CZ208197A3 - Side protein of human receptor for interleukin 1 - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká receptorů pro cytokiny, a přesněji vedlejších proteinů pro receptory lidského interlekinu 1.

Dosavadní stav techniky

Interleukin 1 (IL-1) je polypeptidový hormon, který účinkuje na mnoha typech buněk a má různé biologické vlastnosti (Dinarello, Blood 77: 1627, 1991). IL-1 je hlavním mediátorem zánětu a imunitních odpovědí. Proto, regulace aktivity IL-1 poskytuje prostředky pro kontrolu a modulování těchto odpovědí.

Byly charakterizovány dva druhy IL-1, interleukin lof (IL-Ια) a interleukin 1S (IL-Ιβ), oba jsou zde označovány jako IL-1. Biologické aktivity produkované IL-1 jsou zprostředkovány vazbou na specifické receptory plasmatické membrány, nazývané typ 1 a typ 2 receptorů pro interleukin 1. IL-1 receptory ((IL-1R) jsou transmembránové proteiny s extracelulární doménou o asi 300 aminokyselinách a jsou členy superrodiny imunoglobulinových molekul (Sims et al., Science 241: 585, 1988; Sims et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8946, 1989; McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991). Oba dva druhy IL-1 se váží na tyto receptory a kompletně soutěží o vazbu.

Bylo předpokládáno, že typ 1 II-IR kóduje celý funkční

IL-1 receptor. Experimenty s klonovaným typ 1 IL-1R ukazují, že když byl tento receptor transfektován do ovariálních buněk čínského křečka, byl tento dostatečný pro vazbu IL-1 a pro přenos IL-1 signálu (Curtis et al., Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 86: 3045, 1989). Přítomnost vedlejšího proteinu endogenního pro buňky křečka nebyla v těchto studiích prokázána. Bylo nazanačeno, že typ 2 IL-1R representuje vedlejší řetězec IL-1R (Solari, Cytokine 2: 21, 1990). Nicméně, novější studie ukázaly, že není pravděpodobné, že typ 2 IL-1R funguje jako signální-přenosový vedlejší protein a že místo toho účinkuje jako lákací receptor pro vazbu přebytečného IL-1 a reguluje jeho aktivitu (Colotta et al., Science 261: 472, 1993).

Protože vazba IL-1 na IL-1R zprostředkuje biologický účinek IL-1 je pochopení mechanismů vazby na receptor a aktivace významné pro regulaci aktivit IL-1. Studie afinitního překřížení a vazby se značeným IL-1 ukázaly, že IL-1 receptor existuje jako komplex mnoha proteinů, které mohou vázat IL-1 s různou afinitou (Lowenthal and MacDonald, J. Exp. Med., 164: 1060, 1986; Bensiman et al., J. Immunol. 143: 1168, 1989; McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991).

Byla popsána myší monoklonální protilátka (mAb) 4C5, která rozpoznává 90 kDa protein na myších buňkách, který je asociován s IL-1R a je vyžadován pro signální transdukci a biologickou aktivitu (Powers et al., AAI Meeting, Denver, CO, 21-25.5.1993). Nebylo známé, zda ekvivalentní protein existuje na lidských buňkách nebo která funkce, pokud nějaká, je asociována s takovým proteinem.

Před předkládaným vynálezem bylo snaze o identifikaci lidského IL-lR vedlejšího proteinu nebo o klonování a expresi genů kódujících tento protein významně bráněno nedostatkem purifikovaného proteinu, nedostatkem protilátky, která rozpoznává tento protein a neschopností identifikovat buňky, které exprivují velké množství tohoto proteinu a jeho mRNA. Ani myší vedlejší protein nebyl získán v dostatečném množství pro užití v pokusech o identifikaci korespondujícího lidského vedlejšího proteinu. Myší buněčné linie, o kterých je známo, že exprivují vedlejší protein, mají příliš malé množství (asi 1000 molekul/buňku) pro purifikaci dostatku proteinu pro získání jednoznačné informace o aminokyselinové sekvenci. Nebyla známá žádná mAb rozpoznávající lidský homolog k 4C5 cílovému proteinu (myšímu vedlejšímu proteinu). Kromě toho, vazba na IL-1 nebyla efektivně vyšetřována na identifikaci lidského vedlejšího proteinu, protože je známo, že mnoho vedlejších proteinů bud' neváže ligand, nebo ho váže s velmi nízkou afinitou (Hibi et al., Cell 63: 1149, 1990; Takeshita et al., Science 257: 379, 1992).

Tento vynález poprvé činí dostupným purifikovaný vedlejší protein lidského IL-l receptoru, který může být použit pro regulaci účinků IL-1. Přidání solubilního vedlejšího proteinu inhibuje účinek IL-1 na buňky. Proto, aspektem vynálezu je léčba patologických stavů způsobených nadbytkem aktivity buněk odpovídajících na IL-1 přidáním množství solubilního vedlejšího proteinu lidského IL-lR (IL-lR AcP), které je dostatečné pro inhibici aktivace buněk IL-l. Tato metoda také může být modifikována a solubilní vedlejší protein může být použit jako vyšetřovací agens pro farmaceuty.

Stručně, farmaceuti, kteří pracují s IL-1 antagonisty, mohou tohoto také dosáhnout blokováním interakce IL-1 s IL-1R AcP. Přítomnost IL-lR AcP v buněčné membráně je nezbytná pro umožnění účinné interakce IL-1 s komplexem IL-l receptoru (účinnou interakcí je míněna vazba na receptorový komplex tak, že se iniciuje biologická odpověď).IL-1 receptorový komplex obsahuje typ 1 nebo typ 2 IL-1 receptoru v asociaci s IL-lR AcP (další proteiny mohou také být součástí komplexu) . Přidání solubilního IL-1R AcP inhibuje tuto interakci umožněním IL-1 nebo IL-1 receptoru interagovat se solubilním proteinem namísto IL-1R AcP na povrchu buněk, což redukuje biologickou odpověď způsobenou IL-1. Protilátky k IL-1R AcP podle vynálezu rovněž inhibují biologickou odpověď buněk na IL-1. Vazbou na IL-1R AcP protilátky zabraňují IL-1 , aby účinně interagoval s IL-l receptorem. Blokováním IL-lR AcP tyto protilátky inhibují vazbu IL-1 na receptorový komplex IL-1, což závisí na interakci s IL-lR AcP. IL-lR AcP bude inhibovat interakci IL-1 s IL-1 receptorem, což zabrání aktivaci IL-1 reaktivních buněk a sníží zánětlivou odpověď. Může být také využit purifikovaný IL-lR AcP k vyšetřování potenciálních farmaceutických agens. Pokud léčivo blokuje vazbu IL-1 na IL-lR AcP, potom bude účinným IL-1 antagonistou.

Předkládaný vynález poskytuje polynukleotidy, které kódují vedlejší proteiny IL-1 receptoru nebo jejich aktivní fragmenty, preferovaně jsou polynukleotidy vybrány ze skupiny skládající se z (a) polynukleotidů, preferovaně cDNA klonů, majících esenciálně nukleotidovou sekvenci odvozenou od kódujícího regionu nativního IL-lR AcP genu, jak je ukázáno na obrázku 15 (SEQ ID NO: 1) ; (b) polynukleotidů schopných hybridizace cDNA klonů podle (a) za středně přísných podmínek a které kódují IL-1R AcP nebo jejich fragmenty; a (c) polynukleotidů, které jsou degenerovány z genetického kódu k DNA sekvencím definovaným v (a) a (b) a které kódují IL-1R AcP molekuly nebo jejich fragmenty. Zejména preferovanými sloučeninami jsou polynukleotidy, které kódují vedlejší proteiny lidského IL-1 receptoru, např. polynukleotidy kódující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 4) nebo její aktivní fragment, zejména polynukleotid mající sekvenci (SEQ ID NO: 1). Zejména preferované sloučeniny kódují solubilní vedlejší proteiny IL-1 receptoru, např. lidský solubilní vedlejší proteiny lidského IL-1 receptoru mající například aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 9) . Polynukleotid (SEQ ID NO: 7) kóduje solubilní vedlejší protein lidského IL-1 receptoru. Také jsou součástí tohoto vynálezu antisense polynukleotidy výše uvedených sloučenin.

Předkládaný vynález také poskytuje vektory a vhodné hostitelské buňky, preferovaně expresní vektory obsahující DNA sekvence definované výše, rekombinantní IL-1R AcP produkovaný za použití expresních vektorů a metodu pro produkci rekombinantních molekul vedlejších proteinů za •využití expresních vektorů.

Předkládaný vynález umožňuje získání vedejších proteinů IL-1 receptoru a jejich aktivních fragmentů, kódovaných polynukleotidy definovanými výše. Preferovanými sloučeninami jsou vedlejší proteiny lidského IL-1 receptoru, preferovaně proteiny mající aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3) . Zejména preferovány jsou solubilní vedlejší proteiny lidského IL-1 receptoru, např. ty, které mají aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 9) . Součástí vynálezu jsou také IL-1R

AcP proteiny nesoucí jednu nebo více postraních skupin, které byly modifikovány.

Předkládaný vynález také poskytuje protilátky k IL-1R AcP. Tyto protilátky se specificky váží na vedlejší protein lidského IL-l receptoru a brání aktivaci komplexu IL-1 receptoru Preferované protilátky mají vazebnou afinitu k vedlejšímu komplexu IL-1 receptoru od asi K_d 0,1 nM do asi K_d 10 nM a jsou to například monoklonální protilátky nebo jejich deriváty.

Součástí tohoto vynálezu jsou také farmaceutické kompozice, které obsahují antisense polynukleotid, vedlejší protein IL-1 receptoru nebo protilátku jak je popsáno výše. Tyto farmaceutické kompozice mohou obsahovat jeden nebo více antagonistů cytokinů.

Předkládaný vynález také poskytuje proces pro přípravu vedlejšího proteinu IL-1 receptoru, kde tento proces obsahuje kroky (a) expresi polypeptidu kódovaného výše uvedeným polynukleotidem ve vhodném hostiteli, (b) izolování uvedeného vedlejšího proteinu IL-1 receptoru a (c) pokud je to žádoucí, jeho konvertování na analog, kde je jedna nebo více postraních skupin modifikována. Navíc, vynález obsahuje proces pro přípravu protilátky proti vedlejšímu proteinu IL-1 receptoru, který obsahuje kroky (a) přípravu hybridomní buněčné linie produkující monoklonální protilátku, která se specificky váže na vedlejší protein IL-1 receptoru a (b) produkci a izolaci monoklonální protilátky. Korespondující polyklonální protilátky mohou být produkovány za použití známých metod.

Výše uvedené sloučeniny jsou využitelné jako terapeuticky aktivní substance, např. pro použití při léčbě zánětlivých nebo imunitních odpovědí a/nebo pro regulaci a bránění imunologickým aktivitám interleukinu-1. Zejména jsou tyto sloučeniny užitečné v léčbě akutních nebo chronických onemocnění, preferovaně revmatoidní artritidy, zánětlivých střevních onemocnění, septického šoku, rejekce transplantátu, psoriasy, astmatu a typu edna diabetů, v léčbě nádorů, preferovaně akutní a chronické myeloidní leukemie.

Jak je zde použito zahrnuje IL-l jak IL-Ια, tak IL-Ιβ, a IL-l receptor zahrnuje typ 1 a 2 IL-l receptorů, pokud není uvedeno j inak.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek l. Rovnovážná vazba (^X25I)-4C5 na myší EL-4 buňky při pokojové teplotě. EL-4 buňky (1,5 x 10® buněk) byly inkubovány po 2 hodiny při pokojové teplotě se zvýšenou koncentrací (^12SI)-4C5 za absence (o) nebo přítomnosti (V)

100 nM neznačené 4C5. Celková (o) a nespecifická (V) na buňku navázaná radioaktivita byla určena podle příkladu 1. Specifická vazba (^X25I)-4C5 (*) byla kalkulována odečtením nespecifické vazby z celkové vazby. IA. Vazba EL-4 buněk inkubovaných s (¹²⁵I)-4C5. 1B. Analýza dat vazby podle Scatchardovi metody (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) jak bylo určeno Ligandem (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220, 1980; McPherson, J. Pharmacol, Methods 14: 213, 1985) s jednomístným modelem.

Obrázek 2. Rovnovážná vazba (^X2SI)-4C5 na myší 70Z/3 buňky 70 Z/3 buňky (1,5 x 10^s buněk) byly inkubovány po 2 hodiny při pokojové teplotě se zvýšenou koncentrací (^X25I)-4C5 za absence (o) nebo přítomnosti (V) 100 nM neznačené 4C5. Celková (o) a nespecifická (V) na buňku navázaná radioaktivita byla určena podle příkladu 1. Specifická vazba (^X25I)-4C5 (*) byla kalkulována odečtením nespecifické vazby z celkové vazby. 1A. Vazba 70Z/3 buněk inkubovaných s (^X25I)-4C5. 1B. Analýza dat vazby podle Scatchardovi metody (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) jak bylo určeno Ligandem (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220, 1980; McPherson, J. Pharmacol. Methods 14: 213, 1985) s jednomístným modelem.

Obrázek 3. Inhibice vazby lidského (^X25I)-IL-l na IL-1 receptor na 70Z/3 buňkách monoklonálními protilátkami 4C5, 4E2 a 35F5. Inhibiční test byl proveden jak je popsáno v příkladu 1. Data jsou vyjádřena v procentech inhibice (^X25I)-IL-1 vazby za přítomnosti ukázaných koncentrací protilátky ve srovnání sen specifickou vazbou za nepřítomnosti protilátky. Proteiny jsou lidský IL-la (H-alfa) a lidský IL-lS (H-beta)

Obrázek 4. Inhibice vazby lidského (^12SI)-IL-1 na IL-1 receptor na EL-4 buňkách monoklonálními protilátkami 4C5, 4E2 a 35F5. Inhibiční test byl proveden jak je popsáno v příkladu 1. Data jsou vyjádřena v procentech inhibice (^X25I)-IL-1 vazby za přítomnosti ukázaných koncentrací protilátky ve srovnání sen specifickou vazbou za nepřítomnosti protilátky. Proteiny jsou lidský IL-la (H-alfa) a lidský IL-lS (H-beta)

Obrázek 5. Izolace dvou proteinů o 90 a 50 kDa ze solubilizovaného extraktu EL-4 buněk 4C5 afinitní chromatografií. Proteiny byly částečně purifikovány z detergentového extraktu EL-4 buněk lektin lecitinovou afinitní chromatografií a potom následovala afinitní chromatografie na matrix obsahující buď anti-typ 1 IL-1R protilátku (7E6) , myší IL-Ια (Ma) nebo anti-vedlejší protein protilátku (4C5) jak je popsáno v příkladu 1. Proteiny v detergentovém extraktu EL-4 buněk byly také přímo purifikovány na 4C5 afinitní matrix (4C5). Proteiny eluované z kolon byly separovány SDS-PAGE, transferovány do nitrocelulosy a probovány (^X25I)-4C5. Molekulární velikosti ukázané na okrajích byly určeny ze standardů molekulární hmotnosti (Amersham Prestained Standards) proběhlých v paralelních liniích. Doba expozice byla 1 den.

Obrázek 6. Inhibice IL-1 indukované proliferace B buněk sleziny monoklonálními protilátkami 4C5, 4E2 a 35F5.

Inhibiční test byl proveden jak je popsáno v příkladu 1. Data jsou vyjádřena jako inkorporace ³H-thymidinu (CPM) v B buňkách za přítomnosti ukázaných koncentrací protilátky ve srovnání s nepřítomností protilátky. Proteiny jsou 6A. Lidský IL-Ια (H-alfa) a 6B. Lidský IL-Ιβ (H-beta)

Obrázek 7. Inhibice IL-1 indukované proliferace D10.G4.1 helper T-buněk sleziny monoklonálními protilátkami 4C5, 35F5 a lidského II-Ira. Inhibiční test byl proveden jak je popsáno v příkladu 1. Data jsou vyjádřena jako inkorporace ³H-thymidinu (CPM) v D10 buňkách za přítomnosti ukázaných koncentrací protilátky a II-Ira ve srovnání s inkorporací za nepřítomnosti protilátky nebo IL-lra. Proteiny jsou 7A.

Lidský IL-ΐα a 7B. Lidský IL-Ιβ.

Obrázek 8. Inhibice IL-1 indukované exprese kappa lehkých řetězců 70Z/3 buňkami: účinek monoklonálních protilátek 4C5, 4E2 a 35F2. Indukce exprese kappa lehkého řetězce a inhibice s protilátkami byla jak je popsáno v příkladu 1. Data jsou vyjádřena jako procento buněk exprivujících kappa lehký řetězec v přítomnosti ukázané koncentrace protilátky ve srovnání s procentem buněk za absence protilátky. Proteiny jsou lidský IL-la (IL-Ια) a lidský IL-Ιβ (IL-Ιβ).

Obrázek 9. Inhibice IL-1 indukovaného sérového IL-6 v C57BL/6 myších monoklonálními protilátkami 4C5 a 35F5. Myši byly předošetřeny monoklonální protilátkou 4 hodiny a 10 minut před subcutánní injekcí lidského IL-Ια (alfa) nebo Lidského IL-Ιβ (beta) (0,03 p.g) . Dvě hodiny po podání IL-1 byly určené sérové koncentrace IL-6 jak je popsáno v příkladu 1. Mab X-7B2 je kontrolní protilátka.

Obrázek 10. Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence myšího IL-lR AcP. 10 A. Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámečku myšího IL-lR AcP cDNA klonu E2-K je ukázána. Horní řetězec je kódující sekvence (SEQ ID NO: 4). 10B. Aminokyselinová sekvence myšího IL-lR AcP jak je odvozena od kódující sekvence ukázané na obrázku 10A je ukázána (SEQ ID NO: 6). Výskyt signální peptidového štěpícího místa je předurčen po Ala-1, což vede ke zralému proteinu o 550 aminokyselinách, který sahá od Ser 1 do Val 550. Štěpící místo bylo potvrzeno analýzou NH^- terminální sekvence purifikovaného přirozeného muIL-lR AcP (příklad 10). Určená transmembránová doména sahá od Leu 340 do Leu

363 .

Obrázek 11. Imunoprecipitace rekombinantního MuIL-lR AcP z transfektováných COS buněk mAb 4C5 a 2E6. COS buňky byly transfektovány elektroporací buď pEF-BOS/muIL-lR AcP nebo pEF-BOS samotným (imitacích). Transfektované buňky byly metabolicky značeny (^3SS)Met jak je popsáno (příklad 8). Znajčené transfektanty byly solubilizovány RIPA pufrem a imunoprecipitovány buď s 4C5 nebo 2E6 (viz tabulka 2) jak je popsáno (příklad 8). Obě mAb imunoprecipitovaly značený protein z COS buněk transfektovaných pEF-BOS/muIL-lR AcP, který migroval jako široký proužek mezi 70 a 90 kDa. Žádný značený protein této velikosti nebyl detekován z imitací transfektovaných COS buněk. Druh vyšší molekulové hmotnosti (>200 kDa) je přítomen jak v imitacích, tak v muIL-lR AcP transfektovaných COS buňkách.

Obrázek 11. Rovnovážná vazba (^12SI) - značené 4C5 a IL-1 na myší rekombinantní IL-1R AcP exprivovaný na COS-7 buňkách. Buňky (4-8 x 10⁴) transfektované IL-1R AcP expresním plasmidem (COS(AcP)) nebo kontrolním plasmidem (COS(PEF-BOS)) byly inkubovány po 3 hodiny při 4 °C se zvýšenými koncentracemi (¹²⁵I)-4C5 nebo (^12SI)-IL-Ια za absence (celkem) nebo přítomnosti (nespecifické) 100 nM neznačené 4C5 nebo 50 nM neznačeného IL-Iqí. Celková (celková) a nespecifická (nespecifická) na buňky navázaná radioaktivita byla určena jak je popsáno v příkladu 1. Specifická vazba (^12SI)-4C5 (specifická) nebo (¹²⁵l)-IL-la (specifická) byla kalkulována odečtením nespecifické vazby od celkové vazby. Vazba (¹²⁵I)-IL-Ια na COS buňky transfektované kontrolním plasmidem (COS(PEF-BOS)) ukázala, že COS-7 přirozeně exprivují přibližně 600 krát více afinitních vazebných míst pro IL-Ια. Pravý panel ukazuje analýzu vazebných dat podle metody podle Scatcharda (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) jak je určeno Ligandem (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:

220, 1980; McPherson, J. Pharmacol. Methods 14: 213, 1985) v jednomístném modelu. 12A. Vazba COS(AcP) buněk inkubovaných s (^x2sI)-4C5. 12B. Scatchard křivka dat 12A. 12C. Vazba COS(AcP) buněk inkubovaných s (^12SI)-IL-Ια. 12D. Scatchard křivka dat 12C. 12E. Vazba (COS(PEF-BOS) buněk inkubovaných s (¹²⁵I)-IL-la. 12F. Scatchard křivka dat 12E.

