, se nazývají pravotočivé nebo (+), zatímco vzorky, které stáčejí polarizované světlo doleva, se nazývají levotočivé nebo (-). Takto empiricky odvozená optická otáčivost nijak nekoreluje s absolutní konfigurací. Proto může být L-izomer sacharidu buď pravotočivý nebo levotočivý v závislosti na schopnosti stáčet rovinu polarizovaného světla.

U hexóz a pentóz je cyklická struktura nebo intramolekulámí hemiacetalová forma mnohem stabilnější než necyklická forma, takže je v přírodě nalézána téměř výhradně. Díky tetrahedrálním úhlům mezi uhlíkovými vazbami reaguje karbonylová skupina přednostně se čtvrtým nebo pátým uhlíkem sacharidu za tvorby hemiacetalu. Hemiacetaly s pětičlennými cykly 35 se nazývají furanózy a hemiacetály, s šestičlennými cykly se nazývají pyranózy. Obě formy jsou aktivní a pro účely tohoto vynálezu, zahrnujícího monosacharidovou léčbu, lze aplikovat cyklické i necyklické L-izomeiy.

L-izomemí formy sacharidů se v přírodě nacházejí, ale jen vzácně jsou biologicky aktivní. Tam, 40 kde se vyskytují, bylo zjištěno, že se interakce izomeru s organismem liší. Např. určitá chirální molekula může být esenciální pro vlastní funkci organismu, zatímco její zrcadlová forma není využita vůbec. Zatímco je známo, že L-izomery fukózy a ramnózy jsou využívány ve specifických metabolických procesech, zůstává zahrnutí většiny L-izomerů sacharidů v buněčných pochodech nejasné.

Zatímco obecné mechanismy interakcí izomemích sacharidů s biologickými systémy zůstávají neurčené, protinádorové účinky podle předkládaného vynálezu jsou zřejmé. Kromě vykazování neočekávaných cytotoxických a cytostatických vlastností vykazují L-monosacharidy podle předkládaného vynálezu významnou schopnost zesilovat účinnost různých běžně používaných 50 nádorových terapií. Při použití L-izomemích forem sacharidů jako nádorově senzitizujících látek bylo neočekávaně zjištěno, že tumoricidní působení jiných nádorových terapií bylo velmi zesíleno. Použití těchto vybraných stereoizomemích forem sacharidů může velmi zvýšit účinnost ozařování, hypertermie, chemoterapeutických a biologicky zprostředkovaných technik, zaměřených na odstranění nádoru. Dále lze vybrané stereoizomery využít ve spojení

-6CZ 285686 B6 s operativním zákrokem za účelem snížení možnosti metastázování nebo opětovného výskytu zhoubného nádoru.

I když jsou tyto látky účinné při několika hlavních nádorových terapiích, je předkládaný vynález zvláště výhodný pro použití při chemoterapii. Chemoterapeutika jsou kromě omezení nádoru používána k účinnému prodloužení doby možného znovuobjevení se nádoru a prodlužují dobu přežití pro pacienty, kterým byl již dříve odstraněn nádor a u kterých hrozí možnost opětovného výskytu nádoru. Tento zesílený chemoterapeutický režim prodloužil dobu přežití pacientů s nádorem prsu, tračníku a osteosarkomem. Jiné formy chemoterapie byly použity k redukci velikosti primárních nádorů před operativní resekcí nebo ozařováním karcinomů hlavy a šíje a lokálně rozvinutého nádoru prsu.

Navzdory těmto úspěchům nejsou chemoterapeutické aplikace při léčbě zhoubných nádorů vždy účinné. V mnoha případech je aktuální množství léčiva, dopraveného do místa nádoru, příliš nízké, než aby mohlo vykazovat požadované účinky. Jak bylo již dříve určeno, účinnost mnoha léčeb je omezena toxicitou chemoterapeutik a rezistencí vůči protinádorovým léčivům. Hlavní důraz ve výzkumu nádorových terapií je tedy kladen na vývoj technik k dopravení chemoterapeutik o vyšší dávkové intenzitě. Použitím L-izomerů podle předkládaného vynálezu lze zlepšit dávkovou intenzitu bez změny množství dopravovaného léčiva. Takže přípravou chemoterapeutik podle předkládaného vynálezu nebo jejich doručením současně do místa nádoru by bylo možno značně zlepšit účinnost léčby. Prostředky podle předkládaného vynálezu také kromě senzitizace nádorových buněk a zesílení toxicity chemoterapeutik vykazují vlastní cytotoxické a cytostatické účinky.

