CZ261394A3

CZ261394A3 - Method of increasing expression of recombinant proteins and the use of yolk fraction for this method

Info

Publication number: CZ261394A3
Application number: CZ942613A
Authority: CZ
Inventors: Leif Kongerslev; John Pedersen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-23
Publication date: 1995-02-15
Also published as: WO1993022425A1; DK53792D0; RU94045945A; NO944025L; CA2134198A1; NO944025D0; US5356798A; KR950701380A; FI944997A0; HUT68274A; HU9403070D0; EP0640125A1; FI944997A7; FI944997L; JPH07505780A; AU4260393A

Description

Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů a použóXí^frák'ce vaječného žloutku pro tento způsob

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu zvýšení exprese rekombinantních proteinů a použití frakce vaječného žloutku pro tento způsob.

Dosavadní stav techniky

Četné proteiny, které mají biologickou účinnost, např. krevní koagulační faktory, jako je faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X a faktor XI, imunoglobuliny nebo sérový albumin, jsou tradičně isolovány z tělesných tekutin, jako je sérum, jako jediného jejich zdroje. Jelikož jsou zde však některé tyto proteiny přítomny pouze v malých množstvích, je třeba ohromného množství dárců, aby se umožnila isolace proteinů v průmyslovém měřítku. Vzhledem k riziku přenosu onemocnění souvisejících s krví společně s omezením přírodních zdrojů, se zvýšil zájem o hledání alternativních způsobů produkce těchto proteinů v průmyslovém měřítku bez těchto rizik.

Hemofilie A je dědičná choroba související s X-chromosomem, která ovlivňuje 1 až 2 z 10 000 mužů. Toto onemocnění je způsobeno nepřítomností deficitu faktoru VIII:C. Faktor VIII:C je velmi velký glykoprotein (přírodní má relativní molekulovou hmotnost 330 000 až 360 000), který je v plasmě přítomen v mimořádně nízkých koncentracích. Je nutným prvkem v proteolytické kaskádě, která převádí rozpustný fibrinogen na nerozpustný fibrin. Tím se vytvoří sraženina, která brání ztrátě krve z poškozené tkáně. V krevním oběhu se nachází v nekovalentní asociaci s von Willebrandovým faktorem (vWF), který působí jako stabilizující nosný protein. Faktor VIII:C je velice vnímavý na štěpení thrombinem, plasminem, aktivovaným proteinem C a dalšími serinovými proteinasami. Obecně se isoluje z plasmy nebo plasmových produktů jako serie příbuzných polypeptidů s relativními molekulovými hmotnostmi 160 000 až 40 000 s převládajícími složkami s molekulovou hmotností 92 000 a 80 000 až 77 000. Složitá sestava těchto produktů způsobuje, Že analýza struktury aktivního faktoru VIII:C je velice obtížná.

Rekombinantními proteiny, které se vyrábějí podle tohoto vynálezu, mohou být faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor 7. a faktor XIII. Tyto proteiny se mohou používat pro substituční terapii u jednotlivců, kteří mají deficit v koagulační kas ídě. Rekombinantním proteinem, který se vyrábí podle tohoto /nálezu, může být také imunoglobulin, který se může používat lo léčení infekčních onemocnění, nebo sérový albumin, který e může používat jako náhražka při transfusi krve během operací rbo jako složka kultivačního media.

Rekombinantní proteiny, které mají aktivitu faktoru VIII:C ·'! které se připravují podle tohoto vynálezu, může být faktor i il:C plné délky odpovídající proteinu isolovanému z plasmy \bo jeho derivát se schopností normalizovat nedostatečné srážení krve způsobené nedostatkem faktoru VIII :C. Deriváty faktoVIII:C mohou být formy se zkráceným jednoduchým řetězcem nederiváty se dvěma řetězci. Dokonce fragmenty faktoru VIII:C, .eré samy o sobě nevykazují koagulační aktivitu, ale které se obou používat při léčení hemofiliků, např. pro nasycení proti¹ itek proti faktoru VIII:C jsou přítomny v inhibovaných paciench.

