CZ219498A3 - Kontrastní prostředek - Google Patents

Description

Kontrastní prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká kontrastního prostředku, obsahujícího superparamagnetické částice a určeného zvláště pro zobrazování pomocí magnetické rezonance.

Dosavadní stav techniky “P ři^—di'a'gnO’s't'lckéni^_zobTaz o vání—napřík-l-ad-p ř i—pouzí-tí— rtg-paprsků, ultrazvuku a magneticié rezonance MR se běžně užívají kontrastní látky ke zvýraznění kontrastu mezi různými tkáněmi nebo orgány nebo mezi zdravou a. poškozenou tkání. Při různých zobrazovacích postupech se zvýšení kontrastu dosahuje různými způsoby. Například při zobrazování protonovou MR se zvýšení kontrastu obvykle dosahuje modifikací charakteristické doby relaxace (T^ a T₂) jader, obvykle protonů vody, z nichž je odvozen signál MR, použitý pro vytvoření výsledného obrazu.

V případě, že se do živého organismu injekčně přivádějí materiály s magnetickými vlastnostmi, například paramagnetické, superparamagnetické, ferromagnetické nebo ferrimagnetické látky, může dojít ke snížení hodnot T₁ a T₂ (nebo T₂» protonů vody ve tkáních. Přestože ke snížení hodnoty nemůže dojít bez snížení hodnoty T₂ (nebo T₂*, může být pokles odlišný od poklesu hodnoty T₂ nebo TgK. V případě, že pokles hodnoty je vetší než pokles hodnoty T₂ nebo T₂«, pak se intenzita obrazu MR zvyšuje a materiál se uvádí jako pozitivní kontrastní látka. V případě, že pokles ke menší než pokles T₂ nebo T₂«, pak se intenzita obrazu MR snižuje a materiál je označován nako ?₂ nebo T₂x negativní kontrastní látky.

• » ·’.

·· · · · • Φ· , · · · · • » · · · · ·*· • · · · · ♦ ··· »· · · · ·» ··

Částice se superparamagnetickými, ferrimagnetickými a ferromagnetickými vlastnostmi budou v průběhu přihlášky :uváděny jako magnetické částice.

Poprvé bylo použití magnetických materiálů jako MR kontrastních látek navrhováno v roce 1978, kdy Lauterbur uvedl, že by k tomuto účelu bylo možno použít soli manganu. V patentové literatuře je možno za první návrh považovat patentový spis EP-A-71564 (Schering) a jeho ekvivalent US c, 4 547 447. V tomto spisu se uvadl možné použití ehelátových-komp-hexů—paramagnetxckých“kovových^—řontů“náp'říkiaď trojmocného lanthanidu gadolinia Gd(lII).

Prvními běžně dodávanými kontrastními prostředky pro zobrazování pomocí MR, například GdDTPA, GdDTPA-BMA a GdHP-D03A (Schering, Nycomed a Bracco), nabízené pod obchodními značkami Magnevist, Omniscan a Prohance jsou rozpustné chelátové komplexy paramagnetických lanthanidových iontů, jde o pozitivní kontrastní látky, které zvyšují intenzitu obrazu v oblasti své aplikace.

Později byly jako negativní MR kontrastní látky navrženy částicové ferromagnetické, ferrimagnetické a superparamagnetické materiály. Perorální prostředky s obsahem takových cásticových materiálů, obvykle označovaných jako magnetické částice se již běžně dodávají například pro zobrazování zažívací soustavy, jde například o prostředek Abdoscan (Nycomed Imaging). Je však možno tyto částicové prostředky podávat také parenterálně v případe zobrazení jater a sleziny vzhledem k tomu, že uvedené orgány poměrně velmi rychle vychytávají cizorodé částicové materiály z krevního oběhu. Použití uvedených materiálů ke zobrazení jater a sleziny se navrhuje například v US-A-4 859 210 (Widder).

- 3 • ** * · · · fr · · · · ♦ *** « · · · · · ··· · · ·· ··

V poslední době se například v US-A-5 160 725 a W0-94/21240 (Pilgrimm) navrhuje zpomalit vychytávání parenterálně podaných magnetických částic z krevního oběhu retikuloendotheliálním systémem, čímž je možno prodloužit setrvání těchto látek v krevním oběhu, například chemickou vazbou stabilizátoru na povrch magnetických částic.

Materiálem, který může být užit tímto způsobem jako stabilizátor, mohou být uhlohydráty, například oligo- a polysacharidy, dále polyaminokyseliny, oligo- a polynukleotidy,'polyalkylenoxidy včetně poloxamerů a poloxamínů'a ' dárši“matěFíaly, navržěřTé^-šFUSt^5^—Γ6Ό^-7'2'5 a WO~9^72T24'O (Pilgrimm), v PCT/GB94/02007 (Nycomed), US-A-5 464 696 (Bracco) a US-A-4 904 497 (Illum).

Magnetické částice, povlečené tímto způsobem je možno použít například ke zobrazení krevních cév nebo lymfatických uzlin nebo je uvedené látky možno navázat ještě na činidla, cílená na určité tkáně a tak využít ke zobrazení určitých tkání nebo orgánů.

V případě zobrazení krevních cév bylo zjištěno, že snížení hodnoty pro protony v krvi může být vyšší než snížení nebo T^x, to znamená, že uvedené materiály mohou být použity jako pozitivní MR kontrastní látky při zobrazení cévního systému.

V případě parenterálního podání má rozměr částic a distribuce velikosti částic i chemická povaha povrchu částic velký význam pro stanovení účinností kontrastního prostředku, jeho poločasu v krvi, distribuce v organismu i biologické degradace prostředku. Za ideálních podmínek je rozměr magnetické částice (to znamená rozměr krystalků magnetického materiálu) uvnitř jednoho řádu, takže částice jsou » * ·· ·♦· · i v ♦ » ·* ·* superparamagnetické, nemají žádnou hysterezi a mají sníženou tendenci ke tvorbě shluků a současně je celková distribuce

-^velikosti částic v úzkém rozmezí, takže částice jsou rovnoměrně distribuovány v organismu, rovnoměrně se vylučují a - , mají dobrý kontrastní účinek. S výhodou jsou magnetické·Čás-

- tice opatřeny povlakem materiálu, který modifikuje jejich biologickou distribuci například prodloužením poločasu v krvi nebo zvýšením stálosti nebo tak, že povlak napomáhá přednostní distribuci do určitých cílových tkání, například do nádorové tkáně.

Průměrná velikost krystalků magnetického jádra se obvykle pohybuje v rozmezí 1 až 50, s výhodou 1 až 20 a zvláště 2 až 15 nm, při použití pro zobrazení cév by měla být průměrná velikost částic včetně povlakového materiálu s výhodou nižší než 30 nm. Velikost částic je možno stanovit . elektronovým mikroskopem. Příprava superparamagnetických krystalků nebo komplexnějších částic s uvedeným rozměrem .není sama o sobě zvláště obtížná. Avšak příprava částic s požadovaným rozměrem, přijatelnou distribucí velikosti částic a současně bez shlukování krystalků již naráží na obtíže, které je třeba řešit.

V typických případech se magnetické krystalky srážejí z kapalné fáze, obvykle v roztoku polymerní látky, tvořící povlak, například současným srážením podle US-A4 452 773 (Molday). Tento postup vede ke vzniku poměrně polydispergovaných částic, pak je zapotřebí ještě uskutečnit frakcionaci částic podle velikosti, například odstředěním nebo chromatografií. Takovým způsobem je připravován například prostředek AMI 227 (Advanced Magnetics).

Nyní bylo zjištěno, že magnetické částice se zvláště výhodnými vlastnostmi je možno získat tak, že se tyto čás..·· tice.'připravují .srážením ve vodném .prostředí,· obsahujícím·..<ν·'-·:,:

- 5 ·* 4 · ···♦ * · * ·· · · · · ·· « 4 4 · 4 4444 44·4 • » · · · * · ·, «· · ·* ·· ·* ' polymer s rozvětveným řetězcem a pak se polymer rozštěpí, čímž se uvolní složené částice, obsahující magnetické čás_: tice a povlak rozštěpeného polymeru.' ¹ '

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby složených magnetických částic, který spočívá v tom, že se magnetické částice, s výhodou superparamagnetické částice vytvoří ve vodném prostředí, které obsahuje hydrofilní organický polymer s rozvětveným řetězcem a pak se tento polymer rozštěpí, Čímž se uvolní složené částice, z nichž většina s výhodou obsahuje jednotlivou magnetickou částici.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1, 2 a 3 je znázorněno zobrazení králíka pomocí ,MR při použití kontrastního prostředku, připraveného způsobem podle vynálezu,

Hydrofilní organický polymer s rozvětveným řetězcem, použitý při provádění způsobu podle vynálezu může být jakýkoliv přírodní, syntetický nebo polosyntetický polymer s rozvětveným řetězcem, který může v případě potřeby být vyroben roubováním nebo zesítěním lineárního hydrofilního polymeru.

. V případě, že hydrofilní polymer s rozvětveným řetězcem je značně, zesítěný polymer, dojde při rozštěpení polymeru při provádění způsobu podle vynálezu k rozrušení zesítěné polymerní matrice. Je proto výhodné, aby zesítující vazby byly přístupné chemickému nebo biochemickému Štěpení za podmínek, při nichž nedochází k podstatnější degradaci magne., tických částic < Zvláště,- výhodnými- zesítěný.mi polymery, jsou· a'-?· · • *♦ ··« · · • · · ·« ·

- 6 například zesítěné polymery, vytvářející hydrogel s esterovými vazbami, například vytvořené zesítěním polymerů s

... . hydroxyskupinamijako lineárních, uhlohydrátů, například. .... dextranu -nebo. pólyvinyla-lkoholu. V případě potřeby mohoubýt polymery.vhodným způsobem substituovány, tak, aby bylo;.

- možno zabránit úplnému rozštěpení esterových vazeb nebo toto štěpení řídit. Esterové skupiny mohou být rozštěpeny působením baze, například amoniaku nebo hydroxidu alkalického kovu'.

Při provádění způsobu podle vynálezu je zvláště výhodným hydrofilním polymerem s rozvětveným řetězcem přírodní, syntetický nebo polosyntetický uhlohydrát, zvláště materiál, schopný tvorby gelu ve vodném prostředí, zvláště výhodně jde o polysacharidový materiál, jako glykogen a zvláště škrob, V případě potřeby je možno použít i směs hydrofilních polymerů, z nichž nejméně jeden je rozvětvený. V případě, že se jako polymer užije škrob, může jít o přírodní škrob nebo o zpracovaný škrob, například o škrob, zpracovaný působením kyseliny nebo enzymu nebo o solubilizovaný škrob. Zvláště výhodné jsou škroby přírodního původu, zvláště rostlinné škroby, jako kukuřičný, bramborový, rýžový nebo pšeničný škrob.

Přírodní škroby jsou kombinací obvykle lineární amylosy a rozvětveného polysacharidu amylopektinu. Pro použití při provádění způsobu podle vynálezu je přítomnost amylosy -přijatelná, avšak její množství s výhodou není tak vysoké, .aby došlo ke značně irreversibilnímu přechodu z dispergovaného stavu do v podstatě nerozpustného mikrokrystalického stavu. Z tohoto důvodu je výhodnější použití bramborového škrobu, bohatého na amylopektin než použití kukuřičného nebo pšeničného škrobu.

• ·♦

V případě, že polymerním materiálem, použitým při provádění způsobu podle vynálezu je materiál, který je ovlivněn rozpuštěním ve vodném prostředí a následným tepelným zpracováním, například materiál typu škrobu, který z granulárního stavu nejprve nabobtná a částečně se rozpustí a pak mohou být vlastnosti produktu ovlivněny tepelnými podmínkami, je výhodné zajistit teplotní podmínky, kterými je možno řídit viskositu a strukturu prostředí. V případě škrobu je výhodné reakční prostředí vytvořit, zchladit a pak zahřát, například vytvořením vodné disperze při teplotě 60 až 95 °C, zchlazením na teplotu 5 až 80, například 5 až 60 °C a pak opětným zahřátím na 45 až 85, například 45 až 80 °C. Tímto způsobem je možno dosáhnout výhodné struktury prostředí pro srážení.

Je pravděpodobné, že hydrofilní organický polymer s rozvětveným řetězcem obsahuje místa, vhodná pro srážení a dovoluje tak tvorbu malých vysrážených částic poměrně uniformní velikosti. Použití nerozvětvených hydrofilních polymerů, například želatiny nebo dextranu nebo anorganických gelů, například silikagelu je neúčinné.

Hydrofilní polymer s rozvětveným řetězcem je s výhodou přítomen v koncentraci, dostatečné k vytvoření gelové formy srážecího prostředí při teplotě místnosti nebo při teplotě, která se od teploty místnosti příliš neliší, například 0 až 60 °C. Koncentrace má být taková, aby gel mohl vzniknout při teplotě až 80 °C. V případě Škrobu je možno užít koncentrace 1 až 200, například 2 až 150, s výhodou 20 až 100 a zvláště 40 až 90 g/1.

Srážecím prostředím je obvykle vodné prostředí, může však také jít o směs vody a pomocného rozpouštědla, například alkoholu, etheru nebo ketonu, mísitelného s vodou.

fc fc* fc · fc • fcfc fc·· fcfc fcfc fc

Jak již'bylo svrchu uvedenoje výhodné, aby bylo použito srážecí prostředí v koloidním stavu, to znamená ve stavu, označovaném jako gel. V takovém prostředí polymerní materiál vytváří sít,'mezi níž se^J nachází vodné’ dispergáční ' prostředí. Takový gel bude mít obvykle vyšší viskozitu než samotné vodné disperzní prostředí, avšak pro účely vynálezu nemusí být gel tak viskózní, aby byl v pevném nebo polotuhém stavu. Struktura gelu může být tak volná, že srážecí prostředí může být tekuté. Avšak v tomto případe je nutno ověřit gelovou povahu prostředí jeho thixotropními vlastnostmi, zvláště tím, že viskozita takového prostředí se snižuje v průběhu míchání.

