CZ265896A3

CZ265896A3 - Tryptase inhibitor, its use and pharmaceutical compositions containing thereof

Info

Publication number: CZ265896A3
Application number: CZ962658A
Authority: CZ
Inventors: Hiroshi Kido; Masato Tashiro; Shozaburo Sekido
Original assignee: Tokyo Tanabe Co
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1995-03-20
Publication date: 1997-06-11
Also published as: EP0804930A4; EP0804930A1; FI963753A0; FI963753A; CA2186111A1; RO113431B1; HUT75660A; WO1995025539A1; BR9507165A; CN1144488A; KR970701561A; AU1961195A; SK119896A3; BG100835A; NZ282488A; HU9602598D0; US5900401A; AU689559B2; PL316444A1

Description

Oblast techniky , 0130Q

J

Předkládaný vynález se týká činidla pro léčbu nebo pr^fýlUx? θ θ virových onemocnění, jehož aktivní složkou je antileukoproteáza (vizf'3 níže, ALP). Konkrétněji se týká léčebného nebo profylaktického činidla, obsahujícího ALP jako aktivní složku, určeného pro virová onemocnění dýchacího ústrojí, vyvolaná viry, aktivovanými tryptázou Clara. ·

Dosavadní stav techniky

ALP je přítomna ve vnějších sekretech, jako v bronchiáíní mukóze, slinách, seminální tekutině, cervikáiní mukóze a nosním sekretu. Jedná se o inhibitor serinproteázy o molekulové hmotnosti 12 kDa, skládající se 107 aminokyselinových zbytku, který je považován za totožný s inhibitorem sekreční leukoproteázy (secretory leukoprotease inhibitor, SLPI), inhibitorem bronchiáíní mukózy (bronchial mucous inhibitor), inhibitorem mukózní proteázy (mucous protease inhibitor) a lidským seminálním inhibitorem (human seminal inhibitor). Pro ALP již byla stanovena její aminokyselinová sekvence (publikace W086/03497) a isolován a sekvencován byl také gen této bílkoviny (publikace W086/03519).

Z homologních srovnání je známé, že ALP obsahuje dvě inhibiční oblasti (domény). Jednou je oblast N-konce, která je vyžadována k inhibici různých enzymů podobných trypsinu, a druhou je C-koncová oblast, o které se na základě výzkumu rentgenové analýzy krystalové struktury předpokládá, že se váže na chymotrypsin a vykazuje také aktivitu, inhibující elastázu. [M. G. Gruetter, The EMBO Journal 7(2), 345-351 (1988)].

- 2 Vzhledem k tomu, že ALP inhibuje enzymy podobné chymotrypsinu, jako je leukocytární elastáza a kathepsin G, a rovněž enzymy podobné trypsinu, jako trypsin, plasmin, kailikrein, thrombin a podobně, je spojována s rozedmou (emfyzémem), arthritidou, glomerulární nefritidou, periodontitis (zánětem závěsného aparátu), svalovou atrofií, pronikáním tumoru (tumor invasion) (publikace WO 86/03497), chronickou bronchitidou a chronickým cervikálním zánětem (Japonský pat. spis, dosud nepodrobený průzkumu, c. 62-259591). Ovšem role ALP ve virových onemocněních je stále neznámá. .·.

Virové infekce probíhají v krocích 1) zachycení viru na membránové receptory cílových buněk, 2)' fúze membrán mezi obalem viru a membránou cílové buňky a 3) transfuze virového genomu do cílové buňky. V kroku 2) membránové fúze musejí být glykoproteinové prekursory virového obalu přeměněny na zralé formy glykoproteinů virového obalu s aktivitou membránové fúze. Po této přeměně prostřednictvím proteolýzy virus získává aktivitu membránové fúze mezi obalem viru a buněčnými membránami v dýchacím ústrojí. Prekursory obalového glykoproteinů jsou hemaglutinin (HA) viru chřipky a segment F_o viru Sendai (Paramyxovirus parachřipkového viru typu I) a jejich proteolytické štěpení je zásadní pro expresi (projevení se) virové infekčnosti a pro replikaci viru.