Prostředky podle předkládaného vynálezu obecně neovlivňují jiná léčiva a lze je použít spolu se všemi hlavními třídami chemoterapeutických sloučenin. Lze je tedy použít s chemoterapeutickými antimetabolity, antibiotiky, alkaloidy, alkylačními činidly, hormony a endokrinními inhibitory stejně jako s ostatními rozmanitými sloučeninami. Příklady chemoterapeutik, kompatibilních s prostředky podle předkládaného vynálezu, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny: methotrexát, fluoruracil, fluordeoxyuridin, thioguanin, cytarabin, azacytadin, merkaptopurinaktinomycin, bleomycin, mithramycin, doxorubicin, mytomycin, podophyllin, etoposid, teniposid, vincristin, vinablastin, busulfan, cyklofosfamid, mechlorethamin, melphalan athiotepagleomycin, diethylstilbestrol, tamoxifen, megastrol, luprolid, daunorubicin, daktinomycin, bromocriptinprednison a mytotan. Nedávno objevená léčiva, kompatibilní s prostředky podle předkládaného vynálezu, zahrnují taxol, tiazfurin, cisplatin, nitrosureas, deoxycoformycin a Nmethylformamid.

Kromě chemických činidel jsou prostředky podle předkládaného vynálezu v souladu také s většinou biologických činidel. Takovéto terapie směřují k posouvání rovnováhy faktorů systému, které kontrolují růst nebo diferenciaci buněk ve prospěch pacienta. Biologické modifíkátory odpovědi jsou obecně navrhovány k potlačení defenzních systémů pacientů nebo ataku biologie nádorové buňky. Cílem této silné aktivity je inhibovat růst agresivity nebo možnosti nádoru metastázovat. Nedávné pokroky v bioterapii uvedly několik látek, navržených pro atak nádoru různými způsoby. Například cytokiny, jako je interferon, TNF a interleukin-2, jsou zamýšleny k použití ke stimulaci imunosupresivních buněk působením na receptory na buněčném povrchu. L-izomery mohou senzitizovat nádorové buňky zvýšením jejich citlivosti k těmto látkám.

Jiná hlavní biologická činidla, monoklonální protilátky, byla určena k rozeznávání specifických nádorových antigenů a přímému ataku nádorových buněk. Další monoklonální protilátky byly modifikovány k dopravení chemických a radioaktivních činidel přímo na povrch nádorových buněk. Jako u ostatních činidel účinnost těchto léčeb vzrůstá při použití prostředků podle předkládaného vynálezu.

-7CZ 285686 B6

A konečně nespecifická imunoterapie zahrnuje použití biologických činidel, jako je BCG, neboli Bacille Calmette Gurin, zeslabený kmen Mycobacteria tuberculosis, používaný jako modifikátor biologické odpovědi ke zvýšení imunitní odpovědi na široký rozsah antigenů včetně nádorově asociovaných antigenů. Tato činidla byla zvláště účinná v kombinaci s tradičními chemoterapeutiky. Ostatní biologické materiály, jako je stimulační faktor kolonií, lze použít ke zlepšení účinků tradičních nádorových terapií. Ve všech případech lze tato biologická činidla připravit přímo s prostředky podle předkládaného vynálezu nebo dopravit současně do místa nádoru.

Při použití těchto biologických nebo chemických terapií se kontrola a řízení toxicity a vedlejších účinků staly integrální částí léčby. Vedlejší účinky působení medikamentů (a záření) jsou často tak špatné, že většina účinných kúr během léčení nemohla být dokončena. Použitím prostředků podle předkládaného vynálezu by se mohla tato toxicita značně snížit spolu s obtížemi, spojenými s mnoha těmito terapiemi. Senzitizací nádorů méně toxickými činidly a použitím nižších množství by bylo možno dospět ke stejným výsledkům. Kromě zlepšení spolupráce pacienta a vyhlídek na uzdravení by nižší dávkový režim redukoval náklady, snižoval rezistenci vůči léčivům a předcházel by indukci sekundárních nádorů, vyplývající z předčasného ukončení léčby.

Ostatními hlavními formami léčení, kompatibilními s prostředky podle předkládaného vynálezu, jsou ozařování, hypertermie a operativní zákrok. Prostředky, zahrnující L-izomeiy, lze použít k dramatickému zvýšení účinnosti hypertermie lokální i hypertermie celého těla. Podobně lze tyto prostředky použít k zesílení účinku terapie ozařováním při léčbě lokalizovaných a nelokalizovaných nádorů. Ozařování byla tradičně neúčinná při léčbě lokalizovaných hypoxických (se sníženým množstvím kyslíku) nádorů bez použití externího zdroje kyslíku. Nádory, senzitizované prostředky podle předkládaného vynálezu, mají za následek lepší odpověď na různé dávky záření. Jako u chemoterapeutik by to dovolovalo snížení množství použitého záření a tím i eliminaci mnoha nepříjemných vedlejších účinků. A konečně lze prostředky podle předkládaného vynálezu použít i samotné nebo v kombinaci s ostatními léčbami, zaměřenými na snížení rizika opětovného vzniku nádoru po operativním zákroku.

V souladu s poznatky podle předkládaného vynálezu lze L-izomemí formy sacharidů připravit tak, že zahrnují množství různých farmaceuticky přijatelných nosičů. Tyto nosiče, které zahrnují soli, želírující činidla, pufry nebo další matricové materiály, jsou navrženy tak, aby chránily účinné vlastnosti monosacharidů a usnadnily podávání sloučeniny do množství různých tkání. Způsoby dopravování léčiva zahrnují orální nebo parenterální cesty a mohou být rozvrženy na několik period. Specifickým příkladem jsou injikace do místa nádoru nebo injekce, doručené intramuskulámě, intravenózně, intraarteriálně nebo podkožně. Ostatní způsoby zahrnují implantaci vylučovacího systému nebo lokální aplikace. Nosič může dále zahrnovat další farmaceuticky aktivní sloučeniny, jejichž účinek může nebo nemusí být zesilován chirálním monosacharidem.

Následující příklady, které neomezují předkládaný vynález, jsou zde uvedeny jako ilustrace vlastností vzorových prostředků podle předkládaného vynálezu.

Všechna uvedená procenta v příkladech jsou procenta hmotnostní, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: L-glukóza nemá vliv na životaschopnost normálních buněk

Intestinální buňky lidského embrya (nenádorové buňky)

Experiment byl zaměřen na určení toho, zda měnící se koncentrace L-glukózy má nějaký vliv na normální zdravé lidské buňky.

-8CZ 285686 B6

Zdravé intestinální buňky lidského embrya byly získány a rozrůstány za použití technik, dobře známých v oboru. Konkrétněji se buněčné kultury začaly pěstovat tak, že se zaočkovalo lxlO⁶buněk do 5 ml média 199 v 25 nádobách. Toto médium obsahovalo 10 % fetálního telecího séra, 80 mg/ml gentamicinu a přibližně 1 mg/ml D-glukózy. Buňky byly zaočkovány a inkubovány za podmínek vzdušné vlhkosti s přídavkem 5 % CO₂. Po 48 hodinách byla v kompletním médiu rozpuštěna L-glukóza a přidána do nádob v konečné koncentraci 1, 3 a 6 mg/ml. Jako kontrola bylo do zvláštní nádoby přidáno odpovídající množství D-glukózy. Po 48 hodinách bylo za těchto podmínek vyměněno médium za původní čerstvé médium bez L-glukózy nebo přídavku D-glukózy. Čtrnáctý den inkubace byly spočteny kolonie a poskytly následující hodnoty poměru přeživších buněk vzhledem ke kontrolnímu médiu.

D-glukóza 6 mg/ml (98%)

D-glukóza 3 mg/ml (115%)

D-glukóza 1 mg/ml (119%)

L-glukóza 6 mg/ml (97%)

L-glukóza 3 mg/ml (101%)

L-glukóza 1 mg/ml (101%)

Výsledky ukazují, že zdravé lidské buňky v přítomnosti L-glukózy rostly normálně.

Příklad 2: L-glukóza má vliv na životaschopnost nádorových buněk

Lidský kolorektální adenokarcinom (HT-29)

Studie byla prováděna za účelem zjištění, zda má L-glukóza cytotoxické účinky na nádorové buňky.

Buněčná linie lidského kolorektálního adenokarcinomu HT—29 byla získána a kultivována za použití technik, známých v oboru. Buňky byly pěstovány v médiu RPMI-1640 (Sigma) s obsahem 10% fetálního telecího séra a gentamicinu (80 mg/ml). Toto médium obsahuje asi 2 mg/ml D-glukózy. Buňky v exponenciální fázi růstu byly odebrány ze dna nádoby, spočteny a rozředěny kompletním médiem. 4,5 ml pak bylo zaočkováno asi lxlO⁶ buněk ve třech 25 ml nádobách a inkubováno za vzdušných podmínek bez snížení množství kyslíku a s přídavkem 5 % CO₂.

Po 48 hodinách byly L-glukóza a D-glukóza rozpuštěny v kompletním médiu v různých koncentracích a přidány do nádob v objemu 0,5 ml ve výsledných koncentracích přidané glukózy, rovnajících se 1, 3 a 6 mg/ml (5,5, 16,5, 33,5 mM). Den, kdy byla přidána glukóza, byl označen jako den 0.

Po 14 dnech inkubace byly nádoby s buňkami barveny a počítány. V kontrolních nádobách, obsahujících pouze médium, byly nalezeny buňky, vykazující 18,9 % povrchové účinnosti. Tento průměrný počet kolonií byl považován za 100 %. Poměr přeživších buněk činil:

D-glukóza 6 mg/ml (110%) L-glukóza 6 mg/ml (74,9%) L-glukóza 3 mg/ml (101%) L-glukóza 1 mg/ml (111%)

I když ve výsledcích mohou být nějaké statistické odchylky, pokles životaschopnosti buněk při koncentraci 6 mg/ml L-glukózy nastal. Při použití jiných nádorových buněčných linií, jako je lidský ovariální adenokarcinom (CaOv) a FAF 28 fibroblasty čínského křečka, bylo také dosaženo srovnatelných redukcí buněčného růstu a buněčného přežití.

-9CZ 285686 B6

Příklad 3: Normální buňky a nádorové buňky vykazují odlišné poměry růstu v přítomnosti Lglukózy

Krysí prsní nádorové buňky (9L-gliom)

Gliomy jsou nádory, rezistentní vůči záření a vykazují vysoce účinné mechanismy buněčných a DNA oprav za hypoxických i normálních podmínek. Běžné nádorové terapie, jako je ozařování a hypertermie, byly na tyto nádory použity jen s omezeným úspěchem. Tato zvláštní linie buněk gliomu byla izolována z krysího prsního nádoru a byla poskytnuta Centrem mozkových nádorů U. C. San Francisco Brain Tumor Center. Aby bylo možno ukázat dramatické účinky L-glukózy na nádorové buňky, byla působení L-glukózy podrobena během růstu i nenádorová buněčná linie z čínského křečka.

Obě buněčné linie byly udržovány za použití standardních buněčných kultivačních technik. Kultury pro tento experiment byly rozpěstovány tak, že se zaočkovaly buňky do 5 ml média v 25 ml nádobách. K inokulaci bylo použito asi 10⁵ CHO buněk a 5xlO⁵ 9L buněk gliomu ve vhodných nádobách. Vybrané nádoby obsahovaly L-glukózu, přidanou do média již před zaočkováním. Buňky byly rozrůstány za podmínek vzdušné vlhkosti bez sníženého množství kyslíku, s přídavkem 5 % CO₂, při teplotě 37 °C. Růst byl sledován za použití mikroskopu v inverzním uspořádání, přičemž data byla zpočátku odečítána každé dvě hodiny.

Výsledky experimentu znázorňují obrázky 1 a 2, křivky růstu nenádorových CHO buněk obr. 1 a křivky růstu nádorových buněk 9L gliomu znázorňuje obr. 2.1 když křivky na obr. 1 vykazují nějaké statistické rozptýlení, jsou v zásadě stejné. Tyto výsledky jako v příkladu 1 jasně indikují, že L-glukóza má při těchto koncentracích malé nebo žádné nepříznivé účinky na nenádorové buňky.

Oproti tomu, jak ukazuje obr. 2, nastal dramatický vliv na růst nádorových buněk 9L gliomu, byly-li buňky vystaveny působení stejných koncentrací L-glukózy. Tento cytostatický účinek je zřetelně vykazován i v přítomnosti D-glukózy v médiu. Křivky ukazují, že nádorové buňky, kultivované v přítomnosti L-glukózy, nikdy nedosáhly exponenciální fáze růstu a koncentrace nikdy nevzrostly nad počáteční hodnoty inokulace. L-glukóza buňkám bránila využívat množství živin, přítomných v čerstvém médiu. Oproti tomu nádorové buňky, kultivované v médiu bez Lglukózy, rapidně dosáhly exponenciální fáze růstu a jejich počet se zdvojnásobil.

Z těchto výsledků je zřejmé, že L-glukóza vykazuje cytostatický účinek na buňky zhoubného nádoru, ale neohrožuje růst normálních savčích buněk.