Srážecí prostředí musí obsahovat svrchu uvedený polymer s rozvětveným řetězcem, mimoto však může obsahovat ještě další polymery, vytvářející gel, například s lineárním řetězcem. Jako příklady vhodných polymerů pro toto použití je možno uvést bílkoviny, polysacharidy, proteoglykany a smáčedla, vytvářející gel, například smáčedla typu sledového kopolymerů řady Pluronic a Tetronic, jako prostředky F-127, F-108 a F-68. Tato smáčedla vytvářejí ve vodném prostředí gely při vyšších teplotách a při pH, přijatelném pro provádění způsobu podle vynálezu. Jako příklad je možno uvést, že srážecí prostředí ve formě gelu lze připravit při použití vodné disperze lineárního, gel vytvářejícího smáčedla typu sledového kopolymeru a organického polymeru s rozvětveným řetězcem, například amylopektinu.

Matrice gelu srážecího prostředí by však měla být taková, aby umožnila chemické nebo biochemické štěpení nejméně jedné složky polymeru, s výhodou rozvětveného polymeru k uvolnění magnetických částic. Z tohoto důvodu není žádoucí použití příliš zesítěných polymerů.

• ·

Srážení částic je možno uskutečnit ve vodném prostředí, které má formu polotuhého nebo tuhého gelu, například zpracováním gelu působením baze, avšak s výhodou se srážení.provádí v zahřátém: a míchaném vodném prostředí, - které, může, ale nemusí mít podstatně vyšší viskozitu než voda. Zvláště výhodně se.srážení provádí při teplotě-40 až 95 °C za šetrného míchání.

Úpravou thixotropních vlastností vodného srážecího prostředí je možno připravit složené částice podle vynálezu s velmi různými rozměry.

Je pravděpodobné, že tvorba magnetických částic při . provádění způsobu podle vynálezu probíhá ve dvou stupních, v nichž se vytvoří oblasti amorfního materiálu, které se pak přetvoří na magnetické částice při vyšší teplotě, například 40 až 95 °C, s výhodou 50 až 93 °C. Bylo zjištěno, že vývoj magnetických částic je mošno sledovat v průběhu minut až hodin, například až 3 hodiny. V praxi je však tvorba magnetických částic ukončena do 2 hodin, přičemž vývoj je v podstatě téměř ukončen do 20 minut.

Magnetickými částicemi, které se tvoří ve vodném prostředí, mohou být částice jakéhokoliv oxidu nebo hydroxidu magnetického kovu, které je možno vysrážet, včetně směsných sloučenin kovů, tak jak byly uvedeny například v US-A4 827 945 (Groman), EP-A-525 189 (Meito Sangyo), EP-A-580878 (BASF) a PCT/BG94/02097 (nycomed) nebo ve svrchu uvedených patentových spisech (Pilgrimm). V této souvislosti je možno zvláště uvést oxidy magnetického železa obecného vzorce kde • · .···· · « .«.·· ·· ·· ·

- 10 a jsou přechodné nebo lanthanidové kovy s valencí

II nebo III, z nichž alespoň jedním je železo, n znamená 0 nebo kladné Číslo, zvláště obecného vzorce . _; (M^II0)nFe203(M^III20₃)_m kde je dvojvazný kov, například Fe, Mg, Be, Mn, Zn, Co, Ba, Sr a Cu, je trojvazný kov, například Al, Yb, Y, Mn, Cr nebo lanthanid a n a m znamenají 0 nebo kladné číslo.

S výhodou jsou magnetickými částicemi oxidy železa vzorce (FeO) Fe„O_q, kde n je 0 nebo 1, typickým příkladem n d o je maghemit (gamma-Fe₂0₃) a magnetit (Fe₃C>₄) nebo může jít o směsi magnetických oxidů železa.

Jako zdroj solí železa je možno užít širokou škálu III II těchto solí k získání iontů Fe a Fe , například FeClp,

TTT TT TT

FeCl_q, Fe -citrát, Fe -glukonát, FeSO., Fe_q(SO.)_q, Fe ^J II ^11 ^{ά ó} oxalát, Fe(NO_q)_q, Fe -acetylacetonát, Fe -ethyldiamoniumTT TTT TTT sulfát, Fe¹ -fumarát, Fe -fosfát, Fe -pyrrofosfát, citronan železítoamonný, síran železnatoamonný, síran železitoamonný a oxalát železnatoamonný. Poměr iontů Fe a III

Fe by se měl pohybovat v rozmezí 1 ; 5 až 5 : 1.

Srážení je možno zahájit nastavením pH vodného prostředí nad prahovou hodnotu pro zahájení srážení, obvykle •·*» ;·

9 · • 9 ·· «9 * ·» 9 ·* 9 • * · ·· přidáním baze, s výhodou vodné baze, například hydroxidu alkalického kovu, jako hydroxidu sodného, draselného nebo lithného nebo hydroxidu amonného, s výhodou koncentrovaného hydroxidu amonného. Přidaná baze by měla mít dostatečnou hodnotu pKb pro úpravu pH vodného prostředí nad práh pro zahájení srážení, například nad hodnotu 10.

Baze se s výhodou přidává k vodnému prostředí, které obsahuje ionty kovu a polymer. Je také možno postupovat tak, že se smísí baze a polymer a pak se přidají ionty kovu Toto přidání je možno uskutečnit smísením vodných roztoků složek při vyšší teplotě, například 40 až 95, s výhodou 50 až 50 °C za míchání.

Je pravděpodobné, že po zahájení srážení dojde v amorfních paramagnetických oblastech kovových iontů nebo hydroxidů kovů ke tvorbě krystalků magnetických částic, působících jako očkovací materiál, místo tvorby jsou určována polymerem s rozvětveným řetězcem, postupně se amorfní oblasti přemění úplně na magnetické částice. Tato tvorba částic může probíhat minuty až dny, například 1 minutu až 24 hodin, s výhodou 20 minut až 10 hodin a zvláště 1 až 5 hodin.

V případě, že se částice vytvářejí při teplotě v hor ní části uvedeného rozmezí, například při teplotě 90 °C, udržuje se prostředí s výhodou na této vyšší teplotě pouze po relativně krátkou dobu, například až 2 hodiny.

V případě, že se baze, kovové ionty, určené ke sráze ní a polymer smísí při nižší teplotě a pak se prostředí zahřeje na vyšší teplotu ke tvorbě magnetických částic, měla by být rychlost zvyšování teploty pečlivě řízena a měla by se pohybovat například v rozmezí 10 až 100 °C za hodinu.

To znamená, že se v průběhu tvorby částic teplota vodného prostředí s výhodou zvyšuje řízeným způsobem tak, aby zvyšování teploty bylo v průběhu času lineární, postupuje se například tak, že teplota při míšení je 55 °C a konečné teploty 90 °C se dosáhne v průběhu 2 hodin.

Po ukončení tvorby částic je velmi vhodné reakční prostředí neutralizovat úpravou jeho pH například na hodnotu v rozmezí 6,0 až 8,5, Toho je možno dosáhnout například tak, Že se prostředí zchladí za vzniku gelu, který je pak možno promývat až do neutrální reakce, nebo je možno prostředí neutralizovat působením kyseliny, přijatelnou kyselinou je například kyselina chlorovodíková, sírová nebo dusičná, nebo je možno přidat pevný oxid uhličitý nebo je možno uložit materiál při nižším než atmosférickém tlaku k odstranění baze v případě, že má vysoký tlak par, jak je tomu například v případě hydroxidu amonného. Neutralizované prostředí je možno okamžitě dále zpracovávat.

Neutralizace promýváním je zvláště účinná v případě, že prostředí vytvořilo pevný usazený gel a je zapotřebí odstranit přebytek kovových solí a baze. K promývání je možno užít deionizovanou vodu, s výhodou předem zchlazenou na teplotu 3 až 15 °C, promývání se provádí až do dosažení přibližně neutrálního pH.

I když je možno promytý gel jednoduchým způsobem zpracovat ultrazvukem k rozrušení matrice gelu bez rozštěpení polymeru za uvolnění magnetických částic, opatřených povlakem polymeru, bylo prokázáno, že výsledný produkt ve formě částic má zvláště vhodné vlastnosti v případě, že polymer je rozštěpen k uvolnění povlečených částic, například rozrušením molekulární struktury polymeru. Toto rozrušení je možno uskutečnit čhemicky při použití příslušných činidel například oxidačních látek nebo baží, avšak také biochemicky, například působením enzymu. V případě polymerů typu uhlohydrátu, například škrobu, je možno polymer rozštěpit, enzymaticky , například působením amylázyjako alfa-amylázy. Je však zvláště výhodné rozštěpit polymer působením oxidačního činidla. Zvláště výhodná jsou oxidační či-, nidla, která jsou ve stopovém množství tolerována biologickými tkáněmi nebo jejichž redukční produkty jsou tolerovány biologickými tkáněmi, jako jsou oxyanionty halogenů, například chlornany alkalických kovů, například chlornan sodný nebo vápenatý, dále jodistany, jako jodistan sodný, manganistany, jako manganistan draselný, peroxidy, jako peroxid vodíku a enzymatická oxidační činidla. Jakýkoliv přebytek použitého oxidačního činidla se s výhodou později inaktivuje například přidáním močoviny v případě použití chlornanu. Při rozštěpení polymeru působením oxidačního činidla mají uvolně né magnetické částice negativní povrchový náboj, čímž se dále snižuje možnost shlukování částic.

Chemická činidla, použitá pro rozštěpení polymeru by s výhodou neměla porušovat magnetické Částice nebo vyvolat ztrátu magnetických vlastností těchto částic. To znamená, že použití látek kyselé povahy je obvykle nežádoucí.

Rozsah rozštěpení polymeru je mošno podle potřeby měnit tak, aby na povrchu výsledných částic zůstalo určité menší nebo vetší množství zbytku polymeru jako povlak částice. Je rovněž nutno uvést, Me povlak je obecně žádoucí složkou částice a v důsledku toho je celkový rozměr složené částice o něco větší než rozměr magnetické částice, tvořící jádro. Podle použitého postupu štěpení může být zbytek, tvořící povlak částice stále ještě polymerní, nebo může jít o oligomer nebo dokonce monomer.

; · ·ϊ··· · ···; Z • · · · ·^ρ * ..

*>· ·· ··' ·· ··

Po rozštěpení polymeru se produkt s výhodou žhaví promytím znečišťujících látek při použití filtrace přes membránu, například ultrafiltrace nebo diafiltrace.

Výsledný rozměr částic je obvykle v rozmezí 1 až 300, s výhodou 4 až 30 a zvláště 8 až 20 nm. V této souvislosti je nutno uvést, že při výhodném rozštěpení polymeru dochází ke tvorbě menších částic než při enzymatickém štěpení, přičemž oba tyto postupy mohou zajistit menší částice, než jaké je možno připravit zpracováním gelové matrice ultrazvukem.

V jednom z výhodných provedení je možno složené částice připravit v jediném stupni, čímž je možno snížit celkovou reakční dobu, současně je možno odstranit nutnost dalšího zpracování meziproduktů a současně snížit vliv teploty na magnetické částice. Při tomto výhodném provedení se postupuje tak, že se soli trojmochého a dvojmocného železa, například chloridy rozpustí v roztoku škrobu ve vodě a částice oxidů železa se vysrážejí přidáním baze, například vodného amoniaku. Reakce se nechá probíhat 1 až 3 hodiny při teplotě 70 až 90 °C, načež se přebytek baze sníží nebo odstraní, například při použití sníženého tlaku a/nebo vedením proudu dusíku nad horkou reakční směsí v případě použití amoniaku.

Pak se pH sníží pod 8,2 nebo na hodnotu, při níž reakční směs ztrácí svou pufrovací schopnost. Pak se přidá oxidační činidlo, například hypochlorid sodný, stále ještě při teplotě 70 až 90 °C a oxidace se nechá probíhat při této teplotě tak dlouho, až se vytvoří složené částice požadovaného rozměru.

Pro vytvoření složených částic s průměrem 10 až 20 nm se bude reakční doba pohybovat v rozmezí 30 až 120 minut. Při 0,47 Tesla a teplotě 40 °C by magnetická moment nasycení měl být vyšší než 50 EMU/g FeOx, r^ by melo být vyšší než 15 mM/s a r₂/r₁ by měl mít nižší hodnotu než 2,3. K reakční směsi se pak přidá močovina a směs se zfiltruje, například přes filtr s průměrem ok 0,2 mikrometrů. Zbytky škrobu je možno odstranit diafiltrací, například při použití membrány, která oddělí látky od molekulové hmotnosti 20 000 až 200 000.

Magnetické částice jádra mají s výhodou rozměr, typický pro částice jediné oblasti, například 1 až 50, s výhodou 1 až 20, ještě výhodněji 2 až 15 a zvláště 4 až 12 nm. Složené částice, získané způsobem podle vynálezu obsahují obvykle jako jádro jediný krystalek, který má obvykle rozměr 4 až 12 nm.

Způsob podle vynálezu je tedy možno použít pro výrobu složených částic, to znamená magnetických částic, opatřených povlakem rozštěpeného polymeru, přičemž je možno dosáhnout dostatečně úzké distribuce velikosti částic k tomu, aby již nebylo zapotřebí provádět další frakcionaci podle velikosti. Získaný materiál má například alespoň 90 % částic s odchylkou pouze 10 nm, s výhodou 5 nm a zvláště 2 nm, jak je možno prokázat spektroskopicky. Tyto částice se obvykle přesto filtrují přes filtr s otvory poměrně velkého průměru,, například 0,1 až 0,2 mikrometru, aby byly odstraněny náhodné velké fragmenty polymeru nebo jakékoliv jiné biologické nebo částicové nečistoty. Výslednou velikost částic je možno stanovit elektronovým mikroskopem.

Složené částice, získané způsobem podle vynálezu jsou samy o sobě nové a rovněž tvoří součást podstaty vynálezu. Součást podstaty vynálezu tvoří tedy také složené částice, s výhodou opatřené nábojem, které mají střední průměr 4 až 30 nm a obsahují superparamagnetické anorganické částice jádra a povlak z rozštěpeného hydrofilního polymeru, s výhodou oxidovaného uhlohydrátu a zvláště rozštěpeného škrobu. Většina těchto složených Částic bude s výhodou obsahovat jako jádro jediný krystalek superparamagnetické sloučeniny.

Σ , (.«'i * » ***' » • · · · .· · .*· *· »· ·*

·· «· •Součást podstaty vynálezu tvoří také kontrastní prostředek, který obsahuje účinné množství složených částic, tvořených jádrem, kterým jsou krystalky superparamagnetického oxidu kovu a organickým povlakem, přičemž krystalky jádra mají střední průměr 2 až 10, s výhodou 4 až 8 nm a celé částice mají střední průměr až 30, s výhodou až 15 nm, přičemž povlak je tvořen odixativně rozštěpeným škrobem, s výhodou spolu s polyalkylenoxidem s navázanými funkčními skupinami, může například jít o polyethylenglykol s koncovou skupinou oxidu fosforu, jako je methoxy-PEG-fosfát.