Proteiny vyrobené podle tohoto vynálezu vykazují homologii elou přírodní molekulou faktoru VIII:C nebo s částí této moduly .

Příprava rekombinantních proteinů s aktivitou faktoru i.II:C rekombinantními technikami byla mimo jiné popsána v čet/ch patentových publikacích. Tak evropská patentová přihláška 160 457 a mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu

- WO 86/01961 popisuje výrobu faktoru VIII:C o plné délce, evropská patentová přihláška č. 150 735, mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu č. WO 86/06101, evropská patentová přihláška č. 232 112, mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu č. WO 87/04187, mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu č. WO 87/07144, mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu č. WO 88/00381, evropská patentová přihláška č. 251 843, evropská patentová přihláška č. 253 455, evropská patentová přihláška č. 254 076, USA patent č. 4 980 456, evropská patentová přihláška č. 294 910, evropská patentová přihláška č. 265 778, evropská patentová přihláška č. 303 540, mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu č. WO 91/07490 a mezinárodní patentová přihláška Světového úřadu č. WO 91/09122 popisují expresi rekombinantů pod jednotek faktoru VIII :C nebo ko-expresi pod jednotek pro produkci komplexů vykazujících koagulační aktivitu nebo vazebnou afinitu na protilátky inhibující faktor VIII:C. Exprese rekombinantního lidského faktoru VIII :C o plné délce je obvykle nízká a molekula je nestálá vůči proteolyse.

Deriváty faktoru VIII:C ve formách se zkráceným jednoduchým řetězcem nebo deriváty obsahující'dva řetězce byly úspěšně produkovány také rekombinantními technikami. I když se tyto deriváty normálně získávají expresí ve vyšších výtěžcích než faktor VIII:C o plné délce, stále ještě existuje potřeba zvýšení úrovně této exprese.

Aby se získala přijatelná úroveň exprese a přijatelná stabilita produkovaného rekombinantního proteinu s biologickou aktivitou, je často výhodné, aby k expresi proteinů docházelo v savčích buňkách. Tyto buňky se obvykle nechávají růst v prostředí, které obsahuje savčí sérum, např. novorozenecké nebo plodové hovězí sérum, v množstvích asi 10 % obj. sera vzhledem k celkovému množství media. Rekombiantní protein se sekretuje do kultivačního media a během isolace se musí oddělit od složek sera.

Sérum má vysoké obsahy proteinů, které způsobují, že isolace a čištění žádaných proteinů je obtížná. Takové přidání může také způsobit potenciální riziko zavedení maligních virů z hovězího sera do konečných krevních preparátů. Existuje tedy potřeba nalézt kultivační medium bez sera nebo medium, které obsahuje snížená množství sera pro kultivaci hostitelských buněk, aniž by se podstatně snížila exprese nebo stabilita žádaného proteinu.

Bylo navrženo několik způsobů exprese proteinů, které mají biologickou aktivitu v mediu bez sera.

Spis Světového úřadu WO 87/04187 a evropský patent 251 843 popisují, že exprese faktoru VIII :C v mediu bez sera nebo v přítomnosti von Willebrandova faktoru (vWF) nebo fosfolipidu zvyšuje expresi faktoru VIII:C. V evropském patentu 254 076 je popsáno, že přidání lipoproteinu k mediu bez sera zvyšuje expresi faktoru VIII v hostitelské buňce nesoucí gen kódující faktor VIII. Japonský patent 61 063283 popisuje, že exprese mimo jiné mcooklonálních protilátek v mediu bez sera se může zvýšit přid; 7Ím lipoproteinu ve formě frakce vaječného žloutku. A konečné evropský patent 441 695 popisuje expresi faktoru VIII:C nebo jeho analoga v mediu bez sera v přítomnosti kationtového nebí uiiontového polymeru, s výhodou polysacharidu, který je nejv\ idněji v sulfatované formě. Bylo navrženo zrychlit růst kulti 'íycobacterium nebo stabilizovat media pro kultivaci bacilů t’ rkulosy přidáním celého vaječného žloutku.