Obrázek 13. Rovnovážná vazba (^12SI) - značené 35F5 a IL-1 na myší rekombinantní typ 1 IL-1R exprivovaný na COS-7 buňkách. Buňky (4-8 x 10⁴) transfektované typem 1 IL-1R expresním plasmidem (COS (Mu-IL-IR) ) byly inkubovány po 3 hodiny při 4 °C se zvýšenými koncentracemi (¹²⁵I)-35F5 nebo (¹²⁵I)-IL-la a (^12sI)-IL-lfi za absence (celkem) nebo přítomnosti (nespecifické) 100 nM neznačené 35F5 nebo 50 nM neznačeného IL-1. Celková (celková) a nespecifická (nespecifická) na buňky navázaná radioaktivita byla určena jak je popsáno v příkladu 1. Specifická vazba (^12SI)-35F5 (specifická) nebo (^X25I)-IL-Ια nebo (¹²⁵I)-IL-1E (specifická) byla kalkulována odečtením nespecifické vazby od celkové vazby. Pravý panel ukazuje analýzu vazebných dat podle metody podle Scatcharda (Scatchard, Ann. N.Y. Acad.

Sci. 51: 660, 1949) jak je určeno Ligandem (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220, 1980; McPherson, J. Pharmacol. Methods 14: 213, 1985) v jednomístném modelu.

13A. Vazba COS(Mu-IL-IR) buněk inkubovaných s (^12SI)-35F5. 13B. Scatchard křivka dat 13A. 13C. Vazba COS (Mu-IL-IR) buněk inkubovaných s (^l2sI)-IL-Ιβ. 13D. Scatchard křivka dat 13C. 13E. Vazba (COS(Mu-IL-IR) buněk inkubovaných s (^12SI)-IL-la. 13F. Scatchard křivka dat 13E.

Obrázek 14. Konstrukce kompletního cDNA klonu lidského IL-lR AcP. Schematické representace struktur lidských IL-lR AcP cDNA insertů v klonech č.3 a č.6 jsou ukázány v horní části obrázku. Klon č. 3 obsahuje 5'nekódující sekvence, iniciační ATG kodon a signifikantní část kódujícího regionu Klon č. 6 se překrývá s klonem č. 3 a obsahuje většinu kódujícího regionu, TGA stop kodon a 3' nekódující sekvence 846 bp Xbal/BstXI fragment z klonu č. 3 a asi 2700 bp BstXI/Xbal fragment z klonu č. 6 byly izolovány a ligovány do expresního vektoru pEF-BOS jak je popsáno (příklady 12 a

13) . Schematická representace vzniklé cDNA kódující kompletní lidský IL-lR AcP je ukázána na spodní řádce.

Obrázek 15. Nukleotidová sekvence lidského IL-lR AcP.

Je ukázána nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámečku v cDNA kompletního lidského IL-lR AcP (příklad 13, obrázek

14) . Horní řetězec je kódující sekvence (SEQ ID NO: 1) .

Obrázek 15. Aminokyselinová sekvence lidského IL-lR AcP. Aminokyselinová sekvence lidského IL-lR AcP odvozeného z translace nukleotidové sekvence podle obrázku 15 je ukázána (SEQ ID NO: 3) . Výskyt signálního peptidového štěpícího místa je určen po Ala-1, což vede k produkci zralého proteinu o 550 aminokyselinách, který je v rozsahu od Serl do Val 550. Předpokládaná transmembránová doména je v rozsahu od Leu340 do Leu363.

Obrázek 17. IL-1 indukce IL-6 produkce v MRC-5 buňkách: inhibice antagonisty IL-1 receptoru a anti-typ 1 IL-1 receptorovou protilátkou 4C1. Lidské embryonální plicní fibroblasty MRC-5 (5 x 10⁴ buněk; ATCC č. CCL-171) byly umístěny na 24-jamkové shlukové plotny (č. 3524; Costar) po 24 hodin při 37 °C v humidifikovaném inkubátoru. Po 24 hodinách byly buňky předošetřeny zvýšenými koncentracemi buď antagonistů IL-1 receptoru (IL-1RA; 10“² až 10³ pM), anti typ 1 IL-1 receptorovou protilátkou 4C1 (10^-4 až 10¹ ^g/ml) nebo nebyly ošetřeny ničím po jednu hodinu při 37 °C. Na konci první hodiny bylo přidáno buď 5 pM nebo 100 pM lidského IL-Ιβ a inkubace pokračovala po 24 hodin při 37 °C. Na konci inkubační periody bylo 100 μΐ buněčného supernatantu odebráno z každé jamky a testováno na koncentraci IL-6 Quantikine Human IL-6 Assay kitem (R & D Systems) . Data jsou vyjádřena jako koncentrace (pg/ml) IL-6 secernované MRC-5 buňkami za přítomnosti buď IL-Ιβ samotného nebo za přítomnosti IL-Ιβ a inhibitoru. Účinek zvýšených koncentrací tumor nekrosis faktoru-α (TNF-a) na stimulaci IL-6 sekrece z MRC-5 buněk byla také určena. TNF-α byl méně potentní (asi 500 krát) než IL-Ιβ na stimulaci IL-6 sekrece těmito buňkami a jevil se být částečně závislým na autokrinní sekreci IL-l těmito buňkami. 17A ukazuje data pro IL-Ιβ, TNF-qí a inhibici IL-lra. 17B ukazuje data pro inhibici mAb 4C1.

Obrázek 18. Nukleotidová sekvence solubilního lidského IL-1R AcP. Je ukázána nukleotidová sekvence cDNA solubilního lidského IL-1R AcP. Horní řetězec je kódující sekvence (SEQ ID NO: 7).

Obrázek 19. Aminokyselinová sekvence solubilního lidského IL-1R AcP. Aminokyselinová sekvence lidského IL-1R AcP odvozeného z translace nukleotidové sekvence podle obrázku 18 je ukázána (SEQ ID NO: 9).

Předkládaný vynález je zaměřen na izolovaný polynukleotid, který kóduje IL-1R AcP (IL-1R AcP) nebo aktivní fragment IL-1R AcP (t.j. schopný inhibice schopnosti IL-l vázat se na nebo jinak aktivovat IL-1 receptor), zejména lidský nebo myší IL-1R AcP. Příklady takových polynukleotidů jsou DNA polynukleotid mající sekvenci (SEQ ID NO: 1) a DNA polynukleotid mající kódující lidský IL-1R AcP, který má aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3). Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou být použity jako intermediáty pro produkci proteinu IL-1R AcP jak je popsáno dále. Tento protein je užitečný v léčbě stavů souvisejících se zánětlivou aktivitou IL-1. Polynukleotidy mohou být použity v léčbě sami o sobě ve známých antisense modalitách.

Vynález je také zaměřen na vedlejší protein IL-1 receptoru (IL-1R AcP), který je izolován bez jiných proteinů, nebo na izolovaný fragment IL-1R AcP. IL-1R AcP podle tohoto vynálezu je protein nebo aktivní fragment, který inhibuje schopnost IL-l vázat se na nebo jinak aktivovat IL-1 receptor.

Částí tohoto vynálezu je způsob pro získání lidského IL-1R AcP, kde tento způsob využívá jako intermediátů následujících sloučenin: Polynukleotidů kódujících myší IL-1R AcP, myší IL-1R AcP, protilátky proti myším IL-1R AcP a polynukleotidů kódujících lidský IL-1R AcP. z polynukleotidů kódujících lidský IL-1R AcP mohou být získány solubilní lidský IL-1R AcP a protilátky proti němu. Prvním zásadním intermediátem pro tento vynález je izolace mAb proti vedlejšímu proteinu myšího IL-1R. Tyto mAb jsou získány imunizací parciálně purifikovaným přípravkem solubilizovaného zkříženě vázaného IL-la/IL-lR komplexu z myších 70Z/2 pre-B buněk (popsáno v příkladu 1). Použití zkříženě vázaného komplexu ligand-receptor bylo unikátně stabilní, protože vedlejší protein nemohl být pouze purifikován v důsledku jeho interakcí v takovém komplexu. Jedna z těchto mAb (4C5) byla potom využita k izolaci cDNA kódující myší IL-lR AcP. Tato myší cDNA byla použita k získání částečného genomového klonu lidského homologu. Proba odvozená od částečného genomového klonu byla potom využita k izolaci kompletní cDNA pro lidský IL-lR AcP.

Jak je zde použito, označuje polynukleotid izolovaný DNA nebo RNA polymer, ve formě jednotlivých molekul nebo jako složku většího DNA nebo RNA konstruktu, který byl odvozen od DNA nebo RNA izolované ve významně čištěné formě, t.j. prosté od kontaminace endogenním materiálem a v množství nebo koncentraci umožňující identifikaci, manipulaci a získání sekvence a jejích komponent nukleotidových sekvencí standartními biochemickými metodami, například, za použití klonovacího vektoru. Takové sekvence jsou preferovaně poskytnuty ve formě otevřeného čtecího rámečku nepřerušovaného vnitřími netranslatovánými sekvencemi, nebo introny, které jsou typicky přítomny v eukaryotických genech. Nicméně, bude zřejmé, že genomová DNA obsahující relevantní sekvence může být také použita.

Může být přítomna 5' nebo 3' sekvence netranslatované DNA z otevřeného čtecího rámečku, pokud neinterferuje s manipulací nebo expresí kódujících regionů.

Tyto polynukleotidy, např. DNA, zahrnují ty, které obsahují jeden nebo více výše identifikovaných DNA sekvencí a ty sekvence, které hybridizují na tyto DNA sekvence za přísných hybridizačních podmínek (viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982) str. 387 - 389) . Příkladem takových přísných hybridizačních podmínek je hybridizace při 4 x SSC při 65 °C, po čemž následuje promytí v 0,1 x SSC při 65 °C po jednu hodinu. Alternativním příkladem přísných hybridizačních podmínek je 50% formamid, 4 x SSC při 42 °C.

Polynukleotidy, které hybridizují na sekvence pro IL-1R AcP za středních hybridizačních poodmínek a které kódují expresi IL-1R AcP peptidů majících IL-1R AcP biologické vlastnosti také kódují nové IL-1R AcP polypeptidy. Příkladem takových ne-přísných hybridizačních podmínek je hybridizace při 4 x SSC při 50 °C, nebo hybridizace s 30 - 40% formamidem při 42 °C. Další hybridizační podmínky jsou zmíněny v příkladu 11. Například, DNA sekvence, která má regiony signifikantní homologie, např. místa glykosylace nebo disulfidové vazby, se sekvencí IL-1R AcP a kóduje protein mající jednu nebo více biologických vlastností IL-1R AcP, jasně kóduje IL-1R AcP polypeptid, i kdyby taková DNA sekvence nehybridizovala za přísných podmínek na IL-lR AcP sekvence.

Polynukleotidy podle tohoto vynálezu byly získány jak je popsáno v příkladech 7 až 13 exprivováním myší cDNA v eukaryotních buňkách a vyšetřováním proteinů buněčného povrchu za použití testů popsaných v příkladu 7. Byl identifikován myší cDNA klon, který vede k expresi proteinu imunoreaktivního s mAb 4C5. Tento cDNA klon byl použit pro získání homologního lidského genomového klonu. Stručně, lidská genomová DNA byla vyšetřována intermediátní myší IL-1R AcP probou získanou od myších buněk v příkladu 7.

Klony byly izolovány a sekvencovány jak je popsáno. Částečné lidské genomové klony byly potom použity jako intermediáty pro vyšetřování lidské cDNA knihovny a klony byly izolovány a sekvencovány jak je popsáno pro získání kompletních polynukleotidů podle tohoto vynálezu kódujících lidský IL-1R AcP.

Specifický polynukleotid podle tohoto vynálezu má sekvenci (SEQ ID NO: 1). Jiný polynukleotid podle tohoto vynálezu kódující lidský IL-1R AcP má aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3) . Jakýkoliv polynukleotid schopný kódování aminokyselinové sekvence IL-1R AcP, nebo specificky (SEQ ID NO: 3), je částí tohoto vynálezu. Jiný polynukleotid podle -vynálezu má sekvenci (SEQ ID NO: 4) .

Součástí tohoto vynálezu je také polynukleotid kódující aktivní fragment IL-1R AcP. Takové polynukleotidy jsou fragmenty polynukleotidů poskytnutých výše (fragmetováných známými metodami jako je restrikční trávení nebo stříhání) které, pokud j sou exprivovány konvenčními metodami, produkuj i proteiny, které blokují IL-l aktivitu v IL-l testu popsaném níže. Polynukleotid kódující solubilní IL-1R AcP je preferovaným fragmentem podle vynálezu. Příklad takového polynukleotidů má sekvenci (SEQ ID NO: 7) .

Polynukleotidy kódující IL-1R AcP a jejich aktivní fragmenty jsou užitečné jako intermediáty, ze kterých jsou získány IL-1R AcP a jejich aktivní fragmenty. Kromě toho jsou tyto polynukleotidy užitečné jako antisense terapeutika, která blokují produkci IL-1R AcP. Antisense terapeutika jsou použita podle Akhtar a Ivinson, Nátuře Genetics 4: 215, 1993. RNA nebo DNA polynukleotidy mají oba toto využití. Antisense polynukleotidy, které jsou komplementární k (SEQ ID NO: 1) nebo k fragmentu této sekvence jsou částí tohoto vynálezu. Takové polynukleotidy mohou být získány známými metodami jako je DNA nebo RNA syntesa za produkce komplementární sekvence. Tak, jakákoliv sekvence z polynukleotidů podle tohoto vynálezu, která je schopna hybridizace na DNA nebo RNA kódující IL-1R AcP za středně přísných podmínek známých v oboru a která, pokud takto hybridizuje brání syntese IL-1R AcP, je také částí tohoto vynálezu.

Tento vynález zahrnuje vektory, které obsahují polynukleotidy zde popsané, které kódují IL-lR AcP nebo jakýkoliv aktivní fragment. Může být použit jakýkoliv v oboru známý vektor, jako jsou plasmidy, fagemidy, virové vektory, cosmidy a jiné vektory. Polynukleotidy jsou insertovány do vektorů metodami dobře známými v oboru rekombinantní DNA technologie. Expresní vektory jsou jednotlivým příkladem vynálezu.

Jak je zde použito označuje expresní vektor vektor jako je plasmid obsahující transkripční jednotku obsahující seskupení (i) genetického elementu nebo elementů majících regulační úlohu v expresi genu, například, promotory nebo enhancery, (2) strukturální nebo kódující sekvenci, která je transkribována do mRNA a translatována do proteinu a (3) vhodné iniciační a terminační sekvence transkripce a translace. Strukturální elementy vhodné pro použití jsou různé eukaryotní expresní systémy preferovaně obsahující signální sekvenci umožňující extracelulární sekreci translatovaného proteinu hostitelskou buňkou. Alternativně, pokud je rekombinantní protein exprivován bez signální nebo transportní sekvence, pak může obsahovat N-terminální methioninový zbytek. Tento zbytek může být volitelně následně štěpen z expresního rekombinantního proteinu za vzniku konečného produktu.

Součástí tohoto vynálezu jsou také hostitelské buňky obsahující expresní vektory obsahující polynukleotidy podle tohoto vynálezu, které exprivují IL-lR AcP nebo aktivní fragmenty. Tyto polynukleotidy jsou insertovány do vektorů obsahujích regulační sekvence transkripce za tvorby expresních vektorů. Tyto expresní vektory jsou potom insertovány do hostitelských buněk transfekcí, infekcí, elektroporací nebo jinými dobře známými způsoby. Takové hostitelské buňky jsou schopné produkce proteinů z expresních vektorů do nich insertovaných. Jiné hostitelské buňky, např. kvasinky, ovariální buňky čínského křečka, bakteriální buňky mohou být využity s vhodnými expresními vektory.

Jak bylo zmíněno výše je tento vynález také zaměřen na vedlejší protein IL-l receptoru (IL-lR AcP) izolovaný bez jiných proteinů, nebo na aktivní fragment IL-lR AcP. IL-lR AcP podle tohoto vynálezu nebo aktivní fragment, který inhibuje schopnost IL-1 vázat se na nebo jinak aktivovat IL-1 receptor, zejména typ 1 IL-1 receptoru. Inhibice aktivace lidského IL-1 receptoru je zprostředkována lidským IL-lR AcP nebo aktivními fragmenty a má různé účinky, zejména v redukci zánětu. Tak je prostřednictvím IL-lR AcP nebo aktivního fragmentu možné inhibovat IL-1 aktivaci buněk a tak redukovat nebo zmírnit příznaky asociované se zánětem.

Aktivní fragment nebo IL-1R AcP mohou být získány konvenčními metodami pro získávání proteinových fragmentů. Například, DNA podle tohoto vynálezu může být fragmentována restrikčním trávením nebo stříháním a může být exprivována v hostitelské buňce konvenčními metodami pro poskytnutí fragmentů IL-1R AcP. Fragmenty IL-lR AcP mohou být také získány proteolýsou IL-lR AcP podle tohoto vynálezu. Aktivní fragmenty podle tohoto vynálezu jsou určeny vyšetřením aktivity za použití IL-1 testu popsaného níže.

Solubilní IL-1R AcP je IL-1R AcP fragment podle tohoto vynálezu, ve kterém delece COOH-terminálních sekvencí vedla k sekreci proteinu do kultivačního media. Solubilní IL-1R AcP koresponduje celému nebo části extracelulárního regionu IL-1R AcP. Metody pro objasnění COOH terminálních a extracelulárních regionů proteinů jsou dobře známé. Vzniklý protein si preferovaně uchovává svou schopnost interagovat s IL-1 nebo typem 1 a typem 2 IL-1R. Zejména preferované sekvence zahrnují ty, ve kterých jsou transmembránový region a intracelulární doména IL-lR AcP deletovány nebo substituovány pro usnadnění sekrece vedlejšího proteinu do kultivačního media. Solubilní IL-lR AcP může také obsahovat část transmembránového regionu, což umožňuje sekreci solubilního IL-lR AcP z buňky. Solubilní IL-lR AcP je získán jak je popsáno v příkladech 14 a 15. Specifický solubilní

IL-1R AcP podle tohoto vynálezu má sekvenci (SEQ ID NO: 9) .

Preferovaný příklad IL-1R AcP má aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3). Aminokyselinová sekvence IL-1R AcP jak je odvozena z cDNA sekvence (SEQ ID NO: 1) je ukázána na obrázku 16. Jakýkoliv IL-1R AcP, který ovlivňuje IL-1 vazbu jak je popsáno výše, je obsahem tohoto vynálezu, stejně jako analog mající sekvenci (SEQ ID NO: 3), ve kterém bylo jedna nebo více postraních skupin modifikováno známým způsobem, připojením sloučenin jako je polyethylenglykol, nebo inkorporací ve fusním proteinu (s jinou proteinovou sekvencí jako je imunoglobulinová sekvence) například, nebo proteiny, jejichž aktivita byla jinak uchována nebo posílena jakoukoliv takovou modifikací. Jsou zde také obsaženy proteiny, které inhibují IL-1 vazbu na IL-1 receptor a mají esenciálně sekvenci (SEQ ID NO: 3) s adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin známými technikami jako je místně řízená mutagenese. Změna v aminokyselinách je omezená a konzervativní, takže udržuje identitu proteinu jako je IL-1R AcP se všemi nebo částí jeho aktivity jak je popsána, nebo posiluje tyto aktivity. Prostředky pro určení IL-1 inhibiční aktivity jsou popsány v příkladech 5, 6, 16 a obsahují inhibici IL-1 vazby na IL-1 receptor, inhibici proliferace lymfocytů nebo exprese kappa lehkých řetězců a snížení IL-1 indukované IL-6 exprese.