Způsob podle vynálezu je možno uskutečnit ve dvou oddělených koncích tak, že se nejprve vytvoří složené částice, například běžným současným srážením obou složek, tak jak se tento postup provádí při výrobě magnetických mikrokuliček s obsahem škrobu, MSM například podle mezinárodní patentové přihlášky WO 89/03675 (Schroder) , polymer se pak rozštěpí za vzniku složených částic podle vynálezu. Složené částice, vyrobené tímto způsobem mohou obsahovat v každé částici větší počet magnetických krystalků. Tento postup rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.

Pro určitá použití může být žádoucí odstranit v podstatě veškerý povlak rozštěpeného polymeru z magnetických částic a popřípadě jej nahradit jinou látkou, modifikující povrchové vlastnosti. V tomto případě je možno použít oxidač ní činidlo, s výhodou neiontové oxidační činidlo, například peroxid vodíku nebo také enzym, schopný rozrušit rozštěpený polymer, například amylázu. Použití iontových oxidačních činidel je méně výhodné z toho důvodu, že tyto látky snižují elektrostatickou stálost a mohou vyvolat shlukování magnetických částic po odstranění stericky stabilizovaného povlaku rozštěpeného polymeru. Před odstraněním povlaku polymeru je tedy žádoucí přidat stabilizační činidlo, například elek·· • * * • · · »· · · · ♦ »

4« trostatické stabilizační činidlo, jako fosforečnan nebo hydrogenfosforečnan sodný, tyto látky jsou schopné se vá zat na magnetické částice a stabilizují tak elektrostaticky jejich suspenzi.. Hodnota pH by měla být udržována v neutrální nebo slabě alkalické oblasti, například přidáním hydroxidu sodného vzhledem k tomu, ze kyselé pH může způsobit vyvloČkóvání protonací fosfátového stabilizačního činidla. Bylo zjištěno, že inkubace magnetických částic, opatřených povlakem rozštěpeného škrobu s hadrogenfosforečnanem sodným a peroxidem vodíku při teplotě 50 až 60 °C celkem 3 až 24 hodin je dostatečná k odstranění v podstatě veškerého povlaku rozštěpeného polymeru, odvozeného od škrobu. Výsledné částice mají.střední průměr přibližně 9 nm, jsou stálé v suspenzi při teplotě místnosti i při sterilizaci parou.

Tyto stálé suspenze elektrostaticky stabilizovaných magnetických částic jsou nové a rovněž tvoří součást podstaty vynálezu. Vynález se tedy týká také vodné suspenze superparamagnetických anorganických částic jádra se středním průměrem částic 4 až 30 nm, přičemž tyto částice jsou v podstatě zbaveny organického povlaku a nesou povrchově vázané anorganické elektrostatické stabilizační činidlo.

Po rozštěpení polymeru, v jakémkoliv požadovaném promytí a odfiltrování uvolněných částic se částice s výhodou opatří povlakem druhého materiálu, například ke zvýšení biologické snášenlivosti snížením aktivace komplementu, k prodloužení životnosti částic v krevním oběhu, k dosažení možnosti cílení částic do určitých tkání, ke zvýšení skladovatelnosti nebo ke zlepšení samovolného štěpení částic.

Druhý povlak je možno na částice uložit také ve dřívějším stupni, například před tvorbou magnetických částic nebo po tvorbě magnetických částic před štěpením polymeru.

..... · ....

·« ·· · ·· ·· *

- 18 Ve zvláště výhodném provedení je druhým povlakovým materiálem povlak přírodního nebo syntetického polysacharidu, syntetické polyaminokyseliny nebo fyziologicky snášeného syntetického polymeru,: například tak jak byly tyto látky popsány v PCT/GB94/02097, použít je možno také stabilizátory, popsané svrchu v publikaci Pilgrimma nebo Illuma. Ve zvláště výhodném provedení je materiálem pro druhý povlak polyalkylenoxid, například poloxamer, poloxamin, polyethylenglykol a podobně, nebo heparinoid, velmi výhodné jsou materiály, nesoucí funkční skupiny, jako oxykyseliny, například kyslíkaté kyseliny síry, uhlíku a fosforu, při jejichž použití se materiál povlaku může chemicky vázat nebo adsorbovat na složené částice a zvláště na magnetické částice jádra. V této souvislosti je nutno zvláště uvést methoxy-PEG-fosfát MPP a další materiály typu polyalkylenoxidu, popsané v US-A-5 160 725 (Pilgrimm) a ve W0-94/21240. Příznivých účinků MPP je možno využít také při použití hydrofilních polymerů s koncovými funkčními skupinami jiných siderofilních látek, než jsou fosfátové skupiny MPP. Jednou z těchto skupin je například salicylát. Tuto skupinu je možno vázat na PEG konjugací této látky s kyselinou 4-aminosalicylovou nebo

5-aminosalicylovou, obě tyto látky jsou v podstatě- neškodné s dlouhou historií biologického použití.

Dalším vhodným druhým materiálem pro tvorbu povlaku je 3-hydroxy-4-pyridino, nesoucí hydrofilní polymer, jako PEG na dusíkovém atomu pyridinu. Jednoduché analogy, například 1,2-dimethyl-3-hydroxy-4-pyridino jsou již užívány klinicky k odstranění přebytků železa z lidského organismu, například u lidí, jimž bylo nezbytné podat velké množství červených krvinek. Tyto sloučeniny mají vysoké vazné konstanty pro trojmocné železo, například log-beta(3) je řádu 35. V této souvislosti je možno použít několik způsobů pro výrobu těchto látek. Polymer PEG je možno vázat na atom dusíku • · · ··· ·· • · · ·· »* • · * ·· ··

- 19 2-methyl-3,4-dihydroxypyridinu alkylaci. PEG je také možno vázat na 2-methyl-3-hydroxypyridin alkylaci s následnou oxidací výsledného produktu v poloze 4. Je však možno také. nechat reagovat PEG, který nese primární aminoskupinu. s 3-hydroxy-2-methyl-4-pyronem a pak nahradit atom kyslíku v kruhu atomem dusíku a tak vytvořit v jediném stupni požadovaný 3-hydroxy-4-pyrídinon.

l-PEG-2-methyl-3-hydroxy-4-pyridinon

Další možností vazby polymerů typu PEG na povrch oxidů železa je vázat tyto látky na některou z velkých skupin bakteriálních .sideroforů, jako příklad je možno uvést ferredoxin/ferrioxamin. Ferrioxamin má koncovou aminoskupinu, kterou je možno použít k vazbě na vhodný derivát PEG acylací nebo alkylaci.

Další možností vazby druhého povlakového materiálu na povrch oxidu je použití oligomerů nebo polymerů skupin, schopných vazby na železo, například fosfátů, jako difosfátů, trifosfátů a vyšších polymerů, které jsou výhodnější než monofosfát MPP. Takové oligo- a polyfosfáty jsou schopné velmi silné vazby na částice oxidu železítého, pravděpodobně vzhledem k přítomnosti většího počtu vazných míst a konjugační reakce je jednoduchá a snadno probíhá. Například místo svrchu uvedeného methoxy-PEG-fosfátu je možno použít methoxy-PEG-difosfát nebo methoxy-PEG-trifosfát, jak bude dále

- 20 ··· 9 ♦

• 9 · 1

9· ·* 'uvedeno v příkladové částí. Oligo- a polyfósfáty, sulfáty a sulfonáty je také možno použít ke konjugaci jiných vektorů pro magnetické částice, jak bude dále vysvětleno.

Místo fosfátových vazných skupin pro vazbu druhého povlakového materiálu nebo jiného vektoru na povrch oxidu je možno použít také fosfonátové vazné skupiny, například methoxy-PEG-fosfonáty. Toto použití nabízí řadu potenciálních výhod, zvláště zvýšenou stálost při hydrolýze vzhledem k náhradě vazby P-O-C v MPP vazbou P-C, která je potenciálně pevněji vázána na povrch oxidu a také zvýšenou chemickou stálost, která může dovolit tvorbu širší škály heterobifunkčních PEG-fosfonátů pro použití k vazbě na povrch magnetických krystalů.

Například následující heterobifunkční spojovací řetězce

H₂O₃P-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂ 0 J-SCN

Ci

H₂O₃P- (CH₂CH₂O)_TiCH₂CH₂ -N~ i

I

H₂O₃P- (CH₂CH₂O) _nCH₂CH₂-S-CH=CH₂

I o

(A) (B) (C)

H₂O₃P- (CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-S-S-^ 0 o

¹ Λ

H₂O₃P- (CH₂CH₂O) _nCH₂CH₂-C-O-N (D) (E) « ·· • · * • · ·

A · • ·* ♦ · · ♦ • · · · * · ··· • · « · ♦ ·»· «· ·· · by bylo možno použít pro vazbu magnetických částic na bilkoviny, fragmenty bílkovin, oligopeptidy a další peptidové vektory. Materiály vzorce A až E je možno vázat na uvedené peptidové látky pomocí reaktivního thiolu nebo amiňoskupin ; a pak je vázat na magnetické částice přes fosfořiátové sklipiny.

Dalšími vhodnými skupinami pro vazbu PEG nebo jiné vektorové skupiny na magnetické částice jsou další skupiny s vysokou vaznou afinitou pro ionty železa, jako hydroxamátové, katecholové, askorbátové a deferrioxaminové skupiny.

Molekulová hmotnost druhého povlakového materiálu není zvláště kritická a může se pohybovat v rozmezí 100 až 1 000 000, například 300 až 20 000, s výhodou 500 až 10 000 a zvláště 1000 až 5000, může jít například o polyalkylenoxidy, obsahující nejméně 60 opakujících se alkylenoxidových jednotek.

Hmotnostní poměr druhého povlakového materiálu k anorganickým částicím jádra se se s výhodou pohybuje v rozme zí 0,02 až 25 g/g, ještě výhodněji v rozmezí 0,4 až 10 a .. zvláště 0,5 až 8 g/g.

Zvláštní výhodou složených částic podle vynálezu, opatřených dvojím povlakem je skutečnost, že takové částice je možno sterilizovat v autoklávu, například 15 minut při teplotě 121 °C bez příliš velkých nežádoucích změn rozměru částic nebo distribuce velikosti částic. Tato skutečnost je velmi důležitá vzhledem k tomu, že předchozí stupně postupu nemusejí být prováděny za aseptických podmínek, což zvyšuje hospodárnost výroby těchto částic.

·· · « ·“'··♦ · · · ’ © · · · · * · * · · φ © · · « φ ··© * ··· · * φ © φ φ « © · · · • © © ·♦ »« «· · · ”

- 22 Kromě uložení povlaku druhého povlakového materiálu je možno složené částice podle vynálezu modifikovat ještě jinými způsoby. Je například možno tyto částice zpracovávat působením funkčního činidla k dosažení vazby zbývajícího povlaku uhlohydrátu, nebo je možno navázat skupiny, jimiž je možno částice zacílit na určité místo, jako protilátky, fragmenty protilátek, peptidy nebo biologické molekuly, například insulin, nebo je možno navázat na některý z povlakových materiálů běžným chemickým způsobem reportérové skupiny, například skupiny, využitelné při diagnostickém zobrazování pomocí rtg-paprsků, MR, ultrazvuku a podobně. Další vektory pro cílené uložení materiálu a imunoreaktivní skupiny byly popsány například ve W0-93/21957.

Typicky je možno konjugáty mezi magnetickými částicemi a vektorovou nebo reportérovou skupinou vyjádřit vzorcem

MP - X - L - V kde

MP je magnetická částice, popřípadě s odstraněným polymerním povlakem, jak byla popsána svrchu,

X je zakotvující skupina, schopná vazby na povrch částice, jako fosfát, oligo- nebo polyfosfát, fosfonát, hydroxamát nebo jiná siderofilní skupina,

L je chemická vazba nebo s výhodou vazná skupina, s výhodou organický řetězec s molekulovou hmotností 1000 až 1 000 000, například PEG s molekulovou hmotností 2000 až 50 000, zajištující vazbu nejméně jedné skupiny X na nejméně jednu skupinu V a

V je vektorová nebo reportérova skupina.

• ♦ · • · · · • · « »· ·»

- 23 » * ΐ ♦ · • ·· · · ♦ · i 9 · * * » ·*♦ • t · · · · ··· ·· · · ··

Vektorovou nebo reportérovou skupinou ve významu V je například skupina, která modifikuje biologickou distribucí magnetické částice, například vyvolává její přednostní nahromadění v určitých, orgánech, tkáních nebo chorobně ' změněných tkáních, nebo jde o skupinu, snadno prokazatelnou diagnostickým zobrazováním, například chelatovaný ion těžkého kovu, paramagnetického kovu, radioaktivního kovu nebo může jít o mikrobublinku plynu nebo látku, takové mikrobublinky vytvářející, o nekovovou radioaktivní látku, o nekovový atom, který nemá nulový nukleární spin, například atom fluoru s výjimkou atomu vodíku nebo o těžký atom, odlišný od kovu, například jod, o látku, nesoucí barevnou skupinu, fluorescenční skupinu, účinnou látku a podobně.

Uvedeným způsobem je možno na magnetické částice navázat širokou škálu vektorových a reportérových skupin. Jako příklad vektorů pro zacílení částic je možno uvést PEG, způsobující prodloužení pobytu materiálu v krevním oběhu, t-PA, streptokinázu a urokinázu jako úplné bílkoviny nebo jako fragmenty, obsahující vazné oblasti, dále peptidy, obsahující RGD a analogické skupiny, schopné se vázat na receptory krevních destiček, peptidy, schopné se vázat na atherosklerotické plaky, například fragment SP-4 apolipoproteinu B. Některé z těchto látek se běžně dodávají, například t-PA (Genentech). Peptidy typu RGD jsou popsány v patentové literatuře, například v US-A-4 589 881, US-A4 661 111, US-A-4 614 517 a US-A-5 041 380. Jako příklad použitelného peptidu typu RGD je možno uvést Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Ala-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Lys-Lys-CONH^» tento peptid je konjugovatelný svým Lys-Lys-CONH^-zakončením. Peptid je možno připravit běžnou syntézou oligopeptidů, například v pevném stavu. Peptid SP-4 ve formě (Tyr)-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Gly-Ala-Lys-CONH^, kde (Tyr) se přidává k umožnění radioaktivního značení jodem, je možno ke konjugaci · ·· * · · * · * .** 4 »· ··· »♦··· ·· · • · » » · · .- .* využít pres zakončení Lys-CONH^. Také tuto látku je možno p.řipravit běžnými postupy.

