CZ234693A3 - Process of selective deactivation of undesired proteins in a mixture of proteins by microwave irradiation - Google Patents

Description

Oblast techniky _ _. . Vynález se týká selektivní deaktivace nežádoucích proteinů ve směsi proteinů mikrovlnným ozářením.

Dosavadní stav techniky

Z patentu DE 40 06 436 je již známo, že je možné mikrovlnným ozářením selektivně čistit proteiny Při způsobu popsaném v tomto patentovém spisu se mikroorganismy produkující příslušné proteiny nejdříve rozruší a teprve potom se získaná směs proteinů zahřeje mikrovlnným ozářením.

S překvapením bylo nyní zjištěno, že tento proces čištění proteinů může být prováděn i jinak, přičemž se tímto alternativním způsobem dosáhne pokroku oproti známému stavu techniky.

Podstata vynálezu

Tento alternativní způsob deaktivace nežádoucích proteinů ve směsi proteinů, který je předmětem vynálezu, spočívá v tom, že se mikrovlnným ozářením zahřívá suspenze v podstatě nerozrušených buněk, což znamená, že uvedené zahřátí mikrovlnným ozářením se provádí ještě před rozrušením buněk. Proti očekávání se tímto způsobem dosáhne vysoké selektivity denaturace a současně snadnějšího průběhu následného rozrušení buněk.

Předmětem vynálezu je tedy způsob selektivní deaktivace nežádoucích proteinů ve směsi proteinů zahřátím mikrovlnným ozářením, jehož podstata spočívá v tom, že se mikrovlnným ozářením zahřeje suspenze v podstatě nerozrušených buněk. Výraz v podstatě nerozrušené buňky znamená, že se způsobem podle vynálezu zpracovávají mikroorganismy v nerozrušené formě, přičemž suspenze nerozrušených mikroorganismů obsahuje malý podíl rozrušených, buněk, k jejichž rozrušení nevyhnutelně došlo v průběhů fermentačního procesu. To zejména znamená, že se při způsobu podle vynálezu neprovádí před zahřátím suspenze buněk mikrovlnným ozářením žádné opatření, které by vedlo- k rozrušení buněk.

Způsob podle vynálezu se provádí v závislosti na charakteru směsi proteinů, ve které se provádí deaktivace, a na volbě proteinů, které nemají být deaktivovány, při odpovídající optimální kombinaci teploty a doby prodlení v generátoru mikrovlnného záření, přičemž za těchto teplotních a časových·podmínek ještě nedochází k deaktivaci požadovaných proteinů, avšak již proběhne úplná denaturace nežádoucích proteinů. Například v případě mikroorganismu Trigonopsis variabilis, kdy má dojít k deaktivaci esteráz a kataláz a k zachování aktivity oxidázy D-aminokyselin,leží optimální teplota v rozmezí 60 až 85 °C při době prodlení v mikrovlnném generátoru 10 až 40 sekund, přičemž výhodně leží tato teplota v rozmezí 65 až 75 °C při době prodlení 15 až 25 sekund a zejména tato teplota činí asi 70 °C při době prodlení asi 20 sekund. Účinnost a selektivita způsobu podle vynálezu může. být. dále zvýšena tím,, že se buněčná suspenze vystaví několika zahřívacím cyklům působením mikrovlnného záření za přesně stanovených podmínek.

Způsob podle vynálezu může být prováděn za použití různých mikrovlnných zařízení. Výhodně se použije mikrovlnný kmitočet 074~~až^-2!4~GHž^ zejmena^-071Taz^—2T5'5Hž.ΉObzvláště^- výhodne’^_jšbu mikrovlnné kmitočty asi 433 MHz, 915 MHz a 2,45 GHz. S výhodou se používá průtokový mikrovlnný ohřívač, ke kterému může být přiřazena dráha pro výdrž teploty. Provozní podmínky (laminární nebo turbulentní proudění, použití míchadel, atd.) závisí na použitém zařízení a tento provoz je vždy třeba optimalizovat tak, aby veškerá suspenze určená ke zpracování byla zahřívána za stabilních podmínek s vyloučením gradientů teploty a doby prodlení. Detaily, týkající se použitých zařízení a provozních podmínek, lze nalézt ve výše zmíněném patentovém spisu a v literatuře, která je v tomto patentovém spisu citována.