Pc . <:ata vynálezu

Tento vynález je založen na překvapujícím zjištění, že fr ;e vaječného žloutku bez oddělení lipidů se může použít pro zv oni exprese rekombinantních proteinů, které mají biologicko aktivitu, s výhodou faktoru VIII:C, v mediu bez sera.

Tento vynález se týká způsobu zvýšení exprese rekombinantního proteinu v savčí hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat uvedený protein, v mediu bez sera, vyznačující se tím, že hostitelská buňka se kultivuje v kultivačním mediu bez sera, které obsahuje frakci vaječného žloutku, která neob5 sáhuje lipoprotein a tuky, takže se expresí získává uvedený protein.

Neočekávaně bylo zjištěno, že přidání frakce vaječného žloutku, která neobsahuje lipoprotein a lipidy, zvyšuje v mediu bez sera expresi rekombinantních proteinů.

Frakce vaječného žloutku používaná podle vynálezu se může připravit přidáním polyethylenglykolu v množství 3,5 % hmot. a pufru k vaječnému žloutku a mícháním a odstřeďováním, jak je to popsáno v Immunological Communications 9(5). 475 (1980). Při tomto srážení se vysráží lipoproteinová frakce vaječného žloutku. Lipoproteiny jsou micely, které obsahují lipidy, které mají svoje lipofilní části uvnitř a povrch obsahující mimo jiné apoproteiny. Lipidy sestávají z fosfolipidů mastných kyselin a cholesterolu. Frakce, která se používá podle tohoto vynálezu, je supernatant z prvního odstřelování, který není žádanou frakcí podle shora uvedené citace pojednávající o isolaci protilátek ze sraženiny. V této citaci neexistuje/žádný náznak jakéhokoliv použití tohoto supernatantu.

Při tomto dělení se všechny složky lipoproteinů, které byly dříve navrženy jako doplněk pro zvýšení exprese rekombinantních proteinů v mediu bez sera, isolují z vaječného žloutku jako sraženina.

Podle výhodného aspektu tohoto vynálezu se frakce vaječného žloutku přidává v množství od 0,5 do 15 % hmot., výhodněji v množství 1 až 10 % hmot., nejvýhodněji v množství 5 až 10 % hmot.

Podle výhodného aspektu se tento vynález týká způsobu zvýšení exprese proteinu, který má aktivitu faktoru VIII:C. Podle výhodného aspektu tohoto vynálezu se tohoto způsobu používá pro expresi komplexu podjednotek faktoru VIII:C o molekulových hmotnostech 92 000 a 80 000/77 000. Při této kultivaci frakce vaječného žloutku nejen zvyšuje úroveň exprese jednotlivých podjednotek faktoru VIII:C, ale zvyšuje také stupeň tvorby komplexu a stabilizuje produkovaný komplex a tedy zvyšuje výtěžek aktivního produktu.

Podle jiného aspektu se tento vynález týká použití frakce vaječného žloutku, který neobsahuje lipoprotein a lipidy, pro zvýšení exprese rekombinantních proteinů v hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat uvedený protein, při čemž se tato exprese provádí kultivováním uvedeného hostitele v buněčném růstovém mediu bez sera.

Podle ještě jiného aspektu se tento vynález týká použití frakce vaječného žloutku, která neobsahuje lipoprotein a lipidy, pro zvýšení exprese rekombinantních proteinů, které mají aktivitu faktoru VIII:C.

Pojem těžký řetězec (HC) tak, jak se zde tento pojem používá, znamená pod jednotku faktoru VIII :C s molekulovou hmotností 92 000.

Pojem lehký řetězec (LC) tak, jak se zde tento pojem poižívá, znamená podjednotku faktoru VIII :C s molekulovou hmotností 77 000/80 000.