V případě, že V je chelatovaný kov, bude vazný řetězec obsahovat příslušnou, chelatační skupinu, například skupinu DTPA, EDTA, TMT, D03A a podobně.· Takové skupiny jsou velmi dobře známé v oboru diagnostického zobrazování s použitím kontrastních látek a mohou být konjugovány přes funkční skupiny, navázané na základní řetězec, například CH₂0SCN nebo přes některou z koordinačních skupin pro kov, například přes skupinu CHgCOOH.

Kovový ion se volí podle zamýšleného použití, může jít například o Y, chelatované pomocí TMT v případě scintigrafie nebo o europium, chelatované TMT v případě fluorescenčního zobrazování.

I

V případě zobrazení pomocí rtg-záření je vhodné použít jodovaný organofosfát nebo fosfonát nebo oligo- nebo polyfosfát vzhledem k tomu, že takové látky stabilizují magnetické částice a současně působí jako kontrastní látky zvýšením neprostupnosti částic. Jako příklad jodovaných organofosfátů je možno uvést sloučeniny obecného vzorce

kde 1 2

R a R jsou popřípadě, avšak s výhodou, hydroxylované alkylo vé skupiny o 1 až 6 atomech uhlíku a fc • fcfc

fc · · * • fc fcfc· • * * fc· ·* • fc fc »

R je vazná skupina, například vytvářející řetězec o až 6 atomech uhlíku.

Je zvláště výhodné., aby se na sloučenině X-L-V nacházelo větší počet zakotvujících míst pro vazbu ná magnetickou částici. Výhodné sloučeniny X-L-V je tedy možno vyjádřit vzorci ;^LM

V -L (X)_p* nebo kde a L₂ jsou složky vazného řetězce L a p má hodnotu 2 nebo vyšší, jako 2, 3, 4 nebo 5.

Struktury na bázi PEG s 1 až 4 zakotvujícími skupinami by tedy mohly být vyjádřeny následujícím způsobem:

V- (PEG) -OC-CH₂-N (CH₂X) CH₂ (CH₂N (CH₂X) CH₂) _rC0 (PEG) -V [X (CH₂) ₃}-CH₂-Y-(PEG)-V

V-PEG-CONH(CH₂)₅N(OH)CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₅N(OH)CO(ch₂) ₂conh (ch₂) ₂n (OH) coch₃ kde znamená 1, 2 nebo 3 .; · • a ··

*· * a · · * · * a » * a a·* a znamená 1 až 6, ‘(PEG) znamená skupinu CONH nebo NHCO, znamená-polyethylenglykovlový řetězec a znamená CONHOH, -CONH-bishydroxyfenyl nebo -CO-O-bishydroxyfenyl, přičemž hydroxylové skupiny se nacházejí na sousedních uhlíkových atomech.

V případě, že vektor nebo reportérova skupina jsou konjugovány tímto způsobem, je možno volit počet skupin na částici a na dávku tak, aby bylo k dispozici dostatečné množství vektoru k zacílení Částic a/nebo dostatečné množství reportéru k dobré detekci částic zvoleným způsobem.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je například možno postupovat tak, že se

i) v zahřátém vodném roztoku škrobu smísí železnaté a železité soli a baze, ii) roztok se popřípadě zchladí pod 15 °C, aby se vytvořil gel, iii) hodnota pH se sníží na rozmezí 6,0 až 8,5, přičemž tento stupeň se popřípadě provede před stupněm ii), iv) působí se oxidačním činidlem, například halogenovým oxyaniontovým činidlem k rozštěpení škrobu a uvolnění částic,

v) uvolněné částice se promyjí a odfiltrují, vi) uvolněné Částice se popřípadě nechají reagovat s polyalkylenoxydovým derivátem s funkčními skupinami k vazbě tohoto derivátu na částice a vii) popřípadě se uvolněné Částice sterilizují v autoklávu.

· ' ·

- 27 4 4 4 *44

4«

4

4

4 44

4444 ·

4 * 4 ·

4« 44 4* ··

Stupeň iii) je možno uskutečnit například tak, že se odstraní přebytek vody a baze, například hydroxidu amonného za sníženého tlaku před stupněm ii), nebo se přidá kyselina, například kyselina chlorovodíková k odstranění přebytku baze před stupněm iv).

Bylo prokázáno, že složené částice, obsahující anorganické částice jádra, opatřené povlakem rozštěpeného hydrofilního polymeru, vázaného na povrch anorganických částic a prodlužujícího pobyt částic v krevním oběhu mají významně vyšší poločas v krevním oběhu ve srovnání s částicemi, které jsou opatřeny pouze jedním povlakem. Je pravděpodobné, že toto prodloužení je důsledkem přítomnosti rozštěpeného polymeru, který překrývá vazná místa polymeru pro prodloužení poločasu v krevním oběhu, čímž dochází ke zpomalenému štěpení in vivo. Takové částice rovněž představují součást podstaty vynálezu.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat kontrast ní prostředek pro injekční podání, který obsahuje anorganické částice jádra, s výhodou oxidu kovu nebo směsného oxidu kovu, zvláště superparamagnetického oxidu železa, tyto částice jsou chemicky nebo fyzikálně, s výhodou nebo chemicky opatřeny povlakem hydrofilního polymeru, prodlužujícího setrvávání částic v krevním oběhu, s výhodou polyalkylenoxidu s funkčními skupinami, například methoxy-PEG-fosfátu a zvláš tě výhodně lineárního polymeru s terminálními funkčními skupinami a molekulovou hmotností pod ledvinovým prahem, například 200 až 30 000, zvláště 1000 až 10 000, tento povlak polymeru je pak opatřen povlakem hydrofilního organického póly meru, překrývajícího vazná místa prvního polymeru, například povlakem rozštěpeného uhlohydrátu s rozvětveným řetězcem, jako oxidovaného škrobu.

- 28 ·» 9 » t *·

I · ·

9» ··· ·*

Γ 99

Uvedené částice je popřípadě možno konjugovat s vektorem pro zacílení na určitou tkáň, jak bylo uvedeno svrchu. Je také možno je nechat obíhat v krevním oběhu. Mimoto je možno takové částice využít pro nepřímou lymfografii, napři-, klad nitrožilní nebo podkožní injekcí. Vzhledem k tomu, že anorganickým jádrem těchto částic je s výhodou superparamegnetický oxid železa, je možno použít i částice jiných.kovů; například radioaktivních látek nebo jiných léčebně nebo diagnosticky účinných kovů.

Relaxivita částic s obsahem superparamagnetických krystalků se bude měnit v závislosti na rozměru a složení jádra a celé povlečené částice a také s teplotou a s použitým magnetickým polem. Relaxivita (^) se může pohybovat v rozmezí 5 až 200, kdežto relaxivita T₂ (r^) se pohybuje v rozmezí 5 až 500 při 0,5 T (relaxivita, udaná v

Poměr r₂/r^ ^{se m}®^{nit v} rozmezí 1 až více než 100, například 1 až 10 a zvláště 1,3 až 3 pří 0,47 T a teplotě 40 °C. Malé jednotlivé krystalky budou mít nižší poměr r^/r^, kdežto velké částice a částice, obsahující větší počet krystalků budou mít vyšší hodnoty uvedeného poměru. V případě, že částice jsou superparamagnetické, pak magnetizace částic v oblasti OT až IT bude záviset na velikosti krystalků, přičemž vetší krystalky budou mít podstatně vyšší magnetizaci. Při IT je magnetizace v rozmezí 20 až 100, s výhodou 30 až 90 emu/g oxidu železa.

V případě, Že superparamagnetické částice jsou získávány srážením dvojmocného a trojmocného železa působením baze, bude mít poměr ^/r^ při 0,47 T a teplotě 40 °C obvykle hodnotu nižší než 3. V důsledku toho při zobrazování v oblasti budou částice, získané způsobem podle vynálezu účinné jako pozitivní kontrastní částice. Mimoto prokazují křivky magnetizace pro suspenze takových částic, že ani při síle pole.4T nejsou.Částice, úplně magnetizovány. Tato

I » « « i * * ··· · • ·· » · · · · , « 1» «* · · · · * * neúplná magnetizace částic při síle pole, běžně užívané v zařízení pro zobrazování pomocí MR znamená, že velikost jakýchkoliv nežádoucích vlivů, které mohou být přítomny při tomto zobrazování je sníženo. Mimoto se relaxivita částic podle vynálezu nesnižuje tak rychle se zvyšováním intenzity pole, jako je tomu u částic běžného oxidu železa..

Při běžném zobrazování pomocí MR byly vyvíjeny snahy používat zařízení s primární intenzitou magnetického pole 1 až 1,5 T. V poslední době se však zvyšuje počet zařízení s nižší intenzitou pole, takže je žádoucí vyvinout kontrastní prostředky, které by i při této slabší intenzitě pole, například 0,1 až 0,3 T poskytovaly kontrastní obrazy. Tento požadavek je splněn částicemi podle vynálezu, které jsou při uvedených intenzitách nejméně třikrát účinnější než běžné kontrastní látky na bázi chelátu kovu, jako Magnevist,. Součást podstaty vynálezu tvoří tedy také způsob zlepšení kontrastu zobrazování magnetickou rezonancí při použití pozitivního kontrastního prostředku, při němž se zobrazuje alespoň část organismu při použití běžného zařízení pro zobrazování pomocí MR, přičemž zařízení má primární magnet s intenzitou pole nižší než 0,3 T, použitý pozitivní kontrastní prostředek obsahuje magnetické částice s fyziologicky přijatelným povlakem uhlohydrátu a tyto částice jsou při uvedené intenzitě pole neúplně magnetizovány, například jsou magnetizovány do 90 % maximální možné magnetizace a s výhodou jsou neúplně magnetizovány až do intenzity pole 2T a zvláště až do intenzity 4T.

Součást podstaty vynálezu tvoří také diagnostický pro středek, který obsahuje částice podle vynálezu spolu s fyzio logicky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou, například vodou pro injekční podání.

'*·» · · i · · *·

I . . .

» · ·

Prostředky podle vynálezu mohou mít jakoukoliv běžnou farmaceutickou formu, může jít například o suspenze, emulze, prášky a podobně a mohou obsahovat vodné nosné prostředí, například vodu pro injekční podání a/nebo'další složky pro úpravu osmotického tlaku, pH, viskosity a stálosti. V ideálním případě je prostředkem suspenze, která je iso tonická. Isotonickou suspenzí je možno připravit například přidáním solí, jako chloridu sodného, cukrů s nízkou molekulovou hmotností, jako glukosy (dextrosy), laktosy, maltosy nebo mannitolu nebo rozpustné frakce činidla pro tvorbu povlaku nebo směsi těchto látek. Hodnotu pH je možno upravovat přidáním kyseliny, jako kyseliny chlorovodíkové nebo baze, například hydroxidu sodného v případě, že je zapotřebí jen malé úpravy pH. Je také možno použít pufry, například citrátový, acetátový, borítanový, tartrátový, glukonátový pufr, pufr s obsahem obojetných iontů nebo tris-pufr. Chemickou stálost částic v suspenzi je možno modifikovat přidáním antioxidačních látek, například kyseliny askorbové nebo pyrrosiřičitanu sodného. Mimoto je možno přidat pomocné látky ke zlepšení fyzikální stálosti prostředků. Z nejčastěji užívaných pomocných látek pro suspenze, určené pro parenterální podání je možno uvést smáčedla, jako polysorbitany, lecithin nebo estery Sorbitanu, dále látky, modifikující viskositu, jako glycerol, propylenglykol a polyethylenglykoly nebo látky, modifikující, vytvoření zákalu, s výhodou neiontová činidla. Tyto látky modifikují teplotu, při níž dochází k zákalu, což znamená, že u neiontových smáčedel dochází k dělení fází a může dojít k vyvločkování,

Prostředky podle vynálezu budou s výhodou obsahovat oxid magnetického kovu v diagnosticky účinné koncentraci kovu, která se obvykle pohybuje v rozmezí 0,1 až 250 mg Fe/ml, s výhodou 0,5 až 100 a zvláště 1 až 75 mg Fe/ml.

♦···' · • 0 *

Při použití prostředku podle vynálezu je možno vytvořit kontrastní obraz organismu savce včetně člověka, postupuje se tak, že se podá, s výhodou parenterálně a zvláště výhodně do·cévy suspenze’kontrastního činidla podle vynálezu a pak se vytvoří oblast alespoň části organismu, do nějž byl kontrastní prostředek podán, například pomocí MR nebo magnetometrií, například při použití detektoru SQIUD nebo soustavy detektorů SQUID.

Tímtéž způsobem je také možno stanovit distribuci kontrastní látky podle vynálezu v organismu savce, s výhodou člověka. Postupuje se tak, že se do organismu podá, s výhodou parenterálně, uvedený kontrastní prostředek a pak se prokáže signál, vysílaný nebo modifikovaný tímto kontrastním prostředkem, například radioaktivním zářením, deformace magnetického pole nebo signál magnetické resonance.

Zvláště výhodné je zobrazení cévního systému, zvláště při použití MR. Obraz je možno vytvořit před nahromaděním Částic v játrech nebo ve slezině. Při použití částic, opatřených povlakem pro prodloužené setrvávání částic v krevním oběhu, například povlakem polymeru, jako methoxy-PEG-fosfátu je možno obraz vytvořit až do 24 hodin, s výhodou do 4 hodin a zvláště výhodně do 1 hodiny po podání do cévního systému. V dalším možném provedení při podání lokalizované injekce T^ je možno vytvořit obraz lymfatického systému nebo obraz cévního systému v játrech nebo ve slezině nebo obraz difuzní struktury těchto orgánů.

Při použití kontrastního prostředku podle vynálezu k uvedeným účelům se vždy užije účinná dávka kontrastního prostředku pro zobrazení zvoleného orgánu nebo tkáně. Tato dávka se obvykle bude pohybovat v rozmezí 0,05 až 30 mg Fe/kg tělesné hmotnosti, s výhodou v rozmezí 0,1 až 15 a zvláště 0,25 až 8 mg Fe/kg.