IL-1R AcP izoláty prosté od jiných proteinů mohou být získány z polynukleotidů podle tohoto vynálezu, které kódují IL-1R AcP. Například, IL-1R AcP může být získán konvenčními prostředky expresí polynukleotidů zde poskytnutých kódujících IL-1R AcP, preferovaně DNA (SEQ ID NO: 1) nebo (SEQ ID NO: 2) v hostitelských buňkách, a izolací výsledného proteinu. Pokud je získán IL-1R AcP, pak může být izolován protein prostý od jiných proteinů konvenčními prostředky. Tyto metody zahrnují, ale nejsou omezeny na purifikaci nebo protilátkovou afinitní kolonus protilátkami podle tohoto vynálezu, chromatografii na iontových výměnných nebo gelových filtračních kolonách, purifikaci vysoce účinnou kapalinovou chromatografii a purifikaci s IL-l afinitní kolonou.

IL-1R AcP může být stabilizován připojením polyalkylenglykolového polymeru pomocí známých metod. Polyalkylenglykol zahrnuje polyethylen glykol a jiné polyalkylenové polymery, které mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené. Polymery mohou přímo navázány na protein nebo mohou být připojeny prostřednictvím vazebných skupin spojujících například COOH polymeru a NH^ lysinu na proteinu.

IL-lR AcP podle tohoto vynálezu může být použit přímo v terapii pro vazbu nebo odklizení IL-l, což poskytuje prostředek pro regulaci a zabránění zánětlivých nebo imunologických aktivit IL-l. V tomto použití pro zabránění nebo zvrácení patologických odpovědí mohou být solubilní IL-lR AcP nebo protilátky k IL-1R AcP kombinovány s jinými antagonisty cytokinů jako jsou protilátky k IL-2 receptoru, solubilní TNF receptor, antagonisté IL-l receptoru, solubilní IL-l receptor a podobně. Kromě toho, izolovaný IL-1R AcP podle tohoto vynálezu je užitečný pro vznik protilátek proti IL-lR AcP, které jsou sami o sobě užitečné v terapii. Vývoj takových protilátek je snadný, jelikož tento vynález poskytuje IL-lR AcP v dostatečném množství pro produkci protilátek.

Tak je tento vynález také zaměřen na protilátky k lidskému IL-lR AcP. Myší nebo krysí monoklonální protilátky k lidskému IL-lR AcP jsou získány jak je uvedeno v příkladu 15. Tyto protilátky jsou získány imunizací purifikovaným nebo částečně purifikovaným množstvím lidského IL-lR AcP, které je získáno po expresi rekombinantního kompletního nebo solubilního lidského IL-lR AcP za použití DNA podle tohoto vynálezu. Lidská IL-lR AcP cDNA byla izolována za použití myší IL-lR AcP DNA podle tohoto vynálezu, která byla izolována unikátní mAb 4C5 popsanou v příkladech 2 a 3. Pro myší nebo krysí mAb k lidskému IL-lR AcP může potom být použita pro získání hybridomů hybridomová technika dobře v oboru známá pro generování mAb. Chimérické protilátky nebo humanizované protilátky mohou být získány z těchto hlodavcích protilátek za použití známých metod (Brown et al., Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 88: 2663, 1991; WO 90/7861, EP 620276) nebo produkcí heterodimerických bispecifických protilátek (Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547, 1992).

Protilátky k lidskému IL-lR AcP podle tohoto vynálezu váží specificky lidský IL-lR AcP a brání aktivaci IL-1 receptorového komplexu IL-1. Tato aktivita může být určena testy zde popsanými. Specificky, biologické testy zahrnují vyšetření založené na schopnosti protilátky inhibovat proliferaci IL-1 reaktivních buněk nebo inhibovat IL-1 indukovanou sekreci prostaglandinu E₂ nebo IL-6. Takové testy mohou být provedeny konvenčními metodami v buněčné biologii. Vhodné buněčné linie pro tyto testy zahrnují B buňky sleziny, buněčné linie jako je lidská B buněčná linie RPMI 1788 (Vamdenabeele et al., J. Immunol. Meth. 135: 25, 1990) a lidské fibroblasty jako je lidská linie plicních fibroblastů

MRC-5 (Chin et al., J. Exp. Med. 165: 70, 1987). Metody pro takové testy využívající myších buněk lze nalézt v příkladech 1, 2, 5 a 6. Například, může být využit in vivo test, který měří inhibici IL-1 indukované IL-6 produkce u myší. Tyto testy mohou být provedeny za použití lidských buněk pro účinné vyšetření požadované aktivity za použití stejných technik poskytnutých v příkladech. Preferovaná protilátka má vazebnou afinitu k vedlejšímu komplexu IL-1 receptoru okolo K_o 0,1 nM do K_d 10 nM, jak je určeno konvenčními metodami (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949).

Protilátky podle tohoto vynálezu mohou být podány známými metodami pro zmírnění stavů způsobených přítomností IL-1. Jednotlivě, protilátky podle tohoto vynálezu jsou užitečné v redukci zánětu. Tyto protilátky k IL-1R AcP mohou být podány, například, za účelem potlačení zánětu nebo imunitní odpovědi u lidí. Množství chorob a stavů způsobených zánětlivým procesem (např. revmatoidní artritida, zánětlivé střevní choroby a septický šok) nebo imunitních reakcí (např. typ 1 diabetů, rejekce transplantátu, psoriasa a astma) je asociováno se zvýšenou hladinou IL-1 (Dinarello and Wolff,

New Engl. J. Med. 328: 106, 1993) . Léčba protilátkami, které inhibují IL-1 interakce s IL-1R AcP může proto být účinně použita pro potlačení zánětu nebo imunitních odpovědí v klinické léčbě akutních nebo chronických onemocnění jako je revmatoidní artritida, zánětlivé střevní choroby a typ 1 diabetů. Kromě toho jsou protilátky účinné v léčbě jistých nádorových onemocnění, jako je akutní a chronická myeloidní leukemie (Rambaldi et al., Blood 78: 3248, 1991; Estrov et al., Blood 78: 1476, 1991).

V tomto vynálezu jsou zahrnuty protilátky proti myšímu IL-1R AcP, specificky 4C5, 2B6, 3F1, 4C4, 24C5, 4D4 (viz tabulka 1) a 1D2, 2D6, 2E6, 1F6, 2D4, 2F6, 3F5, a 4A1 (viz tabulka 2). Tyto protilátky jsou užitečné v získání lidského IL-lR AcP, jak je popsáno.

Jak je uvedeno výše, protilátky mohou být produkovány přirozeně vhodnými buňkami, nebo mohou být produkovány rekombinantními expresními vektory, které modifikují protilátkové proteiny, např. humanizací protilátky (Brown et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2663, 1991) nebo produkcí heterodimerických bispecifických protilátek (Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547, 1992; WO 90/7861, EP 620276), které mohou rozpoznávat jak vedlejší protein, tak typ 1 nebo typ 2 IL-1R.

Rozsah dávek pro podání IL-1R AcP a jeho fragmentů nebo protilátek k IL-1R AcP nebo antisense polynukleotidů může být odborníkem určen bez přehnaného experimentování. Obecně, vhodné dávky jsou ty, které jsou dostatečné pro produkci požadovaného účinku, například, pro blokování aktivity endogenního IL-1 na buňkách reaktivních na IL-l. Dávka by neměla být příliš velká, aby způsobovala vedlejší nežádoucí účinky, jako je nežádoucí zkřížená reakce, anafytaktická reakce a podobně. Obecně se bude dávka velmi lišit s věkem, kondicí, pohlavím a rozsahem onemocnění u pacienta, kontraindikacemi, pokud nějaké jsou, imunitní tolerancí a jinými proměnnými, které budou zváženy jednotlivým lékařem. IL-lR AcP a jeho fragmenty nebo protilátky k tomuto proteinu nebo antisense polynukleotidy mohou být podány parenterálně injekcí nebo graduální perfuzí během určité doby. Mohou

2Ί být podány intravenosně, intraperitoneálně, intramuskulárně nebo subkutánně.

Tento vynález obsahuje farmaceutické kompozice obsahující protein a/nebo protilátky podle tohoto vynálezu v množství účinném pro redukci zánětu a farmaceuticky akceptovatelné nosiče jako jsou přípravky a vehikula popsaná níže. Takové kompozice mohou obsahovat jiné aktivní sloučeniny, je-li to žádoucí. Pro proteiny je příklad účinného množství v rozsahu od 4 do 32 mg/m². Pro protilátky je příklad účinného množství v rozsahu od 0,1 do 15 mg/kg tělesné hmotnosti.

Přípravky pro parenterální podání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspense, a emulse. Příklady ne-vodných rozpouštědel jsou propylen glykol, polyethylen glykol, rostlinné oleje jako je olivový olej, a injikovatelné organické estery jako je ethyl oleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, alkoholové/vodné roztoky, emulse nebo suspense, včetně salinického a pufrovacího media. Parenterální vehikula zahrnují roztok hloridu sodného, Ringerovu dextrosu, dextrosu a chlorid sodný, Ringer-laktát, nebo fixované oleje. Intravenosní vehikula zahrnují náhradní roztoky tekutin a živin, elektrolytů, jako jsou ty, které jsou založeny na Ringerově dextrose a podobně. Mohou také být přítomny preservativy a jiná aditiva, jako jsou například antimikrobiální, antioxidační, chelatační agens, inertní plyny a podobně. Viz obecně, Remington's Pharmaceutical Science, 16. vydání, Mack Eds., 1980.

Následující příklady jsou poskytnuty pro další popis vynálezu a neomezují ho v žádném směru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad l

Metody

Příprava, vyšetření a purifikace hybridomních protilátek

Lewis krysy (Charles River Laboratory) byly imunizovány intraperitoneálně (i.p.) v detergentu rozpuštěným přípravkem IL-Ια (Gubler et al., J. Immunol. 136: 2492, 1986), afinitně zkříženě vázaný na IL-lR z myších 70Z/3 pre B buněk (ATCC č. TIB 158). Pro primární imunizaci obdržely myši solubilizovaný IL-la/IL-lR komplex (0,4 ml), který byl připraven a purifikován z 1 χ ΙΟ³·¹ 70Z/3 buněk (Chizzonite et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA86: 8029, 1989) a emulsifikován v kompletním Freundově adjuvans v poměru 1:2a injikován i.p. (popsáno níže). O šest týdnů později obdržely krysy solubilizovaný IL-Ia/IL-IR komplex (0,3 ml), který byl připraven a purifikován z 2,25 χ 10¹¹ buněk a emulsifikován v kompletním Freundově adjuvans v poměru 1:2a injikován do zadních nohou a i.p. Sérum bylo odebráno od krys 2 a 6 týdnů po poslední imunizaci a bylo testováno na aktivitu, která blokovala (^12SI)-IL-Ιβ vazbu na IL-lR na 70Z/3 buňkách. Čtyři měsíce po poslední imunizaci byla jedna krysa imunizována následujícím množstvím solubilizovaného IL-la/IL-lR komplexu v přípravku pro izolaci splenocytů: 0 ,1 ml (připraveno a purifikováno z 8 χ 10^1θ buněk) a emulsifikováno v kompletním Freundově adjuvans v poměru 1:4a injikováno do zadních nohou a subkutánně (s.c.) do každé zadní končetiny a 0,9 ml (připraveno a purifikováno z 7,4 χ ΙΟ¹¹ 70Z/3 buněk) injikovaných intravenosně (i.v.) a i.p. 0 dva dny později byly krysy imunizovány solubilizovaným IL-la/IL-lR komplexem (0,5 ml; připraveno a purifikováno z 2 x ΙΟ¹¹ 70Z/3 buněk) ve směsi s fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS), pH 7,4 (0,5 ml) injikovaným s.c. do každé zadní nohy. Dva dny po této poslední imunizaci byly izolovány buňky sleziny od krys a byly fušovány s SP2/0 buňkami (ATCC CRL 1581) v poměru 1 ;

(buňky sleziny : SP2/0 buňky) s 35% polyethylen glykolem (PEG 4000, E. Merck) podle publikovaného postupu (Fazekas et al., J. Immunol. Meth. 35: 1, 1980) . Fúzované buňky byly umístěny v densitě 3 x 10⁵ buněk/jamku/ml na 48 jamkové plotny v IMDM doplněném 15% FBS, glutaminem (10 mM), 5%

ORIGIN hybridomním klonovacím faktorem (IGEN, lne.), 5%

P388D1 supernatantem (Nordon et al., J. Immunol. 139: 813, 1987) a 100 U/ml rekombinantním lidským IL-6 (Genzyme).

Supernatanty hybridomů byly vyšetřovány na inhibiční a neinhibiční protilátky specifické pro IL-1R AcP a typ 2 IL-1R ve čtyřech testech: 1) na inhibiční protilátky: inhibice (¹²⁵I)-IL-Ιβ vazby na 70Z/3 a EL-4 thymomové buňky (popsáno níže), 2) na neinhibiční protilátky: imunoprecipitace solubilizovaného (¹²⁵I)-IL-Ιβ zkříženě navázaného na typ 2 IL-1R, 3) na inhibiční protilátky specifické pro IL-1R AcP nebo typ 2 IL-1R: inhibice (¹²⁵I)-IL-Ιβ a (¹²⁵I)-IL-Ια vazby na buňky exprivující rekombinantní typ 1 a 2 IL-1R, a 4) pro eliminaci jakýchkoliv protilátek specifických pro IL-1: imunoprecipitace (^12SI)-IL-Ια a (^12SI)-IL-Ιβ. Hybridomní buněčné linie secernující protilátky specifické pro typ 2 IL-1R a IL-1R AcP byly klonovány omezeným ředěním. Protilátky byly purifikovány ze široké škály hybridomových kultur nebo z ascitu afinitní chromatografií na proteinu G navázaném na

Sepharose 4B fast flow podle návodu výrobce (Pharmacia).

Kultivované buňky a biologické testy

Myší EL-4.IL-2 thymomové buňky (TIB 181) a D10.G4.1 (TIB 224) byly uchovávány jak je popsáno (Kilián et al., J. Immunol. 136: 1, 1986). Myší 3T3L1 (CL 173) a 70Z/3 pre-B (TIB 158) buňky byly udržovány v IDMD obsahujícím 5% fetální hovězí sérum v 600 cm² plotnách. Výše uvedené buňky byly získány z American Type Culture Collection a ATTC čísla jsou v závorkách.

Biologická aktivita neznačeného IL-1 a (^X2SI)-IL-1 proteinů byla hodnocena v testu proliferace myších D10 (Kaye et al., J. Exp. Med. 158: 836, 1983.

Značení IL-1 a purifikovaných monoklonálních protilátek ^{12 5} Σ

Rekombinantní myší IL-Ια, lidský IL-Ια a lidský IL-Ιβ byly purifikovány podle dřívějšího popisu (Kilián et al., J. Immunol. 136: 1, 1986; Gubler et al., J. Immunol. 136: 2492, 1986) kromě toho, že myší IL-Ια byl připraven v 25 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl. Určení proteinu bylo provedeno BCA proteinovým testem (Pierce Chmeical Co., Rocford, IL). Lidský IL-lcť, lidský IL-Ιβ, myší IL-Ια, myší IL-Ιβ a purifikovaný IgG byly značeny ^Χ2ΞΙ pomocí modifikované jodogenové metody (Pierce Chemical Co.). Jodogen byl rozpuštěn ve chloroformu a 0,05 mg bylo sušeno v 12 x 15 mm borosilikátové skleněné trubičce. Pro radioznačení bylo přidáno 1,0 mCi Na(^x25I) (Amersham, Chicago, IL) k jodogenem potažené trubičce obsahující 0,05 ml Tris-jodinačního pufru (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA) a byla provedena inkubace po 4 minuty při pokojové teplotě. Aktivovaný roztok ¹²⁵I byl přenesen do trubičky obsahující 0,05 až 0,1 ml IL-1 (5-13 μ$} nebo IgG (100 μ$) v Tris-jodačním pufru a reakce byla inkubována po 5 - 8 minut při pokojové teplotě. V konci inkubace bylo přidáno 0,05 ml Jodogen stop pufru (10 mg/ml tyrosin, 10% glycerol v Dulbecco PBS, pH 7,4) a reakce probíhala po 3 minuty. Směs byla potom ředěna 1,0 ml Tris-jodinačního pufru a aplikována na Bio-Gel P10DG odsolovací kolonu (BioRad Laboratories) pro chromatografii. Kolona byla eluována Tris-jodačním pufrem a frakce (1 ml) obsahující peakové množství značeného proteinu byly kombinovány a ředěny na 1 x 10® cpm/ml s 1% BSA ve Tris-jodinačním pufru. TCA precipitovatelná radioaktivita (10% TCA konečná koncentrace) byla typickyvíce než 95% celkové radioaktivity. Radiospecifická aktivita byla typicky 2000 až 3500 cpm/fmol pro purifikované protilátky a 3500 až 4500 cpm/fmol pro IL-1.

Myší IL-1 receptor vazebné testy

Vazba radioznačeného IL-1 na myší buňky kultivované v suspenzní kultuře byla měřena dříve popsanými metodami (Kilián et al., J. Immunol. 136: 1, 1986). Stručně, buňky byly jedenkrát promyty ve vazebném pufru (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPES, pH 7,4), byly resuspendovány ve vazebném pufru do density 1,5 x 10⁷ buněk/ml a byly inkubovány (1,5 x 10^s buněk) s různými koncentracemi (^X25I)-IL-1 (5 - 1000 pM) při 4 °C po 3 - 4 hodiny. Na buňky vázaná radioaktivita byla separována od volného (^X2SI)-IL-l centrifugací testované směsi přes 0,1 ml olejové směsi (1 : 2 směsi Thomas Silicone Fluid 6428-R15, A.H. Thomas, a Silicone Oil AR 200, Gallard-Schlessinger) při 4 °C po 90 sekund při 10000 x g. Vrchol obsahujíc buněčnou peletu byl excidován a na buňky navázaná radioaktivita byla určena gamma kamerou.

Nespecifická vazba byla určena inklusí 50 nM neznačeného IL-l v testu. Inkubace byla provedena dvakrát nebo třikrát. Data vazby na receptor byla analyzována za použití nelineárního regresního programu EBDA, LIGAND a Kinetics (Munson and Rodbard, Anal. Biochem 107: 220, 1980) adaptovaného pro IBM osobní počítač McPherson (McPherson, J. Pharmacol. Methods 14: 213, 1985) od Elsevier-BIOSOFT.

Vazba rádiojodovaných IL-l proteinů na adherentní buňky byla provedena inkubací buněk a ligandů na 24 nebo 12 jamkových plotnách při 4 °C na žlábkované plotně po 4 hodiny ve vazebném pufru (24). Monovrstvy byly potom třikrát vypláchnuty vazebným pufrem při 4 °C, solubilizovány 0,5 ml 1% SDS a uvolněná radioaktivita byla měřena na gamma kameře. Nespecifická vazba byla určena za přítomnosti 50 nM neznačeného IL-l. Analýza vazebných dat byla provedena jak je popsáno níže.

Rovnovážná vazba (^X25I)-značených monokonálních protilátek a myší buňky

Myší buňky byly jedenkrát promyty ve vazebném pufru (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPES, pH 7,4) a byly resuspendovány ve vazebném pufru do buněčné density 1,5 x 10⁷ buněk/ml. Buňky byly inkubovány (1,5 x 10® buněk) s různými koncentracemi (^X25I)-specifických IgG (.005 až 2 nM) při pokojové teplotě po 1,5 - 2 hodiny. Na buňky vázaná radioaktivita byla separována od volné (¹²⁵I)-značené protilátky centrifugací testované směsi přes 0,1 ml olejové směsi při 4 °C po 90 sekund při 10000 x g. Vrchol obsahujíc buněčnou peletu byl excidován a na buňky navázaná radioaktivita byla určena gamma kamerou. Nespecifická vazba byla určena inklusí 100 nM neznačené protilátky do testu. Inkubace byla provedena dvakrát nebo třikrát. Data vazby na receptor byla analyzována stejně jak je popsáno pro IL-1 vazbu na buňky.