Pojem ko-expresující tak, jak se zde používá, v kombinaci s proteiny, které mají aktivitu faktoru VIII:C, se týká současné exprese podjednotek faktoru VIII:C o molekulových hmotnostech 92 000 a 80 000 ve stejné hostitelské buňce. Sekvence polynukleotidů kódující podjednotky o molekulových hmotnostech 92 000 a 80 000 mohou být na stejné nebo na různých expresních kasetách nebo plasmidech. Ko-exprese pod jednotek o molekulových hmotnostech 92 000 a 80 000 umožňuje patřičné skládání, které dále poskytuje komplex, který je aktivní a který je efektivně sekretován.

Pojem buněčné růstové (kultivační) medium (prostředí) tak, jak se zde tento pojem používá, znamená jakékoliv medium vhodné pro kultivování hostitelských buněk. Tento pojem zahrnuje media vhodná pro dosažení exprese rekombinantních produktů, ař. dochází k růstu skutečných buněk nebo nikoliv. Buněčné růstové medium obvykle zahrnuje živiny a metabolizovatelný zdroj energie ve vodném roztoku. Jestliže je to žádoucí, buněčné růstové medium může zahrnovat také sloučeninu, která indukuje expresi rekombinatních polypeptidů podle tohoto vynálezu. Výběr takové indukující sloučeniny závisí na promotoru, který se zvolí pro regulaci expres. Mezi další typické přísady patří vybrané sloučeniny (tj. léčiva nebo jiné chemikálie přidané k mediu, aby se zajistilo to, že v mediu přežijí pouze transformované hostitelské buňky).

Pojem medium bez sera tak, jak se zde tento pojem používá, znamená roztok, který byl doplněn tak, že se nemusí přidávat nutné stopové faktory přítomné v seru ve formě sera. Existuje mnoho vhodných buněčných růstových medií, které jsou dostupný z komerčních zdrojů.

Pojem vaječný extrakt tak, jak se zde používá, označuje frakci vaječného žloutku, která neobsahuje lipoprotein a tuky, připravenou podle postupu popsaného v Immunological Communications (viz shora).

Strukturní geny typicky obsahují leader sekvenci kódující signální peptid, který směruje polypeptid do průchodu endoplasmatického retikula pro opracování a maturaci. Popřípadně obsahuje další sekvence kódující propeptidy, které se opracovávají post-translačně endopeptidasami, při čemž endopeptidasy štěpí peptidovou vazbu, odstraňují propeptid a generují maturovaný polypeptid. Signálním peptidem může být přirozeně se vyskytující peptid, zvláště N-koncový peptid, nebo může jít o signální peptid, který zajištuje opracování a maturaci polypeptidů.

Mohou se používat různé savčí hostitelské buňky, v nichž jsou regulační sekvence a replikační systém funkční. Mezi takové buňky patří COS7 buňky, buňky vaječníků čínského křečka ,CHO), buňky ledvin myší, buňky ledvin křečků, buňky HeLa, buňky HepG2 nebo podobné, např. VĚRO buňky, W-138 nebo MDCK buněčná linie.

Proteiny s aktivitou faktoru VIII:C produkované podle vynálezu jsou primárně určeny pro léčení hemofiliků a pacientů trpících stavy, které zahrnují poruchy srážení krve. Tyto proteiny se podávají ve fysiologicky přijatelném nosiči, jako je voda, solný roztok, fosforečnanem pufrovaný solný roztok a citrátem pufrovaný solný roztok, v množstvích 10 až 200 jednotek/ /ml. Viz USA patenty č. 3 631 018, 3 652 530 a 4 069 216 pro způsoby podávání a podávaná množství. Mohou obsahovat také další konvenční přísady. Mají rovněž různá použití jako imunogeny pro přípravu protilátek, pro isolaci von Willebrandova faktoru afinitní chromatografií a při diagnostických analýzách faktoru VIII:C.

