CZ282093B6

CZ282093B6 - Způsob přípravy diskrétních individuálních mikrosfér mikroorganismů

Info

Publication number: CZ282093B6
Application number: CZ942049A
Authority: CZ
Inventors: William M. Rutherford; Jack E. Allen; Herman Wade Schlameus; Donald J. Mangold; Jr. William W. Harlowe; Joseph R. Lebeda
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Priority date: 1992-02-26
Filing date: 1993-02-02
Publication date: 1997-05-14
Also published as: EP0628072A4; JPH07503375A; EP0628072B1; MX9300671A; BG98996A; DE69321219T2; US5292657A; BR9305977A; RU94042902A; HUT71198A; DE69321219D1; SK101294A3; CA2130918C; ATE171468T1; EP0628072A1; RU2096453C1; CA2130918A1; JP2683956B2; WO1993017094A1; CZ204994A3

Abstract

Sušené mikrosféry mikroorganismů, připravené na rotačním disku s použitím matrice mastné kyseliny.ŕ

Description

Způsob přípravy diskrétních individuálních mikrosfér mikroorganismů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy diskrétních individuálních mikrosfér mikroorganismů sušených na rotačním disku.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že určité mikroorganismy, jako jsou bakterie, mají potenciálně příznivý účinek při přídavku do krmiv. Bakterie například dodávají přirozenou střevní mikroflóru. Některé společnosti nabízejí na prodej přímo zkrmované mikrobiální přípravky, které obsahují žádoucí bakterie. Přímo zkrmované mikrobiální přípravky však činí určité potíže při udržování stabilního produktu. Typicky se přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek používá ve značně malém množství v přídavku ke krmivu v množství asi 1 %. Nepoužité krmivo nebo krmná přísada, obsahující přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek, se však často skladuje na farmách dlouhou dobu. Toto skladování častokrát probíhá za podmínek, v nichž se vyskytuje určitá vlhkost.

V mnoha případech je přítomno právě dostatečné množství vlhkosti, aby bylo aktivováno zahájení růstu bakterií, ale množství dosud nedostatečné kjeho podpoře. V důsledku toho bakterie zahynou a aktivita přímo zkrmovaného mikrobiálního přípravku zmizí. V některých případech antibiotika, přidávaná ke krmivu, obsahujícímu přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek, nepříznivě interagují s bakteriemi, zejména je-li přítomno malé množství vlhkosti, a bakterie opět hynou. Existuje tedy významný problém dlouhodobé skladovací stability přímo zkrmovaných mikrobiálních přípravků.

V jiném prostředí, je-li přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek přidáván například ke krmivu pro kuřata, je obvyklé materiál peletizovat a přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek přidávat před peletizací. Vlhkost z páry, používané při peletizaci, částečně aktivuje bakterie, avšak může při nedostatečném množství způsobit jejich zánik. Bakterie mohou zahynout také v důsledku tepla při peletizaci. Pak je zde také problém kyselého prostředí v žaludku, potenciálně inaktivujícího bakterie, než se reálně dostanou do střev. Existuje tedy trvalá potřeba přímo zkrmovaných mikrobiálních přípravků, které by uvolňovaly mikroorganismy pouze ve správném čase ve střevě a nikoli dříve vlivem vlhkosti nebo nepříznivých podmínek pH, jaké existují v trávicím traktu před tenkým střevem.

Pro účely tohoto vynálezu je nutno poznamenat, že volná mastná kyselina jednotlivě nezapouzdřuje mikroorganismy a netvoří mikrokapsle mikroorganismů. Místo toho tvoří produkt způsobu podle vy nálezu mikrosféry. Mikrosféra se vztahuje na matrici mastné kyseliny, v níž je zabudováno množství mikroorganismů. Je odlišná od mikrokapsle, v níž jsou zapouzdřeny jednotlivé mikroorganismy. V mikrosféře matrice mastné kyseliny funguje pro kompozit podobně vztahu mezi matricí sušenkového těsta a sušenkou s čokoládovými zlomky, kde zlomky představují skupinu mikroorganismů, jako jsou bakterie nebo kvasinky. Při způsobu podle vynálezu by mikrokapsle nefungovaly, zatímco mikrosféry fungují. Mikrosféry mají oproti individuálnímu zapouzdřování každého mikroorganismu výhodu stability a účinnějšího dávkování mikroorganismů.

Primárním účelem vynálezu je nalézt přímo zkrmované mikrobiální přípravky, vhodné k přídavku do krmivá, které obsahují mikroorganismy, obsažené v mikrosférách, vyráběných speciálním rotačním procesem s použitím volné mastné kyseliny k vytvoření kuliček.

Dalším účelem vynálezu je nalézt přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek, který je stabilní v rozsahu 3 až 6 měsíců bez významného snížení počtu organismů.

- 1 CZ 282093 B6

Dalším účelem vynálezu je nalézt způsob rotační výroby mikrosfér sušených bakterií, produkující matrici volné mastné kyseliny, v níž je obsaženo množství organismů.

Dalším účelem vynálezu je poskytnout mikrosféry sušených bakterií, vyrobené na rotačním disku, které jsou sypké a snadno zpracovatelné do krmiv.

Dalším účelem vynálezu je poskytnout mikrosféry Enterococcus faecium, Lactobacilli a kvasinek.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob přípravy diskrétních individuálních mikrosfér mikroorganismů s matricí mastné kyseliny, přičemž uvedené mikroorganismy jsou uloženy v matrici mastné kyseliny, jehož podstata spočívá v tom, že se připraví první proud suroviny taveniny mastných kyselin C|₂ až C₂₄, připraví se druhý proud suroviny kultury mikroorganismů, zvlášť se přivádí uvedený proud suroviny kultury a uvedený proud suroviny taveniny mastných kyselin do zařízení s rotačním diskem za vzniku směsi obsahující 50 až asi 90 % hmotnostních taveniny mastné kyseliny a zpracuje se na zařízení s rotačním diskem za vzniku mikrosfér mikroorganismů s matricí sypké mastné kyseliny.

Stručný přehled obrázků na výkresech

Obr. 1, 2 a 3 graficky znázorňují stabilitu mikrosfér kmenů s použitím kyseliny stearové jako volné mastné kyseliny.

Obr. 4, 5 a 6 ukazují v blokovém schématu provedení vynálezu.

Obr. 7 znázorňuje pomocí schematického diagramu další systém toku krmivá pro použití podle vynálezu.

Vynález se týká lyofilizovaných mikrosfér mikroorganismů, zahrnujících houby, jako jsou kvasinky, a také zahrnujících bakterie, zpracovaných na rotačním disku. Organismy jsou výhodně bakterie. Existují tři významné a důležité aspekty vynálezu, které jej odlišují od dřívějších patentů na zapouzdřené bakterie. Především jde o charakter produktu, tj. mikrosféry, a v druhé řadě se jedná o volnou mastnou kyselinu. Za třetí se jedná o charakter procesu na rotačním disku. Běžné procesy používají obvyklou techniku sprejového sušení, nikoli produkci mikrosfér na rotačním disku. Spolupůsobením těchto tří zřetelných znaků se získává vysoce stabilní přímo zkrmovaný mikrobiální přípravek podle vynálezu. Nejsou-li tyto znaky přítomny, nemusí být příznivých účinků podle vynálezu dosaženo.

Výhodnou matricí pro vytvoření mikrosfér je volná mastná kyselina Ci₂ až C₂₄. Je sice možno použít směsí mastných kyselin, ale výhodné je používat jednu čistou volnou mastnou kyselinu. Je rovněž výhodné, je-li volnou mastnou kyselinou kyselina nasycená; nejvýhodnější je kyselina stearová.

Obecně řečeno, je důležité, aby mastná kyselina měla teplotu tání méně než 75 °C, výhodně v rozmezí 40 až 75 °C. Musí být samozřejmě tuhá za teploty místnosti, aby mohla být účinnou matricí. Tyto požadavky splňují všechny volné mastné kyseliny v rozsahu dosud uvedeného chemického popisu.

Přesný mikroorganismus pro použití v mikrosférách není kritický. Nicméně konkrétní zvolený mikroorganismus závisí na vyráběném přímo zkrmovaném mikrobiálním přípravku. Obecně

-2CZ 282093 B6 řečeno je pro použití podle vynálezu výhodnou bakterií Enterococcus faecium, ale je možno použít i jiné. Je tedy možno rovněž použít jiné bakterie jako je Lactobacillus, Bacillus atd. Stejně jako jednotlivé kmeny je možno použít směsi kmenů. Rovněž je možno použít houby a kvasinky. Za účelem zvýšení stability produktu se bakterie nejčastěji před přidáním do produktu lyofilizují. Mohou být pak oživeny přídavkem vlhkosti.

V mikrosférách, vyrobených podle dále popsaného postupu, částice obvykle obsahují asi 50 až více než 90 % hmotnostních komponenty mastné kyseliny a zbytek jsou mikroorganismy, obvykle bakteriální kultura. Výhodné rozmezí je asi 60 až asi 75 % mastné kyseliny. Použije-li se příliš málo mastné kyseliny, bude povlak nevhodný pro ochranu. Na druhé straně, použije-li se jí příliš mnoho, bude povlak příliš tlustý a nedojde ke správnému uvolňování ve střevech.

Způsob výroby mikrosfér podle vynálezu používá rotačního disku. Obecně řečeno se při technologii rotačního disku suspenze mikroorganismů, často bakterií, a komponent mastné kyseliny důkladně smísí a směs se přivádí rovnoměrnou rychlostí do středu rotujícího disku z nerezavějící oceli. V důsledku odstředivé síly je pak směs vrhána směrem ven. Pak je sbírána v chladicí komoře, udržované na podmínkách místnosti nebo mírně nižších, kalibrována a připravována k balení.

Zatímco zpracování na rotačním disku je známo, není známo pro použití u mikroorganismů k přípravě mikrosfér. Obecně lze popis zapouzdřování materiálů na rotačním disku nalézt v práci Johnsona a d. z Southwest Research Institute of San Antonio v Joumal of Gas Chromatography, říjen 1965, str. 345-347. Kromě toho je zařízení s rotačním diskem, vhodné pro použití podle vynálezu, detailně popsáno ve Sparksově patentu USA č. 4,675.140, vydaném 23. 6. 1987, o názvu Method For Coating Particles or Liquid Droplets, na kteroužto literaturu se zde tímto odkazuje.

Je nutno poznamenat, že zpracování mikrosfér na rotačním disku produkuje produkt zřetelně odlišný od běžného sušení ve sprejové věži. Při běžném sušení ve sprejové věži mají částice tendenci se shlukovat a vzniká nepravidelný povlak, což má za následek významné ovlivnění stability produktu pravděpodobně na dny až týdny. Při rotačním zpracování mikrosfér, zejména s přídavkem mastných kyselin, podle vynálezu bude stabilita získaných mikroorganismů, zejména bakterií, i při vystavení určitému množství vlhkosti a antibiotik, od tří do šesti měsíců.

Používá-li se matrice mikrosfér podle vynálezu z volné mastné kyseliny ve výše uvedených rozmezích, může se postup, nejčastěji s použitím 4 rotačního disku, provádět s rychlostí otáčení 2000 až 4000 min¹, výhodně asi 2500 až 3200 min'¹ a přísunem suroviny rychlostí 50 až 200 gmin'¹. Výhodné podmínky, v současnosti známé, zahrnují použití kyseliny stearové, použití Enterococcus faecium, čtyřpalcový rotační disk, otáčky 3000 min'¹ a přísun 100 gmin’¹ suspenze bakterií v kyselině stearové o složení 35 % bakterií, 65 % kyseliny stearové. Za těchto podmínek se získá produkt o velikosti částic 75 až 300 pm, výhodně pod 250 pm.

Obrázky 1, 2 a 3 budou popsány v souvislosti s příklady 1 až 4.

Obrázky 4 až 6 schematicky znázorňují výhodné znaky postupu podle vynálezu. Základní postup je podobný postupu podle základní přihlášky na výrobu mikrosfér. Velmi výhodným znakem však je oddělený přísun kultury a roztavené mastné kyseliny, při němž je kultura vystavena teplu pouze po velmi krátkou dobu.

Obr. 7 znázorňuje další způsob odděleného přísunu podle vynálezu.

Další modifikace systému zahrnuje přídavek vlhkost absorbující kolony pro roztavenou volnou mastnou kyselinu a sušicí komory pro bakteriální kulturu. Tyto modifikace zvýší výtěžek

-3 CZ 282093 B6 životaschopných mikroorganismů v mikrosférách a pravděpodobně sníží výrobní náklady.