4«

· ·

Vynález se rovněž týká použití nových magnetických krystalických materiálů pro výrobu diagnostického kontrastního prostředku pro použití k diagnostickým účelům při po⁴ dávání tohoto prostředku do organismu různých živočichů včetně člověka. ' Složené částice podle vynálezu je kromě použití jako kontrastních látek možno využít také k léčebným účelům v omezené oblasti, například při nutnosti zvýšit nebo snížit teplotu při využití magnetických vlastností uvedených částic. Energii je možno převést in vivo na částice, například působením magnetického pole se změněným směrem nebo se změněnou intenzitou pole nebo naopak je možno využít ztrátu energie částic do okolní tkáně k léčebným účelům, například pro dosažení cytotoxického účinku. Tyto postupy jsou zvláště důležité v případě, že Částice jsou konjugovány s vektorem pro zacílení těchto částic, například pomocí bifunkČního vazného řetězce, jako polyalkylenoxidu.

Částice je mimoto možno použít také tam, kdy je zapotřebí do organismu dodat železo. V tomto případě není nezbytné zachovat magnetické vlastnosti krystalků v jádrech Částic, může jít o paramagnetické oxidy železa, opatřené povlakem rozštěpeného polymeru a popřípadě druhým povlakem, například MPP.

Je známo, že různé prostředky s obsahem oxidů železa, připravené známým způsobem mohou mít významné nepříznivé účinky při nitrocévním podání. Nejčastěji udávaným účinkem tohoto typu je pokles systemického krevního tlaku a akutní nedostatek krevních destiček. Je pravděpodobné, že tyto vedlejší účinky mohou být fyziologickou a hematologickou odpovědí na aktivaci komplementu, vyvolanou podáním těchto částic. Běžné Částice oxidu železa, například magnetické mikrokuličky,s obsahem Škrobu.MSM mohou silně aktivovat • Λ > * » * · ι * '•ϊ' .3.

kaskádu komplementu, avšak částice podle vynálezu nemají žádný vliv nebo mají jen malý vliv na počet destiček v krevním oběhu na rozdíl od akutní vyjádřené přechodné thrbmbocytopenie, vyvolané .běžnými prostředky.

Bylo neočekávaně prokázáno, že částice podle vynálezu, at již obsahují nebo neobsahují druhý povlakový materiál, například MPP, mají překvapivě nízký nebo nemají vůbec žádný vliv na systém komplementu ani na s tímto systémem spojené parametry, jako jsou krevní tlak a počet destiček. Zvolený povlakový materiál vytváří povrch Částic, který neaktivuje komplement tak jako běžné částice.

Částice mohou být snadno opatřeny druhým povlakovým materiálem, například polymerem, který je schopen se chemicky nebo fyzikálně vázat na povrch oxidu železa FeOx, jde například o MPP. Tyto Částice jsou velmi vhodné pro další modifikaci povrchu nebo povlaku vzhledem ke své velké povrchové ploše a k tenkému povlaku uhlohydrátu, který dovoluje průnik hydrofilního polymeru s koncovými funkčními skupinami, například MPP a vazbu takových polymerů nebo jejich adsorpci na povrch magnetické Částice jádra.

Částice FeOx mají nižší magnetizaci než částice běžných oxidů železa, přičemž magnetizace není zcela nasycena při použité intenzitě pole. Tato vlastnost částic snižuje výskyt artefaktů při použití magnetického pole s vysokou intenzitou.

Bylo prokázáno, že částice mají významně vyšší poločas setrvání v krevním oběhu, a to nejméně dvakrát vyšší u myší než běžné částice MSM, získané současným srážením škrobu a FeOx.

Kinetiku částic v krevním oběhu je· možno dále modifikovat použitím druhého povlakového materiálu. Bylo prokázáno,

• · ·/

I ..

« « ·· že povlečené částice MPP, to znamená částice s dvojitým povlakem mají významně delší poločas setrvávání v krvi u myší, a to nejméně dvakrát delší poločas než částice bez tohoto povlaku nebo částice, opatřené povlakem methoxy-PEG (methoxy-PEG je pouze pomocná látka, která nevstupuje do. interakce s povrchem FeOx).

Částice, opatřené povlakem MPP mají prokazatelně a významně vyšší poločas setrvávání v krvi u myší, a to nejméně dvakrát delší poločas než částice FeOx velikosti nanometru, opatřené povlakem MPP, avšak bez primárního povlaku rozštěpeného polymeru.

Bylo prokázáno, že Částice s jednoduchým povlakem ani částice podle vynálezu s trojitým povlakem nemají žádné hematologické účinky u krys, kdežto prostředky běžného typu s obsahem polysacharidu a FeOx vyvolávají značnou thrombocytopenii.

Mimoto ani Částice s jednoduchým povlakem, ani částice s dvojitým povlakem podle vynálezu nemají žádný vliv na lidský komplement, kdežto běžné částice s obsahem škrobu a FeOx, MSM jsou účinným aktivátorem komplementu.

Částice podle vynálezu, které jako jádro obsahují jediný krystal, jsou zvláště výhodné vzhledem k tomu, že mají sníženou tendenci vytvářet shluky, čímž se snižuje množství potřebného stabilizátoru, například dextranu a tím i možnost vzniku toxicity.

Aby bylo možno se co nejvíce vyvarovat problémům při skladování a přepravě, je možno vyrábět a dodávat částicové kontrastní prostředky podle vynálezu ve formě suchého prášku, získaného například sušením rozprašováním nebo lyofilizací,

Β© Φ ·• © .

• * «J • ♦ · © » «' * ·'

*.ϊ **♦·;· ·' ·) ··« s výhodou za aseptických podmínek. Kontrastní prostředek v suchém stavu rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají v žádném smyslu sloužit k omezení jeho rozsahu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Gel se připravuje tak, že se připraví roztok škrobu, který se zahřeje na 55 °C, k tomuto roztoku Škrobu se přidá chlorid železa, pak se přidá k roztoku škrobu s obsahem železa ještě hydroxid amonný, reakční směs se zahřeje na teplotu 87 až 90 °C, načež se produkt zchladí/gel se neutralizuje.

A. Příprava roztoku škrobu

1. 50 g rozpustného bramborového škrobu (CAS č. 9005-84-9) se uvede do suspenze v 850 g vroucí deionizované vody a důkladně se promísí.

2. Směs se přivede k varu a pak se ihned přenese do vodní lázně s teplotou 55 °C.

B. Přidání železa a hydroxidu amonného ke škrobu

1. 9,0 g FeCl^.GHjO a 3,3 g FeCl₂.4H₂0 (molární poměr trojmocného a dvojmocného železa je 2 : 1) se rozpustí v celkovém objemu 50 ml deionizované vody.

2. Po zchlazení roztoku škrobu na 55 °C se roztok železa vlije do roztoku škrobu, směs se promíchá a přidá se ml 30% N'H₄0H.

* ·. Τ » * » ’ ’ _B », «·.·/ ♦. ·*· > ·♦· · ’ β···.·· · · * »·« ·< ··. ♦· ·* ·*

3. Výsledný roztok se v průběhu 2 hodin zahřeje na teplotu 89 °C a na této teplotě se udržuje ještě dalších 50 minut.

4. Po 170 minutách zahřívání na vodní lázní se

a) roztok zchladí na 4 C k vytvoření gelu, nebo se

b) roztok zchladí na teplotu místnosti a neutralizuje se kyselinou (bude dále popsáno).

C. Promytí gelu (v případě, Že není neutralizován kyselinou)

Vytvořený gel se promyje čerpáním chladné deionizované vody suspenzí usazeného gelu tak dlouho, až se dosáhne pH nižšího než 8,5.

D. Alternativní neutralizační postup

Směs se zchladí na teplotu nižší než 40 °C a pak se neutralizuje přidáním kyseliny.

E. Oxidativní štěpení gelu hypochloritem sodným

Titrace potřebného množství hypochloritu sodného na gram gelu může být provedena na jiném vzorku k optimalizaci produkce. Tvorba magnetických částic se stanoví fotonovou korelační spektroskopií PCS, kterou se určí rozměr i dispergovanost a stanovením relaxace protonů vody.

a. Přidá se například 1,8 ml 5% hypochloritu na 12,5 mg

Fe/5 g gelu. Objem hypochloridu se upraví na koncentraci dostupného chloru a na mg Fe v 5 g gelu.

b. Gel se zváží, přidá se hypochlorit a směs se zahřeje na 45 minut na vodní lázni na 70 °C.

• ·· »·· ·^ι · « « · «· «· *··

Přidá se 8M močovina (0,8 ml/5 g gelu) po zahřátí roztoku. Močovina inaktivuje přebytek hypochloritu.

d. . Provede se diafiltrace při použití membrány, oddě• lující látky s molekulovou hmotností od 100 000 tak . dlouho, až se odstraní volné Fe a CHO.

F.

Analýza

Vzorky vytvořených částic se podrobí analýze. Charakteristické vlastnosti materiálu, získaného uvedeným způsobem jsou shrnuty v tabulce 1.

Vysvětlivky k tabulce 1:

+++ 1 g FeOx obsahuje přibližně 70 % hmotnostních železa.

sí Nukleární magnetická relaxace disperze.

íísí Zobrazování pomocí mřížky.

sísísí Výroba ve větším měřítku.

++ Méně než 5 % se usadí při odstředění 5 minut při

000 g.

% plochy = % celkové plochy pod křivkou při HPLC.

j

Tabulka 1

Analýza Složka	Výsledek Hodnoty***
železo (Fe)	6,4 mh/ml až 95 mg/ml'-
Mossbauerova	převážně nanokrystal-
spektroskopie	ky gamma-Fe^Og
uhlohydráty (CHO)	3,6 mg/ml
CH0:Fe (hmot.poměr)	0,57 0,2 až 0,3
čistota	supematant z částic, chromatografie

odstředěných při CSC1 na gelu gradientu při 1,4 g/ml

volné Fe v %	0 %
volné CHO v % velikost jádra z oxidu železa	0 %	2 % plochy pod křivkou
předpoklad z r^/r^.	9 nm	8 nm
NMRD*	8 nm	8 nm
LFI** vypočteno z magne-	6,24±0,74 nm
tizace rozměr(celé Částice) fotonová korelační	5,7 až 5,8 nm
spektroskopie	11,5 nm	10 až 12 nm
rychlost sedimentace	42,6 Svedbergových

jednotek • » ·♦ ·· 4 a >

- 39 • *· • a. · Va · a a a) aaa a »· « · • 4 >· ·· • 4 ·♦ „ . O relaxivita při 40 C a 0,47 T ^rl ^r2 ^Γ2^/Γ1 , ...... MJíX ~ . Ostabilita pri 4 C magnetizace do nasycení

16,34 mM.sec

28,04 mM.sec

1,72 >6 měsíců emu/gm FeOx^KXK až 23 mM.s až 38 mM.s

1,6 až 1,7 az 90 emu/g Fe

V případě NMRD se longitudinální rychlost relaxace (1/T^) měří jako funkce intenzity magnetického pole v oblasti 2,35 Gausa .až 1,2 Tesla, jak je popsáno například v publikaci Koenig a další, NMR Spectroscopy of Cells and Organisms, sv. II, str. 75, R. K. Gupta (Ed), CRC Press, 1987 a Koenig a další, Progress in MR Spectroscopy 22 : 487 - 567, 1990.

Příklad 2

Magnetické částice se připraví způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se bramborový škrob nahradí kukuřičným škrobem.

Je nutno uvést, že použití materiálů, odlišných od rozpustného bramborového Škrobu si může vyžádat modifikaci množství materiálu, který je použit pro tvorbu gelu a pro degradaci.

··· '99

- 40 9 9 9 *)*··· * 9 · · * •ι · · ¹ 9 · · · ·· ·» Μ

Příklad 3

Magnetické Částice se připraví podle příkladu 1 s í tím rozdílem, že místo bramborového škrobu se použije rýžový škrob.

Příklad 4

Magnetické Částice se připraví způsobem podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se nezpracují působením hypochloritu Místo tohoto zpracování se vzorky gelu s hmotností 4, 8 a 12 g zředí fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfáto vým pufrem a škrob se enzymaticky hydrolyzuje při použití 100 mikrogramů enzymu alfa-amylázy EC 3.2.1.1 s účinností 0,7 až 1,4 jednotek/mikrogram při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Výsledné uvolněné částice Se odstředí nízkou rychlostí k odstranění větších shluků a pak se materiál zfiltruje přes filtr s průměrem otvorů 0,45 mikrometrů. Tímto postupem se získají částice s velikostí v rozmezí 10 až 110 nm a s jádry oxidu železa s velikostí 6 nm.

Příklad 5

Magnetické částice se připraví podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se nezpracovávají hypochloritem v odstavci D a místo toho se 10 g gelu zpracuje ultrazvukem při použití zařízení Branson se sondou s průměrem 7 mm. Zpracování ultrazvukem se provádí kontinuálně 15 minut. Po odstředění nízkou rychlostí k odstranění velkých shluků a po filtraci přes filtr s průměrem otvorů 0,45 mikrometrů se výsledné uvolněné částice oddělí. Částice mají velikost 30 až 800 nm a jádro stejné velikosti jako v příkladu 4.

• ·· f ri · · » »» • 9 ♦ · · · 999 9 · • 9 · · · · ♦·♦ *»· 9» ·· 9· ·· ··

- 41 Příklad 6

Κ vodné suspenzi Částic z příkladu 1 se přidá methoxy. PEG fosfát' MPP s-molekulovou hmotností 50Ό0 při poměrů. MPP k oxidu železa FeOx typicky 1 až 2 g MPP/g Fe, směs se inkubuje 15 hodin při 37 °C za stálého míchání a pak se uloží při teplotě 4 °C až do použití.

V případě potřeby je možno Částice sterilizovat v autoklávu 15 minut při teplotě 121 °C.

Pak je možno částice povlékat analogickým způsobem při použití chondroitinsulfátu.

Je také možno postupovat tak, že se povlečené částice MPP inkubují 12 hodin při teplotě 75 °C nebo je možno je přímo sterilizovat v autoklávu 10 až 20 minut při 121 °C.

Příklad 7

Částice, opatřené povlakem MPP se získají analogickém způsobem jako v příkladu 6 při použití MPP s různou molekulovou hmotností 1100, 2100, 5000 a 10 000 a při použití různého množství povlaků 0,02, 0,2, 0,4, 0,5, 0,8, 1,0, 1,2,

1,5, 1,6, 2, 2,5, 3, 4 a 8 g MPP/g FeOx.