Autorům tohoto vynálezu se podařilo isolovat z krysích plic novou serinovou proteázu, specifickou vůči argininu, která byla nazvána traptáza Clara (J. Biol. Chem. 267, 13573-13579, 1992).

j ϊ

Tryptáza Clara štěpí segment F_o z viru Sendai na dvě podjednotky F, a Fj a aktivuje infekčnost viru in vitro v závislosti na dávce. Kromě toho je známé, že protilátky vůči tryptáze Clara inhibují proteolytickou aktivitu viru Sendai v krysích plících, což vyvolává supresi (potlačení)

- 3 replikace viru a patologických změn v krysích plících (Journal of Virology 66, 7211-7216, 1992).

Tryptáza Clara kromě toho štěpí i hemaglutinin (HA) viru chřipky A/Aichi/2/68 (H3N2) na HA, a HA₂ (J. Biol. Chem. 267, 13573-13579,

1992) .

Tryptáze Clara je tedy považována za zásadní hostitelský faktor, který vymezuje patogenitu takových infekčních virů v dýchacím ústrojí.

Autoři vynálezu již dříve zjistili, že piicní povrchově aktivní látka inhibuje štěpení prekursorú glykoproteinu virového obalu tryptázou Clara a blokují tak virovou infekci epiteiovýčh buněk bronchiální mukózy a replikaci viru (publikace W094/00181, FEBS Letters 322, 115-119,

1993) .

Podstata vynálezu

Výsledkem pokračujícího výzkumu autory vynálezu, který měl za cíl nalézt látku, inhibující aktivaci virů tryptázou Clara, bylo zjištění, že antileukoproteáza (ALP) je schopná význačně inhibovat aktivaci viru touto tryptázou a inhibovat tak replikaci viru u virem nakažených zvířat. Tím byl předkládaný vynález završen.

Předkládaný vynález poskytuje pro virová onemocnění léčebné a profylaktické činidlo, které obsahuje jako svou aktivní složku ALP.

ALP, používaná podle vynálezu, zahrnuje nejen ALP isolovanou a vyčištěnou z přírodních zdrojů a ALP vytvářenou metodami genetického inženýrství (např. metodami, popsanými v patentových spisech WO 86/03519, WO89/06239, v japonském patentovém spisu, dosud nepodrobeném průzkumu, č, 62-259591, č. 3-123490 a pod.), ale také

- 4 bílkoviny, sestávající z ALP s provedenou substitucí, delecí, insercí nebo adicí v určité části aminokyselinové sekvence, které vykazují stejnou aktivitu jako ALP.

K virovým onemocněním, která mají být cílem léčebného nebo profylaktického činidla podle vynálezu, patří virová onemocnění, vyvolaná virem chřipky, paramyxovirem, respiračním syncytiálním vírem (zde RS virus), rhinovirem, coronavirem, reovirem, adenovirem, virem coxsackie, echovirem, virem oparu (Herpes simplex), rotavirem, enterovirem, poliovirem, cytomegalovirem, virem planých néštovic a virem HIV. Přednostním cílem jsou však virová onemocnění, u nichž infekce počíná v dýchacím ústrojí působením viru, aktivovaného tryptázou Clara, tj. opouzdřené viry, jako je virus chřipky, parymyxovirus, RS virus, virus spalniček a virus příušnic.

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje inhibiční účinek ALP na štěpení giykoproteinového prekursoru F_o z obalu viru Sendai pomocí tryptázy Clara.

Obr. 2 znázorňuje inhibiční účinek ALP na štěpení giykoproteinového prekursoru HA z obalu viru chřipky pomocí tryptázy Clara.

Obr. 3 znázorňuje inhibiční účinek ALP na infekci viru Sendai a chřipkového viru v buněčné kultuře. Pokus, týkající se infekce viru Sendai je označen jako A, pokus využívající chřipkový virus pak jako B. Na ose x je vynesena koncentrace ALP, na ose y infekčnost.