Tento vynález je podrobněji vysvětlen v níže uvedených příkladech, které jsou návodem pro zručného odborníka jak pracovat podle vynálezu, ale které nejsou zkonstruovány jako omezení ochrany vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a způsoby

Buněčné růstové medium se připraví následujícím způsobem: Prásek Seromed mem-Dulbeco TZ 043C pro 10 1 se rozpustí v 8,5 1 Milli-Q-vody. Potom se přidá 0,977 g bezvodého síranu hořečnatého, 37,0 g hydrogenuhličitanu sodného, 6,2 g chloridu sodného, 1,5 g 1-prolinu a 1,1 g pyruvátu sodného.

Po úpravě pH kyselinou chlorovodíkovou na 7,4 se objem upraví přidáním demineralizované vody na 9 1. Roztok se sterilně zfiltruje. Jestliže se používá, přidá se 10% 1 M vodného chloridu sodného.

Potom se připraví přidáním následujících složek základní medium: 2,5 g/1 papainem rozštěpeného sojového proteinu, 5 mg/1 insulinu, 5,5 mM Gly-Gly, 25 μΜ síranu železitého, 6,5 Mg/l seleničitanu sodného, 0,1 g/1 Dextranu o molekulové hmot..67 000 a 0,5 g/1 e-ACA.

Příklad 1

Získání buněčných linií, které ko-expresí poskytují těžký řetězec a lehký řetězec faktoru VIII:C

Postup transfekce

DHFR- CHO buněčná linie DG44 (G. Urlaub a spol.: Som. Cell.

Mol. Genet. 12, 555 (1986).) se nejdříve transfektuje plasmidem pCMF8-80AT: V tomto plasmidu CMV promotor (popsaný v příkladu 7 spisu Světového úřadu W091/07490) transkribuje FVIII-LC cDNA odvozenou od pSVF8-80AT (popsaný v příkladu 6) a po směru vláknu se umístí Ad-MPL-dhfr kaseta odvozená od pAd-DHFR (popsaný v příkladu 4 spisu Světového úřadu W091/0749). Použitým způsobem transfekce byl polybrenový způsob podle W. Chaneyho a spol.

(Som. Cell. Mol. Genet. 12, 237 (1986).). Selekcí DHFR⁺ buněk (DMEM + 10 % DFCS) se isoluje několik producentů FVIII-LC; jeden z nich se označí 11W.

Pro zavedení FVIII-HC do 11W se buněčná linie kotransfektuje plasmidem pPR78 (tento plasmid je analogem k pCMVF8-80AT, ale místo FVIII-LC cDNA nese v sobě FVIII-HC cDNA odvozenou od pCMVF8-92R popsaného v příkladu 8 spisu Světového úřadu WO91/ /07490) a pSV-neo (P. J. Southern a P.Berg: J. Mol. Appl. Genet.

1, 327 (1982).). Jako způsob transfekce byl použit modifikovaný » postup s fosforečnanem vápenatým podle C. Chena a H. Okayamy (Mol. Cell. Biol. 7, 2745 (1987).). Transfektanty byly isolovány v mediu obsahujícím 700 Geneticinu (G418 Sulphate, Gibco) na ml. Buňky z primárního souhrnu se subklonují omezenou zřeáovací metodou a jednotlivé klony se testují na expresi aktivního FVIII. Tímto způsobem bylo isolováno několik buněčných linií produkujících FVIIIzC. Jedna z nich byla označena 45.

Buňky, které se tímto způsobem vyberou na základě úrovně exprese, se vysejí do T-baněk pro kultivaci v nepřítomnosti vaječného extraktu nebo v přítomnosti různých množství vaječného extraktu.

Popis transfekce, který odkazuje na spis Světového úřadu W091/07940, je zde zahrnut jako odkaz, včetně odkazu na plasmidy pSVF8-92, pSVF8-80 a pSVF8-200, které jsou uloženy pod číslem ATCC 40222, ATCC 40223 a ATCC 40190.

Příklad 2

Kultivace buněčných linií, které ko-expresí poskytují těžký řetězec a lehký řetězec faktoru VIII:C

Výsledky shora uvedené kultivace v T-baňkách jsou uvedeny níže v tabulkách.