Příklad 8

Výsledky, získané při použití částic z příkladů 1, 6 a 7 v plasmě člověka a na zvířeti

Poločas u myší T^/2 ^st^anoven P^r0 částice podle vynálezu s různými povlaky MPP. Vzorky s objemem 100 míkrolitrů a s obsahem 1 mg Fe/ml částic z příkladu 1, 6 nebo 7, • 0 0* ·

0*0 • a 00 ·»·

000 0 00* · ·

0 0 * ** ·* byly myším vstřiknuty do ocasní žíly. Pak byly myši v různých Časových intervalech usmrceny, byly odebrány krevní vzorky a spojeny vždy ze dvou myší a pak byla stanovena hodnota 1/T^. Z těchto hodnot byl pak vypočítán poločas. T^/₂-.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2, která uvádí také srovnání, pro nepovlečené částice a pro běžné částice MSM.

I.

Tabulka 2

cr MPP*/a ?eOx	T1/2 (min)
0	27.9
0.02	28.0 ± 3.2 =
0.2	31.9 ± 3.3
0.4	39.1 ± 14.1
0.8	28.5 ± 1.3
1.6	69.3 ± 27.7
2	48.9 ± 3.8
4	45.6 ± 3.0
8	62.0 ± 5.6
MSM	3.8

κ molekulová hmotnost 5000 průměr ± standardní chyba v linearitě křivky T^^

MSM běžné částice, získané společným srážením magnetických částic a roztoku škrobu.

Z tabulky 2 je zřejmé, že povlak MPP podstatně prodlužuje poločas v krevním oběhu, avšak i nepovlečené částice podle vynálezu mají daleko delší poločasy v krevním oběhu než běžné částice.

• ·· ·· · · ⁴ • · <

• · ·* ♦ · · ' :? V případe, že-byl· místo MPP použit povlak, který se neváže na Částice, nedošlo k podstatnějšímu prodloužení poločasu v krevním oběhu u myší. Tuto skutečnost bylo možno prokázat ^srovnáváním poločasu-pro riepovl-ečené· částicečás—. tice, povlečené MPP a. částice, opatřené povlakem methoxy PEG ¹ s. molekulovou hmotností 5000 nebo povlakem škrobového- derivátu Hetastarch. Na rozdíl od MPP se- methoxy PEG ' neváže · na částice chemicky ani se jinak s nimi nespojuje. Výsledky uve děného srovnání jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

Materiál sekundárního povlaku ^1/2 ^m'''ⁿ

MPP, molekulová hmotnost 5000,
8 g/g FeOx	62,0
MeO-PEG, molekulová hmotnost 5000,
8 g/g FeOx	26,3
p Hetastarch , 6% roztok	28,1
žádný	27,9

Částice s povlakem MPP a bez tohoto povlaku byly podrobeny zkouškám ná krysách na hematologické účinky.

Krysím samcům byly zavedeny kathetry do pravé jugulární žíly pro vstřikování různých materiálů nebo pro odbě vzorků. Přibližně - 24 hodin před podáním zkoumané látky a přibližně 3, 10 a 60 minut a/nebo 24 hodin po podání zkoumané látky byly odebrány krevní vzorky. Pak byly počítány bílé krvinky a destičky.

« · ·· ··· · • © ©t ·· ' Na rozdíl od částic s dextranem a magnetitem nebo Částic MSM nebylo možno pozorovat u částic s povlakem MPP ani bez tohoto povlaku přechodnou thrombocytopení i.

Částice, opatřené povlakem MPP, částice bez tohoto povlaku a částice MSM byly také sledovány na svůj vliv na komplex komplementu v lidské krevní plasmě. Na rozdíl od MSM neměly částice, opatřené povlakem MPP ani Částice bez tohoto povlaku žádný aktivační vliv na komplement.

Příklad 9

Částice s povlakem MPP z příkladu 6 byly podány králi kům v dávce 1 mg Fe/kg a po dalších 15 minutách ještě v dávce 2 mg Fe/kg. Kontrastní T^-obrazy MR byly zaznamenány při

l.,5 T, 3D TOF, TR/TE 25/5,6, úhel 60° a jsou uvedeny jako obr. 1, 2 a 3. Z výkresů je zřejmé postupné zlepšení kontrastu cévního systému, přičemž přes kombinaci vysoké dávky a vysoké intenzity pole je možno pozorovat na obr. 3 vysoký kontrast cév oproti zbývající tkáni bez artefaktů.

Příklad 10

Štěpení polymeru po vytvoření složených částic

a) Syntéza MSM g škrobu (Reppe Glycose, Švédsko) se střední molekulovou hmotností 70 000 se rozpustí v 10 ml vody. Při teplotě 60 °C se v roztoku uhlohydrátu rozpustí 2,7 g FeCl^.GH^O a 4,5 g FeCl₂.4H₂0 a pak se směs pomalu sráží v 50 ml 1,2M hydroxidu sodném při teplotě 60 °C za současného působení ultrazvuku. Ve zpracovávání ultrazvukem se pokračuje ještě 1.0 minut a pak se materiál 5 minut odstředí při 5000 ot/min.

- 45 Supernatant se oddělí a dialyzuje proti 0,9% NaCl. Magnetizační křivka prokázala, že výsledné částice škrobu byly superparamagnetické a měly hydrodynamický průměr 400 nm.

b) Zpracování MSM hypochloritem sodným

1,70 ml částic MSM s obsahem 15,5 mg Fe/ml a se střed ním průměrem 400 nm byly přidány k hypochloritu sodnému s obsahem 13,8 % volného chloridu (Fluka č. 71696). Nádoba byla uzavřena a zahřáta na 45 minut na 70 °C. Pak byla reakční směs zchlazena, bylo přidáno 0,17 ml 8M močoviny a suspenze byla zfiltrována přes filtr s průměrem ok 0,2 mikro metrů. Částice byly čištěny vodou při použití odstředivého koncentračního zařízení Macrosep při úrovni oddělení 100 K při 3000 ot/min. Velikost částic jako funkce přidaného množství hypochloritu sodného je uvedena v následující tabulce 4

Tabulka 4

množství NaOCl ml	střední velikost Částic nm
0	400
0.063	88
0.100	76
0.300	70
0.500	68
1.000	shluky 1)

Všechen škrob je rozštěpen, tvoří se shluky krystalků oxidu železa.

1) , * ·· • rf · » ¹ • · « «· ·· • rfrf · rf ·» • rf ·

Příklad 11

Produkty z příkladů 1 a 7, zpracované na kontrastní prostředky

V následující tabulce 5 jsou uvedeny vlastnosti částic z příkladu 1 (prostředek A) a částic s 1,2 g MPP s molekulovou hmotností 2000/g FeOx (prostředek B) při zpracování spolu s 50 mM tris, 2,5 % mannitolu a hydroxidem sodným do pH 6 až 8.

Tabulka 5

Analýza	prostředek A	prostředek B
Složka železo (Fe)	30 mg/ml	30 mg/ml
uhlohydráty, poměr CHO : Fe	0,8	1,2
MPP, mol.h 2000	0	60 mg/ml
čistota	po chromatografií	po chromatografií
% volných CHO	na gelu 10 až 12 % plochy	na gelu 10 až .12 % plochy
rozměr jádra oxidu Fe předpoklad z r^/r^	7 nm	7 nm
NMRD	7 nm	7 nm
velikost (celá částice) spektroskopie při korelaci fotony	9 až 11 nm	11 až 13 nm
relaxivita při 40 °C a 0,47 Tesla ri	19'až 20/mM.sec-1	19 až 21/mM.sec 1
Γ2	30 až 32/mM.sec-1	30 až 33/mM.sec-1

magnetizace do nasycení 0,45 Tesla stálost • » * ··· *·

- 47 1,4 až 1,6 až 100 emu/g Fe více než 3 měsíce' při 40 °C • · · · ·· ·* ··

1,5 až 1,6 až 100 emu/g Fe více než 3 měsíce při 40 °C

NMRD = Nukleární magnetická relaxace disperze % plochy = % celkové plochy pod křivkou při HPLC.

Příklad 12

Způsob přípravy částic před povlékáním MPP

A) V baňce se třemi hrdly s objemem 22 litrů, opatřené mechanickým míchadlem a chladičem se zahřeje 12,8 litrů deionizované vody na teplotu 95 °C a pak se za míchání rychlostí 80 až 100 ot/min přidá suspenze 800 g rozpustného bramborového škrobu (Sigma, č. S-2630) v 1,6 litrech deionizované vody. Výsledný mírně zakalený roztok se 10 minut míchá při teplotě místnosti a pak se v průběhu 30 minut zchladí na 55 °C. Pak se přidá ještě roztok 144 g hexahydrátu chloridu železitého a 52,8 g tetrahydrátu chloridu železnatého v 1,2 litrech deionizované vody, po 3 minutách se pak najednou přidá ještě 800 ml 28% hydroxidu amonného. Rychlost míchání se sníží přibližně na 60 ot/min a černá reakční směs se pak míchá ještě 15 minut při teplotě místnosti, načež se v průběhu 60 minut postupně zahřeje až na teplotu 92 °C. Pak se teplota udržuje 3 hodiny na hodnotě 92 až 94 °C a postup reakce se měří v průběhu reakce i po ní na základě magnetických vlastností částic. Přebytek hydroxidu amonného se odstraní,destilací ve vakuu. Směs se zchladí na 20 °C a · pak ještě dále .až do· vytvoření gelu.

β * * * · · » ’ • · a • · · *

- 48 Celkem byl gel připraven ze čtyř vsázek, přičemž při největší z nich bylo užito 800 g bramborového škrobu.

Tabulka 6

Příprava gelu

vsázka	škrobFeC1J	Fedj 4H,0 (9)	νε,οη (ml)	objem směsi (L)	. hmot. gelu (kg)	Pa, XRF* (g/kg)	M («au/ mg FS)	(xlO·4 esssi/
(g)	SHjO (g)
1	600	108	39,6	600	12	9.8	3.33	0.0932	0.69
2	500	108	39.6	600	12	9.8	3.3Ξ	0.0954	0.71
3	600	108	39.6	600	12	9.3	3.36	0.0924	0.69
4	300	144	39.S	800	12	13.7	3.30	0.09ΞΞ	0.70

m XRF = fluorescenční spektroskopie, rtg-paprsky.

B) Gel byl promyt chladnou vodou k odstranění chloridu amonného, vytvořeného v průběhu přípravy oxidu železitého a zbytku přidaného ' hydroxidu amonného. Tyto látky by totiž reagovaly s hypochloritem sodným, použitým ve stupni C) k rozštěpení škrobu, takže by bylo v tomto stupni spotřebováno daleko větší množství hypochloritu.

Gel byl opakovaně promyt vodou v míchaném reaktoru, který byl udržován přibližně na 5 °C tak, aby pokud možno nedošlo k rozpuštění gelu. Gel byl krátce a pomalu míchán v přibližně dvou objemech chladné deionizované vody a pak ....

;.· byl·, přibližně 1 hodinu-.ponechán k usázení;. - Tmavý supěrnátántr, ·.ě ’ϊ '*«' · »· · · * ··.

• · v * · · · ·,·· · ··· · * ····· · -* ·..* ··· ·· ·· ·· ·· ·· který se oddělil od velmi tmavé vrstvy gelu byl odfiltrován za odsávání. Pak .bylo přidáno stejné množství vody a pomalé míchání, usazení a oddělení bylo opakováno tak dlouho, až bylo. dosaženo vodivosti 0,5’ mmho. Celkem bylo k promyti gelů nutno použít 8 obéjmů vody, přičemž výtěžek železa byl· přibližně 80 %.

Tabulka7

Promyty gel

vsázka h	'hmot- nost vsázky (kg)	voda cel- kem (L)	počet promyt i	konečná hmotnost (kg)	Fe (g)	Fe výtěžek (%)	jočáteč- ní vodivost (touho)	<onečná /odivost (mmho)
.1	1.7	15	7	(odstředění)	6.1	78	4.8'	0.3
2	9.5	80	5	14.5	26.5	81	5.2	0.5
3	9.5	80	4	11.2	24.5	77	4.7	O.S
4	13.3	106	5	16.4	36.9	83	4.8	0.3

C) V tomto stupni se promytý gel zpracuje na disperzi částic oxidací Škrobové matrice. Tato oxidace se uskuteční působením hypochloritu sodného. Množství hypochloritu, užité pro oxidaci se stanoví předběžnými pokusy v malém měřítku na přibližně 50 až 100 g gelu se současným měřením relaxivity r^, r a r^/r^ ^a rozměru částic. ¹

J·..'

9 · • * · • ·

- 50 · · «« « ··

Promyty gel se zahřeje na 45 °C a pak se zpracovává 12% roztokem hypochloritu sodného. Teplota reakční směsi poněkud poklesne v průběhu přidávání zchlazeného hypochloritu. Reakční směs se proto zahřeje na 45 °C a pak v průběhu 30 minut až na 55 °C, při této teplotě začne exothermní reakce, při níž teplota stoupne každých 15 minut přibližně o 15 °C. Jakmile je tato reakce ukončena, upraví se teplota reakční směsi na 70 °C a na této teplotě se udržuje 45 minut. Při hodnocení rizika tohoto stupně při použití kalorimetru RCI bylo prokázáno., že jde o mírnou exothermní reakci, kterou je možno snadno řídit.

Reakční směs se pak nechá zchladnout na teplotu místnosti a zfiltruje pres náplň Millipore s proměrem otvorů 0,2 mikrometry. Největší vsázka pro oxidaci byla 15 kg gelu, 34 g železa, výtěžek byl kvantitativní.

Tabulka 8

Disperze částic

vsázka	hmot- nost vsázky (kg)	12% KaOd (L)	močo- vina tsrJ	koneč- ný objem (L)	Fe (g)	Brook- haven (aa)	(aM.a)'1	r2 (na. a) l	r2/rl
1	3.0	0.S3	20	3.5	5.5	11.1	13.37	23.1	i. sa
2	s.s	1.33	42	3	11.8	11.3	14.5	24.3	i. es
3	10	2.25	112	12	22	12.4	14.9	25.0	1.63
4	1S	2.00	30	18	34	12.7	21.0	33.2	1.71

: ι· ·· · · • ·

- 51 D) Tento stupeň zahrnuje odstranění zbývajícího škrobu, volného železa a ostatních reakčních složek po oxidaci hypochloritem. K dosažení uvedených výsledků. bylo použito··¹ filtrů...s membránou z regenerované celulosy, Millipore, TM· TFF 100K. Čistota částic byla sledována plynovou preparativní chromatografií PGC. Čistota výsledného produktu'po ultrafiltraci při PGC byla 97 až 99 %.