Protilátkami zprostředkovaná inhibice (^12SI)-IL-1 vazby na myší buňky nesoucí typ 1 nebo typ 2 IL-1 receptorů

Schopnost roztoků hybridomních supernatantů, purifikovaných

IgG nebo antisera inhibovat vazbu (^12SI)-IL-1 proteinů na myší buňky nesoucí IL-1 receptor byla měřena následovně: sériové ředění supernatantů kultur, purifikovaných IgG nebo antisera byla smísena s buňkami (1 - 1,5 x 10⁶ buněk) ve vazebném pufru (RPMI-1640, 5% FBS, 25 mM HEPES, pH 7,4) a byla inkubována na orbitální třepačce po 1 hodinu při pokojové teplotě.

(^12SI)-IL-1 (1 x 10⁵ cpm; 25 pM) byl přidán do každé trubičky a inkubován po 3 - 4 hodiny při 4 °C. Nespecifická vazba byla určena inklusí 50 nM neznačeného IL-1 do testu. Inkubace byla provedena dvakrát nebo třikrát. Na buňky vázaná radioaktivita byla separována od volného (^12SI)-IL-1 centrifugací testované směsi přes 0,1 ml olejové směsi jak je popsáno výše. Vrchol obsahuj íc buněčnou peletu byl excidován a na buňky navázaná radioaktivita byla určena gamma kamerou.

Afinitní zkřížená vazba a purifikace solubilizovaných (¹²⁵I)-IL-la/IL-lR komplexů

Afinitní zkřížená vazba rádiojodinovaných IL-1 proteinů na buňky byla provedena jak je popsáno (Riske et al., J. Biol. Chem. 266: 11245, 1991) s malými modifikacemi. Stručně, buňky (1,5 x 10⁷ buněk/ml) byly inkubovány s radioznačeným IL-1 (60 - 300 fmol/ml) za přítomnosti nebo absence 50 nM neznačeného IL-1 po 4 hodiny při 4 °C ve vazebném pufru. Buňky byly potom promyty ledem ochlazeným PBS, pH 8,3 (25 mM fosfát sodný, pH 8,3, 0,15 M NaCl, 1 mM MgCl₂), resuspendovány v koncentraci 5 x 10^s buněk/ml v PBS, pH 8,3. Byl přidán disukcimidyl suberat (DSS) nebo bis(sulfosukcimidyl)suberat (BS3) (Pierce Chemical Co.) v dimethyl sulfoxidu do konečné koncentrace 0,4 mM. Inkubace pokračovala po 30 - 60 minut při 4 °C při konstantním míšení. Buňky byly promyty ledem ochlazeným 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA a byly solubilizovány při 0,5 - 1 x 10® buněk/ml v solubilizačním pufru (50 mM fosfát sodný, pH 7,5, obsahující buď 8 mM CHAPS nebo 1% Triton X-100, 0,25 M NaCl, 5 mM EDTA, 40 /xg/ml fenylmethylsulfonyl fluorid a 0,05% NaN₃) po jednu hodinu při 4 °C. Detergentový extrakt byl centrifugován při 120000 x g po jednu hodinu při 4 °C pro odstranění jader a jiné drti. Extrakty byly přímo analyzovány SDS-PAGE na 8% předem odlitém gelu (NOVEX) a potom následovala autoradiografie.

Alternativně byly extrakty imunoprecipitovány protilátkou vázanou na Gamma-Bind G Plus (Pharmacia). Precipitované proteiny byly uvolněny ošetřením Laemmli vzorkovým pufrem (Laemmli, Nátuře 227: 680, 1970), separovány SDS-PAGE a analyzovány autoradiografií.

Příprava solubilizovaných zkříženě vázaných komplexů IL-la/lL-lR, které byly použity jako imunogen, byla provedena jak je popsáno výše s drobnými modifikacemi. Stručně, 70Z/3 buňky (0,5 - 1,0 x 10® buněk/ml) byly inkubovány s IL-la (0,5 - 1,0 nM) po 4 hodiny při 4 °C v pufru vazebného testu.

Buňky byly potom promyty ledem ochlazeným PBS, pH 8,3 resuspendovány v koncentraci 5 x 10⁷ buněk/ml v PBS, pH 8,3 a bis(sulfosukcimidyl)suberatu (BS3) (Pierce Chemical Co.) v dimethyl sulfoxidu do konečné koncentrace 0,4 mM. Inkubace pokračovala po 30 - 60 minut při 4 °C při konstantním míšení. Ukončení procedury afinitní zkřížené vazby a solubilizace buněk detergentem bylo provedeno jak je popsáno -výše.

Pro purifikaci solubilizovaného IL-la/IL-lR komplexu, který byl použit jako imunogen, byl detergentový extrakt 70Z/3 buněk aplikován do afinitní kolony (10 ml) kozí anti-lidský IL-ΐα imobilizované na agarose opatřené zkříženě vázanými korálky (Affi-Gel 10, BioRad Laboratories). Kozí anti-lidský IL-Ια afinitní kolona byla připravena podle návodu výrobce v densitě l mg IgG/ml baleného gelu. Po aplikaci detergentového extraktu byla kolona promyta 10 objemy kolony solubilizačního pufru bez Chaps nebo Tritin X-100 nebo dokud absorbance při 280 nm nebyla základní. Kolona byla potom eluována 3 M thiokyanatu draselného, 25 mM fosfátu sodného, pH 7,5, 5 mM EDTA, 40 ^g/ml fenylmethylsulfony1 fluoridu a 0,05% NaN₃ .

Proteiny eluované z afinitní kolony byly koncentrovány 10 až 100 krát a byly použity pro imunizaci.

Imunoblotová analýza proteinů solubilizovaných z myších buněk

Myší 70Z/3 a EL-4 buňky byly promyty třikrát ledem chlazeným PBS a solubilizovány při 0,5 - 1 x 10® buněk/ml v solubilizačním pufru, který obsahoval buď 8 mM CHAPS nebo 1% Triton X-100 a 1 mg/ml BSA po jednu hodinu při 4 °C. Extrakt byl centrifugován při 120000 x g po 45 minut při 4 °C pro odstranění jader a jiné drti. Extrakty byly inkubovány buď s 4C5 (anti-IL-lR AcP získané jak popisuje příklad 2), 12A6 (anti-typ 1 I1-1R získaná jak popisuje Chizzonite et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8029, 1989) nebo s kontrolní protilátkou vázanou na protein G imobilizovaný na zkříženě vazebnou agarosu (Gamma Bind G Plus, Pharmacia).Precipitované proteiny byly uvolněny ošetřením 0,1 M glycinem pH 2,3, neutralizovány 3M Tris, sméseny s 1/5 objemu 5X Laemmli vzorkového pufru a separovány SDS-PAGE na 8% předem odlitých akry1amidových gelech (NOVEX). Separované proteiny byly transferovány do nitrocelulosové membrány (0,2 μΜ) po 16 hodin při 100 voltech v 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 76,8 mM glycinu, 20% methanolu a 0,01 SDS. Nitrocelulosové membrány byly blokovány BLOTTO (50% hmotnost/objem netučné sušené mléko v PBS + 0,05% Tween 20) a duplikované bloty byly probovány (^12SI)-4C5 IgG (1 x 10® cpm/ml v 8 mM CHAPS, PBS, 0,25 M NaCl, 10% BSA a 5 mM EDTA) s a bez značeného 4C5 IgG (67 nM).

Exprese myších rekombinantních typ 1 a 2 IL-1 receptorů a IL-1R AcP v COS buňkách a určení vazby (¹²⁵I)-značené 4C5, 35F5 a IL-1.

COS buňky (4 - 5 x 10⁷) byly transfektovány elektroporací s 25 μg plasmidové DNA exprivující rekombinantní lidské IL-1 proteiny nebo IL-1R AcP v BioRad Gene Pulser (250 μΡ, 250 voltů) podle protokolu výrobce. Buňky byly umístěny na 600 cm² kultivační plotnu, sklízeny za 72 hodin ošetřením No-Zyme (JRH Biologics) a seškrábáním, promyty a resuspendovány ve vazebném pufru. Transfektované buňky (4 - 8 x 10⁴) byly inkubovány s rostoucími koncentracemi (¹²⁵I)-značených 4C5, 35F5 nebo IL-1 proteinů při 4 °C po 3 hodiny. Na buňky navázaná aradioaktivita byla separována od volné (^X25I)-značené protilátky nebo IL-1 jak je popsáno výše.

Exprese kappa lehkých řetězců 70Z/3 buňkami v odpovědi na IL-1; Inhibice monoklonálními protilátkami 35F5, 4E2 a 4C5.

70Z/3 buňky (1 x 10⁵/ml v RPMI 1640 suplementováném 10% FBS, β-merkaptoethanolem a gentamicinem) byly inkubovány s a bez 100 U/ml (0,19 nM) lidského rekombinantního IL-Ια nebo IL-Ιβ po 24 nebo 48 hodin. Buňky byly preinkubovány po jednu hodinu před přidánímIL-1 se 30 ^g/ml ukázaných protilátek v celkovém objemu 0,5 ml. Dalších 0,5 ml media obsahujícího IL-l nebo medium samotné bylo přidáno do jamek pro konečnou koncentraci 15 ^g/ml (100 nM) protilátek. Buňky byly jedenkrát promyty po kultivaci a barveny buď kontrolní krysí protilátkou konjugovanou s FITC nebo krysí anti-myší kappa lehký řetězec protilátkou konjugovanou s FITC (Tágo, Burlingame, Ca). Buňky byly potom analyzovány na expresi kappa lehkého řetězce na FACScan průtokovém cytometru (Becton-Dickinson).

Proliferace myších B buněk sleziny v odpovědi na IL-1: Inhibice monoklonálními protilátkami 35F5, 4E2 a 4C5.

B buňky sleziny byly purifikovány ošetřením splenocytů izolovaných z C57BL/6 myší s anti-Thyl.2 protilátkou a králičím komplementem a potom následovaly dvě sekvenční pasáže přes Sephadex G10 (Pharmacia) kolony. B buňky (5 x 10^s buněk) byly ošetřeny kozím anti-myším IgM (1 μg/ml) (ZYMED) a dibutyryl cAMP (10^-3 M) v konečném objemu 200 μΐ RPMI 1640 media doplněného 10% FBS, β-mercaptoethanolem a gentamicinem. B buňky sleziny byly ošetřeny s a bez IL-1 (100 U/ml) a s a bez protilátek 35F5, 4C5 a 4E2. Buňky byly inkubovány po dva dny za přítomnosti různých činidel a potom byly pulsovány 0,5 μϋί tritiovaného thymidinu, inkubovány po dalších šest hodin a sklízeny.

Proliferace myších D10.G4.1 buněk v odpovědi na IL-1: Inhibice monoklonálními protilátkami 4C5 a 35F5 a lidským IL-lra.

D10.G4.1 helper T buňky byly uchovávány jak je popsáno (Kaye et al., J. Exp. Med. 158: 836, 1983; Mclntyre et al., J. Exp. Med. 173: 931, 1991) a stimulovány IL-1 jak je popsáno (Mclntyre et al., J. Exp. Med. 173: 931, 1991).

Buňky (1 x 10⁵ v 200 μΐ) byly inkubovány s 0,2 pM IL-1 v RPMI 1640 mediu obsahujícím 5% FBS, β-mercaptoethanol (5 x 10^-5 M) , gentamicin 8 ^g/ml) , 2 mM L-glutaminu, 2,5 μ3/πί1 konkavalinu A a ukázané koncentrace protilátek nebo antagonistů lidského IL-1 receptoru (Il-lra). Kultury byly inkubovány po dva dny, pulsovány 0,5 μθί tritiovaného thymidinu a sklízeny o 16 hodin později.

In vivo indukce sérového IL-6 IL-1: Inhibice monoklonálními protilátkami 4C5 a 35F5

Indukce sérového IL-6 IL-1 byla provedena jak je popsáno (Mclntyre et al., J. Exp. Med. 173: 931, 1991). Stručně, C57BL/6 myši byly předošetřeny (i.p.) 250 μ$ protilátky 4 hodiny a 10 minut před podáním IL-Ια nebo IL-lS {0,3 /xg/myš, s.c.). Sérum bylo myším odebráno 2 hodiny po podání IL-1 a bylo analyzováno na koncentraci IL-6 modifikací B9 hybridomního buněčného biotestu jak je popsáno (Aarden et al., Eur. J. Immunol. 17: 1411, 1987).

Krysí anti-myší vedlejší protein IL-1 monoklonální protilátka 4C5 byla připravena, charakterizována a generována následovně.

Příklad 2

Příprava, charakterizace a identifikace monoklonálních protilátek specifických pro IL-1R AcP a typ 2 IL-1R

V průběhu přípravy protilátek k typu 2 IL-l receptoru byly identifikovány protilátky k neočekávané, nové složce IL-1 receptorového komplexu. Protože myší 70Z/3 buňky exprivují téměř exklusivně typ 2 IL-1R, byla imunizace krys purifikovaným zkříženě vázaným IL-la/IL-lR komplexem solubilizovaným z těchto buněk počáteční strategií použitou pro vývoj monoklonálních protilátek anti-typ 2 IL-1R. Krysy imunizované tímto IL-la/IL-lR komplexem vyvíjely sérové protilátky, které blokovaly (^12SI)-IL-Ιβ vazbu na 70Z/3, což ukazuje na přítomnost blokujících protilátek specifických pro typ 2 IL-lR. Sérové vzorky také obsahovaly protilátky, které imunoprecipitovaly s (^12SI)-IL-1S/IL-1R komplexem solubilizovaným z 70Z/3 buněk, což ukazuje na přítomnost neblokujících protilátek anti-typ 2 IL-lR. (^12SI)-IL-Ιβ byl použit pro testy IL-lR vazby a imunoprecipitace pro eliminaci identifikace protilátek specifických pro IL-la místo pro typ 2 receptoru.

Hybridomy vzniklé z fúse splenocytů izolovaných z imunizovaných krys byly vyšetřovány na protilátky, které blokují IL-Ιβ vazbu na jak 70Z/3 (nesoucí typ 2 receptoru), tak na EL-4 (nesoucí typ 1 receptoru). Protilátky, které blokovaly vazbu pouze na 70Z/3 buňky byly identifikovány a eliminovány z další analýzy, protože to jsou protilátky pro typ 2 IL-lR a protilátky, které blokovaly vazbu pouze na EL-4 buňky byly identifikovány a eliminovány z další analýzy, protože to jsou protilátky pro typ 1 IL-lR. Protilátky, které blokovaly vazbu IL-1 u obou typů buněk jsou specifické pro IL-lR AcP.

Z počáteční fúse bylo identifikováno sedm protilátek, krteré blokovaly vazbu IL-Ιβ na 70Z/ buňky (tabulka 1). Šest z těchto protilátek (2B5, 4C5, 3F1, 4C4, 24C5 a 4D4) blokovaly vazbu IL-Ιβ jak na 70Z/3, tak na EL-4 buňky. Tyto protilátky neblokovaly vazbu IL-Ιβ na CHP buňky exprivující myší rekombinantní typ 1 IL-lR a byly proto specifické pro IL-lR AcP. Jedna protilátka, 4E2, blokovala pouze vazbu IL-Ιβ na 70Z/3 buňky, což ukazuje, že je specifická pro typ 2 IL-lR.

Z počáteční fúse byly také vyšetřovány neblokující protilátky, které jsou specifické pro buď IL-lR AcP nebo pro typ 2 IL-1R. Osm protilátek (1D2, 2D6, 2E6, 1F6, 2D4, 2F6,

3F5 a 4A1) imunoprecipitovalo s IL-1S/IL-1R komplexem solubilizovaným z 70Z/3 buněk (tabulka 2). Tyto protilátky také imunoprecipitovaly s IL-1E/IL-1R komplexy solubilizovanými ze dvou jiných typ 2 IL-1R nesoucích myších buněčných linií, AMJ2C11 a P388D1. Sedm z těchto protilátek také imunoprecipitovalo s IL-1S/IL-1R komplexy solubilizovanými z EL-4 buněk, což ukazuje, že rozpoznávají IL-1R AcP. Jedna protilátka, 1F6, se nevázala na IL-lS/IL-lR komplex solubilizovaný z EL-4 buněk, což ukazuje neblokující protilátku pro typ 2 IL-1R. Pro potvrzení toho, že se tyto protilátky nevážou na typ 1 IL-1R byly tyto testovány v imunoprecipitačním testu s myším solubilním typem 1 IL-1R (tabulka 2). Žádná z těchto protilátek neimunoprecipitovala komplex (^12SI)-IL-Ιβ zkříženě vázaný s rekombinantním solubilním typem 1 IL-1R ((¹²⁵I)-sMsR(bv)). Také neimunoprecipitovaly i³-²⁵!)-značený solubilní receptor typu 1 produkovaný buď expresním systémem baculovirus/hmyzí buňka nebo v expresním systému COS buněk (tabulka 2).

Protože krysy byly imunizovány solubilizovaným IL-la/IL-lR komplexem, byly v krysím séru také identifikovány protilátky rozpoznávající IL-Ια. Každá monoklonální protilátka byla testována v imunoprecipitačním testu s (^12SI)-značenými myšími a lidskými IL-1 proteiny pro potvrzení toho, že se neváží na IL-1. Všech 15 protilátek (tabulka 1 a 2) bylo v těchto testech negativní.

Tabulka 1

Identifikace inhibičních Anti-IL-IR AcP protilátek

Monoklonální protilátka

Inhibiční testy1	2B6	4C5	3F1	4C4	24C5	4D4	4E2
70Z/3 (typ 2 IL-lR)	++	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +
AMJ2C11 (typ 2 IL-lR)	ND	+ +	ND	ND	ND	ND	ND
P388D1 (typ 2 IL-lR)	ND	+ +	ND	ND	ND	ND	ND
EL-4 (typ 1 IL-lR)	+	+	+	+	+	+	-
CHO (Mu typ 1 IL-lR)	-	-	-	-	-	-	-
Ligandové imunoprecipitační testy 2
rHull-la	-	-	-	-	-	-	-
rHuIl-Ιβ	-	-	-	-	-	-	-
rMull-la	-	-	-	-	-	-	-

1. Inhibice (¹²⁵I)-Il-lS vazby na buněčné linie 70Z/3, AMJ2C11, P388D1, El-4 a CHO (Mu typ l I1-1R) protilátkami byla popsána v příkladu 1.

2. Imunoprecipitace (¹²⁵I)-značených rekombinantních IL-l proteinů byla stejná jak je popsáno v příkladu 1.

3. rHull-la - lidský rekombinantní IL-la rHuIl-Ιβ - lidský rekombinantní IL-lS rMull-la - myší rekombinantní IL-la

4. ++ a +; protilátka blokuje (^l25I)-Il-ΐβ vazbu

5. -; protilátka byla v testu negativní.

Tabulka 2

Identifikace neinhibičních Anti-IL-IR AcP protilátek

Monoklonální protilátka

	ID2	2D6	2E6	1F6	2D4	2F6	3F5	4A
Ligandové imunoprecipitace1 rHull-la
rHull-lS	-	-	-	-	-	-	-
rMuIl-Ισ	-	-	-	-	-	-	-
Imunoprecipitace zkříženě vázaných komplexů2 70Z/3 (typ 2 IL-1R)	+	+	+	+	+	+	+	+
AMJ2C11 (typ 2 IL-1R)	+	+	+	+	+	+	+	+
P388D1 (typ 2 IL-1R)	+	+	+	+	+	+	+	+
EL-4 (typ 1 IL-1R)	+	+	+	-	+	+	+	+
sMu typ 1 I1-1R (bv)3	-	-	-	-	-	-	-
Přímé imunoprecipitační testy (125I-sMu IL-lR(bv))
(125I-sMu IL-lR(Cos))	-	-	-	-	-	-	-	-

1. Jak je popsáno v tabulce 1

2. Imunoprecipitace komplexů (^12ΞΙ)-I-I1-1S/I1-1R solubilizovaných z ukázaných buněčných linií

3. Imunoprecipitace komplexů (^X2SI)-Il-lS afinitně zkříženě navázaných na solubilní myší typ 1 IL-lR exprivovaný v bakulovirovém systému.

4. Imunoprecipitace (^X2SI)-značeného typu 1 IL-lR exprivovaného v buď bakulovirovém (¹²⁵I)-sMuIL-lR (bv) nebo v Cos buněčném (¹²⁵I)-sMuIL-lR (Cos) expresním systému.

Příklad 3

Charakterizace myších IL-lR a IL-lR AcP reaktivitou s monoklonálními protilátkami anti-typ 1 (35F5), Typ 2 (4E2) a vedlejší protein (4C5)

Po počáteční identifikaci a charakterizaci protilátek popsaných výše byly 4C5, domněle blokující IL-lR AcP (IL-lR AcP) protilátka a 4E2 protilátka blokující typ 2 IL-lR, vybrány jako proby pro další studium IL-lR AcP. Dříve identifikovaná a charakterizovaná anti typ 1 IL-lR protilátka 35F5 byla také zahrnuta do této studie (Chizzonite et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8029, 1989), Mclntyre et al., J. Exp. Med. 173: 931, 1991).

Tyto tři protilátky byly použity pro identifikaci přítomnosti typu 1 a typu 2 IL-lR a IL-lR AcP na různých myších buňkách. Rovnovážný vazebný test s (^12SI)-značenou mAb 4C5 demonstroval přítomnost IL-lR AcP na myších buňkách nesouécích predominantně typ 1 (EL-4 buňky) nebo typ 2 (70Z/3 buňky) receptorů (obrázek 1 a 2). Jiné buňky nesoucí predominantně typ 1 (3T3L1 buňky) nebo typ 2 (P388D1 buňky) receptorů také exprivovaly IL-lR AcP (tabulka 3). Buňky (S49.1), které neexprivují ani typ 1, ani typ 2 IL-lR AcP neexprivují IL-lR AcP, což ukazuje na vazbu mezi expresí IL-lR a IL-lR AcP. Během této počáteční charakterizace mAb 4C5 blokovala vazbu (¹²⁵I)-lidského IL-Ιβ jak na EL-4, tak na 70Z/3 buňky. Další studie stanovily, že mAb 4C5 také inhibuje vazbu radioznačeného lidského IL-Ια (obr. 3), myšího IL-Ια a IL-Ιβ na 70Z/3 buňky (tabulka 4). Obdobně k inhibici vazby (^X2SI)-lidského IL-ΐβ na EL-4 buňky blokuje

4Ί

4C5 také vazbu (^Χ2ΞΙ)-myšího IL-lS na tyto buňky (tabulka 4). Nicméně, 4C5 neblokuje ani vazbu radioznačeného lidského IL-la (obr. 4) ani myšího IL-la (tabulka 4) na EL-4 buňky. Kromě toho, 4C5 meblokuje vazbu (^12ΞΙ)-značených IL-1 proteinů na CHO a COS buňky exprivující typ 1 nebo typ 2 receptorů. Anti-typ 1 receptor protilátka 35F5 a anti typ 2 receptor protilátka 4E2 inhibovaly jak vazbu IL-la, tak IL-Ιβ na jejich příslušné IL-1 receptory, bez ohledu na to, zda byly receptory přirozené nebo rekombinantní formy (tabulka 4). IC_so pro 4C5-zprostředkovanou inhibici vazby IL-l na EL-4 a 70Z/3 buňky byly alespoň 1000-krát nižší než IC_so pro inhibici vazby na buňky exprivující rekombinantní typ l nebo typ 2 receptorů (tabulka 5) . Tato IC_so data naznačují dva závěry: 1) mAb 4C5 nereaguje zkříženě v jakémkoliv signifikantním rozsahu s typem 1 nebo typem 2 IL-1R a 2) rozdíl ve schopnosti 4C5 blokovat vazbu IL-lE, ale nikoliv IL-la na přirozený IL-lR nebyla ve vztahu k afinitě protilátky.

Tabulka 3

Rovnovážná vazba radioznačeného IL-1, 4C5 a 4E2 na predominantně typ 1 nebo typ 2 IL-lR	myší buňky exprivuj
Ligand	Buněčná	linie
	EL-47	S49.1®	3T3L1-7	70Z/34	P388D14	COS	II
(12SI)-IL-	lx K 2 s/c3		K D	S/C	K D	S/C	K S/C	K D	s/
rMuIl-la	.05 1200	NSB	008	1640	.2	1500	.19 380	.21	19
rHull-la	.05 1200							.33	12
rHull-lS	.1 1200
(125Ι)-4C5	1.2 2800	NSB	93	19200	1.4	3000	.77 1870	NSB
		•	61	14200

(^12SI)-4E2 NSB

NSB NSB

1.2 1900 ND

ND

1. Zkratky IL-l proteinů jako v tabulce 1.

2. K_d - rovnovážná disociační konstanta

3. S/C - vazebných míst na buňku

4. Buňky exprivující přirozený nebo rekombinantní typ 2 IL-1R

5. NSB - žádná specifická vazba radioznačeného ligandu

6. ND - není stanoveno

7. Buňky exprivující přirozený myší typ 1 IL-1R.

8. Buňky neexprivující ani myší typ 1, ani typ 2 IL-1R.

Příklad 4

Určení velikosti IL-lR AcP rozpoznaného monoklonální protilátkou 4C5

Přibližná velikost molekuly proteinu buněčného povrchu rozpoznávaného mAb 4C5 na EL-4 buňkách byla určena afinitní chromatografií a imunoblotingem okolo 90 kDa (obr. 5). Detergentové extrakty připravené z EL-4 buněk byly purifikovány na lentil lektin afinitní matrix a potom následovala afinitní chromatografie buď na anti-typ 1 receptor protilátku, na myší IL-Ια (Ma) nebo na 4C5 afinitní gel. Proteiny eluované z každé afinitní kolony byly ošetřeny Leammli vzorkovým pufrem, separovány SDS-PAGE na 8% gelech a transferovány do nitrocelulosových membrán. Proteiny imobilizované na nitrocelulose byly probovány (^12SI)-4C5 a byly identifikovány imunoreaktivní proužky autoradigrafií. Hlavní protein o 90 kDa a menší proteiny o 55 kDa byly imunoreaktivní s radioznačenou 4C5. Tyto dva proteiny byly též identifikovány na imunoblotu, pokud byl EL-4 extrakt přímo purifikován na 4C5 afinitní matrix. Tato data ukazují, že zřejmá molekulová hmotnost přirozeného, glykosylovaného IL-lR AcP je 90 kDa a že proteolytické zpracování může redukovat jeho velikost na 55 kDa.

Tabulka 4

Inhibice vazby IL-1 proteinů na různé subtypy a formy myšího
IL-1 receptoru	anti-receptořovými protilátkami
IL-1	Typ 1 přirozený EL-44	rekombinantní CHO6 solubilní7	Typ 2 přirozený 70Z/35	rekombinantn COS®
Inhibice 35F5 (anti typ 1)
Mu IL-la	+	+	+	-	-
Mu IL-Ιβ	+	+	ND	-	ND
Hu IL-la	+	+	+	-	-
Hu IL-Ιβ	+	+	+	-	ND
Hu IL-lra	50%	ND	+	-	ND
Inhibice 4C5
(anti vedlejší	protein)
Mu IL-la	-	-	-	+	-
Mu IL-Ιβ	+	-	ND	+	ND
Hu IL-la	-	-	-	+	-
Hu IL-Ιβ	+	-	ND	+	-
Hu IL-lra	-	ND	ND	ND	ND
Inhibice 4E2 (anti typ 2)
Mu IL-la	-	ND	ND	+	+
Mu IL-Ιβ	-	ND	ND	+	ND
Hu IL-la	-	ND	ND	+	+
Hu IL-Ιβ	-	ND	ND	+	ND

1. + a protilátka blokuje 100% a méně než 10%, v příslušném pořadí, IL-1 vazby při 0,1 mg/ml.

2. Mu IL-Ια a Mu IL-Ιβ - myší IL-Ια a IL-Ιβ, v příslušném pořadí.

3. Hull-lce, Hull-ΐβ a Hu IL-lra - lidský IL-la, IL-Ιβ a IL-lra, v příslušném pořadí.

4. Myší EL-4 buňky exprivují přibližně 2000 typu 1 IL-1R na buňku a nedetekovatelné množství typu 2 IL-1R.

5. Myší 70Z/3 buňky exprivují přibližně 2000 typu 2 IL-1R na buňku a nedetekovatelné množství typu 1 IL-1R.

6. Rekombinantní kompletní typ 1 IL-1R exprivovaný v CHO buňkách.

7. Extracelulární doména rekombinantního typu 1 IL-1R exprivovaná v bakulovirovém expresním systému.

8. Rekombinantní typ 2 IL-1R exprivovaný v COS buňkách.

Inhibice vazby IL-1 a různé IL-1 receptory anti-receptorovými protilát

Protilátka IC50 ^g/ml) typ 1 typ 2 přirozený¹ rekombinantní² přirozený¹ rekombin

EL-4	70Z/3	HuIL-la
	HuIL-la3	HuIl-lS4HuIL-la	Hull-ΐβ	HuIL-la	Hull-ΐβ
35F5 (anti	typ	2)	.0001	.0015	< .1	<.l	>100	>100	ND
4E2 (anti	typ	2)	>100	>100	>100	>100	.1	.25	2
4C5			>100	.13	>100	>100	.32	.34	>100

(anti vedlejší protein)

1. Zdroje přirozeného typu 1 (EL/4 buňky) a typu 2 (70Z/3 buňky) IL-lR použité v inhibičních testech.

2. Rekombinantní typ 1 nebo typ 2 IL-lR byly exprivovány bud' v CHO nebo COS buňkách.

3. (^12SI)-Hu-IL-Ια jako ligand v testu.

4. (¹²⁵I)-Hu-IL-Ιβ jako ligand v testu.

Příklad 5

Neutralizace biologické aktivity IL-Ιβ monokonální protilátkou 4C5

Schopnost mAb 4C5 neutralizovat IL-Ιβ bioogickou aktivitu na dávce závislým způsobem byla demonstrována ve třech biologických testech; l) IL-l indukované proliferaci B buněk myší sleziny, 2) IL-1 indukované proliferaci D10.G4.1 helper T buněk a 3) IL-1 indukované expresi kappa lehkých řetězců v 70Z/3 buňkách. MAb 4C5 demonstrovala na dávce závislou inhibici IL-Ιβ, ale ne IL-la, indukovanou proliferaci B buněk sleziny (obr. 6). Oproti mAb 4C5 blokovala anti typ 1 receptorová protilátka jak IL-Ια, tak IL-Ιβ indukovanou proliferaci B buněk. Anti typ 2 IL-lR protilátka 4E2 neinhibovala proliferaci indukovanou buď IL-Ια, nebo IL-Ιβ. Podobně, mAb 4C5 inhibovala IL-Ια, ale ne IL-Ιβ indukovanou proliferaci D10.G4.1 T buněk (obr. 7). Jak mAb 35F5, tak lidský IL-lra blokovaly IL-Ια a IL-Ιβ indukovanou proliferaci D10.G4.1 buněk. MAb 4C5 také blokovala IL-ΐβ, ale ne IL-la indukovanou expresi kappa lehkéhé řetězce na 70Z/3 buňkách (obr. 8). Protilátka 35F5 blokovala jak IL-Ια, tak IL-Ιβ indukované účinky v tomto testu, zatímco mAb 4E2, která rozpoznává typ 2 IL-lR byla inaktivní. Pro tyto testy je neutralizace IL-1 aktivity protilátek nebo IL-lra detekována jako na dávce závislé snížení biologické odpovědi. Blok odpovědi může být 100% inhibice (t.j. stejná, jako když není přidán IL-1) nebo nižší hladina v závislosti na potenciálu protilátky.

Příklad 6

Inhibice IL-Ιβ biologické aktivity in vivo monoklonální protilátkou 4C5

Myši, kterým byl podán IL-1, vykazují dramatické zvýšení koncentrace IL-6 v séru. Rozsah zvýšení sérového IL-6 závisý na dávce IL-1 a může být blokován faktory, které interferují s IL-1 vazbou na typ 1 IL-lR.Při testování v tomto biologickém modelu blokovala 4C5 přibližně 90% IL-Ιβ, ale nikoliv IL-lce, indukovaného zvýšení sérového IL-6 (obr. 9) . Anti-typ 1 IL-1R protilátka 35F5 blokovala jak IL-Ια, tak IL-Ιβ indukované zvýšení sérového IL-6. Kontrolní mAb X-7B2 neměla žádný inhibiční účinek.

Příklad 7

Expresní klonování myšího IL-1R AcP za použití mAb 4C5

Extrakce RNA

3T-LI buňky byly sklizeny a celková RNA byla extrahována za použití guanidinium isothiokyanat/fenol jak je popsáno (P Chomczynski and N. Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156, 1987). Póly A+ RNA byla izolována z celkové DNA jednou absorpcí na oligo dT latexové korálky jak je popsáno (K. Kuribayashi et al. , Nucl. Acids Res. Symposium Series 19: 61, 1988). Z této purifikace byla získaná póly A+ RNA přibližně 6%. Integrita RNA přípravků byla analyzována frakcionací na 1% agarosových gelech za denaturačních podmínek za přítomnosti 2,2M formaldehydu (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, J. Sambrook, E.F.Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .

Konstrukce 3T3-L1 cDNA knihovny

Z výše uvedené póly A+ RNA byla připravena cDNA knihovna v savčím expresním vektoru pEF-BOS (Mizushima and Nagata, Nucl. Acids Res. 18: 5322, 1990) . 10 μg póly A+ RNA bylo reversně transkribováno za použití RNasaH“ reversní transkriptásy (GIBCO BRL Life Technologies lne., Gaithersburg, MD) . Vzniklé mRNA-cDNA hybridy byly konvertovány do tupě zakončené dvoj řetězcové cDNA zavedenými postupy (Gubler and Chua, v Essential Molecular Biology, Volume II, T.A. Brown, editor, str. 39 - 56, IRL Press 1991) .BstXI linkery (Aruffo and Seed, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8573, 1987) byly ligovány do vzniklých cDNA a molekuly > 1000 párů baží (bp) byly selektovány pasáží přes Sephacryl SF500 kolonu. Sephacryl SF 500 kolona (0,8 x 29 cm) byla gravitačně naplněna v 10 mM Tris-HCl pH 7,8/1 mM EDTA/ 100 mM Na Acetát. BstXI linkerem ošetřená cDNA byla aplikována do kolony a byly odebrány 0,5 ml frakce. Malé aliquoty každé frakce byly frakcionovány v 1,0% agarosovém gelu. Gel byl vysušen ve vakuu a velikost distribuce radioaktivní DNA byla vizualizována expozicí gelu na rentgenovém filmu. Frakce obsahující cDNA >1000 bp byly vybrány a shromážděny. cDNA byla koncentrována precipitací ethanolem a byla ligována do klonovacího vektoru. Klonovací vektor byl plasmid pEF-BOS, který byl tráven BstXI restrikčním enzymem a purifikován ve dvou následných agarosových gelech. 375 ng plasmidové DNA bylo ligováno do

18,75 ng podle velikosti vybrané cDNA z předchozího kroku ve 150 μΐ ligačního pufru (50 mM Tris-HCl pH 7,8/ 10 mM MgCl_z/ mM rATP/ 25 mg/ml hovězího sérového albuminu) při 15 °C přes noc. Další den byla ligační reakce extrahována fenol/chloroform/isoamyl alkoholem (25:24:1). Nukleové kyseliny byly precipitovány ethanolem za přítomnosti 5 ^g ústřicového glykogenu. Precipitát byl rozpuštěn ve vodě a znovu precipitován ethanolem a potom následovalo promytí 70% ethanolem. Konečná peleta byla rozpuštěna v 14 μΐ vody a 1 μΐ aliquty byly elektroporovány do E. coli kmene DH-10B (GIBCO-BRL). Touto metodou byla generována knihovna o přibližně 4 x 10⁶ rekombinantů.

Vyšetřování cDNA myšího vedlejšího proteinu IL-1 receptorů (muIL-lR AcP) panoramováním s monoklonální protilátkou 4C5

Panoramovací metoda byla popsána dříve (Aruffo and Seed, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8573, 1987). Aliquoty z 3T3-LI knihovny, kde každý representoval přibližně 5 x 10⁴ klonů byly umístěny na LB agarové plotny obsahující 100 μg/ml ampicilinu (amp) a byly kultivovány přes noc při 37 °C. Další den byly kolonie z každého poolu seškrábnuty z plotny do separátních 50 ml aliquot LB + amp a kultura byla kultivována při 37 °C po další 2-3 hodiny. Plasmidová DNA byla následně extrahována za použití QIAGEN plasmidového kitu (Qiagen lne., Chatsworth, CA). Deset separátních DNA poolů bylo potom opoužito pro transfekci COS buněk DEAE dextranovou technikou (5 μ$ DNA/2 x 10⁶ buněk/plotna o průměru 9 cm) (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, J. Sambrook, E.F Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). 72 hodin po transfekci byly COS buňky odebrány z ploten za použití 0,5 mM EDTA/ 0,02% Na-azidinu ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS). Byla vyrobena jedna suspenze buněk pro každý pool. Anti-muIL-lR AcP 4C5 byla navázána na buňky po jednu hodinu na ledu ((10 ^g/ml 4C5 mAb ve 3 ml PBS/0,5 mM EDTA/ 0,02% Na azid/ 5% fetální telecí sérum (FCS)). 3 ml suspenze buňka/mAb byly centrifugovány v 6 ml 2% Ficoll ve výše uvedeném pufru (300 x g, 5 minut) pro odstranění nenavázné mAb. Buňky byly jemně resuspendovány ve výše uvedeném pufru. Buňky z každého poolu byly následě přidány k jednotlivým bakteriálním plotnám (9 cm v průměru), které byly potaženy polyklonálním kozím anti-krysím IgG (20 ^g/ml v 50 mM Tris-HCl pH 9,5, pokojová teplota, 1,5 hodiny) a blokovány přes noc PBS/1% BSA při pokojové teplotě. COS buňky byly ponechány na bakteriálních plotnách po 2 - 3 hodiny při pokojové teplotě s mírným třepáním. Neadherované buňky byly šetrně odstraněny promytím PBS. Zbylé buňky byly lysovány přidáním 0,8 ml Hirt lysovacího roztoku (0,6% SDS/ 10 mM EDTA). Lysát byl transferován dp 1,5 ml Eppendorfových tub a opatřen 1 M NaCl, inkubován přes noc na ledu a odstředěn při 15000 x g po 15 minut při 4 °C. Supernatanty byly extrahovány fenol/chloroform/isoamyl alkoholem (25:24:1) jedenkrát, bylo přidáno 15 /xg ústřicového glykogenu a DNA byla dvakrát precipitována přidání 0,5 objemů 7,5 M NH₄OAc a 2,5 objemuethanolu. Pelety byly promyty 70% ethanolem, sušeny a resuspendovány v 1 μΐ ^Η2°· Každý panoramovaný pool DNA byl potom elektroporován do E. coli kmene DH-10B. Po elektroporací bylo 5 x 10⁴ kolonií každého poolu kultivováno jak je uvedeno výše a plasmidová DNA byla izolována jak je uvedeno výše. Tato DNA representuje jedno kolo panoramování k obohacení knihovny. Celkem byly dokončeny tři kola panoramování za udržování deseti poolů knihovny separovaných od sebe.

Po třetím kole panoramování byl každý pool použit pro transfekci COS buněk DEAE dextranovou metodou (1 /xg DNA/ 2 x 10⁵ buněk/jamku 6 jamkové Costar plotny). 72 hodin po transfekci byly COS buňky vyšetřovány na pooly, které exprivovaly muIL-lR AcP tvorbou rozet se sekundární protilátkou potaženými polystyrénovými korálky (Dynal lne.

Great Neck, NY). 4C5 mAb byla navázána na transfektovane COS buňky v PBS/2% FCS (2 gg Ab/jamku) po 1,5 hodiny při pokojové teplotě s mírným třepáním. Protilátka byla odstraněna a buňky byly promyty PBS/2% FCS. 1 ml PBS/2% FCS/ 1 μΐ ovčím anti-krysím IgG potažených polystyrénových korálků (4 x 10⁵, Dynabeads M-450) byl přidán a inkubován po 1,5 hodiny při pokojové teplotě s mírným třepáním. Korálky byly odstraněny a buňky byly promyty 5-10 krát PBS. Buňky byly potom fixovány inkubací v 95% ethanolu/5% kyselině octové a potom byly mikroskopicky vyšetřovány na tvorbu rozet. Byl nalezen jeden z deseti poolů (panoramování pool č. 2), který byl pozitivní na povrchovou expresi muIL-lR AcP.

Pro identifikaci pozitivních klonů bylo 100 μΐ LB + amp umístěno do jamek 96-jamkové mikrotitrační plotny.Každá jamka byla potom inokulována 4 jednotlivými koloniemi z panoramovacího poolu č. 2. Bakteriální buňky byly kultivovány po 5 - 6 hodin při 37 °C. Potom byly vyrobeny pooly kombinováním 10 μΐ aliquot z každé jamky v 8 řadách a 12 sloupcích každé plotny, při zachování separace řádků a sloupců. Tyto pooly byly použity pro inokulaci separátních 5 ml kultury v LB + amp a byly kultivovány přes noc při 37 °C.

» ή

ΐ

Další den byla izolována plasmidová DNA za použití QIAGEN plasmidového kitu. Každá připravená DNA representovala pooly o bud' 48 (řadách), nebo 32 (sloupcích) jednotlivých izolátů z panoramovacího poolu č. 2. Každý mikrotitrační pool byl použit k transfekci COS buněk v 6-jamkových plotnách jak je uvedeno výše a 72 hodin po transfekci byly buňky vyšetřovány na Dynabead rozetování jak je uvedeno výše. Byly nalezeny dva pozitivní pooly z jedné z mikrotitračních ploten, jeden z řady E a jeden ze sloupce 2. 10 ml aliquta byla odebrána z jamky v průsečíku sloupců a řad (jamka E2) a umístěna na LB agar + amp. Po inkubaci přes noc bylo 40 jednotlivých kolonií použito pro inokulaci 5 ml LB + amp kultury. Plasmidová DNA byla izolována z těchto kultur za použití QIAGEN plasmidových kitů. Každý izolovaný plasmid byl tráven Xbal restrikčním enzymem pro uvolnění cDNA insertu a byl frakcionován na 1,0% agarosovém gelu. Analýza odhalila, že v pozitivním mikrotitračním poolu byly representovány pouze tři velikosti cDNA insertů. Jeden representant každého ze tří plasmidů byl použit pro transfekci COS buněk v 6-jamkových plotnách jak je uvedeno výše vyšetřován na Dynabead rozetování. Téímto způsobem byl identifikován jeden cDNA klon (E2-K), který kóduje 4C5-reaktivní muIL-lR AcP.

Charakterizace muIL-lR AcP cDNA cDNA klon E2-K (pEF-BOS/muIL-IR AcP) byl nejprve charakterizován mapováním restrikčními enzymy. Trávení tohoto klonu Xbal uvolnilo 3,2 kb cDNA insert. 3,2 kb Xbal fragment byl purifikován na gelu a DNA sekvence obou řetězců byla určena za použití ABI automatizovaného DNA sekvenátoru s termostabilní DNA polymerasou a barvivém značenými dideoxynukleotidy jako terminátory. DNA sekvence ukázala otevřený čtecí rámeček (ORF) v 5-prime polovině klonu (viz níže). Mapování restrikčními enzymy za použití

Intelligenetics počítačového softwaru ukázalo 1,4 kb Pstl restrikční fragment uvnitř ORF. Tento 1,4 kb fragment byl izolován na gelu a použit jako proba pro identifiaci dalších muIL-lR AcP cDNA klonů. Přibližně 6 x 10⁵ dalších klonů z 3T3-LI cDNA knihovny popsané výše bylo umístěno na plotny jak bylo popsáno výše. Byl proveden odebrání kolonie (colony lift) (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, J. Sambrook, E.F.Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a odběry byly probovány 1,4 kb Pstl restrikčním fragmentem značeným (³²P)-dCTP náhodným - primingem za použití Multiprime DNA značkovacího systému (Amersham Co., Arlington Heights, IL). Tímto způsobem byly izolovány dva další homologní cDNA klony. Jeden obsahoval 1,0 kb insert a druhý 4,3 kb insert jak bylo určeno Xbal trávením. DNA sekvence 4,3 kb insertu byla určena jako výše pro potvrzení muIL-lR AcP ORF.

Sekvenční analýza muIL-lR AcP cDNA klonu

Nukleotidová sekvence otevřeného čtecího rámečku muIL-lR AcP cDNA insertu je ukázána na obrázku 10A. (SEQ ID NO: 4) . Tento otevřený čtecí rámeček (ORF) se skládá z 1710 bp, které kódují protein o 570 aminokyselinách. Aminokyselinová sekvence, ukázaná na obrázku 10B (SEQ ID NO: 6) určuje 2 0 aminokyselin NH_s-terminálního signálního peptidu se štěpením po Ala-1, extracelulární doménu od Serl-Glu339, hydrofobní transmembránovou doménu Leu340-Leu363 a cytoplamatický konec od Glu 364 do COOH-konce. Sedm potenciálních N-vázaných glykosylačních míst je také obsaženo v extracelulární doméně.

Prohledání database s proteinovou sekvencí za použití Intelligenetics počítačového programu ukázalo, že muIL-lR AcP má signifikantní homologii s oběma - typl a typ 2 - IL-1 receptory u myší, lidí, kuřat a krys. Homologie každého z těchto proteinů je asi 25% a je rovnoměrně distribuována v proteinové sekvenci. Další analýza aminokyselinové sekvence muIL-lR AcP ukázala, že je členem imunoglobulinové superrodiny. Tři páry cysteinových residuí, konservované v v extracelulární doméně všech IL-1 receptoru a odpovědné za tvorbu tří IgG podobných domén jsou perfektně konzervovány v muIL-lR AcP.

Příklad 8

MAb 4C5 vazba na myší rekombinantní IL-lR AcP exprivovaný v COS buňkách

Pro potvrzení toho, že cDNA pro muIL-lR AcP kóduje protein reaktivní s mAb 4C5 byl rekombuinantní muIL-lR AcP exprivován na transfektovaných COS buňkách a vyšetřován na přímou vazbu (¹²⁵I)-4C5. COS buňky byly elektroporovány standartními metodami pEF-BOS/muIL-lR AcP. Po elektroporací byly buňky umístěny na 6 jamkové tkáňové kultivační plotny v 2 - 3 x 10⁵ buněk/jamku. Po 48 - 72 hodinách byly kultivační medium odstraněno a byl přidán 1 ml vazebného pufru (RPMI/5%FCS) obsahující 1 x 10^e cpm (¹²⁵I)-4C5 na každou jamku buď samostatně, nebo za přítomnosti 2 μg neznačené 4C5 ako studeného inhibitoru (nespecifická vazba). Jak celková, tak nespecifická vazba byly provedeny dvojnásobně. Po 3 hodinové inkubaci pri 4 °C byl vazebný pufr odstraněn a buňky byly třikrát promyty PBS. Buňky byly potom lyžovány přidáním 0.,75 ml 0,5% SDS. Lyzát byl odebrán a počet vazeb byl určen. Specifická vazba byla počítána odečtením nespecifické vazby od celkové vazby. Specifická vazba byla přibližně 30000 cpm/jamku s nespecifickým pozadím 8%, což ukazuje, že pEF-BOS/muIL-lR AcP řídí expresi 4C5 imunoreaktivního proteinu v COS buňkách.

Velikost rekombinantního lidského muIL-lR AcP exprivovaného v COS buňkách byla určena metabolickým značením transfektováných COS buněk (^3SS)-methioninem a imunoprecipitací značeného muIL-lR AcP s mAb 4C5 nebo 2E6 (tabulka 2). 36 hodin po elektroporaci pEF-BOS/muIL-lR AcP bylo medium odstraněno a COS buňky byly jedenkrát promyty methioninem prostým mediem (DMEM (vysoká koncentrace glukosy, bez methioninu-GIBCO-BRL)/10% FBS/ 1 mM L-glutamin/ 1 mM Na pyruvát)). Čerstvé methionin prosté medium bylo přidáno a po 5 - 8 hodinové inkubaci při 37 °C bylo přidáno 50 - 100 μθΐ ³⁵S - methioninu na 1 ml media a inkubace pokračovala po 24 hodin. Potom bylo medium odstraněno a buňky byly dvakrát promyty chladným PBS. Buňky byly solubilizovány přidáním RIPA pufru (0,5% KC1, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA) a inkubovány na ledu po 15 minut. Potom byl lyzát přesunut do tub a odstředěn při 15000 x g po 15 minut. Lyzáty byly předčištěny přidáním 40 μΐ GammaBind G Sepharosy (50% objem/objem v RIPA pufru) (Pharmacia Biotech lne., Piscataway, NJ) do 500 μΐ lyzátu a inkubovány přes noc při 4 °C. Další den byly předčištěné lyzáty odstředěny 30 sekund v mikrofuse a byly přeneseny do čistých tub. Jiných 40 μΐ

GammaBind Sepharosy bylo přidáno spolu s 20 gg mAb 4C5 nebo 2E6 (tabulka 2) a imunoprecipitáty byly inkubovány po 3 hodiny při 4 °C s rotováním. Komplexy Sepharosa-mAb byly odstředěny a promyty IX RIPA pufrem, IX 50 mM HEPES pH 7,9/ 200 mM NaCl/ 1 mM EDTA/ 0,5% NP-40 a IX 25 mM Tris pH 7,5/

100 mM NaCl/ 0,5% Deoxycholát/ 1,0% Triton X-100/ 0,1% SDS. protein byl uvolněn z korálků přidáním 20 μΐ 2X Laemmli vzorkového pufru (Laemmli, Nátuře 227: 680, 1970). Proteiny byly separovány elektroforesou v Tris-Glycin PAGE a vizualizovány autoradiografií. Jak je ukázáno na obrázku 11, imunoprecipitovaný rekombinantní muIL-lR AcP s mAb 4C5 nebo 2E6 z transfektovaných COS buněk migroval jako široký proužek o 70 - 90 kDa. Žádný protein nebyl precipitován z imitací transfektovaných COS buněk.

Příklad 9

Exprese rekombinantního IL-lR AcP v COS buňkách:

reaktivita s (¹²⁵I)-značenými IL-l proteiny a monoklonálními protilátkami

Byly stanoveny vazebné charakteristiky rekombinantního IL-lR AcP pro (¹²⁵I)-značený IL-l, 4C5 a 4E2 (obrázek 12). Data ukazují vysokou hladinu exprese rekombinantního IL-lR AcP (Cos(4C5)) jak je určeno (^:L25I)-4C5 vazbou, ale nikoliv zvýšení v (¹²⁵I)-lidský IL-Ια vazbě ve srovnání s kontrolními transfektovánými COS buňkami (Cos(PEF-BOS)). Pro srovnání, vysoká hladina exprese myšího rekombinantního typu 1 receptoru v COS buňkách (COS (Mu-IL-1R)) jak byla určena vazbou (^12SI)-35F5 byla doprovázena korespondujícím zvýšením vazby radioznačeného lidského IL-Ιβ a IL-Ια (obrázek 13).

Příklad 10

Purifikace přirozeného myšího vedlejšího proteinu IL-1 receptoru (IL-lR AcP) z EL-4 buněk ,

Myší EL-4 buňky (100 gm) byly solubilizovány v 1 litru PBS obsahujícím 8 mM CHAPS, 5 mM EDTA a inhibitory proteas pepstatin (10 gg/ml) , leupeptin (10 /xg/ml) , benzamidin (1 mM) , aprotinin (1 gg/ml) a PMSF (0,2 mM). Po centrifugaci při 100000 x g pro odstranění nerozpustného materiálu byl supernatant zaveden na 50 ml agglutinin pšeničných klíčků (WGA) agarosové kolony (Vektor Laboratories, lne.) v 0,8 ml/min. Kolona byla promyta ekvilibračním pufrem (PBS, 8 mM CHAPS, 5 mM EDTA) a potom následoval ekvilibrační pufr obsahující 0,5 M NaCl a navázaný protein byl eluován PBS obsahujícím 8 mM CHAPS a 0,3 M N-acetyl-D-glukosamin.

Cukrem eluované frakce ze tří WGA běhů agarosových kolon byly poolovány a zavedeny na 5 ml imunoafinitní kolonu (mAb 4C5 protilátka zkříženě vázaná na Protein G Sepharosu cestou dimethyl-pimelimidatu (Stern, A.S. a Podlaski, F.J, v techniques in Protein Chemistry IV, R.H. Angeletti, vyd., str. 353 - 360, Academics Press, NY, 1993) ekvilibrovanou PBS obsahujícím 8 mM CHAPS v 1 ml/min. Kolona byla promyta ekvilibračním pufrem a potom následoval ekvilibrační pufr obsahující 1 M NaCl. Navázaný protein byl eluován 50 mM diethylaminového pufru pH 11,5 obsahujícím 8 mM CHAPS.

Frakce obsahující IL-lR AcP byly znovu dialyzovány proti PBS obsahujícímu 4 mM CHAPS a koncentrovány.

cDNA sekvence je 66 kDa. Tento zjevný rozdíl je pravděpodobně v důsledku glykosylace vedlejšího proteinu. Pro vyřešení tohoto byl afinitně purifikovaný IL-1R AcP podroben SDS-PAGE a Coomasie modří barvený proužek korespondující 80 kDa, 4C5 imunoreaktivnímu proteinu byl eluován z gelu a chemicky deglykosylován trifluormethansulfonová kyselina (Edge et al., Anal Biochem. 118: 131, 1981). Deglykosylovaný protein migroval s M =63 - 64 kDa v SDS-PAGE, což je hodnota, která dobře odpovídá

X* předpokládané molekulové hmotnosti z cDNA sekvence.

Tabulka 6

Aminokyselinové složení přirozeného myšího vedlejšího proteinu IL-1 receptorů z EL-4 buněk

aminokyselina	mol %
Cys	n.d.
Asx	10.5
Thr	5.3
Ser	5.1
Glx	13.1
Pro	n.d.
Gly	8.5
Ala	8.9
Val	7.4
Met	2.7
Ile	6.9
Leu	10.6
Thr	3.3
Phe	4.5
His	2.1
Lys	5.7
Trp	n.d.
Arg	5.4
n.d. = neurčeno

Příklad 11

Izolace genomových klonů lidského vedlejšího proteinu IL-1 receptoru

Vyšetření zkříženou hybridizací

Byly provedeny pokusy pro identifikaci a izolaci cDNA kódující lidský homolog IL-1R AcP za vyšetřování lidských cDNA knihoven zkříženou hybridizací se sekvencemi z myšího IL-1R AcP. Lidské cDNA knihovny připravené z mRNA izolované z RÁJI buněk nebo z NC37 buněk byly probovány myší IL-1R AcP cDNA, ale počáteční pokusy byly neúspěšné, pravděpodobně díky velmi nízké expresi tohoto homologu v těchto buňkách (viz příklad 12). Rozhodli jsme se vyšetřit lidskou genomovou knihovnu pro izolování specifických sekvencí, které by mohly být použity pro následné vyšetření lidské cDNA knihovny.

Myší IL-1R AcP cDNA klon (3,2 kb Xbal fragment) a restrikční fragmenty myšího IL-1R AcP cDNA klonu (1,4 kb Pstl fragment a 843 párů baží (bp) Bam HI/SalI fragment) byly použity jako proby pro provedení Southern blot analýzy s nízkou přísností lidské genomové DNA (Clontech, Palo Alto, CA). Tato analýza byla provedena pro určení optimálních hybridizačních a promývacích podmínek, za kterých by mohla myší proba detekovat homologní sekvence přítomné v lidském genomu. Hybridizace s myší IL-1R AcP cDNA probami byla provedena při 37 °C přes noc v hybridizačním pufru A (2X SSC, 20% formamid, 2X Denhart, 100 ^g/ml kvasinkové RNA,

0,1% SDS). Proby byly značeny (³²P)-dCTP za použití Prime-It

II Random Primer Labeling Kitu (Stratagene, La Jolla, CA). Bloty byly promyty 2X SSC a 0,01% SDS při různých teplotách od 37 °C. Stanovené optimální podmínky byly: použití (³²P)-843 bp BamHI/SalI fragmentu, hybridizace při 37 °C přes noc v hybridizačním pufru A, promytí v 2X SSC, 0,01%

SDS při 55 °C. Tyto podmínky dávaly nejnižší pozadí a byly použity pro vyšetřování komerčně dostupných lidských genomových knihoven.

Pro identifikaci lidských genomových klonů IL-1R AcP byla vyšetřována knihovna lidských plicních fibroblastů v Lambda FIX č. 944201 (Stratagene, La Jolla, CA). 4,8 x 10⁵ plaků bylo vyšetřováno standartními plakovými hybridizačními technikami (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) za použití podmínek popsaných výše. Následující plakovou hybridizací bylo purifikováno šest pozitivně hybridizujících fágových klonů. Dva fágové klony byly dále charakterizovány (č. 1 a č. 7).

Charakterizace lidských genomových klonů

Lidské IL-lR AcP genomové klony byly počátečně charakterizovány mapováním restrikčními enzymy. DNA bakteriofágu lambda byla izolována z klonů č.l a č. 7 za použití LambdaSorb fágového adsorbent (Promega, Madison,

WI). Fágová DNA byla trávena Sací pro uvolnění insertů a fragmenty byly potom separovány elektroforesou na 1% agarosových gelech. Inserty pro oba klony č. 1 a č. 7 byly velikosti 17 kb. Další mapování klonů č.l a č. 7 bylo provedeno za použití Xbal a EcoRI. Trávené DNA byly separovány elektroforesou na 1% agarose, přeneseny do nylonové membrány (ICN, Irvine, CA) a zkříženě vázány pro Southern blot analýzu. Membrána byla hybridizována 843 bp (BamHI/SalI) fragmentem myšího IL-1R AcP, který byl popsán dříve. Proba byla značena (³²P)-dCTP za použití Prime-It II Random Primer Labeling Kitu (Stratagene, La Jolla, CA). Bloty byly hybridizovány a promyty za použití ppodmínek hybridizace o nízké přísnosti jak jsou popsány výše.

4,5 kb fragment z EcoRI trávení a 2,6 kb fragment z Xbal trávení byly identifikovány jako pozitivní pro hybridizaci na myší IL-1R AcP sekvence. 4,5 kb fragment a 2,6 kb fragment byly izolovány z 0,8% Seaplaque agarosy (FMC, Rockland, ME ) a byly purifikovány Qiaex (Qiagen,

Chatsworth, CA). Fragmenty byly subklonovány do vektoru pBluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) pro usnadnění charakterizace. Plasmidová DNA byla připravena za použití Qiagen plasmidového kitu (Qiagen, Chatsworth, CA).

Byla provedena Southern blot analýza pro určení toho, který fragment bude nejvhodnější pro detekci homologních sekvencí v lidském genomu. 4,5 kb a 2,6 kb fragmenty byly použity jako proby. Byly použity následující podmínky hybridizace o nízké přísnosti: 5X SSC, 50% formamid, 5X Denhart, 100 ^g/ml kvasinkové RNA, 0,1% SDS, 37 °C, hybridizace přes noc. Proby byly značeny (³²P)-dCTP za použití Prime-It II Random Primer Labeling Kitu (Stratagene, La Jolla, CA). Membrány byly promyty za podmínek vysoké přísnosti (0,lX SSC a 0,01% SDS) při různých teplotách od 37 °C. Byly určeny optimální podmínky pro zajištění výběru proby, která bude specifická pro huIL-lR AcP při vyšetřování

Ί2 lidské cDNA knihovny. Tyto optimální podmínky jsou popsány v příkladu 12.

Analýza sekvence lidského genomového klonu pBluescript II SK+/2,6 kb lidská genomová IL-lR AcP plasmidová DNA byla sekvencována za použití ABI automatizovaného DNA sekvenátoru spolu s termostabilní DNA polymerasou a barvivém značenými dideoxynukleotidy jako terminátory. Předběžná analýza DNA sekvence ukázala, že tato DNA obsahuje 150 - nukleotidový region s 90% homologií k sekvenci kódující intracelulární doménu myšího IL-lR AcP.

Příklad 12

Izolace cDNA klonů lidského IL-lR AcP

Konstrukce cDNA knihovny YT buňky mAb 2E6 (příklad 2, tabulka 2) byla původně charakterizována svou reaktivitou s myším IL-lR AcP. Předběžná data ukazují, že mAb 2E6 detekuje IL-lR AcP na lidských buňkách. Byl vyšetřován počet lidských buněčných linií (¹²⁵Ι)-2E6 a bylo určeno, že YT buněčná linie (Yodoi et al.,J. Immunol. 134: 1623, 1985) exprivuje relativně vysoký počet 2E6 reaktivních míst na buňku ve srovnání s jinými buněčnými liniemi, např. RÁJI. YT buněčná linie byla proto vybrána jako zdroj RNA pro konstrukci cDNA knihovny.