Obr. 4 znázorňuje základní postup. Kyselina stearová se vloží do tavícího kotle 10 v množství dostatečném k několika hodinovému provozu. V kotli se roztaví. Roztavená hmota se pak čerpá do menší směšovací nádoby 12, kde se kyselina stearová mísí s koncentrátem kultury, jak je znázorněno v nádobách 14 a 16. V nádobě 12 je obsaženo pouze množství směsi, postačující k provozu po dobu přibližně 20 min, a tak je sníženo vystavení bakterií vyšší teplotě (60 °C), nutné k udržení matrice v roztaveném stavu. Druhá mísící nádoba 16 pracuje simultánně tak, že při snížení obsahu nádoby 14 se může nová dávka začít mísit v nádobě 16. Nádoby 14 a 16 obsahují míchadla (neznázoměná) k rovnoměrnému rozptýlení kultury. Při práci v takovémto systému míšení dávek je možno na disk 18 dodávat nepřetržitý přísun suroviny. Obě mísící nádoby 14 a 16 jsou umístěny v olejové lázni s konstantní teplotou k zajištění roztaveného stavu materiálu matrice po celou dobu výroby.

Směs je čerpána čerpadlem 20 a potrubím 22 do sběrné komory 24. Spodní sekce 26 sběrné komory 24 je ohnuta tak, že se mikrosféry odvalují po stěnách dolů do potrubí 28, kde jsou proudem vzduchu neseny do cyklonového sběrače 30. Mikrosféry jsou zachyceny v cyklonovém sběrači 30 a transportovány na kalibrační síta 32, kde jsou oddělovány nadsítné a příliš malé částice a recyklovány do taviči nádoby 12.

Obr. 5 znázorňuje modifikaci základního postupu podle obr. 4, kde jsou nádoby 14 a 16 na kulturu v olejové lázni nahrazeny kontinuálním dávkovačem 34 pevné kultury. Je přidána také sušička 42, dodávající suchý vzduch do násypky kultury nebo sběrné komory 24. Tyto modifikace, jak je znázorněno na obr. 6, odstraňují nadbytečnou vlhkost před vytvořením mikrosfér. Postup podle obr. 6, podobný jako podle obr. 5, opět využívá výhody předběžného roztavení volné mastné kyseliny a jejího smísení s kulturou těsně před přenesením na rotační disk 18 za účelem minimalizace vystavení teplu. Každý z postupů, znázorněných na obr. 4, 5 a 6, má zřetelné výhody a použití postupů, znázorněných na obr. 5 a 6, je zvlášť výhodné pro tepelně citlivé materiály.

Obr. 7 znázorňuje další možnost úspěšné tvorby mikrosfér bez tepelného poškození bakterií. Pevný materiál se přivádí vnitřní trubkou 42 a kapalná mastná kyselina vnější trubkou 44. Mezi oběma proudy suroviny je ponechán prostor 46, aby nedošlo ke kontaktu před stykem s povrchem disku 18. Jak se disk 18 otáčí, je pevný podíl vrhán směrem ven, přichází do styku s povlakovým materiálem z mastné kyseliny a cestou k okraji rotačního disku 18 se povléká.

Tento systém je zvlášť vhodný pro výrobu mikrosfér tepelně citlivého materiálu v obalu z roztaveného materiálu, neboť doba kontaktu s povlakem v roztavené formě je velmi krátká.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je blíže osvětlen na uvedených příkladech, které však neomezují jeho rozsah.

Příklad 1

Příklad 1 se vztahuje kobr. 1. Ukazuje stabilitu produktu ze dvou různých kmenů Enterococcus faecium při teplotách 4 °C a 27 °C. Jak je znázorněno na obr. 1, ukazuje stabilitu mikrosfér kmenů Enterococcus faecium při postupu s rotačním diskem a s použitím kyseliny stearové s obsahem kultury 35 % hmotnostních. Postup je znázorněn na obr. 4. Použijí se výše popsané podmínky, tj. suspenze bakterií v kyselině stearové 35/65 při teplotě 60 °C, čtyřpalcový rotační disk, otáčky 3000 min'¹ a přísun 100 gmin’¹. Kultura se povléká matricí za vzniku mikrosféry, plní do teplem zatavených sáčků s parní bariérou a každý týden se odebírají destruktivní vzorky

-4CZ 282093 B6 pro stanovení CFU. Je patrné, že produkt podle vynálezu si podržuje vynikající počty organismů tvořících kolonie (CFU) až do dob skladování až 70 dní.