Tabulka 9

Konečný produkt

vsázka	objem vsázky (1)	filtrační prostředí	voda celkem (1)	„ - Fe konečná	Fe výtěžek {»)
hmot- nost (kg)	ICP (g)
1	2	Millipore 100K. . 2 Jí 0,1 m	25	670	2.2	67
2	S	Millipore 100K, r, c 2 Jí 0,6 m	45	671	8.S	70
3	12	Millipore 100K. c 2 Jí 0,6 m	60	980	13.7	73
4	ia	Millipore 100K,	100	1674	27.7	82

_n , 2 M

0,6 m

Jí membrány filtru byly vyrobeny z regenerované celulosy.

• · 9 · * 9 »«· 9 ··· « ·

9 · · 9 « 9 9*

999 99 99 99 ·· 9·

- 52 Konečně analytické údaje pro- všechny Čtyři vsázky jsou shrnuty v následující tabulce 10.

E) Tvorba povlaku PEG

Částice, vyrobené ve stupních ,A až D mohou být v přípa dě potřeby opatřeny povlakem PEG, s výhodou povlakem methoxy-PEG-fosfátu s molekulovou hmotností 2000 při použití 1,2 g MPP na g FeOx.

Částice s povlakem PEG nebo bez tohoto povlaku je možno zpracovávat pro podání spolu s 50 mM tris-pufru a

2,5 % mannitolu, přičemž pH se upraví hydroxidem sodným na hodnotu 6 až 8.

♦ · · · :.·*.

- 53 10 >· w · « ·* * · · · « · ··· ··· ·· • « ·♦ • · »· ·♦

T a b u 1. k a Analytické výsledky

vsázka	*	2	3	4
čistota (%, G?C)	97.2	98.1	99.0	99.2
Fe (mc/ ml, (IC?))	3.3	13.1	13.7	16.5
r2/rl	1.67	1.66	1.55	1.64
rl (ntM.s)	19.6	18.9	20.0	21.3
r2, (mM.s) 'l	32.7	31.3	33.0	35.0
magnetizace (emu/mc Fe)	0.0752	0.0795	0.0801	0.0826
velikost částic (nm, Brookhaven)	12	10	10	11,
mobilita (mV^s'1 x £08)	-3.02	-3.02	-3.04	-2.92
PH	4.1	4.0	4.0	4.0
poměr C/Fe 0,52	0.28	0.30	0.28

vzhled nevískozní neviskozní neviskozní neviskozní barva tmavě barva tmavě barva tmavě barva tmavě červená až hnědá hnědá hnědá hnědá ·· ·*·

- 54 Příklad 13

Příprava diethyl-2-(3,5-bis-acetylamino-2,4,6-trijodbenzoyloxy)ethylfosfonátu

K míchanému roztoku 7,1 g, 11,2 mmol diatriazoátu sodného v 50 ml bezvodého dimethylformamidu se při teplotě místnosti pod argonem přidá roztok 3,02 g, 12,3 mmol, 1,1 ekvivalentu diethyl-2-bromethylfosfonátu v 10 ml dimethylformamidu. Směs se 12 hodin míchá a pak se rozpouštědlo odpaří ve vakuu na bílou pevnou látku, která se promyje 300 ml nasyceného vodného hydrogenuhličitanu sodného a pak se extrahuje směsí chloroformu a ethanolu 2:1, užije se 3 x 200 ml této směsi. Organický extrakt se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří ve vakuu, čímž se ve výtěžku 41 % získá 3,61 g produktu ve formě bílé pevné látky. Po překrystal-ování z acetonitrilu se získá analyticky čistá látka s teplotou tání 249 až 251 °C.

MH⁺ (779).

^H-NMR (200 MHz) spektrum je v souladu se strukturou výsledného materiálu.

Analýza pro ^c17^H22'^[3^P^2⁰7 vypočteno C 26,24, H 2,85, I 48,93, N 3,60 % nalezeno C 26,26, H 2,70, I 49,05, N 3,50 %.

Příklad 14

Příprava kyseliny 2-(3,5-bÍs-acetylamino-2,4,6-trijodbenzoyloxy)ethylfosfonové

K míchanému roztoku 3,1 g, 3,98 mmol diethyl-2-(3,5-bis-acetylamino-2,4,6-trijodbenzoyloxy)ethylfosfonátu ve ml bezvodého dichlormethanu se při teplotě místnosti

4 » *

4 44

4*4 4 *

4 4 ··

- 55 • · • 4 « · ·

4 · · «4 4 44 ft t 4 • 4 4 « >44 4 • 4 pod dusíkem přidá 1,5 ml, 10,56 mmol, 2,65 ekvivalentu trimethylsilyljodidu. Směs se míchá 12 až 14 hodin, vytvoří se viskozní suspenze, k níž se přidá ještě 40 ml dichlormethanu, načež se. .směs ještě 6 hodin, míchá. Pak se. přidají ještě 4 ml vody a reakční směs se míchá dalších 10 minut. Pak se přidá 40 ml methanolu a výsledný červený roztok se odpaří ve vakuu, čímž se získá 3,42 g surového produktu ve formě žluté pevné látky. Tento surový produkt se rozpustí ve 20 ml směsi 10 % methanolu a 90 % vody a roztok se nechá projít přes sloupec íontomeniče Ο^θ, jako eluční činidlo se užije 50 ml směsi methanolu a vody. Filtrát se odpaří ve vakuu, čímž se ve výtěžku 14 % získá 0,48 g výsledné fosfonové kyseliny ve formě bílé pevné látky s teplotou tání vyšší než 220 °C, k rozkladu dochází při teplotě přibližně 250 °C.

MH⁺ (723).

¹H-ISfMR (300 MHz) spektrum je v souladu s předpokládanou strukturou výsledného materiálu.

Analýza pro ^ci3^H]_4^I3^PN2⁰7 vypočteno C 21,63, H 1,95, I 52,73, N 3,88, P 4,29 % nalezeno C 21,29, H 1,95, I 52,44, N 3,71, P 4,31 %.

Sloučeninu z příkladu 14 je možno použít k povlékání magnetických částic, připravených podle předchozích příkladů.

Příklad 15

Syntéza methoxy-PEG(2K)-fosfónátu

Stupeň 1:

21,60 g methoxy-PEG( 2K)-0H se vaří pod zpětným chladičem ve .10.8 ml „toluenu za .azeotropního .odstraňováni vody » · · • · · ♦ · · ·

- 56 *·» • ·· »·> ·· po dobu několika hodin. Ke zchlazenému roztoku se po kapkách přidá směs 7,88 ml thionylchloridu a 0,313 ml DMF a pak se směs 4 hodiny vaří pod zpětným chladičem. Pa se reakční směs odpaří za sníženého tlaku a světležlutý pevný od-, párek se rozpustí ve 108 ml vody a roztok se 2x promyje etherem. Pak se vodný roztok 2x extrahuje chloroformem, extrakty se spojí, vysuší se bezvodým síranem hořečnatým a odpaří, čímž se získá 19,90 g methoxy-PEG( 2K.) -Cl.

Stupeň 2:

Směs 18,51 g methoxy-PEG(2K)-C1 a 185 ml triethylfosfitu se vaří 4 dny pod zpětným chladičem. Po zchlazení na teplotu místnosti se vytvoří sraženina, která se odfiltruje, promyje se etherem a suší ve vakuu, čímž se získá 18,16 g methoxy-PEG(2K)-P(0)(OEt)2· ¹H-NMR (CDC1₃, 300 MHz): 4,10 (m, -P(0)(OCH CHg) ) , 3,65 (s, (-CH₂CH₂0-)_n), 3,38 (s, -OCH ), 2,13 (dublet tripletů, -CH₂CH₂P(0)(0CH₂CH₃)₂), 1,33 ppm (t, -P(0)(0CH₂CH₃)₂ ) .

Stupeň 3:

Roztok 5,02 g methoxy-PEG(2K)-P(0)(0Et)₂ ve 100 ml methylenchloridu se užije jako předloha a po kapkách se přidá 28 ml roztoku, připraveného z 24,15 g bromtrimethylsilanu a 157 ml methylenchloridu. Reakční směs se míchá 16 hodin při teplotě místnosti a pak se odpaří na bílou pevnou látku. K této pevné látce se přidá 50 ml methanolu, roztok se nechá stát 2 hodiny a pak se odpaří, čímž se získá 4,57 g produktu ve formě bílé pevné látky.

¹H-NMR (CDC1₃, 300 MHZ, ppm): 8,20 (br s, -P(0)(0H)₂), 3,65 (s, -(CH₂CH₂O-)_n), 3,38 (s, -0CH₃), 2,17 (dublet tripletů,

-ch₂ch₂p(o)(oh)₂).

« «0»

000 · ·

0 0

00

- 57 0 «i « 0 • 0 * «II • « 0

00

Příklad 16

Příprava konjugátu methoxy-PEG(2K)-fosfonátu a superparamagnetického oxidu železa

Směs 0,448 g methoxy-PEG(2K)-fosfonátu, 3,42 ml suspenze produktu s obsahem oxidů železa z příkladu 12 s obsahem 93,7 mg Fe/ml a voda do celkového objemu 20 ml se inkubuje 20 hodin při teplotě 37 °C. Reakční Směs se vloží do komůrky Amicon s objemem 50 ml, opatřené membránou YM-30 a za míchání se podrobí diafiltraci proti vodě a pak zfiltruje přes filtr s otvory 0,2 mikrometru. Analýzou ICP bylo prokázáno, že vzorek obsahuje 13,3 mg Fe/ml, 0,34 mg/ml nenavázaného methoxy-PEG(2K)-fosfonátu a 1,42 mg/ml vázaného methoxy-PEG(2K)-fosfonátu.

Příklad 17

Příprava konjugátu methoxy-PEG(5K)-thiolů a superparamagnetického oxidu železa

Směs 0,438 g methoxy-PEG(5K)-thiolů, 1,67 ml suspenze produktu z příkladu 12 s obsahem 93,7 mg Fe/ml a 10 ml vody se inkubuje 22 hodin při teplotě 37 °C. Pak se reakční směs uloží za míchání do komůrky Amicon s objemem 50 ml, opatřené membránou YM-30 a podrobí se diafiltraci proti vodě a pak se zfiltruje přes nylonový filtr s průměrem otvorů 0,2 mikrometry. Analýzou TCP bylo prokázáno, že vzorek obsahuje 13,47 mg Fe/ml, 0,23 mg/ml nenavázaného methoxy-PEG(5K) -thiolů a 5,46 mg/ml vázaného methoxy-PEG(5K)-thiolu.

Příklad 18

Příprava suspenze částic s obsahem oxidu, železa s povlakem MPP a bez tohoto povlaku » · • « 4»

4444 4 • 4 »

44 «I

- 58 Β * t · 4 «

4 4 4 4 • »4* 4 ♦·· «4»4 «

44 44

Bez MPP:

Nejprve se uloží přibližně 70 % celkového objemu vody pro injekční podání do výrobního tanku ze skla nebo do tanku, vyloženého sklem. Za stálého míchání se přidá a rozpustí mannitol. Konečná koncentrace mannitolu může být v rozmezí 1 až 5 g/100 ml, typická koncentrace je 3,5 g/100 ml.

Za stálého míchání se pak přidá a rozpustí tromethamin. Koneční koncentrace thromethaminu se může pohybovat v rozmezí 10 až 100 mM, typická koncentrace je 50 mM. Za stálého míchání se pak přidá produkt z příkladu 12 ve formě suspenze s obsahem oxidů železa. Konečná koncentrace oxidů železa je v rozmezí 0,1 až 10 g/100 ml, typická koncentrace je 3 g/lOOml. Pak se ověří hodnota pH suspenze a v případě potřeby se pH upraví na hodnotu 8,1 až 8,3, s výhodou 8,2 přidáním 0,1 N NaOH nebo 0,1 N kyseliny chlorovodíkové. Za stálého míchání se suspenze doplní na 100 % konečného objemu vodou pro injekční podání. Takto připravenou suspenzi je možno sterilizovat parou při teplotě 121 °C při 10 až 50 F , typická hodnota je 15 F . Konečná suspenze může mít pH v rozmezí .5 až 8, s výhodou 7 až 7,5.

S MPP:

Přibližně 25 % celkového objemu vody pro injekční podání se vloží do příslušného výrobního tanku. Za stálého míchání se přidá methoxypolyethylěnglykolfosfát (2000) a rozpustí se. Konečný poměr MPP/Fe může být v rozmezí 0,1 až 5, typická hodnota je 1,5. Za kontinuálního míchání se přidá a rozpustí tromethamin. Konečná koncentrace tromethaminu může být v rozmezí 10 až 100 mM, typická hodnota je 50 mM. Za stálého míchání se přidá a rozpustí mannitol. Konečná koncentrace mannitolu může být v rozmezí 1 až 5 g/100 ml, typická hodnota je 2,5 g/100 ml. Pak se vloží příslušné * · ·· • * · • · • ·· • · · · » * « · * · ♦ · ♦ • φ · «· « • · » » • ⁴ ·· Λ ··· · * • · » ·· ·· množství suspenze oxidů železa z příkladu 12 do vhodné nádoby. K této suspenzi se za stálého míchání pomalu přidává roztok, obsahující MPP, mannitol a tromethamin. Konečná koncentrace oxidů železa se může pohybovat v rozmezí 0,1 až 10, s výhodou 3 g/100 ml. Pak se ověří hodnota pH výsledné suspenze a pH se upraví na 8,4 až 9,0 přidáním 0,4 N hydroxidu sodného. Za stálého míchání se pak suspenze doplní na 100 % konečného objemu vodou pro inekční podání. Takto připravenou suspenzi je možno sterilizovat parou při teplotě 121 °C při 10 až 50 Fe^, typická hodnota je 15 Fe_Q. V průběhu sterilizace parou se ukončí vazba MPP na oxid železa. Je také možno postupovat tak, že se suspenze inkubuje 2 až 4 hodiny při teplotě 60 až 95 °C k ukončení vazby MPP na oxidy železa. Výsledná suspenze může mít pH v rozmezí 5 až 8, s výhodou 7 až 7,5.

