CZ220091A3 - process for preparing glucomannan carbonaceous bio-polymer - Google Patents

Description

Dosavadní stav techniky

V současné době je získávání biopolymeru submersními fermentačními procesy ve světě prováděno s využitím sacharosy, glukosy, či jiných standardních surovin dostupných na trhu. Využití odpadních surovin pro biosyntézu definovaného produktu, které by bylo ekonomicky výhodné, nebylo dosud popsáno.

Většina publikací se zabývá sledováním růstové kinetiky produkčních kmenů, např. Xanthomonas carapestris B-1459 (j.T. Patton, S.K. Dugar; Process Biochem. 1981, 6,46) nebo procesními charakteristikami bioprocesu na definovaných substrátech (R.V.Silman, P.Rogovin: Biotechnol. Bioeng. XIV, 1972,23; P.Rogovin, V. Albrecht, V.Sohns: Biotechnol. Bioeng. VII, 1965, 161 ap.).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob příravy glukomannanového uhlíkatého biopolymeru, který spočívá v tom, že se odbílkovaná nebo neodbílkovaná syrovátka naočkuje mikroorganismem Xanthomonas fuscans XFL a fermentuje po dobu 72 až 96 hodin při teplotě 28 až 30 °C a pH 6,5 až 7,2 v jednom až třech fermentačnich stupních.

Po ukončení fermentace se biopolymer isoluje buď ethanolickou nebo acetonovou precipitací, filtrací, prostým nebo sprayeovým sušením, lyofilisací. Isolovaný biopolymer sestává z těchto konstituentních monosacharidů: a-D-glukosa, β-D-glukosa, a-D-mannosa, β-D-mannosa a s malým podílem D-ribosa, a-D-galaktosa.

K očkování se používaj í mutační kmeny Xanthamonas fuscans

XFL (sbírka Mikrobiologického ústavu ČSAV), s výhodou CCM 2850 podle čs. AO 185 394, který má tyto mikrobiologické vlastnosti:

a) mikroskopiské pozorování : pohyblivé tyčinky, barvení dle Grama negativní, délka 2-3 μπι, šířka 1-2 pm,

b) kultivační charakteristika: bakteriální kolonie po 48-72 h na agarové půdě jsou oválné, hladké, lesklé, navalité, velikosti

3-5 mm, žluté barvy, sliznaté s produkcí hnědého pigmentu do prostředí,

c) fysiologické vlasstnosti: aerobní mikroorganismus, roste jak na bohatých organických půdách tak na půdách syntetických obohacených kvasničným extraktem při teplotě 28-30°C a pH 6,5-7,2. Ztekucuje gelatinu, indol netvoří, sirovodík netvoří, škorob hydrolyzuje, pepton využívá, nitráty neredukuje, z cukrů využívá sacharosu, glukosu, laktosu, fruktosu, maltosu, slaběji roste na arabinose a mannose.

Složení syrovátky je velice variabilní v závislosti na technologickém procesu, jehož je syrovátka vedlejším produktem. K výrobě biopolymeru lze použít i živné medium obsahuj ící sušenou syrovátku ke krmným účelům lišící se od výše uvedené odlišnými mikrobiálními parametry. Lze použít odbílkovanou i neodbílkovanou syrovátku. Sušená sladká syrovátka z výroby sýrů je pro účely fermentace s výhodou obnovována na roztoky obsahující 4-7 % sušené syrovátky. Toto rozmezí odpovídá koncentrací sušiny v tekuté syrovátce v závislosti na druhu vyráběného sýra. Alternativně lze použít i kyselou syrovátku, jež je odpadním produktem výroby tvarohu a kyselého kaseinu. Výsledkem optimalisace složení fermentačního media je stanovení přídavku vybraných druhů minerálních látek a kvasničného extraktu, který lze ve stejném množství nahradit kvasničným autolyzátem. Podstatného zvýšení produkce biopolymeru lze dosáhnout obohacením živného media o 0,5-1% hmot. kukuřičného výtažku. Syrovátka je vedlejší produkt při výrobě sýrů, tvarohu a kaseinu, její složení se liší podle druhu vyráběného sýra.

Způsobem podle vynálezu se získá biopolymer jak technické kvality tak i čistý. Při získávání biopolymeru technické kvality není nutno odstraňovat biomasu produkčního kmene a takto získaný produkt lze využít v řadě průmyslových technologií bez nákladného čištěni.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Při jednostupňové fermentaci se kultura bakterie Xanthomonas fuscans XFL, CCM 2850 očkuje do tekutého živného media o složení: K₂HP0₄ 0,75 g , KN0₃ 0,375 g, MgSO₄.7H₂0 0,15 g, NaCl 0,075 g, CaCl₂ 0,075 g, FeCl₃ 0,07 g, kvasničný extrakt 0,75 g, laktosa 20,0 g, H₂0 dest. ad 1000 ml.