Příklad 2

Příklad 2 je nutno interpretovat v souvislosti s obr. 2. Obrázek ukazuje stabilitu jednotlivých zapouzdřených kmenů při smísení s typickým krmivém v přítomnosti tří drůbežích antibiotik.

Krmivo sestává z těchto složek:

jemně drcená kukuřice	54%
sojová mouka	26%
rybí moučka	2%
fosforečnan divápenatý	1,5 %
vápenec	1 %
sojový olej	5,5 %
obsah vlhkosti	12%

Antibiotika jsou přidána v tomto hmotnostním množství: Deccox 6 % (454 ppm), Salinomycin (50 ppm) a monensin sodný (120 ppm).

Kultura se ke směsi přidá v množství, vedoucímu k přibližně 1.10⁶ CFU/g krmivá. Krmivo se plní do teplem zatavených sáčků a inkubuje při teplotě místnosti. Jednou týdně se odebírají vzorky pro stanovení CFU. Graf na obr. 2 ilustruje výtečnou stabilitu.

Příklad 3

Příklad 3 je třeba interpretovat v souvislosti sobr. 3. Ukazuje stabilitu zapouzdřené směsi Enterococcus faecium v krmivu v přítomnosti různých antibiotik. Krmivo sestává ze 60 % jemně drcené kukuřice, 38 % sojové mouky a 2 % vápence s obsahem vlhkosti asi 14 %. Kultura se přidává do množství přibližně 10⁶ CFU/g krmivá apromísí. Desetilibrové alikvotní díly se skladují v zatavených sáčcích při 20 °C a po dobu 16 týdnů se jednou týdně odebírají vzorky. Antibiotika jsou v krmivu obsažena v tomto množství:

bacitracin methylendisalicylát	50 g/t
carbadox	50 g/t
chlortetracyklin	200 g/t
lasalocid	30 g/t
lincomycin	100 g/t
neomycin	140 g/t
oxytetracyklin	150 g/t
sulfamethazin	100 g/t
tylosin	100 g/t
virginiamycin	20 g/t
ASP250	100 g/t

V tabulce 1 jsou uvedeny časy pro 1 log ztráty počtu jednotek tvořících kolonie (CFU).

Tabulka 1

Čas ve dnech pro ztrátu 1 log počtu CFU při 20 °C v mačkaném krmivu se 14 % vlhkosti antibiotikum doba skladování(dny)

kontrola	103
bacitracin	88
carbadox	54
chlortetracyklin	60
lasalocid	57
lincomycin	75
neomycin	53
oxytetracyklin	59
sulfamethazin	62
tylosin	52
virginiamycin	112
ASP250	67
furadox	53

Příklad 4

V příkladu 4 se stanovuje stabilita produktu pro použití jako kuřecí krmivo. Podmínky mikroenkapsulace jsou jak vý še uvedeno. Dále se použijí tyto podmínky:

surový protein ne méně než surový tuk ne méně než surová vláknina ne více než

18,0%

5,0 %

6,0 %

Pelety s antibiotikem a bez něho (50 g/t CTC) se připraví za těchto podmínek a s těmito přísadami:

Kukuřice, SBM, syrovátka, sojový olej, fosforečnan divápenatý, vápenec, stopový minerální premix, vitaminový premix, selen, síran měďnatý. Kultura se přidává v množství přibližně 5.10⁵CFU/g krmivá (100 až 150 g/t).

Teplota kondicionace je 70 °C a pelety za tryskou mají 78 °C.

Pelety se skladují v nezatavených pytlích a jednou týdně se odebírají vzorky pro stanovení CFU.

V žádném případě nebyla podmínkami peletizace nepříznivě ovlivněna stabilita peletizovaného produktu. Konkrétně vykazoval peletizovaný produkt stejnou stabilitu jako produkt nepeletizovaný.

Příklad 5

Příklad 5 osvětluje provedení postupu, popsaného v příkladu 1, avšak bez kmene Enterococcus faecium a s mikrosférami s povlakem kyseliny stearové jako volné mastné kyseliny na kvasinkách. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Mikrosféry, získané postupem, shrnutým v tabulce 2, obsahují kvasinky s počtem životaschopných buněk, uvedeným v tabulce. Skladují se při teplotě místnosti 84 dny. Po skončení

-6CZ 282093 B6 doby skladování se zjišťují životaschopné kvasinky. V 84. den je počet životaschopných kvasinek v mikrosférách 1,3.10⁹ CFU/g. Mírně vyšší výtěžek je důsledkem normální diference v odebírání atestování mikrosfér. Vzorek mikrosfér s kvasinkami (0,841 g) se smísí s2270 g typického drůbežího krmivá a skladuje při teplotě místnosti. Drůbeží krmivo obsahuje 17 % vlhkosti a připravuje se, jak uvedeno výše v příkladu 2.

Na základě počátečních počtů mikrosfér 5,3.10⁸ CFU/g vychází při započtení poměru ředění počet 1,96.10⁵ CFU/g. Po skladování po dobu 84 dnů se krmivo testuje na životaschopné kvasinky. V 84. dni je počet kvasinek 7.10⁴ CFU/g krmivá.

Příklad 6

Postup výroby mikrosfér podle příkladu 1 se provádí s těmito modifikacemi:

1) kmeny rodu Lactobacillus a druhu L. plantarum nebo L. caseii,

2) bakteriální kultura se připravuje s inklusním poměrem 2 až 40 %, výhodně asi 30 %,

3) bakteriální kultura se přivádí do roztavené kyseliny stearové těsně před stykem se zvlákňovacím diskem, jak načrtnuto na obr. 4,

4) je třeba dbát na ochranu bakteriální kultury proti vysoké vlhkosti, například vyšší než 40 %, během skladování a zpracování, použitím modifikace podle obr. 5,

5) je třeba dbát o udržování teploty vzduchu na asi 80 °F nebo méně a vlhkosti v oblasti sběru mikrosfér asi 60 % nebo méně.

Další experimenty, například jako v příkladu 2, je možno provádět s mikrosférami rodu Lactobacillus a druhů L. plantarum, L. acidophilus nebo L. caseii. Při takovém zpracování se očekává, že organismy ve formě mikrosfér si podrží výbornou schopnost přežití se ztrátou životnosti méně než l log počtu jednotek tvořících kolonie (CFU) do dob skladování až 70 dní. Rovněž se očekává, že organismy ve forrňě mikrosfér při smísení s typickým drůbežím krmivém si uchovají vynikající schopnost přežití se ztrátou životnosti menší než 1 log CFU do dob skladování až 45 dní.

Claims

1. Způsob přípravy diskrétních individuálních mikrosfér mikroorganismů s matricí mastné kyseliny, přičemž uvedené mikroorganismy jsou uloženy v matrici mastné kyseliny, vyznačující se tím, že se připraví první proud suroviny taveniny mastných kyselin C_!2 až C₂₄, připraví se druhý proud suroviny kultury mikroorganismů, zvlášť se přivádí uvedený proud suroviny kultury a uvedený proud suroviny taveniny mastných kyselin do zařízení s rotačním diskem za vzniku směsi obsahující 50 až asi 90 % hmotnostních uvedené taveniny mastných kyselin a uvedená směs se zpracovává na uvedeném zařízení s rotačním diskem za vzniku sypkých mikrosfér mikroorganismů s matricí mastné kyseliny.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rotační disk se otáčí rychlostí 2000 až 4000 min’¹.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rotační disk se otáčí rychlostí 2500 až 3200 min'¹.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rychlost podávání materiálu do zařízení s rotačním diskem je 50 až 200 gmin'¹.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že mastnou kyselinou je kyselina stearová.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se faecium.

tím, že bakterií je Enterococcus

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující uchovávají odděleně do doby styku s diskem.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující uvádějí před sty kem s diskem do vzájemného mikroorganismu.

se tím, že se první a druhá surovina se tím, že se první a druhá surovina styku na dobu zachovávající životnost

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se první a druhá surovina uvádějí do vzájemného styku na méně než jednu minutu před stykem s diskem uvedeného zařízení s rotačním diskem.