CZ280553B6

CZ280553B6 - Kmen Mycelium sterilae MS 2929 produkující cyklosporiny submerzním způsobem fermentace

Info

Publication number: CZ280553B6
Application number: CZ942089A
Authority: CZ
Inventors: Josef Rndr. Satke; Vladimír Ing. Csc. Maťha; Alexandr Rndr. Csc. Jegorov; Josef Ing. Stuchlík; Milan Ing. Novotný; Iva Ing. Porazilová
Original assignee: Galena, A.S.
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 1996-02-14
Also published as: CZ208994A3

Abstract

Nový vysokoprodukční kmen mikroorganismu Mycelium sterilae MS 2929, využitelný pro výrobu cyklosporinů, zejména cyklosporinu A, submerzním způsobem fermentace. Cyklosporin A je substancí pro výrobu imunosupresivních léčiv. ŕ

Description

Mycelium sterilae MS 2929 produkující cyklosporiny submerzním způsobem fermentace

Oblast techniky

Vynález se týká nového kmene Mycelium sterilae MS 2929, produkujícího cyklosporiny v podmínkách submerzní fermentace. Cyklosporiny jsou cyklické neutrální, nepolární undekapeptidy mikrobiálního původu. V současné době je známo 25 různých cyklosporinů, označených písmeny A - Z (Helv. Chim. Acta 70, 13 /1977/). Z klinického hlediska je nejdůležitější cyklosporin A, který se používá pro své imunosupresní účinky v oblasti transplantační chirurgie a při léčbě autoimunitních chorob.

Dosavadní stav techniky

Cyklosporiny jsou produkovány celou řadou divokých kmenů vláknitých hub (Sydowia 39, 22 /1986/, Microbios Letters 45, 6 5 /1990/). Výroba cyklosporinů vyžaduje vyšlechtění a stabilizaci vysokoprodukčního kmene, který si dlouhodobě zachovává standardní produkční schopnosti. Z rešerše patentové literatury vyplývá, že pro průmyslové využití byly vyšlechtěny vysokoprodukční kmeny Cylindrocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (švýcarský patent č.589716), Fusarium solani, MCI - 549, MCI - 1550 (japonský patent č.8263093), Tolypocladium inflatum Gams, NRRL 8044 (švýcarský patent č.603790), Tolypocladium terricola, CCEB 2-201 M (československý patent č.2624).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je nový kmen Mycelium sterilae MS 2929 uložený pod číslem 8184 v Mezinárodní sbírce mikroorganismů (CCM) Masarykovy university v Brně. Předmětný kmen byl vyšlechtěn opakovanou mutací původního kmene izolovaného ze skleníkové populace infikovaných larev komárů Culex pipiens. Výchozí izolát byl po přeočkováni na syntetické médium ztužené agarem nestálý a spontánně disocioval na bílé neprodukční a fialově pigmentované produkční formy.

Pigmentové kolonie byly použity jako výchozí materiál pro přípravu nového vysokoprodukčního kmene Mycelium sterilae MS 2929. Cílem šlechtění bylo vytvořit vysokoprodukční kmen, nesoucí takový morfologický znak, který je charakterizovaný vysokým stupněm trofické závislosti mezi C-složkou média a produkcí cyklosporinů, aby již po jedné pasáži na kultivačním médiu, obsahujícím nevhodný C-zdroj došlo k disociaci kmene na neprodukční morfologicky odlišné formy.

Homogenizovaná primární submerzní kultura pigmentující formy divokého kmene byla nejprve exponována UV zářením o výkonu 30 J.m²-s^-1 po dobu 300 sekund. Přežívající hyfové částice byly regenerovány na agarem ztužených chudých minerálních médiích. Pigmentovaní mutanti, produkující cyklosporiny v koncentraci vyšší než 250 mg.l^-1 produkčního média, byli pasážováni na minerálním médiu s vysokým obsahem monosacharidu a pouze takoví mutanti, kteří na tomto médiu revertovali do neprodukčních světlých forem,

-1CZ 280553 B6 byli použiti jako výchozí materiál pro další šlechtění. Takto vybrané kmeny byly dále vystaveny působení nitrosoguanidinu po dobu 60 minut. Z následného rozsevu byli opět vybráni ti vysokoprodukční pigmentovaní mutanti, kteří na bohatém médiu revertovali do světlých neprodukčních forem. Tito mutanti byli opětovně vystaveni UV záření o stejné intenzitě po dobu 600 sekund, kdy přežívalo méně než 0.1 % hyfálních částic, které byly opět testovány na produkci cyklosporinů a morfologickou stabilitu na bohatém médiu a opět mutovány pomocí nitrosoguanidinu. Celý cyklus byl za stejných podmínek opakován čtyřikrát po sobě.

Získaní finální mutanti byli stabilizováni na minerálním agarem ztuženého médiu s 0.3 % kvasničného autolyzátu při 25 °C. Stabilizovaní mutanti byli otestováni v podmínkách submerzní kultivace na produkci cyklosporinů a morfologickou stabilitu při použití bohatých C,N-médií. Na základě výsledků byl jako nejvhodnější vybrán mutant Mycelium sterilae MS 2929, který vykazuje vysoké produkční schopnosti v podmínkách submerzní fermentace a vysokou schopnost revertovat v neprodukční formu při použití syntetického média, obsahujícího jako jediný C-zdroj monosacharidy, zejména glukózu a fruktózu.

Nový kmen Mycelium sterilae MS 2929 je charakterizován výrazně zpomaleným růstem. Na sladinovém agaru s 0.3 % kvasničného autolyzátu tvoří kmen tmavě pigmentové kolonie, dosahující po 10 dnech kultivace při 25 °C průměru 4 až 6 mm. Povrch kolonií je radiálně vrásčitý, lesklého až sametového vzhledu, s tendencí tvořit substrátové mycelium, spíše suchý, bez tvorby krůpějí nebo jiných forem exsudátu. Kolonie jsou černofialové až černé a pigment je produkován i do okolního kultivačního média.

Na sladinovém agaru s 0.3 % kvasničného autolyzátu vytváří kmen nepravidelně zduřelé hyfy, připomínající chlamydospory, nevytváří konidiofory ani konidie, patrná jsou pouze konidiím podobná terminální apresoria. V submerzní kultuře tvoří kmen sterilní hyfy, které se rozpadají v tvarově variabilní arthrosporoidní hyfová tělíska, tvorba apresorií je redukována. Charakteristickým znakem nového kmene Mycelium sterilae MS 2929 je jeho morfologická nestabilita při kultivaci na takových médiích, která obsahují jako jediný zdroj uhlíku monosacharidy, například glukózu nebo fruktózu. Na těchto médiích se kmen obvykle již po první pasáži zvrhává na nízkoprodukční šedavé formy, které po 3 až 7 pasážích, v závislosti na složení kultivačního média, přecházejí ireverzibilně na bílé, v podmínkách submerzní kultivace, neprodukční formy. Na médiích, jejichž uhlíkatý zdroj je tvořen disacharidy nebo polysacharidy, například maltózou, sacharózou, dextrózou a podobně, si kmen zachovává své morfologické i produkční vlastnosti i po dlouhodobém pasážování.

Od původního divokého kmene se Mycelium sterilae MS 2929 liší závislostí na uhlíkatém zdroji kultivačního média, retardovaným růstem, zbarvením, extracelulární produkcí černého pigmentu a vysokou a stálou produkcí cyklosporinů v podmínkách submerzní fermentace.

Vlastnosti nového kmene Mycelium sterilae MS 2929 umožňují jeho použití k výrobě cyklosporinů, zejména cyklosporinu A v podmínkách submerzní fermentace.

-2CZ 280553 B6

Produkční vlastnosti nového kmene jsou uvedeny v následujících příkladech. Uvedené příklady pouze ilustrují produkční aktivitu kmene Mycelium starilae MS 2929 a v žádném případě neomezují jeho další použití.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Z 18 dnů staré kultury kultivované na tuhém sporulačním médiu o složení (g.l^-1): malt extract Difco 20.0, vitamin free casamino acids Difco 4.0, pH 6.0, při teplotě 24 °C se připraví suspenze inokulačních částic ve fyziologickém roztoku. Touto suspenzí, která obsahuje 10⁴ až 10⁵ inokulačních částic v 1 ml, se zaočkují 250 ml Erlenmeyerovy baňky s předem vysterelizovaným inokulačním médiem o složení (g.l^-1): sacharóza 30.0, kukuřičný extrakt přáškový 15.0, enzymatický hydrolyzát kaseinu 15.0, NH₄H₂PO₄ 10.0, MgSO₄ . 7 H₂O 0.2, pH 6.0, vždy 8 ml suspenze na 60 ml média. Erlenmeyerovy baňky se kultivují na rotační třepačce po dobu 96 hodin při teplotě 24 °C, 200 otáčkách za minutu a excentricitě 5.5 cm.

Inokulum se po skončení inokulační fáze přeočkuje do předem připraveného vysterilizovaného produkčního média o složení (g.l^-1): sacharóza 60.0, enzymatický hydrolyzát kaseinu 40.0, NH₄H₂PO₄ 4.0, (NH₄)₂SO₄ 4.0, KC1 1.0, NaCl 1.0, CaCl₂ 0.2, MgSO₄ . 7 H₂0 0.2, pH 6.0 ve 250 ml Erlenmeyerových baňkách, vždy 6 ml inokula na 60 ml produkčního média. Kultivace takto naočkovaných Erlenmeyerových baněk se realizuje na rotační třepačce při teplotě 24 °C, 200 otáčkách za minutu a excentricitě 5.5 cm.

Po 10 dnech kultivace se stanoví produkce jednotlivých cyklosporinů v methanolickém extraktu mycelia metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Vyfermentovaná kultivační tekutina se centrifuguje po dobu 10 minut při 4 000 otáčkách za minutu. Supernatant se oddělí a sediment, tvořený houbovým myceliem, se extrahuje v methanolu po dobu 10 minut v ultrazvukové lázni.

Produkce cyklosporinů činila 2.492 mg v 1 ml fermentační tekutiny, z toho bylo 62.0 % cyklosporinů A, 17.3 % cyklosporinů B a 20.1 % cyklosporinů C. Produkce cyklosporinů D,F a G byla ve stopách. Suchá hmotnost mycelia byla 34.6 g vil fermentační tekutiny.

Příklad 2

Submerznín inokulem, připraveným stejným způsobem jako v příkladu 1, se zaočkuje předem vysterilizované produkční médium o složení (g.l^-1): fruktózový sirup 60.0, enzymatický fydrolyzát kaseinu 40.0, NH₄H₂PO₄ 6.0, MgSO₄ . 7 H₂O 0.2, pH 5.8, v 1 000 ml

-3CZ 280553 B6

Erlenmeyerových baňkách, vždy 20 ml inokula na 200 ml média. Tyto Erlenmeyerovy baňky se kultivují na rotační třepačce při teplotě 24 °C, 200 otáčkách za minutu a excentricitě 5.5 cm. Během submerzní fermentace se provede třetí a šestý den trvání produkční fáze dávkování sterilním fruktózovým sirupem, vždy v množství 30 g fruktózového sirupu na 1 1 produkčního média.

Po 10 dnech kultivace se připraví methanolický extrakt mycelia tak, jak je uvedeno v příkladu 1.

Produkce cyklosporinů činila 2.688 mg v 1 ml fermentační tekutiny, z toho bylo 73.8 % cyklosporinů A, 12.3 % cyklosporinů B a 13.4 % cyklosporinů C, ostatní cyklosporiny byly produkovány ve stopách. Suchá hmotnost mycelia byla 28.6 g v 1 1 fermentační tekutiny.

Příklad 3

Submerznín inokulem, připraveným analogickým způsobem jako v příkladu 1, se zaočkuje předem vysterilizované produkční médium o složení (g.l^-1): sorbit 40.0, dextróza 40.0, enzymatický hydrolyzát kaseinu 10.0, NH₄H₂PO₄ 4.0, (NH₄)₂SO₄ 4.0, KC1 0.4, MgSO₄. 7 H₂O 0.4, pH 5.6, v 1 000 ml laboratorním fermentoru, v množství 60 ml inokula na 600 ml produkčního média. Submerzní fermetnace probíhá při teplotě 24 °C, 280 otáčkách míchadla za minutu, vzdušnění 0.4 wm a přetlaku 10 kPa. Během kultivace je mezi 80 až 140 kultivační hodinou kontinuálně dávkován sterilní roztok D,L-valinu tak, že výsledná dávka tohoto činí po skončení dávkování 8.0 g v 1 1 fermentační tekutiny.

Po deseti dnech trvání produkční fáze se připraví methanolický extrakt mycelia obdobným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1.

Produkce cyklosporinů činila 2.341 mg v 1 ml fermentační tekutiny, z toho 82.7 % cyklosporinů A, 8.6 % cyklosporinů B a 8.0 % cyklosporinů C, ostatní cyklosporiny se vyskytovaly ve stopách. Suchá hmotnost mycelia byly 21.7 g vil fermentační tekutiny.

Průmyslová využitelnost

Postup podle vynálezu je určen pro průmyslovou výrobu cyklosporinů, zejména cyklosporinů A, který je substancí pro výrobu imunosupresních léčiv. Submerzní fermentace je běžnou průmyslovou výrobní metodou.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Kmen Mycelium sterilae MS 2929, produkující cyklosporiny submerznín způsobem fermentace, který je uložený pod číslem 8184 Mezinárodní sbírce mikroorganismů (CCM) Masarykovy univerzity Brně.