Obr. 4 znázorňuje účinek ALP u krys, infikovaných chřipkovým virem (myším adaptovaným chřipkovým virem A/Asia/1/57 (H2N2)). Titr

- 5 viru v plicích je uveden pod označením A a rozsah poškození plic pod označením B. V části A představuje plná linie titr viru v nepřítomnosti

ALP a přerušovaná linie titr viru za přítomnosti ALP. Prázdné kroužky označují celkový titr viru a plné kroužky označují titr aktivního viru. ALP byla podávána v bodech, označených šipkami.

Nejvýhodnější způsob provedení vynálezu

Popsán bude účinek ALP na virová onemocnění. Při všech pokusech byly použity následující typy ALP, virů a tryptázy.

ALP

Používána byla přírodní ALP, připravená metodou, popsanou v japonské patentové publikaci, která nebyla podrobena průzkumu, č. 62-259591.

Viry

Používanými viry byly virus Sendai a virus chřipky [virus chřipky A/Aich/2/68 (H3N2) a virus myší adaptované chřipky A/Asia/1/57 (H2N2)]. Virus Sendai a chřipkový vir, pěstované v amniotické dutině vyvíjejících se slepičích vajec, byly oddělené suspendovány v roztoku fosfátového pufru, neobsahujícího vápník, v poměru 254 HAU/ml (hemaglutinačních jednotek/ml).

Tryptáza Clara

Tryptáza Clara byla připravena z krysích plic podle metody Kidoa (J. Biol. Chem. 267, 13573-13579, 1992).

Krysí plíce byly promyty ve fysiologickém roztoku a nastříhány nůžkami, homogenizovány při pH 5,5 a odstředěny k získání roztoku supernatantu, který byl použit jako extrakt. Tento surový extrakt byl

- 6 podrobem iontově výměnné sloupcové chromatografii na sloupci, tvořeném CM-52 Cellulosou^(TM) a na sloupci, tvořeném Sephadexem CM-52^(TM). Shromažďovány byly podíly s aktivitou, měřenou za použití Boc-GIn-Ala-Arg-MCA jako substrátu. Shromážděné aktivní frakce byly podrobeny afinitní chromatografii na sloupci arginin-Sepharosy^(TM), která je sorbentem, specifickým pro serinovou proteázu. Enzym podobný trypsinu byl z eluátu shromažďován specifickou adsorbcí. Nakonec byl tento enzymový roztok podroben gelové filtraci na sloupci a aktivní podíly byly shromážděny k isolaci a vyčištění pro přípravu tryptázy Clara.

Příklady provedení vynálezu

Test inhibice štěpení virové bílkoviny účinkem ALP

Příklad 1

Virus Sendai

Test byl prováděn způsobem, popsaným v The Journal of Virology 66, 7211-7216, 1992.

Tryptáza Clara (50 pg/ml) a různé koncentrace ALP (10 nM, 100 nM a 1 μΜ) byly po rozpuštění v destilované vodě 5 minut preinkubovány při 0’C a poté byla stanovována štěpitelnost bílkoviny F_o[³Hj glukosaminem značeného inaktivního viru Sendai, pěstovaného v $ buňkách LLC-MK₂. Výsledky analýzy za použití elektroforézy v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) jsou uvedeny na obrázku 1.

Bylo zjištěno, že ALP ínhibuje štěpení F_a tryptázou Clara na podjednotky F, a F₂ dávkově závislým způsobem, přičem 100% inhibice nastává při koncentraci 1 μΜ.

- 7 Příklad 2

Chřipkový virus

Štěpení bílkoviny HA chřipkového viru (virus chřipky A/Aichi/2/68 (H3N2)) na HA, a HA₂ účinkem tryptázy Clara bylo testováno podle metody, popsané v J . Biol. Chem. 267, 13573 - 13579, 1992, a v Příkladu 1.

Jak je ukázáno na obrázku 2, ALP inhibuje štěpení HA fryptázou Clara na podjednotky HA, a HA₂ dávkově závislým způsobem.