Byla testována následující množství přidaného vaječného xtraktu: 1, 2,5, 5 a 10 % hmot. v základním mediu. Tyto kultiice byly srovnávány s kultivací v základním mediu bez přidání i ječného extraktu.

V tabulce l je uveden výsledek stanovení koagulační aktiLty soustavou Coatest kit (KabiVitrum) a v tabulce 2 a 3 vý; ¹ edky stanovení FVIII:HC a FVIII:LC.

Tabulka 1 FVIII:C (j./ml)

1:základ	2:základ + 5 % vaj.ext.	3:základ + 2,5 % vaj.ext.	4:základ + 1 % vaj.ext.	5: základ
dnů	+ 10 % vaj.ext.
3	1,120	0,58	0,549	0,47	0,310
5	2,778	1,48	1,300	0,97	0,725
7	3,947	2,77	2,280	1,99	1,470
10	8,440	5,44	4,430	4,08	2,920

Tabulka 2 FVIII:HC (j./rol)

	1:základ	2:základ	3:základ	4:základ	5:	základ
dnů	+ 10 %	+ 5 %	+ 2,5 % /	+ 1 %
	vaj.ext.	vaj.ext.	vaj.ext.	vaj.ext.
3	5,25	3,90	2,95	3,05	2	,25
5	12,65	7,60	6,90	7,05	7	,10
7	24,50	17,35	14,00	14,80	13	,80
10	> 50	44,00	38,50	39,00	35	,00

Tabulka 3 FVIII:LC (j./ml)

	1:základ	2:základ	3:základ	4:základ	5:	základ
dnů	+ 10 %	+ 5 %	+ 2,5 %	+ 1 %
	vaj.ext.	vaj.ext.	vaj.ext.	vaj.ext.
3	18,10	13,6	14,0	13,87	12	,60
5	34,50	22,0	25,0	25,57	22	,25
7	49,00	38,5	33,5	32,09	32	,50
10	109,50	99,5	79,5	68,08	62	,00

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčí · hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat tyto proteiny, vyznačující se tím, že se * kultivuje hostitelská buňka v buněčném růstovém mediu bez sera, které obsahuje frakci vaječného žloutku, která neobsahuje lipoprotein a tuky, takže se expresí získávají uvedené proteiny.
2. Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčí hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat tyto proteiny podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství frakce vaječného žloutku je od 0,5 do 15 % hmot.
3. Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčí hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat tyto proteiny podle nároku 2, vyznačující se tím, že množství frakce vaječného žloutku je od 1 do 10 % hmot.
4. Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčí hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat tyto proteiny podle nároku 3, vyznačující se tím, že množství frakce vaječného žloutku je od 5 do 10 % hmot.
5. Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčí hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat tyto proteiny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vy- , značující se tím, že produkovaným rekombinantním proteinem je protein, který má aktivitu faktoru .

VIII:C.
6. Způsob zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčí hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat ty14 to proteiny podle nároku 5, vyznačující se tím, že produkovaným proteinem, který má aktivitu fak» toru VIII:C, je komplex podjednotek faktoru VIII:C o molekulové hmotnosti 92 000 a 80 000/77 000.
7. Použití frakce vaječného žloutku, která neobsahuje lipoprotein a tuky, vyznačující se tím, že zvyšuje expresie rekombinantních proteinů v hostitelské buňce, která je schopna expresí poskytovat tyto proteiny v buněčném růstovém mediu bez sera.
8. Použití frakce vaječného žloutku, která neobsahuje lipoprotein a tuky, vyznačující se tím, že se expresí získá protein, který má aktivitu faktoru VIII:C.

Zastupuje:

Dokumenty ke spisu č. 9530:

Mezinárodní předběžný průzkum *

V. 2. Citace a vysvětlení

Tento vynález se týká způsobu zvýšení exprese rekombinantních proteinů v savčích hostitelských buňkách s využitím buněčného růstového media bez sera, které obsahuje frakci vaječného žloutku bez lipoproteinů a tuků a která se může získat isolací supenatantu po vysrážení tuků a lipoproteinů polyethylenglykolem.