Příklad 4: L-glukóza vykazuje cytostatické účinky na nádorové buňky

Krysí prsní nádorové buňky (9L gliom)

Aby bylo možno dále demonstrovat cytostatické účinky L-glukózy na nádorové buňky, byly prováděny studie, používající různé koncentrace tohoto monosacharidu. Nádorové buňky 9L gliomu byly kultivovány za podmínek bez sníženého množství kyslíku a v přítomnosti různých množství L-glukózy i D-glukózy. Linie nádorových buněk byla stejná jako v příkladu 3.

Buněčné kultury 9L gliomu byly pro tento experiment rozrůstány zaočkováním buněk do 5 ml média v 25 ml nádobách. Počáteční koncentrace buněk v kultuře byla adjustována pod 2xl0⁵buněk/ml pro každý experiment. pH média bylo nastaveno v rozmezí od 7,2 do 7,4. Nádoby obsahovaly různá množství L-glukózy a D-glukózy, přidané do média před zaočkováním nádorovými buňkami. Buňky byly inkubovány za podmínek vzdušné vlhkosti s přídavkem 5 % CO₂ při teplotě 37 °C. Růst byl sledován po dobu od tří do čtyř dnů.

-10CZ 285686 B6

K změření účinku L-glukózy na nádorové buňky byla stanovena základní linie za použití čtyř různých koncentrací D-glukózy. Jak je ukázáno na obr. 3, buňky 9L gliomu byly kultivovány v přítomnosti 2,5, 5, 15 a 20 mM D-glukózy. Počáteční koncentrace buněk v kultuře činila asi 1,4x10⁵ buněk/ml a v každém případě kultury vykazovaly krátkou růstovou lag fázi kratší než 8 hodin. Jak je vidět, konečná koncentrace životaschopných buněk je úměrná množství Dglukózy v médiu. Zatímco koncentrace buněk při 2,5 mM koncentraci D-glukózy dosahuje pouze poloviny hodnot, dosažených při 15 mM nebo 20 mM, aktuální růstový poměr se nezdá být závislým na koncentraci D-glukózy.

Obr. 4 ukazuje růst buněk 9L. gliomu v přítomnosti různých koncentrací L-glukózy. Ačkoliv se poměr L-glukózy ku D-glukóze měnil, koncentrace racemické glukózy se pohybovala v rozmezí od 4 do 5 mM. Nádorové buňky byly kultivovány za poměru L ku D 1:1, 4:1 a 16:1 při odpovídajících koncentracích L-glukózy 2,5 mM, 4 mM, respektive 4 mM.

Růst při všech třech poměrech byl pomalejší než růst nádorových buněk v přítomnosti 5 mM Dglukózy, jak znázorňuje obr. 3. Při nejvyšší koncentraci L-glukózy v podstatě nebyl zjištěn žádný růst buněk. Dále byla finální koncentrace buněk, kultivovaných v přítomnosti L-glukózy, nižší než hodnoty, získané v přítomnosti jenom D-glukózy. Podle očekávání klesala koncentrace buněk s tím, jak se zvyšovalo množství L-glukózy. Tyto výsledky ukazují, že poměr glukóz L/D je důležitým faktorem, působícím na dělení buněk a následkem toho i na dobu zdvojení buněk.

Experiment, znázorněný na obr. 5, odpovídá experimentu na obr. 4 kromě toho, že koncentrace racemické směsi glukózy byla udržována stabilně na hodnotě 10 mM. Poměry glukóz L/D činily 1:1, 2:1, 4:1 a 8:1, což odpovídá absolutním koncentracím L-glukózy 5 mM, 6,6 mM, 8 mM, respektive 8,9 mM.

Jak ukazuje obr. 4, buňky vykazují relativně nízký růstový poměr s prodlouženou lag fází. Při všech poměrech kromě 1:1 je lag fáze prodloužena až na 50 hodin, neboje asi o 20 % delší než u buněk, kultivovaných bez L-glukózy. Tato prodloužená doba lag fáze odpovídá relativně delší době zdvojení a pomalejšímu růstu nádoru.