Test inhibice virové infekce účinkem ALP (in vitro)

Příklad 3

Virus Sendai

Tento test byl prováděn podle metody, popsané v publikaci WO94/00131. Tryptáza Clara (20 pg/ml) byla preinkubována 20 minut při 0°C s různými koncentracemi (0,1, 10, 100 a 1000 nM) ALP ve fysiologickém roztoku. Poté bylo na inaktivní virus Sendai, pěstovaný v buňkách LLC-MK₂, působeno 5 minut reakční směsí při teplotě 37^eC. Reakce byla zastavena přídavkem aprotininu (100 pg/ml). Aktivní virus Sendai, získaný tímto působením, byl opět přidán k buňkám LLC-MK₂, které pak byly následně kultivovány 15 hodin. Poté byla měřena CIU (jednotka infikace buněk, cell infecting unit) imunofluorescenční metodou počítání buněk. Virová infekčnost byla vyjádřena jako titr CIU (log,_QCIU/ml).

Příklad 4

Chřipkový virus; virus chřipky A/Aichi/2/68 (H3N2)

- 8 Působení na virus, měření CIU a stanovení titru virové infekčnosti bylo prováděno stejným způsobem jako v Příkladu 3, s tou výjimkou, že místo viru Sendai bylo použito chřipkového viru (viru chřipky

A/Aichi/2/68 (H3N2)) a misto buněk LLC-MK₂ buněk MDCK.

Obrázek 3 znázorňuje inhibiční účinek ALP na infekci viru Sendai a chřipkového viru. Inaktivní viry byly před působením tryptázy Clara (1 x 10⁴ ClU/ml a ve druhém případě 1,2 x 10⁴ ClU/ml) aktivovány tryptázou Clara až do 4 x 10⁸ ClU/ml, respektive 1,8 x 10® ClU/ml.

ALP redukovala infekčnost viru přídavkem ALP v rozmezí od 1 nM do 1 μΜ v závislosti na dávce a současně inhibovala štěpení glykoproteinu virového obalu tryptázou Clara. Téměř 100% inhibiční účinek ALP na infekci byl pozorován při koncentracích 100 nM až 1 μΜ.

Test inhibičního účinku ALP na virovou infekci (in vivo)

Příklad 5

Pokusy na zvířatech, zaměřené na protichřipkový účinek ALP

Testy byly prováděny podle metody, popsané v J. Virol. 66, 7211-7216,1992.

Krysy kmene SD (3 týdny staré, s tělesnou hmotností 120 g, dodávané firmou Japan Charles River Co.) byly intranasálně infikovány 1 x 10⁴ jednotek vytvářejících plaky (PFU) chřipkového viru (myší adaptovaný virus chřipky A/Asia/1/57 (H2N2)). ALP byla podávána intranasálně v množství 6 gg (50 μΙ) na krysu každých 8 hodin po infikaci, a to celkem 15krát. Kontrolám bylo podáváno 50 μΙ fysiologického roztoku. Ve stanovenou dobu byly každých 24 hodin

- 9 zabity 3 krysy a v homogenátu plic byl měřen celkový virus a titr aktivního viru.

Stupen celového zánětu plic byl vyjádřen jako ohodnocení plicní leze na základě visuálního pozorování. Ohodnocení plicní leze vycházelo z pětíbodové stupnice od 0 do 4, představující podíl hepatizace, tj. hnědé oblasti, vzhledem k celkovému povrchu plic. Při ohodnocení plicní leze 0 znamenala 0 % hepatizice vzhledem k celkovému povrchu plic, 1 označovala 1-25 %, 2 označovala 26-50 %, 3 označovala 51-75 % a 4 označovala 76-100 % hepatizace.

Výsledky jsou shrnuty na obrázku 4.

Krysy, infikované chřipkovým virem A/Asia/1/57 (H2N2), kterým byl podáván fysiologický roztok, vykazovaly pátý den přibližně 2000 násobné zvýšení virového titru, přičemž asi 95 % činil aktivní virus. Pozorován byl těžký zánět plic, dosahující vrcholu sedmý den a pokračující do devátého dne.

Naproti tomu krysy, kterým byla intranasálně podávána ALP v dávce 6 itg na krysu a to celkem 1 Skrát, vykazovaly pouze malé zvýšení virového titru, přibližně Wnásobné v pátý den. To předsstavuje inhibici virového titru na pouhých 0,5 % hodnoty, pozorované u skupiny, která nebyla ovlivněna ALP. Navíc 95 % tohoto slabě zvýšeného viru zůstalo inaktivních. Zánět plic vyvrcholil pátý den s ohodnocením 1, což ukazuje pouze minimální vývoj (progresi).