Celková RNA byla extrahována z YT buněk a cDNA byla vyrobena z této RNA jak je zde popsáno (příklad 7:

konstrukce 3T3-LI cDNA knihovny). EcoRI adaptory (Stratagene, La Jolla, CA) byly ligovány do vzniklých cDNA a molekuly >1000 bp byly vybrány pasáží přes Sephacryl SF500 kolonu jak je zde popsáno (Příklad 7: konstrukce 3T3-LI cDNA knihovny). cDNA byla koncentrována precipitací ethanolem a ligována do klonovacího vektoru. Klonovacím vektorem byl Lambda ZAP II fág (Stratagene), který byl tráven EcoRI restrikčním enzymem a defosforylován (jak je poskytnuto dodavatelem). 10 aliquot Lambda ZAP II ramének (EcoRI trávených a defosforylovaných) v 5 μΐ ligačního pufru (66 mM Tris-HCl pH 7,5/ 5 mM MgCl₂/ 1 mM DTE/ 1 mM rATP) při 15 °C přes noc. Následující den byly ligace poolovány a baleny do Lambda fágu ve dvanácti 4 μΐ aliquotách za použití Gigapack II balicích extraktů a podle návodu výrobce (Stratagene). Balený fág byl titrován umístěním v bakteriálním kmenu XLl-Blue-MRF^ (Stratagene) za přítomnosti 5 mM isopropyl-S-D-thiogalakto-pyranosidu (IPTG) (Boehringer Mannheim Co., Indianopolis, IN) a 4 mg/ml 5 -bromo-4 -chloro-3 -indolyl- β -D -galaktopyranosidu (X-gal) (Boehringer Mannheim) pro odlišení nerekombinantního fágu. Plaky počítané následující den ukázaly, že byla získána knihovna o 3,55 x 10® rekombinantech s nerekombinantním pozadím < 0,1%.

Vyšetření lidské cDNA knihovny hybridizací s lidskými fragmenty genomového klonu IL-lR AcP

2,6 kb Xbal restrikční fragment, který byl dříve popsán jako specifická proba pro huIL-lR AcP byl použit pro hybridizací o nízké přísnosti: 5X SSC, 50% formamid, 5X Denhart, 100 μg/ml kvasinkové RNA, 0,1% SDS, 37 °, přes noc)

Ί4 vysoce přísné promývací podmínky (0,1 x SSC, 0,01% SDS, 10 °C) byly použity k vyšetření YT cDNA knihovny. 4,8 x 10^Ξ plaků bylo vyšetřováno standartními plakovými hybridizačními technikami (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) za použití podmínek popsaných výše. Následující plakovou hybridizací byly identifikovány a purifikovány tři pozitivně hybridizující fágové klony (č. 3, 5 a 6). Excise pBluescript SK (-) fagemidů obsahujících insert DNA z Lambda ZAP II vektoru byla provedena podle návodu výrobce.

Charakterizace lidských cDNA klonů

Lidské IL-lR AcP cDNA inserty č. 3, č. 5 a č. 6 v pBluescript SK (-) byly dále charakterizovány mapováním restrikčními enzymy. Nejprve, miniprep plasmidová DNA byla připravena metodou rychlého varu (Holmes and Quigley, Anal. Biochem. 114: 193, 1981). Potom byla plasmidová DNA připravena Qiagen plasmidovým kitem. Potom byla plasmidová DNA trávena EcoRI pro uvolnění insertů a inserty byly potom separovány elektroforesou na 1% agarose. Klon č. 3 obsahoval 2,3 kb insert, klon č. 5 obsahoval 1,4 kb insert a klon č. 6 obsahoval 2,7 kb insert. Další mapování klonů ukázalo jedno PvuII místo ve všech třech klonech.

Analýza sekvence lidských IL-lR AcP cDNA klonů

Plasmidová DNA z klonů č. 3, č. 5 a č. 6 byla sekvencována za použití ABI automatizovaného DNA sekvenátoru spolu s termostabilní DNA polymerasou a barvivém značenými dideoxynukleotidy jako terminátory. Předběžná analýza DNA sekvence ukázala, že pouze klony č. 3 a č. 6 mají inserty, které jsou homologní k myší IL-1R AcP cDNA. Proto byly inserty klonů č. 3 ač. 6 sekvencovány kompletně. Analýza sekvence ukázala, že klony č. 3 a č. 6 jsou překrývající se klony. Schematická representace klonů č. 3 a č. 6 jsou ukázány na obrázku 14. Klon č. 6 obsahuje ATG iniciační kodon a 5 část kódujícího regionu. Klon č. 6 obsahuje 2' část cDNA a TGA stop kodon. Tyto dva překrývající se klony byly použity pro konstrukci kompletní huIL-lR AcP cDNA.

Příklad 13

Konstrukce kompletní lidské IL-1R AcP cDNA

Mapování restrikčními endonukleasami a předběžná analýza sekvence ukázaly, že existuje jedno BstXI místo v klonech č. 3 a č. 6. Na obrázku 14 je ukázána schematická representace překrývajících se klonů č. 3 a č. 6. Klony č. 3 a č. 6 byly tráveny restrikčními enzymy BstXI a Xbal. Fragmenty o přibližně 846 bp a přibližně 2700 bp byly připraveny z klonu č. 3 a č. 6, v příslušném pořadí, elektroforesou cv 0,7% Seaplaque agarose (FME, Rockland, ME) a byly purifikovány Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA).

Kompletní lidský IL-1R AcP byl připraven subklonováním do savčího expresního vektoru pEF-BOS (Mizushima and Nagato, Nuc. Acids Res. 18: 5322, 1990). pEF-BOS plasmidová DNA byla trávena Xbal, ošetřena telecí střevní fosfatasou (Boehringer Mannheim Co., Indianopolis, IN), separována elektroforesou na 0,7% Seaplaque agarose a byly purifikovány Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA) . 846 bp a přibližně 2700 bp BstXI/Xbal fragmenty popsané výše byly ligovány do Xbal štěpeného pEF-BOS expresního vektoru a produkty ligace byly transformovány do MC1061 kompetentních buněk. Transformované buňky byly umístěny na LB agarové plotny obsahující 100 /xg/ml ampicilinu a byly kultivovány přes noc při 37 °C.

Další den bylo 12 jednotlivých kolonií seškrábnuto, inokulováno na LB a ampicilin (100 μg/ml) a inkubováno přes noc při 37 °C. Miniprep plasmidová DNA byla připravena metodou rychlého varu (Holmes and Quigley, Anal. Biochem. 114: 193, 1981). Analýza restrikčními endonukleasami potvrdila, že 10 klonů obsahuje vhodný insert ve správné orientaci vzhledem k promotorovému regionu pEF-BOS.

Plasmidová DNA byla izolována ze dvou pozitivních klonů č. 1 a č. 9 Qiagen metodou (Qiagen, Chatsworth, CA) . Nukleotidová sekvence obou řetězců obou plasmidů byla určena jak je popsáno v příkladu 7. Sekvence 1710 bp otevřeného čtecího rámečku (ORF) obsaženého v huIL-lR AcP cDNA je ukázána na obrázku 15. (SEQ ID NO: 1). Dedukovaná aminokyselinová sekvence ukázaná na obrázku 16 (SEQ ID NO:

3) by měla kodovat protein o 570 zbytcích skládající se ze signálního peptidu o 20 aminokyselinách (Met^-20 - Ala^-1), putativní extracelulární domény (Serl - Glu 339) , hydrofobní transmembránové domény (Leu340 - Leu363) a cytoplasmatické části (Glu364 - Val550). Sedm potenciálních N-vázaných glykosylačních míst jsou všechny přítomny v extracelulární doméně. Všech sedm míst je konzervováno v myším a lidském IL-1R AcP.

Příklad 14

Exprese solubilního lidského IL-lR AcP

Pro expresi huIL-lR AcP byla solubilní forma proteinu zpracována pro expresi v baculovirovém expresním systému. Tento systém je užitečný pro nadprodukci rekombinantních proteinů v eukaryotních buňkách (Luckow and Summers, Bio/Technology 6: 47, 1988) . Za použití metody polymerasové řetězové reakce (PCR) (Innis M.A. et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academics Press, San Dlego) byl produkován amplikon, který kodoval solubilní formu extracelulární domény huIL-lR AcP. Stručně, byly syntetizovány dva oligonukleotidové primery na Applied Biosystems syntezátoru. Forward primer obsahoval BamHI místo a kodony pro prvních 11 aminokyselin signálního peptidu: (5') GGCC GGA TCC ATG ACA CTT CTG TGG TGT GTA GTG ATG CTC TAC (3) (SEQ ID NO: 10) . Sekvence reversního primeru kódovala 11 aminokyselin před transmembránovou doménou, Ala spacer a Glu-Glu-Phe smyčku, a potom následoval terminační kodon TAG a KpnI místo: (5') CGCGCG GGT ACC CTA GAA CTC TTC AGC TTC CAC TGT GTA TCT TGG AGC TGG CAC TTT CTGC (3') (SEQ ID NO: 11) . Glu-Glu-Phe tripeptidová smyčka v COOH-konci byla zpracována tak, aby poskytla epitop pro detekci rekombinantního proteinu protilátkou. Tato tripeptidová smyčka je rozpoznávána komerčně dostupnou monoklonální protilátkou k α-tubulinu (Skinner et al., J. Biol. Chem.

266: 14163, 1991).

Forward a reversní primery byly použity pro amplifikaci extracelulární domény huIL-lR AcP, za použití klonu č. 3 (obrázek 14) jako templátu. Vzniklý PCR amplikon o přibližně 800 bp byl tráven BamHI a KpnI. Trávený fragment byl podroben elektroforese přes 0,7% Seaplaque agarosu a byl purifikován Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA). Solubilní lidská IL-lR AcP extracelulární doména byla potom subklonována do pNRl, derivátu bakulovirového přenosového vektoru pVL941 (PharMingen, San Diego, CA). pNRl byl připraven z pVL941 odstraněním EcoRI místa v pozici 7196 (štěpení EcoRI a vyplnění lepivých konců Klenow DNA polymerasou). DNA byla podrobena religaci, potom štěpení BamHI a Asp718 (KpnI izoschisomer) a inserci následujících oligonukleotidů, které obsahovaly BamHI, EcoRI a Asp718 rozpoznávací místa:

(5¹) GATCCAGAATTCATAATAG (3') (SEQ ID NO: 12) (3’) GTCTTAAGTATTATCCATG (5') (SEQ ID NO: 13)

BamHI, EcoRI a Asp718 restrikční místa jsou jedinečná v pNRl.

pNRl plasmidová DNA byla trávena BamHI a KpnI a purifikována z 0,7% Seaplaque agarosy za použití Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA). BamHI/Kpnl PCR amplikonový fragment huIL-lR AcP o přibližně 800 bp byl ligován do BamHI/Kpnl štěpeného expresního vektoru pNRl. Produkty ligace byly transformovány do MC1061 kompetentních buněk, které byly potom umístěny na LB agarové plotny obsahující 100 Ag/ml ampicilinu a byly kultivovány přes noc při 37 °C. Další den bylo 36 nezávislých kolonií seškrábnuto, inokulováno na LB a ampicilin (100 ^g/ml). Miniprep plasmidová DNA byla připravena metodou rychlého varu (Holmes and Quigley, Anal. Biochem. 114: 193, 1981). DNA byla analyzována mapováním restrikčními enzymy. U třiceti plasmidových klonů se ukázalo, že obsahují správný insert. Plasmidová DNA byla připravena ze dvou pozitivních klonů (č. 11, č. 25) Qiagen metodou (Qiagen, Chatsworth, CA). Tyto klony byly verifikovány analýzou sekvence.

pNRl/solubilní lidský IL-lR AcP cDNA (klon č. 25) byl kotransfektován linearizovanou AcRP23.1ac Z bakulovirovou DNA (PharMingen, San Diego, CA) do Sf9 (Spodoptera frugiperda) buněk za použití BaculoGold Transfection Kit (PharMingen, San Diego, CA). Po transfekci byly rekombinantní baculoviry izolovány a plakově purifikovány podle protokolu popsaného v BaculoGold Transfection Kit (PharMingen). Pálky byly vizualizovány barvením MTT jak je popsáno (Shanafelt, Biotechniques 11: 330, 1991). Bylo izolováno dvanáct jednotlivých virových plaků a virové částice byly eluovány z agarosy do 0,5 ml SF-9 media (IPL-41 + 10% FBS - JRH Biosciences, Lenexa, KS) inkubací přes noc při 4 °C na rotátoru. Každý rekombinantní virus byl analyzován na přítomnost insertů PCR analýzou a na expresi rekombinantního lidského IL-lR AcP imunoblotovou analýzou. Pro PCR amplifikaci byla virová DNA extrahována, inkubována s Taq DNA polymerasou a vhodnými pNRl forward a reversními primery (vzhledem k BamHl/Asp718 klonovacím místům) a amplifikována za použití standartních PCR metod (Innis et al., PCR Protocols, Academics Press, San Diego 1990). Každý amplicon byl analyzován elektroforesou na 1,5% agarose. Výsledek potvrdil, že 10 z 11 testovaných plaků obsahovalo insert o 1 kb, korespondující správné velikosti insertu.

Pro imunoblotovou analýzu byla izolována lidská IL-lR AcP + smyčka (ze supernatantu Sf9 buněk infikovaných rekombinantním virem) reakcí s biotinylovanou protilátkou proti tubulinu (YL1/2) (Harlan Bioproducts) imobilizovanou na streptavidin agarose (Pierce, Rockford, IL). Proteiny byly eluovány z anti-tubulin protilátkové matrix 0,2 M glycinem pH 2,7 a frakce byly neutralizovány 3 M Tris báse. Eluované proteiny byly ošetřeny Laemmli vzorkovým pufrem bez β-mercaptoethanolu, separovány na 8% akrylamidovém (Novex) deskovém gelu a přeneseny do 0,2 μ nitrocelulosové membrány (Schleicher and Schuell, Keene, NH). Imobilizované proteiny byly probovány YLl/2 protilátkou (10 μg/ml) a peroxidasa konjugovanou kozí-anti-krysí protilátkou (ředění 1:10000) (Boehringer Mannheim Biochemicals). Imunoreaktivní proužky byly vizualizovány ECL (Amersham) podle návodu výrobce. Tato analýza identifikovala protein o >200 kDa, který byl exprivován rekombinantním virem obsahujícím lidský IL-lR AcP + smyčka insert.

Rekombinantní virus z plaků č. 2 a č. 12 (identifikovaných imunoblotovou analýzou jako exprivující lidský IL-lR AcP + smyčku) byl amplifikován pro získání větší zásoby viru, který by mohl být použit pro produkci většího rozsahu IL-lR AcP + smyčky pro účely imunizace. Sf9 buňky byly kultivovány v logaritmickém růstu (1 x 10^s buněk/ml) v EX-CELL 401 s 1% fetálním hovězím sérem (JRH Biosciences, Lenexa, KS) při 27 °C, infikovány rekombinantním baculovirem jak je popsáno (OReilly et al., Baculovirus Expression Vectors, a Laboratory Manual, Oxford Univ. Press, 1994) a vyčerpané kultivační medium byly sklízeno 3-5 dní po infekci. Buňky byly odstraněny z vyčerpaného kultivačního media centrifugaci a solubilní lidský IL-1R AcP + smyčka byl purifikován přes afinitní matrix složenou z YL1/2 protilátky jak je popsáno v příkladu 15 níže. Purifikovaný lidský IL-1R AcP + smyčka byl použit k imunizaci myší.

Příklad 15

Příprava a vyšetření monoklonálních protilátek specifických pro lidský vedlejší protein IL-l receptorů (huIL-lR AcP)

Pro -vývoj protilátek specifických pro huIL-lR AcP jsou využity tři metody.

Imunizace myší a krys COS buňkami exprivujícími lidský rekombinantní IL-1R AcP

COS buňky (4 x 10⁷⁵ jsou transfektovány elektroporací kompletním huIL-lR AcP expresním plasmidem (20 μg, popsaný v příkladu 13) v BioRad Gene pulser při 250 a 350 voltech podle návodu výrobce. Transfektováné buňky jsou umístěny na 250 m x 250 mm Nunc tkáňovou kultivační misku a sklízeny po 72 hodinách růstu. Transfektováné buňky jsou uvolněny ze tkáňové kultury ošetřením NO-zyme (JRH Biosciences) po 10 minut při 37 °C. Buňky jsou sklízeny, promyty v PBS, pH 7,4 a použity pro imunizaci. Myši a krysy jsou imunizovány intraperitoneální cestou (i.p.) COS buňkami exprivujícími huIL-lR AcP (1 x 10⁷ buněk/zvíře) v den 0, 7, 14 a 28. V den 40 je zvířatům odebrána krev pro zjištění titru protilátek v odpovědi na huIL-lR AcP (viz níže pro specifické testy). Zvířatů je odána dosycovací imunizace (1 x 10⁷ buněk, i.p.) ve 2 - 4 týdením intervalu po dni 40. Titry sérových protilátek specifických pro huIL-lR AcP jsou určeny 10 až 12 dní po každé dosycovací imunizaci. Pokud se u zvířat vyvíjí dostatečný titr sérových protilátek (např. 1/1000 ředění séra imunoprecipituje z alespoň 50% s daným množstvím komplexu (¹²⁵I)-IL-Ιβ zkříženě navázaného na IL-1R AcP solubilizovaného z lidských YT a RÁJI buněk), pak jsou podány dosycovací imunizace v přípravě pro izoaci jejich buněk sleziny. Konečná dosycovací imunizace je složena z 1 x 10⁷ buněk daných jak i.v., tak i.p. ve dvou následujících dnech. Tři dny po poslední imunizaci jsou od zvířat izolovány buňky sleziny a jsou produkovány hybridomní buňky jak je popsáno výše. Hybridomní buňky secernující protilátku specifickou pro huIL-lR AcP jsou identifikovány testem popsaným níže. Hybridomní buňky jsou klonovány jak bylo popsáno dříve v příkladu 1.

Imunizace myší a krys purifikovaným lidským rekombinantním solubilním IL-1R AcP

a. Příprava lidského rekombinantního solubilního IL-1R AcP v COS buňkách a baculovirových expresních systémech. Jak je popsáno výše, COS buňky sou transfektovány plasmidovou DNA exprivující extracelulární doménu huIL-lR AcP, která má smyčku (Glu, Glu, Phe) (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266: 14163, 1991) insertovanou v C-konci (solubilní IL-1R AcP, aminokyseliny 1 - 339+ Ala + Glu + Glu + Phe). Smyčka kóduje sekvenci pro rozpoznání anti-tubulinovou protilátkou YL1/2 (Harlan Bioproducts). Medium je sklízeno z buněk 72 hodin po transfekci a solubilní IL-lR AcP + smyčka je detekován a purifikován jak je popsáno níže.