Inokulum se připravuje v 500 ml třepacích bankách kultivací po dobu 48 h při teplotě 28°C, pH 6,5 za stálého třepání a sterilních podmínek. Takto získané bakteriální inokulum se naočkuje do očkovací baňky o objemu 5 1 obsahující 1 1 živného media o složení uvedeném výše. Očkovací baňka se kultivuje za stejných podmínek jako při přípravě inokula. Fermentační tank o objemu 14 1 obsahuje 9 1 kultivačního media. Toto medium obsahující místo laktosy syrovátku v množství 70 g/1 se zaočkuje

5-10 %obj. inokula připraveného kultivací v očkovací baňce. Doba fermentace trvá 72 - 96 h.

Fermentace se uskutečňuje v parou sterilisované fermentační aparatuře běžného vybavení s armaturou opatřenou mmíchadlem a zařízením umožňuj ícím vzdušnění a udržování konstantní teploty i pH. Během fermentace se udržuje teplota 28°C, pH 6,5, se vzdušněním 3 1/min a mícháním 300 οΐ/min na živném mediu tohoto složení: K₂HPO₄ 0,75 g, KNO₃ 0,375 g, MgSO₄.7H₂O 0,15g, NaCl 0,075 g, CaCl₂ 0,075g, FeCl₃ 0,07 g, kvasničný extrakt 0,75 g, syrovátka odbílkovaná 70 g, H₂0 dest. ad 1000 ml.

Příklad 2

Při dvoustupňové fermentaci bakterie Xanthomonas fuscans

XFL,CCM 2850 na živném mediu se syrovátkou bylo inokulum připravováno způsobem, uvedeným v příkladu 1 s tím rozdílem, že živné prostředí obsahovalo místo laktosy 7% hmot. odbílkované nebo neodbíIkované syrovátky. Fermentační tank o objemu 14 1 sloužil při dvoustupňové fermentaci jako očkovací tank. Příprava kultury v tomto fermentoru je uvedena v příkladu 1 s tím rozdílem, že doba fermentace trvá 48 hod.

Fermentace 1,stupně v tanku o obsahu 75 1 s plněním 50 1 živného syrovátkového média uvedeného výše probíhala po zaočkování inokulem v množství 5 - 10%. Inokulum bylo převedeno do fermentačního tanku z předchozího očkovacího stupně. Během fermentace se udržuje teplota 28°C, pH 6,5, vzdušnění 8 1/min, míchání 400 - 600 ot/min, přetlak 0,02 MPa. Doba fermentace trvá 66-80 h.

Pro fermentace 2.stupně ve fermentaru o objemu 300 1 s obsahem 200 1 živného syrovátkového prostředí bylo užito 5% inokulum. K tomuto účelu se vzala část fermentátu z 1.stupně kultivace. Během kultivace se udržuje teplota 28°C, pH 6,5, vzdušnění 50 1/min, míchání 600 ot/min, přetlak 0,02 MPa a doba fermentace 72 hod. Obdobně se postupuje při fermentaci 3. stupně.

Isolace biopolymeru:

Polysacharidy se isolují z kultivačního media precipitací spočívající v tomto postupu: pro získání čistého biopolymeru se odstraní nevyužitý zdroj uhlíku a organické látky 48 hodinovou dialysou proti tekoucí vodě. Živé buňky s bílkovinnou frakcí přídavkem chloroformu v poměru 25:1,0 na 100 dílů objemu bakteriální suspense s přídavkem 0,1 objemu amylalkoholu nebo butylalkoholu se důkladně promísí po dobu nejméně 24 hodin na reciproké třepačce (60 kyvů/min). Vznikají 2 vrstvy z nichž nižší se skládá ze stálého chloroform-proteinového gelu. Horní vodní vrstva se oddělí odstředěním. Poté se vlastní polysacharid precipituje 4násobným podílem ethyl(methyl)alkoholu nebo acetonu. Další zpracování se provádí sušením, lyofilizací nebo filtrací dle účelu použití.

Průmyslová využitelnost

Způsob podle vynálezu lze využít pro průmyslovou přípravu biopolymeru používaného v geologickém, stavebním, textilním, potravinářském a farmaceutickém průmyslu.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Způsob přípravy glukomannanového uhlíkatého biopolymeru vyznačený tím, že se odbílkovaná nebo neodbílkovaná syrovátka naočkuje mikroorganismem Xanthomonas fuscans XFL a fermentuje po dobu 72 až 96 hodin při teplotě 28 až 30 °C a pH 6,5 až 7,2 v jednom až třech fermentačních stupních.

   i