ALP tedy jasně inhibovala rozšíření plicních leží způsobených virovou infekcí, čímž prokázala svou účinnost vůči růstu virové infekce.

Metoda a dávkování

- 10 Jednotlivá dávka léčebného nebo profylaktického činidla pro virové infekce podle vynálezu obsahuje ALP v množství 0,1 pg až 500 mg, lépe 1 pg až 100 mg a nejlépe 10 pg až 10 mg u dětí a 0,5 pg až 1000 mg, lépe 5 pg až 500 mg a nejlépe 50 pg až 50 mg u dospělých. Dávka je rozpuštěna v roztoku elektrolytu, jako je vodný nebo fysiologický solný roztok, koncentrace je upravena na 0,1 až 500 mg/ml, lépe 0,5 až 200 mg/ml a nejlépe na 1 až 100 mg/ml a podávána infusně nebo rozprášena do dýchacího ústrojí, nebo je použita ve formě kolutorního činidla, buď před infikací virem, nebo po vypuknutí virového onemocnění.

Léčebné nebo profylaktické činidlo podle vynálezu muže, pokud je to nezbytné, rovněž obsahovat farmaceutické přídavné látky jako jsou stabilizační činidla, konzervační činidla, isotonizující činidla, pufrační činidla nebo činidla napomáhající rozpouštění, anebo farmaceutická činidla jako jsou bronchodilatační látky, antitussiva, protiafergická činidla, antypyretická analgetika, antibiotika, syntetická antibakteriáiní činidla či jiná protivirová činidla. Přípravky mohou být v kapalné formě, nebo může jít o práškovité či aerosolové přípravky, které se v době podání suspendují, a mohou být plněny do lahviček, ampulí, nebo jiných uzavřených zásobníků jako antiseptický prostředek.

Průmyslová využitelnost

ALP významně inhibuje aktivaci virů tryptázou Clara a tím zabraňuje virové replikaci u zvířat, nakažených těmito viry.

Přípravky, obsahující jako aktivní složku ALP tedy projevují účinné působeni na virová onemocnění, zvláště pak virová onemocnění, způsobená viry, aktivovanými tryptázou Clara, tj. viry s obalovými

- 11 glykoproteiny, které se replikují infekcí dýchacího ústrojí, jako je virus chřipky, parachřipky, virus RS, virus spalniček a virus příušnic.

Zastupuje:

⁷ juDi. ZDEŇKA KOREJZOVÁ Advokátka

- 13 9. Použití antileukoproteázy podle nároku 6, 7 nebo 8, v y znáčů j í c í s e t í m, že virem je virus chřipky, parachřipky, RS virus, virus spalniček nebo virus příušnic.

Claims

1. Inhibitor tryptázy Clara, vyznačující se obsahuje jako aktivní složku antileukoproteázu.

2. Léčebné nebo profylaktické činidlo pro virová onemocnění, vyznačující se t í m, že obsahuje jako aktivní složku antileukoproteázu.

3. Léčebné nebo profylaktické činidlo pro virová onemocnění podle nároku 2, vyznačující se tím, že virem je virus s obalovým glykoproteinem, replikující se při infekci dýchacího ústrojí.

4. Léčebné nebo profylaktické činidlo pro virová onemocnění podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že virem je virus, který se aktivovuje tryptázou Clara.

5. Léčebné nebo profylaktické činidlo pro virová onemocnění podle nároku 2, 3 nebo 4, v y z n a č u j i c í se t í m, že virem je virus chřipky, parachřipky, RS virus, virus spalniček nebo virus příušnic.

6. Použití antileukoproteázy k výrobě léčebného prostředku pro virová onemocnění.

7. Použití antileukoproteázy podle nároku 6, vyznačující se t í m, že virem je virus s obalovým glykoproteinem, který se replikuje při infekci dýchacího ústrojí.

8. Použití antileukoproteázy podle nároku 6 nebo 7, vyznačuj i c í s e t í m, že virem je virus, který se aktivuje tryptázou Clara.