Příklad 19

Příprava nanokrystalů oxidů železa

a) Odstranění povlaku polymeru, odvozeného od Škrobu z oxidu železa bez přidání stabilizátoru

Byly prováděny pokusy za účelem zjištění, zda by bylo možno ze suspenzí oxidů železa z příkladu 12 připravit stálou suspenzi nanokrystalů oxidů železa bez polymerního povlaku a bez použití stabilizátoru. K podílům 0,5 ml suspenze oxidů železa bylo přidáno vždy 0,5 ml 30% peroxidu vodíku. Vzorek byl inkubován při teplotě 55 °C za stálého míchání a pomocí elektrody byla sledována hodnota pH. Při pokračující oxidační reakci pH postupně klesala. Hodnota pH vzorku byla udržována v rozmezí 6,5 až 7,5 přidáváním 1 N NaOH. V průběhu 3 hodin inkubace došlo k vyvločkování vzorku, což znamená, že suspenze částic, zbavená polymerního je nestálá a vytváří zvětší shluky. · -

« • ·· ··» · · « ·

- 60 ··· ·♦ «·

b) Pokus s monofosfátem

Aby bylo možno zjistit, zda monofosfát je účinný při stabilizaci povrchu nanokrystalů oxidu železitého bez povlaku, byl proveden pokus, při němž bylo vždy 0,5 ml suspenze oxidů železa smíseno s různými koncentracemi fosforečnanu sodného. Pak bylo ke každému vzorku přidáno 0,5 ml peroxidu vodíku. Vzorky byly inkubovány při teplotě 55 °C tak, aby došlo k oxidaci polymerního povlaku, odvozeného od Škrobu, SDPC.

vzorek č.	[Na2HPO4] (mM)
0	0
1	1.7
2	8.3
3	16.6
4	33.3
5	50
6	66.7
Ί	83.3
8	166
9	250
10	333

Všechny vzorky po 5 hodinách inkubace při teplotě 55 °C vyvločkovaly, což prokazuje, že monofosfát není vhodným modifikátorem povrchu a stabilizátorem pro krystalky oxidů železa bez povlaku.

• ·

- 61 »·· ♦·

c) Difosfát' jako modifikátor povrchu á stabilizátor

Účinnost difosfátu, známého také jako pyrofosfát jaΪ ko modifikátoru povrchu částic oxidu Železa byla sledována při použití bezvodého pyrofosfátu sodného obdobným způsobem jako při. použití monofosfátu. Vzorky byly inkubovány při teplotě 55 °C k oxidaci polymerního povlaku, odvozeného od škrobu, SDPC. Po inkubaci 5 hodin při teplotě 55 °C zůstaly vzorky 2 až 7 v suspenzi. Byl měřen střední průměr částic těchto vzorků, výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

vzorek Č.	(Na4P307] (mM)	střední průměr 5ástlc (nm)
0	0	★
1	2.5	11.6
2	6.3	9.5
3	12.5	9.3
4	18.Θ	9.7
5	25.1	9.1
6	25.1	9.6
7	62.7	9.7
6	125.4	★
9	188.1	★
10	250.7	*

at Vzorky vyvločkovaly.

Malý rozměr částic odráží odstranění povlaku, odvozeného od polymeru škrobu. Údaje prokazují, že pyrofosfát v koncentraci v rozmezí přibližně 2 až 60 mM je uspokojivým modifikátorem povrchu a stabilizátorem pro nepovlečené krys tály oxidu Železa.

- 62 d) Trifosfát jako módifikátor povrchu a stabilizátor

Byly prováděny pokusy s trifosfátem jako stabilizátorem. Byl užit hexahydrát trifosfátu pentasodného (Sigma).

K 3,'75 ml suspenze oxidu železa bylo přidáno 5,25 mM trifosfátu sodného, 3,75 ml vody a 7,5 ml 30% peroxidu vodíku. Směs byla inkubována 3 hodiny při teplotě 60 °C. Suspenze nevykazovala žádné známky vyvločkování, střední průměr částic byl 8 nm. I v tomto případě odráží malý střední průměr částic odstranění povlaku. Údaje prokazují, že trifosfát je uspokojivým modifikátorem povrchu a stabilizátorem pro krystalky oxidu železa bez povlaku.

e) Tetrafosfát jako modifikátor povrchu a stabilzátor

Obdobný pokus byl proveden s tetrafosfátem. Byl užit hexaamoniumtetrapolyfosfát (Sigma). Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:

vzorek Č.	[P40u] (mM)	střední průměr částic . , (nm)
0	0	*
1	2.5	27.3
2	5	9.5
3	10	10.1
4	20	9-3

κ Vzorek vyvločkován.

Také v tomto případě odráží malý střední průměr částic ve vzorcích 2 až 4 po inkubaci odstranění povlaku, odvozeného od škrobu. Údaje prokazují, že tetrafosfát je rovněž uspokojivým modifikátorem povrchu a stabilizátorem krystalků oxidu železa bez povlaku.

• ·

- 63 Charakterizace nanokrystalků oxidu železa bez povlaku

Suspenze nanokrystalků oxidu železa bez povlaku (nion) byly připraveny při použití pyrofosfátu sodného. Po ukončení oxidace byla suspenze podrobena diafiltraci proti vodě k odstranění fragmentovaného škrobu a zbytků peroxidu vodíku. Výsledná suspenze je charakterizována několika analytickými technikami, jejichž výsledky budou dále uvedeny.

a) GPC: Chromatografie na gelu, GPC prokázala, že nanočástice oxidu železa bez povlaku (nion) mají ostrý vrchol bez jakéhokoliv vrcholu pro polymery, odvozené od škrobu.

b) Celkové množství organicky vázaného uhlíku: Analýza dvou odděleně připravených vzorků nion prokázala pouze nepatrné množství organicky vázaného uhlíku, což v podstatě prokazuje úplné odstranění polymerního povlaku.

vzorek TOC (ppb) koncentrace Fe

voda (slepá zkouška)	159	-
nion	156	2,6/Ug/ml
vzorek	TOC (ppb)	koncentrace Fe
voda (slepá zkouška)	144	-
nion	211	30yUg/ml
suspenze z příkladu 12	4060	18/Ug/ml

c) Kapilární elektroforéza: Analýza vzorků nion prokázala —4 2 —1 —1 pohyblivost při elektroforéze -3,4 x 10 cm v s , což je hodnota, která je o něco negativnější než hodnota pro pro• ·

- 64 dukt' z příkladu 12, pro nějž je odpovídající hodnota ' _4 2 -1 -1

-3,0 x 10 cm v s . Tyto hodnoty jsou v souladu s negativním elektrostatickým nábojem, který je částicím přidán navíc polyfosfátem.

d) Relaxivita a magnetické nasycení: Hodnoty r. á'r„ byly —1 —i £

22,5 a 34,4 mM s , hodnota pro ^/r^ ¹> 53. Jde o hodnoty, které jsou obdobné hodnotám, prokázaným pro produkt z příkladu 12.

e) Stabilita při sterilizaci parou: Suspenze vzorků nion byly sterilizovány parou při teplotě 121 °C po dobu 20 mí nut, po této době nebylo možno prokázat žádnou změnu v rozměrech Částic.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby složených magnetických částic, vyznačující se tím, že se

   i) vytvoří magnetické částice ve vodném prostředí, obsahujícím hydrofilní organický polymer s rozvětveným řetězcem a ii) tento polymer se rozštěpí, čímž se uvolní vytvořené složené částice.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m , že se jako prostředí užije gel.
3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se t í m , že se užije gel, obsahující aniontové skupiny.
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že se jako magnetické částice vytvoří částice oxidu železa.
5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m , že se vytvoří superparamagnetické částice.
6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se jako polymer s rozvětveným řetězcem užije škrob.
7. 7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m , že se polymer oxidativně rozštěpí.
8. 8. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m , še se štěpení polymeru uskuteční zpracováním částic, obsahujících větší počet magnetických částic v matrici polymeru.

   0· · • ·· · * » « ’ ·· ··

   - 66 • ···
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m , že se složené částice dále zpracovávají a opatřují povlakem hydrofilního polymeru pro prodloužení doby setrvání částic v krevním oběhu.
10. 10. Způsob podle nároku 9,vyznačující se t í ra , že se hydrofilní polymer pro prodloužení doby setrvání v krevním oběhu do prostředí přidává před uskutečněním stupně ii).
11. 11. Způsob podle některého z nároků 9 a 10, v y znáčů j i c i se tím, že se jako hydrofilní polymer užije polyalkylenoxid s funkčními skupinami.
12. 12. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že vodné prostředí dále obsahuje lineární polymer
13. 13. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že se polymer štěpí po vytvoření složených částic z magnetických částic a'polymeru.
14. 14. Způsob podle nároku 1, vyznačuj íc i se t í m , že se provádí v následujících stupních:

    i) v zahřátém vodném roztoku se smísí škrob, soli železnaté a železí té a baze, ii) roztok se popřípadě zchladí pod
15. 15 °C k usazení gelu, iii) hodnota pH se sníží na rozmezí 6,0 až 8,5, přičemž tento stupeň se popřípadě provede před stupněm ii), iv) působí se oxidačním činidlem k rozštěpení škrobu a uvolnění částic, « ··

    - 67 v) uvolněné částice se promyjí a odfiltrují, vi) uvolněné částice se popřípadě nechají reagovat s polyalkylenoxidovým derivátem s funkčními skupinami k vazbě tohoto derivátu na částice a vii) popřípadě se uvolněné, částice sterilizují v autoklávu.
16. 16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se ti m , že většina uvolněných složených částic obsahuje jedinou magnetickou částici.

    16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i ni, že se štěpení ve stupni ii) provádí ve dvou stupních, přičemž druhý stupeň se uskuteční tak, aby došlo k odstranění v podstatě veškerého polymeru z magnetických částic a provádí se v přítomnosti nebo po přidání stabilizačního činidla, které se váže na magnetické částice.
17. 17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í tn , že se stupně i) a ii) provádějí v téže reakční nádobě.
18. 18. Složené částice, vyznačující se t i m , že při středním průměru částic 4 až 30 nm obsahují superparamagnetické anorganické částice jádra a povlak rozštěpeného hydrofilního polymeru.
19. 19. Složené částice podle nároku 18, vyznačující se t i m, že povlakovým materiálem je oxidovaný uhlohydrát.
20. 20. Složené částice podle některého z nároků 18 a 19,vyznačující se tím, že povlakovým materiálem je rozštěpený škrob.

    « ♦· v * ⁴ * * · ♦ ··♦ ·* · • · 1 · · ·« · ·*

    - 68
21. 21. Složené částice podle nároku 18, vyznačující se tím, že dále obsahují povlak hydrofilního polymeru pro prodloužení doby setrvání v krevním oběhu.
22. 22. Vodná suspenze superparamagnetických Částic anorganického jádra se středním průměrem částic 4 až 30 nm, vyznačující se tím, že částice jsou v podk statě prosté organického povlakového materiálu a nesou anorganické elektrostatické stabilizační činidlo, vázané na povrch částic.
23. 23. Vodná suspenze podle nároku 22, vyznačující se tím, že částice jako stabilizační činidlo nesou oligo- nebo polyfosfát.
24. 24. Složené částice podle nároku 18 se středním.průměrem 4 až 30 nm,vyznačující se tím, že obsahují superparamagnetické anorganické částice jádra, na jejichž povrch je navázán modifikátor biologické distribuce, přičemž vazba se uskuteční přes ionty železa nebo přes oligonebo polyfosfátové skupiny nebo fosfonátové skupiny uvedeného modifikátoru.
25. 25. Složené částice podle nároku 24, vyznačující se tím, že modifikátor biologické distribuce obsahuje polyalkylenoxidové skupiny.

    _ri
26. 26. Složené částice podle některého z nároků 24 a 25, vyznačující se tím, že dále obsahují povlak rozštěpeného hydrofilního polymeru.
27. 27. Složené Částice podle některého z nároků 18 až 26, vyznačující se tím, že na povrch částice jádra je vázána reportérova skupina, prokazatelná při diagnos tickém zobrazování.

    - 69 •« · • ···
28. 28. Složené částice podle nároku 27, vyznačující se t í m, že na povrch částice jádra je vázán jodovaný organofosfát.
29. 29. Prostředek pro injekční podání, vyznačující se t í m , že je tvořen anorganickými částicemi jádra, na jejichž povrch je fyzikálně nebo chemicky vázán hydrofilní polymer pro prodloužení doby setrvání v krevním oběhu, přičemž prostředek je opatřen povlakem hydrofilního organického polymeru, chránícího vazná místa.
30. 30. Prostředek podle nároku 29, vyznačující se t í m , že hydrofilním organickým polymerem, chránícím vazná místa je rozštěpený uhlohydrát s rozvětveným řetězcem,.
31. 31. Prostředek podle některého z nároků 29 a 30, vyznačující se tím, že hydrofilním polymerem pro prodloužení doby setrvání v krevním oběhu je polyalkylen oxid s funkčními skupinami.
32. 32. Diagnostický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje částice podle některého z nároků 18 až 31 nebo vyrobené způsobem podle některého z nároků 1 až 17 spolu s nejméně jedním fyziologicky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou.
33. 33. Kontrastní prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje kontrasně účinné množství složených částic, tvořených superparamagnetickými krystalky jádra z oxidu kovu a organickým povlakem, přičemž krystalky jádra mají střední průměr 2 až 10 nm, částice mají střední průměr až 30 nm a povlak je tvořen oxidativně rozštěpeným škrobem.

    - 70
34. 34. Kontrastní prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že povlak dále obsahuje polyalkylenoxid s funkčními skupinami.
35. 35. Kontrastní prostředek podle některého z nároků

    33 a 34,vyznačující se tím, že střední průměr krystalků jádra je 4 až 8 nm a částice mají střední průměr až 15 nm.
36. 36. Způsob vytváření kontrastních obrazů organismu člověka nebo jiného živočicha se zvýšenou kontrastností, vyznačující se tím,že se do organismu podá kontrastní prostředek podle některého z nároků 32 až 35 a vytvoří se obraz nejméně části organismu.
37. 37. Způsob stanovení distribuce kontrastní látky v organismu člověka nebo jiného člověka, vyznačující se t í m , že se podá kontrastní prostředek podle některého z nároků 32 až 35 a zaznamenává se signál, vyslaný nebo modifikovaný uvedenými Částicemi.
38. 38. Použití složených magnetických částic podle některého z nároků 1 až 31, pro výrobu diagnostického kontrastního prostředku.