Jak ukazuje obr. 6, byl prováděn podobný experiment za použití racemické glukózy o koncentraci 20 mM. Poměry glukóz L/D byly opět 1:1, 2:1, 4:1 a 8:1, což odpovídá absolutním koncentracím L-glukózy 10 mM, 13,3 mM, 16 mM, respektive 17,8 mM. Opět byl pozorován stejný průběh růstu, i když prodloužená doba lag fáze byla méně výrazná. Takový výsledek je očekáván při zvýšení absolutní koncentrace D-glukózy. Navíc je hodnota absolutní koncentrace buněk pro všechny poměiy L/D kromě 1:1 pod hodnotou pro 20 mM D-glukózu, kontrolně vynesenou na obr. 3.

Byla také určována doba zdvojení buněk 9L gliomu. Výsledky těchto výpočtů jsou uvedeny v tabulce 1 a ukazují, že buněčný růst je v přítomnosti L-glukózy nápadně pomalý.

Tabulka 1: Doba zdvojení linie nádorových buněk 9L gliomu v přítomnosti L-glukózy a Dglukózy

Složení média	Doba zdvojení (hod)
Pouze D-glukóza 2,5 mM	23
5 mM	25,5
15 mM	24,5
20 mM	24

-11CZ 285686 B6

Tabulka 1 - pokračování

Složení média	Doba zdvojení (hod)
L-glukóza + D-glukóza (10 mM)
5 mM + 5 mM	31
6,6 mM + 3,3 mM	30
8 mM + 2 mM	29
8,89 mM+ 1,11 mM	32
L-glukóza + D-glukóza (20 mM)
10 mM + 10 mM	26
13,3 mM + 6,67 mM	26
16,0 mM + 4 mM	29,5
17,8 mM + 2,2 mM	30

Tyto výsledky přesvědčivě ukazují, že přítomnost L-glukózy brání růstu buňkám zhoubného nádoru. Prodloužená doba lag fáze, daná různými koncentracemi L-glukózy, odpovídá pomalejšímu růstu nádoru. Dále stabilně nižší koncentrace buněk v přítomnosti L-glukózy ukazují, že doprovodným jevem je zde cytotoxický účinek.

Příklad 4: L-glukóza zesiluje cytostatické a cytotoxické účinky hypertermické terapie

Lidský ovariální karcinom (CaOv)

Zesílení účinku hypertermické terapie L-glukózou bylo znázorněno za použití buněčné linie z lidského ovariálního karcinomu (CaOv). Buňky byly kultivovány za normálních atmosférických a hypoxických podmínek. Tyto buňky pak byly na krátkou dobu podrobeny hypertermii v přítomnosti L-glukózy a D-glukózy a po další inkubaci byly spočteny, aby bylo možno určit poměry přeživších buněk a růstové poměry.

Buňky lidského ovariálního karcinomu (CaOv) byly získány a kultivovány za použití technik, dobře známých v oboru. Kultury byly rozrůstány zočkováním buněk do 5 ml média 199, doplněného o 10 % fetálního telecího séra a 80 pg/ml gentamicinu. Buňky pak byly inkubovány po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C za podmínek vzdušné vlhkosti s 5 % CO2.

Po této inkubační době následovalo u velkého počtu nádob generování hypoxických podmínek, a to jejich promýváním směsí plynu s nízkým obsahem kyslíku. Nádoby byly promývány směsí plynu, obsahující 2 % kyslíku, 5 % CO₂ a 93 % dusíku po dobu 20 sekund a ihned byly uzavřeny gumovými zátkami. Zbývající nádoby byly udržovány při vzdušné koncentraci kyslíku asi 21 %. Po tomto působení byly obě sady nádob inkubovány při teplotě 37 °C po dobu dalších 24 hodin.

V tomto bodě bylo do vybraných nádob přidáno 6 mg/ml L-glukózy nebo 6 mg/ml D-glukózy za udržování atmosférických podmínek. Nádoby s buňkami v přítomnosti L- nebo D-glukózy a za normálních nebo hypoxických podmínek pak byly inkubovány při teplotě 41 °C po dobu 2 hodin. Kontrolní nádoby bez přídavku glukózy byly také podrobeny působení tepla po dobu 2 hodin. Kromě toho ostatní nádoby, obsahující L- nebo D-glukózu, nebyly vystaveny zvýšené teplotě. K určení základní linie byly použity kultury za normálních nebo hypoxických podmínek bez přídavku glukózy, nevystavené zvýšené teplotě.

Po hypertermickém působení na vybrané nádoby byly všechny buňky inkubovány po dobu 72 hodin při teplotě 37 °C a při udržování jednotlivých atmosférických podmínek. Po 72 hodinách byl za použití mikroskopu v inverzním uspořádání určen průměrný počet buněk

-12CZ 285686 B6 na kolonii. Poté bylo médium ve všech nádobách vyměněno za více obohacené RPMI-1640, doplněné o 10 % fetálního hovězího séra. Byl určen poměr přežití a růstový poměr pro každou sadu buněk, jak znázorňuje obr. 7 až 10.

Konkrétněji obr. 7 ukazuje účinky hypertermie na růstový poměr CaOv buněk v přítomnosti Lglukózy nebo D-glukózy a v prostředí, obsahujícím kyslík. Podobně ukazuje obr. 8 účinky hypertermie na buňky za hypoxických podmínek a za přítomnosti L-glukózy a D-glukózy. Je-li L-glukóza kombinována s hypertermií, vykazují buňky dramatický pokles růstového poměru při kultivaci za normálních nebo hypoxických podmínek. Růstové poměry byly zpomaleny na 20 % io kontroly za hypoxických podmínek a asi 33 % při provádění procedury v přítomnosti kyslíku.

Ve značném kontrastu pak hypertermie bez použití L-glukózy neredukuje růstový poměr CaOv buněk pod 60 % kontrolních hodnot.

Tyto výsledky jsou podpořeny daty, získanými pro přeživší buňky a jsou graficky znázorněny na 15 obr. 9 a 10. Přežití buněk, podrobených působení tepla v přítomnosti L-glukózy bylo mnohem nižší za hypoxických podmínek, než v přítomnosti kyslíku. To opět odpovídá redukci růstových poměrů, znázorněných na obr. 7 a 8. Za hypoxických podmínek byl poměr přežití pro buňky, podrobené působení tepla v přítomnosti L-glukózy, redukován na čtvrtinu kontrolního přežití. Mimo toto srovnání byl poměr přežití pro buňky, podrobené samotnému působení tepla za 20 hypoxických podmínek téměř poloviční. Zatímco redukce poměru přežití nebyla tak výrazná za přítomnosti kyslíku, úmrtnost buněk, podrobených působení L-glukózy, byla podstatně vyšší než u buněk, podrobených ostatním způsobům.

Oproti tomu přežití CaOv buněk, podrobených působení D-glukózy a hypertermie ukazuje, že 25 oxygenace buněk vykazuje pouze slabý účinek na úmrtí buněk. Buňky, podrobené působení tepla a kultivované v přítomnosti D-glukózy za hypoxických i normálních podmínek, vykazují poměry přežití 98 % a 95 % vzhledem k hypertermii samotné. Výsledky těchto experimentů jasně ukazují, že L-glukóza zesiluje cytotoxické a cytostatické účinky hypertermických působení na nádorové buňky.

Příklad 6: L-glukóza zesiluje cytostatické a cytotoxické účinky chemoterapeutik

Lidský ovariální karcinom (CaOv)

Studie byly prováděny za účelem prokázání zesílení účinku L-glukózy na chemoterapeutika. Stejná buněčná linie nádorových buněk lidského ovariálního karcinomu, použitá v přikladu 5, byla použita i pro tyto série experimentů. Chemoterapeutikum 5-fluoruracil (5-Fu) a 5fluordeoxyuridin (FUd), oba od firmy Hoffman-La Roche, byly vybrány na základě běžnosti 40 jejich používání při nádorových terapiích.

CaOv buněčné kultury byly rozrůstány inokulací 600 buněk v 5 ml média 199, doplněného 10 % fetálního telecího séra a 40 mg/ml gentamicinu. Nádoby byly inkubovány za normálních podmínek s 5 % CO₂ při teplotě 37 °C. Po dvou dnech byla do média přidána L-glukóza ve 45 výsledné koncentraci 6 mg/ml. Do jednotlivých nádob byla ve stejnou dobu přidána různá množství 5-Fu nebo FUdR. Nádoby s jednotlivými koncentracemi chemoterapeutik pak byly inkubovány po dobu dalších dvou dní. Po této inkubaci byla předchozí směs nahrazena čerstvým médiem 199 bez glukózy nebo chemoterapeutik. Po 24 hodinách byl určen počet buněk na kolonii (za použití mikroskopu v inverzním uspořádání) a růstový poměr byl vypočten podle 50 rovnice:

růstový poměr = (počet buněk - 1)/ (počet buněk v kontrole - 1) x 100.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 11 a 12 a v tabulkách, uvedených níže.

-13CZ 285686 B6

Tabulka 2: Růstové poměry CaOv buněk v přítomnosti 5-fluoruracilu a 6 mg/ml L-glukózy

Koncentrace léčiva	Bez L-glukózy (% růstového poměru)	6 mg/ml L-glukózy (% růstového poměru)
1 pg/ml	65	28
10 pg/ml	14	5
50 pg/ml	1	-
2 pg/ml	60	38
10 pg/ml	23	11
40 pg/ml	6	2

Tabulka 3: Růstové poměry CaOv buněk v přítomnosti floxuridinu a 6 mg/ml L-glukózy

Koncentrace	Bez L-glukózy	6 mg/ml L-glukózy
léčiva	(% růstového poměru)	(% růstového poměru)
5 pg/ml	82	39
1 pg/ml	17	8
5 pg/ml	2	6

Tato data definitivně ukazují, že přídavek L-glukózy k chemoterapeutikám zesiluje jejich cytostatické a cytotoxické vlastnosti. V obou případech byl růstový poměr buněk ovariálního karcinomu redukován asi z 50 %. Významné je, že data vykazují, že ke generování ekvivalentní odpovědi bylo za přítomnosti L-glukózy nutno pouze 20 % nebo méně dávky léčiva. To by umožnilo dosažení stejných klinických účinků s mnohem menším množstvím chemoterapeutika a vedlo by k odpovídajícímu snížení zeslabujících vedlejších účinků.

Příklad 7: L-glukóza zesiluje cytostatické a cytotoxické účinky ozařování

Lidský ovariální karcinom (CaOv)

Studie byly prováděny za účelem prokázání zesílení účinku L-glukózy na terapii nádorových onemocnění ozařováním. Stejná buněčná linie nádorových buněk lidského ovariálního karcinomu, použitá v příkladu 5, byla použita i pro tyto série experimentů CaOv buňky s a bez 6 mg/ml L-glukózy byly podrobeny působení různých hladin gamma záření.

CaOv buněčné kultury byly rozrůstány inokulaci 600 buněk v 5 ml média 199, doplněného 10 % fetálního telecího séra a 40 pg/ml gentamicinu. Nádoby byly inkubovány za normálních podmínek s 5 % CO₂ při teplotě 37 °C. Po dvou dnech byla do média přidána L-glukóza ve výsledné koncentraci 6 mg/ml. Jednotlivé nádoby byly ve stejnou dobu ozářeny 8,4 rad/sec na celkových 2, 4, respektive 6 Gy. Buňky byly spočteny 48 hodin po ozáření a růstový poměr byl spočten, jak bylo uvedeno výše.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 13 a jasně ukazují, že L-glukóza zesiluje cytotoxické a cytostatické účinky terapie ozařováním na nádorové buňky. Takovéto zesílení účinků by umožnilo používat nižší hladiny záření při dosažení stejných výsledků. To by značně zmenšilo obtíže, spojené s touto terapií.

Osoby, obeznámené s technikou, by si měly pří takto popsaném reprezentativním provedení předkládaného vynálezu uvědomit, že popisy jsou zde uvedeny pouze jako příklady a že lze

-14CZ 285686 B6 v rozsahu předkládaného vynálezu vytvořit alternativní provedení, adaptace a modifikace. V souladu s tím není předkládaný vynález omezen na specifická provedení zde uvedená pro názornost.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález popisuje protinádorové prostředky, obsahující chirální monosacharidy, a způsoby jejich použití. Prostředky, vykazují cytostatické a cytotoxické vlastnosti vůči nádorovým buňkám, jsou tvořeny za použití L-izomemích forem monosacharidů. Výhodné provedení předkládaného vynálezu využívá L-izomemí formu glukózy s farmaceuticky přijatelným nosičem. Prostředky lze použít samotné nebo jako doplňky jiných forem nádorové terapie a lze je proto použít k výrobě léčiv s cytostatickými a cytotoxickými účinky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek pro léčení karcinomu, vyznačující se tím, že obsahuje směs Lglukózy; agens, jiného než je L-glukóza, vykazujícího cytotoxickou nebo cytostatickou aktivitu vůči nádorovým buňkám; a farmakologicky přijatelného nosiče pro L-glukózu a agens.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující
3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující
4. Prostředek podle nároku 1, vyznačující
5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující
6. Prostředek podle nároku 1, vyznačující
7. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se t í m , že uvedený nosič je vodný.

se tím, že agens je chemoterapeutikum se tí m , žeagensje 5-fluoruracil.

se t í m , že agensje 5-fluordeoxyuridin.

se tí m , žeagensjecis-platina.

se tí m , žeagensje taxol.