Standartní metody (Gruenwald and Heitz, Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual, druhé vydání, 1993, PharMingen, San Diego, CA) jsou využity pro generování čistého rekombinantního akuloviru exprivujícího solubilní IL-lR AcP protein. Stručně, plasmidová DNA kódující solubilní extracelulární doménu lidského IL-lR AcP + smyčku je insertována do přenosového vektoru pNRl jak je popsáno v příkladu 14. Rekombinantní přenosový vektor je purifikován a kotransfektován linearizovanou ACVWl.lacZ DNA (PharMingen) do Sf9 (Spodoptera frugiperda) buněk. Rekombinantní bakuloviry jsou izolovány a plakově purifikovány. SF-9 buňky (2 x 10⁶ buněk/ml) jsou kultivovány do logaritmické fáze růstu v TMH-FH mediu a vyčerpané kultivační medium je sklízeno po 3 - 5 dnech. Buňky jsou odstraněny z vyčerpaného kultivačního media centrifugací a solubilní IL-lR AcP + smyčka protein je detekován a purifikován jak je popsáno níže.

b. Příprava afinitní matrix složené z imobilizované Yll/2 protilátky. Pro imobilizaci YLl/2 protilátky na afinitní matrix může být využito mnoho metod včetně kovalentní zkřížené vazby na buď aktivovaný agarosový gel jako je Affi-Gel 10 (BioRad Laboratories) nebo na agarosový gel obsahující imobilizovaný Protein G (Stern, A.S. a Podlaski, F.J, v techniques in Protein Chemistry IV, R.H. Angeletti, vyd., str. 353 - 360, Academics Press, NY, 1993). Nicméně, pro purifikaci solubilního IL-lR AcP je YLl/2 protilátka kovaentně modifikována NHS-LC-biotinem (Pierce Chemical Co.) a imobilizována na streptavidin agarosovém gelu (Pierce Chemical Co.). YL1/2 protilátka (3 mg/ml) je dialyzována proti 0,1 M borátového pufru, pH 8,5, po čemž následuje reakce s NHS-LC-biotinem v molárním poměru 40:1 (LC-biotin: YLl/2 protilátka) po 2 hodiny při pokojové teplotě. Nezreagovaný LC-biotin je zastaven 1 M glycinu/ 0,1 M borátovým pufrem, pH 8,4. Nezreagovaný a neutralizovaný NHS-LC-biotin je odstraněn centrifugací při 1000 x g po 15 30 minut za použití Centricon-30 mikrocentrátoru (Amicon). po centrifugací je biotynylovaná YLl/2 protilátka ředěna 0,1 M fosforečnanem sodným, pH 7,0 a proces je opakován dvakrát. Biotynylovaná YLl/2 protilátka (6 mg v 0,1 M fosforečnanu sodném, pH 7,0) je zreagována s streptavidin agarosou (6 ml 50% suspenze) po 2 hodiny při pokojové teplotě. Streptavidin gagarosa s imobilizovanou biotynylovanou YLl/2 protilátkou je umístěna do kolony a promyta 10 objemy kolony PBS, pH 7,4.

c. Purifikace solubilního IL-lR AcP. Medium z jak COS, tak Sf9 buněk obsahující solubilní IL-lR AcP se nechá projít YLl/2 afinitní kolonou za průtoku 3 ml/min. Kolona je sekvenčně promyta 2 objemy kolony PBS, pH 7,4, 5 objemy kolony 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,2% Tween 20, 0,05% NaN₃ a 2 objemy kolony PBS, pH 7,4. Solubilní IL-lR AcP + smyčka byl eluován 0,1 M glycin-HCl, pH 2,8 a frakce (1 ml) byly neutralizovány 3 M Tris baze (0,015 ml na 1 ml frakci). Protein eluovaný z kolony (purifikovaný solubilní IL-lR AcP + smyčka) je charakterizován redukční a neredukční SDS-PAGE na 12% akrylamidovém lepivém gelu a potom následuje arvení stříbrem pro vizualizaci proteinových proužků. Solubilní IL-lR AcP + smyčka přítomný v kondicionovaném mediu z COS buněk a baculovirových expresních systémů a purifikované přípravky mohou být také identifikovány postupy western blottingu. Protein v kondicionovaném mediu (0,04 ml) a purifikovaný solubilní

IL-lR AcP + smyčka (0,1 až 1 μ$) jsou ošetřeny Laemmli vzorkovým pufrem bez β-merkaptoethanolu, separovány Sds-PAGE na 12% gelech a přeneseny do nitrocelulosové membrány (0,2 μΜ) jak je popsáno výše v příkladu 1. Proteiny imobilizované na nitrocelulose jsou probovány YLl/2 protilátkou (5 μg/ml) a peroxidasa-konjugovaným kozím anti-myším nebo anti-krysím IgG protilátkou (ředění 1/1000) (Boehringer Mannheim Biochemicals). Imunoreaktivní proužky jsou identifikovány ECL tehnikou (Amersham lne.) podle návodu výrobce. Solubilní IL-lR AcP, které byly purifikovány z COS buněk a bakulovirových expresních systémů by měly migrovat jako proteiny o přibližně 65 - 67 kDa a 45 - 47 kDa, v příslušném pořadí.

d. Imunizace myší a krys solubilním IL-lR AcP + smyčka Myši a krysy jsou imunizovány cestou i.p a do plosky v den 0, 14 a 28 10 - 100 ^g solubilního IL-lR AcP + smyčka. Protein je připraven jako v příkladu 1 a 2 v kompletním Freudově adjuvans pro primární imunizaci a v nekompletním Freundově adjuvans pro dosycovací imunizaci v den 14 a 28. Sérum je zvířatů odebráno v den 40 a je testováno na reaktivitu protilátek (viz testy níže), Zvířatům jsou podány dosycovací imunizace (i.p., 10 - 25 μg proteinu připraveného v nekompletním Freundově adjuvans) ve 4 týdeních intervalech a titr sérových protilátek je určován dva týdny po každé imunizaci. Pokud se u zvířat vyvíjí silný titr sérových protilátek (např. 1/10⁴ ředění séra dává 50% dpověď v EIA), pak jsou podány dosycovací imunizace (i.v. a i.p.) 10 - 100 μg solubilního IL-lR AcP + smyčka dva následující dny. O tři dny později jsou od zvířat izolovány buňky sleziny a jsou fušovány a SP2/0 buňkami jak je popsáno v příkladu 1 pro vývoj anti-myší IL-lR AcP protilátek. Supernatanty hybridomů jsou vyšetřovány na inhibiční a neinhibiční protilátky testy popsanými níže. Hybridomní buněčné linie secernující huIL-lR AcP protilátky jsou klonovány omezujícím ředěním.

Anti-huIL-lR AcP protilátky jsou purifikovány jak je popsáno v příkladu 1.

e. Testy pro detekci protilátek specifických pro lidský IL-lR AcP. Přítomnost anti-IL-lR AcP protilátek v séru e nejprve určena enzymovým ímunotestem (EIA) se solubilním IL-lR AcP + smyčka imobilizovaným na 96 jamkové plotně. Stručně, solubilní IL-lR AcP + smyčka (1 μ9/ιη1) e ředěn s 50 mM pufru uhličitanu sodného, pH 9,0, 0,15 M NaCl (BC salinický roztok) a je pasivně adsorbován (100 μΐ, 100 ng) na jamky Nunc Maxisorb plotny po 16 hodin při pokojové teplotě. Po promytí jsou plotny reagovány s PBS, pH 7,4, 1% hovězím sérovým albuminem (BSA) po 1 hodinu při 37 °C. Sériové ředění (1/100 až 1/10⁶ v 50 mM fosforečnanu sodném, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 20, 1% BSA, 0,05% NaN₃ (protilátkový vazebný pufr)) vzorků séra je inkubovánp s imobilizovaným solubilním IL-lR AcP po 2 hodiny při pokojové teplotě. Po promytí ploten PBS, pH 7,4, 0,05% Tween-20 je navázaná protilátka detekováa peroxidasa konjugovanou kozí anti-myší nebo anti-krysí IgG protilátkou (Boehringer-Mannheim lne.) a je vizualizována TMB (tetramethylbenzidin) substrátem. Barevná intensita jednotlivých jamek je měřena při 450 nm v mnohokanálovém fotometru a je proporcionální ke koncentraci anti-IL-lR AcP protilátky v séru.

Sérové protilátky jsou také testovány na reaktivitu FACS (flurescencí aktivované třídění buněk) a 1) přirozený huIL-lR

AcP exprivovaný na lidských buněčných liniích YT, NC-37 a RÁJI a 2) rekombinantní huIL-lR AcP exprivovaný na COS buňkách. Buňky (1 x 10⁶) jsou inkubovány s ředěným sérem (1/100 až 1/10⁴) v PBS, pH 7,4 (100 μΐ) po 1 hodinu při 4 °C. Po promytí buněk PBS, pH 7,4, pro odstranění nenavázané protilátky jsou buňky inkubovány s fluorescein-konjugovanou kozí anti myší nebo anti.krysí IgG protilátkou /Tágo Laboratories) po 30 minut při 4 °C. Buňky jsou potom promyty PBS, pH 7,4 a kvantita protilátky navázané na povrch buněk je určena zvýšením intensity fluorescence na FACSort (Becton-Dickinson Co.),

Anti myší IL-lR AcP protilátky 4C5 a 2E6 (tabulka 2) vykazovaly inhiiční a neinhibiční aktivitu, v příslušném pořadí, proti IL-lR AcP exprovovanému na myších buňkách. Pro určení toho, zda sérum od zvířat imunizovaných lidským IL-lR AcP obsahuje jak inhibiční, tak neinhibiční protilátky, byly provedeny dva testy: 1) inhibice (¹²⁵I)-IL-Ιβ vazby na lidské buňky a 2) imunoprecipitace solubilizovaného komplexu (¹²⁵I)-IL-Ιβ zkříženě navázaného na proteiny buněčného povrchu lidských buněk. Pro inhibiční test jsou sériové ředění séra inkubovány s YT, NC-37 a RÁJI buňami (1 - 2 x 10^e) ve vazebném pufru po 1 hodinu při pokojové teplotě.

(^12SI)-IL-Ιβ (25 - 250 pM) je přidán do každé tuby, inkubován po 3 hodiny při 4 °C a na buňky navázaná radioaktivita je určena jak bylo popsáno dříve v příkladu 1. Titr inhibičních protilátek je určen ředěním séra, které vede k 50% na buňky navázané radioaktivity. Pro imunoprecipitační test jsou ředění séra inkubována po 16 hodin při 4 °C se solubilizovanými komplexy (¹²⁵I)-IL-Ιβ zkříženě vázaného na huIL-lR AcP a za přítomnosti proteinu-G-Plus imobilizovaného na agarosových korálcích. Každý vzorek séra je testován na reaktivitu se solubilizovanými komplexy připravenými z lidských buněčných linií YT, NC-37 a RÁJI. Po centrifugací a promytí protein-G-Plus agarosových korálků jsou imunoprecipitované proteiny analyzovány SDS-PAGE a autoradiografií jak je popsáno v příkladu 1 pro myší IL-1R AcP protilátky.

Imunizace myší a krys huIL-lR AcP peptidy konjugovanými na hemocyaninu (keyhole limpet hemocyanine - KLH)

Peptidy korespondující sekvencím 1-10, 54-64, 68-77, 265-273, 285-294, 490-499 a 505-515 kompletního huIL-lR AcP byly syntetizovány standartní technikou pevné fáze (Marglin and Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39: 841, 1970). Sekvence každého peptidu měla cystein přidaný na C-konec za účelem kovalentního spárování s KLH MBS technikou. Stručně, KLH (1,5 mg v PBS, pH 7,4) reaguje s 0,32 mg

3-malemidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidesterem (MBS ;

Boehringer Mannheim Biochemicals) po 1 hodinu při 4 °C. Reakční směs je aplikována na předem připravenou BioGel P10 kolonu (10 ml) (BioRad Laboratories) a je provedena chromatografie s PBS, pH 7,4. Frakce obsahující KLH-MBS konjugát jsou poolovány (2 ml) a reagují s peptidem (2 mg) po l hodinu při 4 °C. Konjugát KLH-peptid e koncentrován v Centricon 10 mikrocentrátoru (Amicon) a je použit pro imunizaci. Myši a krysy jsou imunizovány cestou i.p. a přes plosku nohy v den 0, 7, 14 a 28 s 200 - 500 /zg konjugátu KLH-peptid. Konjugát je připraven v kompletním Freundově adjuvans pro primární imunizaci a v nekompletním Freundově adjuvans pro dosycovací imunizaci. Sérum je zvířatům odebráno v den 40 a je testováno na reaktivitu protilátek v solubilní IL-lR AcP EIA. Zvířatům jsou podány dosycovací imunizace (i.p., 100 gg konjugátu KLH-peptid připraveného v nekompletním Freundově adjuvans) ve 4 týdeních intervalech a titr sérových protilátek je určován dva týdny po každé imunizaci. Pokud se u zvířat vyvíjí silný titr sérových protilátek (např. 1/10⁴ ředění séra dává 50% odpověď v EIA), pak jsou podány dosycovací imunizace volného peptidu (500 μ<3, i.v.) dva následující dny. O tři dny později jsou od zvířat izolovány buňky sleziny a jsou fušovány a jsou produkovány hybridomní buňky secernující huIL-lR AcP protilátky a jsou identifikovány jak je popsáno výše.

Příklad 16

Neutralizace IL-Ιβ biologické aktivity anti-lidský IL-lR AcP protilátkami a aktivními fragmenty IL-lR AcP

Schopnost anti-lidský IL-lR AcP protilátek neutralizovat biologickou aktivitu IL-l na dávce závislým způsobem může být určena IL-l indukovaným IL-6 testem s lidskými embryonálními plicními fibroblasty MRC-5 (ATCC č. CCL-171) . MRC-5 buňky jsou umístěny na 96 jamkové plotny a předošetřeny po 1 hodinu buď stoupajícími koncentracemi anti lidský IL-lR AcP nebo aktivních fragmentů IL-lR AcP. Po předošetření jsou buňky stimulovány buď 5 pM lidského IL-Ια nebo IL-Ιβ po 24 hodin. Množství IL-6 secernované buňkami v odpovědi na IL-l je měřeno komerčně dostupným IL-6 EIA (Quantikine Assay for Human IL-6, R and D Systems, Minneapolis, MN) . Inhibiční účinky protilátek a aktivních fragmentů IL-lR AcP sou kalkulovány určením snížení sekrece IL-6 za přítomnosti nebo za absence inhibitorů. Například, 5 pM a 100 pM IL-Ιβ stimuluje sekreci přibližně 8100 a 9800 pg/ml IL-6, v příslušném pořadí, u MRC-5 buněk (obrázek 17). Antagonista IL-1 receptorů (IL-lRA) a anti-lidský typ 1 IL-lR protilátka 4C1 blokuje tuto sekreci IL-6 v odpovědi na IL-Ιβ (obr. 17). Pro IL-1RA a 4C1 bylo IC_so pro blokování 5 pM IL-Ιβ 200 pM a 0,025 ^g/ml, v příslušném pořadí, (obr. 17). Inhibice IL-1RA a 4C1 může být zrušena zvýšením koncentrace IL-Ιβ na 100 pM. Při 100 pM IL-Ιβ byly IC_so ro IL-1RA a 4C1 inhibici >1 nM a 10 ^g/ml, v příslušném pořadí. Tato data demonstrují, že IL-1 indukovaná IL-6 odpověď u MRC-5 buněk byla specifická pro IL-1 a typ-1 IL-lR dependentní odpovědi,stejně jako IL-1 dependentní odpovědi u myších buněk jsou také dependentní na typu 1 receptorů (obr. 6, 7 a 8) . Tyto IL-1 biologické testy s myšími buňkami vedly k identifikaci neutralizačních anti-myší IL-lR AcP protilátek. Obdobně, IL-1 biologický test s MRC-5 buňkami může být použit pro identifikaci neutralizačních anti-lidský IL-lR AcP protilátek a aktivních fragmentů IL-lR AcP.

Claims (35)

1. IPettent-Oves rr sL r? o Lr y

   1. Polynukleotid, který kóduje vedlejší protein IL-1 receptoru nebo jeho aktivní fragment.
2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, který obsahuje DNA sekvenci vybranou z:

   A) polynukleotidu mající v podstatě sekvenci (SEQ ID NO:

   1); nebo

   B) polynukleotidu, který hybridizuje s DNA podle A) za středně přísných podmínek; nebo

   C) polynukleotidu, který se odlišuje v sekvenci kodonů díky degeneraci genetického kódu.
3. 3. Polynukleotid podle nároku 1 nebo nároku 2, který kóduje vedlejší protein lidského IL-1 receptoru.
4. 4. Polynukleotid podle nároku 3, který kóduje protein lidského IL-1 receptoru mající aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3) nebo jeho aktivní fragment.
5. 5. Polynukleotid podle nároku 4, který má sekvenci (SEQ ID NO: 1).
6. 6. Polynukleotid podle nároku 1 nebo nároku 2, který kóduje solubilní vedlejší protein IL-1 receptoru.

   113
7. 7. Polynukleotid podle nároku 6, který kóduje solubilní vedlejší protein lidského IL-l receptorů.
8. 8. Polynukleotid podle nároku 7, který kóduje solubilní protein lidského IL-1 receptorů, který má aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 9) nebo jeho aktivní fragment.
9. 9. Polynukleotid podle nároku 8, který má sekvenci (SEQ ID NO: 7).

   9a. Polynukleotid jak je definován v kterémkoliv z nároků 1-9 kódující fúsní protein obsahující vedlejší protein IL-1 receptorů a imunoglobulin.
10. 10. Polynukleotid podle nároku 1 nebo 2, který je antisense polynukleotid.
11. 11. Vektor, který obsahuje polynukleotid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10.
12. 12. Vektor podle nároku 11, který je expresní vektor.
13. 13. Hostitelská buňka, která obsahuje vektor podle nároku 11 nebo nároku 12.
14. 14. Vedlejší protein IL-1 receptorů nebo jeho aktivní fragment.
15. 15. Protein podle nároku 14 kódovaný polynukleotidem jak je definován v nároku 2.

    114
16. 16. Protein podle nároku 14 nebo 15, který je vedlejší protein lidského IL-1 receptoru.
17. 17. Protein podle nároku 16, který má aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 3).
18. 18. Protein podle nároku 14 nebo 15, který je solubilní vedlejší protein lidského IL-1 receptoru.
19. 19. Protein podle nároku 18, který má aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 9).

    19a. Fúsní protein obsahující vedlejší protein IL-1 receptoru jak je definován v jakémkoliv z nároků 14 - 19 a imunoglobulin.
20. 20. Protein podle jakéhokoliv z nároků 14 až 19 nesoucí jednu nebo více vedlejších skupin, které byly modifikovány.
21. 21. Protilátka, která se specificky váže na vedlejší protein lidského IL-1 receptoru a brání aktivaci IL-1 receptorového komplexu IL-1.
22. 22. Protilátka podle nároku 21, která je monoklonální protilátka.
23. 23. Protilátka podle nároku 21 nebo nároku 22, která má vazebnou afinitu k vedejŠímu komplexu IL-1 receptoru od asi K 0,1 nM do asi K 10 nM.
24. 24. Farmaceutická kompozice, která obsahuje sloučeninu podle

    115 jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
25. 25. Farmaceutická kompozice podle nároku 24 v kombinaci s jedním nebo více antagonisty cytokinů.
26. 26. Způsob pro přípravu vedlejšího proteinu IL-1 receptoru vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

    (a) expresi polypeptidu kódovaného DNA podle jakéhokoliv z nároků l až 10 ve vhodném hostiteli, (b) izolaci uvedeného vedejšího proteinu IL-1 receptoru, a (c) pokud je to žádoucí, tak jeho konvertování na analog, kde je jedna nebo více vedlejších skupin modifikována.
27. 27. Způsob pro přípravu protilátky k vedlejšímu proteinu IL-l receptoru vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

    (a) přípravu hybridomní buněčné linie produkující monoklonální protilátku, která se specificky váže na vedlejší protein IL-1 receptoru a (b) produkci a izolaci monoklonální protilátky.
28. 28. Sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 připravenou způsobem podle nároků 26 nebo 27.
29. 29. Sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 pro použití jako terapeuticky aktivní substance.

    116
30. 30. Sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 pro použití v léčbě zánětlivých nebo imunitních odpovědí a/nebo pro regulaci a zabránění zánětlivých nebo imunologických aktivit Interleukinu - 1.
31. 31. Sloučenina podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 v léčbě akutních a chronických oemocnění, preferovaně revmatoidní artritidy, zánětlivých střevních chorob, septického šoku, rejekce transplantátu, psoriasy, astmatu typu 1 diabetů nebo v léčbě nádorů, preferovaně akutní a chronické myeloidní leukemie.
32. 32. Použití sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 pro výrobu léčiv pro kontrolu nebo prevenci onemocnění.
33. 33. Použití sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 pro výrobu léčiv pro léčbu zánětlivých nebo imunitních odpovědí a/nebo pro regulaci a zabránění zánětlivých nebo imunologických aktivit interleukinu - 1.
34. 34. Použití sloučeniny podle jakéhokoliv z nároků 10 a 14 až 23 pro výrobu léčiv pro léčbu nebo profylaxi revmatoidní artritidy, zánětlivých střevních chorob, septického šoku, rejekce transplantátu, psoriasy, astmatu typu 1 diabetů nebo pro léčbu nebo profylaxi nádorů, preferovaně akutní a chronické myeloidní leukemie.
35. 35. Nové sloučeniny, kompozice, procesy a jejich použití jak je zde popsáno.