Příklady media, které se používá při expresi rekombinantních proteinů, zvláště proteinů typu faktoru VIII:C, jsou uvedeny v průzkumové zprávě v citaci Světového úřadu WO Al 8704187 (viz například nároky a strany 3 až 5).

V této zprávě bylo uvedeno několik dokumentů, které se zdají mít zvláštní důležitost. Tak Derwent abstrakt japonského patentu 1235586 (Dialog č. 8053976) ukazuje použití ve vodě rozpustné frakce vaječného žloutku jako nutriční složky pro živočišnou buněčnou kulturu, která alespoň částečně může substituovat přísadu plodového sera. Podobný přípravek z vaječného žloutku je popisován v Derwent abstraktu japonského patentu 1083100 (Dialog č. 7871164), v němž se roztok - pravděpodobně vodný roztok vaječného žloutku zpracuje tak, aby se odstranily lipoproteiny. Zbývající proteinová frakce se použije jako základní přísada media kultury živočišných buněk. Jelikož lipoproteiny jsou rozpustné ve vodě - roztocích chloridu sodného, frakce, na nichž je odkazováno v těchto dokumentech, nejsou zbaveny lipoproteinů. _t

Vzhledem k vágní definici přísady media, frakce vaječného » žloutku bez lipoproteinů a tuků, bylo v průzkumové zprávě citováno několik dokumentů, které pojednávají o fosfatidylcholinu z vaječného žloutku jako přísady v mediu bez sera (viz Fujii D.K. a spol.: J. Cellular Phys. 114. 267 (1983), Derwent ab17 strakt japonského patentu 128948 (Dialog č. 8118174) a Medline abstrakt článku v J. Immunol. 136(4) , 1334 (1986) (Dialog č.

⁴ 5812414).). Tyto dokumenty však pouze konstatují známý stav, jelikož fosfatidylcholin je tukového původu.

Medline abstrakt (Medline č. 86223710) článku v In Vitro Cell. Dev. Biol. 22, 241 (1986) popisuje použití proteinové frakce vaječného žloutku jako přísady media tkáňové kultury pro proliferaci a diferenciaci buněk. Studium původního dokumentu ukazuje, že spodní frakce podporující růst se může získat gradientovým odstřelováním gradientem bromidu draselného. Horní frakce - obsahující většinu lipoproteinů - a střední frakce jsou toxické (viz strana 243, levý sloupec). Přesvědčivě nebylo prokázáno, že přítomnost zbývajících množství lipoproteinů ve spodní frakci představuje takový rozdíl, který by podporoval invenční stupeň. Jestliže spodní frakce obsahuje vlastnosti podporující růst ekvivalentní doplňku podle tohoto vynálezu, lze považovat za zřejmé, že zručný odborník využije této frakce vaječného žloutku jako doplněk růstového media při produkci rekombinantního proteinu podle spisu WO 87/04187. Dokud nebudou tyto argumenty vyvráceny, chybí nárokům 1 až 4 a 7 invenční stupeň.

Použití způsobu srážení polyethylenglykolem při přípravě přísad media tkáňové kutlktury z vaječného žloutku však může obsahovat invenční stupeň, protože jde o technicky jenoduchý způsob výroby, který je dostupný dlouhou dobu. Změna slova získatelný za získaný by příslušně omezila nároky.

%

Přísady media, von Willebrandův faktor (který je drahý) « a/nebo fosfolipid, popisované ve spisu WO 87/04187 jsou přirozenými součástmi koagulačního systému, o kterých lze čekat, že « budou stát v cestě isolaci produktu. Bylo by nečekanou výhodou, kdyby mohly být tyto přísady vyloučeny bez ztráty produkce rekombinantího faktoru VIII:C. Použití přísady vaječného Žloutku bez tuku a lipoproteinů podle nároků 5, 6 a 8 pro zvýšení exprese rekombinantních proteinů faktoru VIII:C tedy zřejmě za¥ hrnuje invenční stupeň.

Všechny nároky splňují požadavky novosti a průmyslové pou- * žitelnosti.