Způsob podle vynálezu je obzvláště vhodný například pro selektivní deaktivaci esteráz a kataláz a zachování aktivity oxidáz D-aminokyselin v buňkách mikroorganismu Trigonopsis variabilis. Způsob podle vynálezu je zejména výhodný z ekonomického hlediska, nebot se při jeho provádění buněčná suspenze přímo bez předcházejících zpracovatelských stupňů zahřívá popsaným způsobem, přičemž bylo zjištěno, že přísady a pevné podíly, nacházející se v kultivačním prostředí, překvapivě nezpůsobují žádné komplikace.

Po zahřátí podle vynálezu mohou být mikroorganismy zpracovány postupy známého stavu techniky, přičemž rozrušení buněk probíhá následkem působení mikrovlnného záření snadněji, což.již bylo ostatně zmíněno v předcházejícím textu.

V následující části popisu bude způsob podle vynálezu blíže objasněn pomocí příkladu jeho konkrétního provedení, který má však pouze ilustrační charakter a nikterak neomezuje rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

Příklad

Buněčná suspenze se pomocí zubového čerpadla čerpá z předlohové nádoby do mikrovlnné trouby. Bezprostředně po výstupu z mikrovlnné zóny se měří teplota produktu. Aby mohla být buněčná suspenze udržována ještě po požadovanou dobu na nastavené teplotě, je k mikrovlnné troubě připojena odpovídajícím způsobem dimenzovaná a dobře izolovaná dráha pro výdrž teploty. Buněčná suspenze se potom ochladí v chladiči na okolní teplotu jímá ve sběrné nádobě. Jako zdroj mikrovlnného záření se použije například laboratorní mikrovlnný přístroj MLS 1200 firmy Buchi. Tento přístroj je za účelem průchodu produktu přístrojem opatřen otvory v bočních stěnách.

2a účelem dosažení vyššího stupně obohacení směsi proteinů požadovaným nedenaturovaný proteinem může být vhodné zahřát suspenzi mikrovlnným ozářením několikrát. Dosažené výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Změna aktivity enzymů při vícenásobném zahřátí (1. až 3. zahřátí) buněčné suspenze: T = 70 °C, doba prodlení % 20 sekund max

	Aktivita enzymu (%)	Katalázy
Oxidáza D-aminokyselin	Esterázy
Slepá hodnota (před t.zahřátím)	100	100	100
1.zahřátí	100	13,0	56
2.zahřátí	81,8	7,3	36
3.zahřátí	82,0	5,5	28

- 5 1

Alba ζδ .« ^E0

proteinů ve směsi ačenv tím.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROK

   1. Způsob selektivní deaktivace nežádoucích proteinů zahřátím mikrovlnným ozářením, v y z n že se zahřívá mikrovlnným ozářením suspenze v podstatě nerozrušených buněk.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se použije mikrovlnné záření o kmitočtu 0,4 až 24 GHz.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2,vyznačený tím, že se použije mikrovlnné záření o kmitočtu 0,4 až 2,5 GHz.
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený t í m , že se směs proteinů vytvoří kultivací mikroorganismu Trigonopsis variabilis.

   4. způsob podle nároku 4,vyznačený tím, že se ve směsi proteinů vytvořené kultivací mikroorganismu Trigonopsis variabilis deaktivují esterázy a katalázy, přičemž se v podstatě zachová aktivita oxidázy D-aminokyselin.
5. 5. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že se selektivní deaktivace nežádoucích enzymů provádí v buněčné suspenzi, která nebyla po fermentaci podrobena žádnému zpracovatelskému procesu.

   Zastupuje: