CZ2020342A3

CZ2020342A3 - Způsob přípravy léčiva transfer faktor, léčivo transfer faktor, metodika testování biologické účinnosti, léková forma a její použití

Info

Publication number: CZ2020342A3
Application number: CZ2020342A
Authority: CZ
Inventors: Juraj Vronka; Juraj RNDr Vronka
Original assignee: AUMED, a.s.
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2021-12-22
Also published as: WO2021249581A1; EP4072569A1

Abstract

Způsob přípravy léčiva transfer faktor, léčivo transfer faktor, metodika testování biologické účinnosti, léková forma a její použití, kde způsob přípravy léčiva z leukocytů periferní krve, vychází z jednotlivých kroků a) z připraveného leukocytárniho koncentrátu, b) dialýzy a nebo ultrafiltrace, c) odstranění solí a koncentrace nanofiltrací, d) tepelné inaktivace, e) formulace tablety a f) přípravy lyofilizované tablety, přičemž krok odstranění solí nanofiltrací z produktu a koncentrace produktu nanofiltrací spočívá v tom, že získaný dialyzát se zbavuje nežádoucích solí a zároveň se koncentruje nanofiltrací na požadovaný objem. Použití transfer faktoru je ve formě lyofilizované tablety k podání do ústní dutiny, při kterém lyofilizovaná tableta bezprostředně adheruje ke sliznici, tím je zabráněno jejímu polknutí a je rychle na bukální sliznici rozpuštěna, přičemž se dostane přímo do trávicího systému jako humánni nebo veterinární léčivo nebo doplněk stravy či profylaktický přípravek.

Description

Způsob přípravy léčiva transfer faktor, léčivo transfer faktor, metodika testování biologické účinnosti, léková forma a její použití

Oblast techniky

Technické řešení se týká zásadních modifikaci v technologii přípravy transfer faktoru, metody testování jeho biologické účinnosti a technologie přípravy nové lékové formy transfer faktoru ve formě lyofilizované tablety definovaného složení.

Dosavadní stav techniky

Od padesátých a šedesátých let dvacátého století je známý přenosový faktor (transfer faktor), schopný přenést imunologickou reaktivitu dárce na příjemce. Jedná se o směs biologicky Aktivních nízkomolekulámích látek, získaných dialyzací homogenátu bílých krvinek (leukocytů).

Transfer faktor lze získat různými metodami, nej častěji je popisována dialýza nebo ultrafiltrace směsi leukocytů periferní krve (lidské nebo zvířecí).

Stav techniky popisují např. dokumenty EP2037949 [Sevapharma A.S., CZ] a dokumenty téže patentové rodiny, např. WO2007143957 a CZ2006377.

Dosavadní stav techniky popisuje tyto výrobní technologické kroky:

a) Příprava leukocytámího koncentrátu

b) Dialýza a/nebo ultrafiltrace

c) Koncentrace lyofilizací

d) Příprava roztoku surového léčiva

e) Mezioperační zkoušky

f) Homogenizace

g) Předfiltrace

h) Ultrafiltrace

i) Sterilizující filtrace

j) Tepelná inaktivace

k) Rozpínání

1) Lyofilizace

Dosud vyráběné transfer faktory jsou připravovány buď jako tekuté přípravky nebo ve formě prášku, získaného lyofilizací nebo jinou formou sušení. Jejich bezpečnost je zajištěna několika metodami; nej častěji tepelným ošetřením (pasterizací při definované teplotě a délce trvání) nebo různými stupni filtrací (např. sterilizující filtrace) a testy vstupní suroviny na nepřítomnost patologických mikroorganizmů. Výstupem všech dosud popsaných postupů je tekutá nebo prášková forma transfer faktorů, kterou lze aplikovat buď injekčně (podkožně nebo intravenózně) nebo jako perorálně podané přípravky (např. roztoky) do zažívacího traktu.

Biologická účinnost dosud vyráběných transfer faktorů je prokazována testováním in vivo na zvířecích modelech nebo in vitro sledováním jejich vlivu na cytokinové a jiné buněčné aktivity.

Vyráběné přípravky na bázi transfer faktorů vykazují tyto nevýhody:

- při injekčním podání mají velkou bolestivost, která je přímo úměrná aplikovaným objemům;

- parenterální přípravky musí být vyráběny jako sterilní přípravky;

- biologický účinek transfer faktorů, podávaných perorálně do zažívacího traktu, je snižován

- 1 CZ 2020 - 342 A3 agresivním prostředím zažívacích orgánů.

Vynález řeší všechny tyto nevýhody modifikací technologie výroby a technologií přípravy transfer faktoru ve formě lyofilizované tablety definovaného složení.

Popis vynálezu

Způsob výroby zahrnuje následující technologické kroky:

a) Přípravu leukocytámího koncentrátu

b) Dialýza nebo ultrafiltrace

c) Odstranění solí a koncentrace nanofiltrací

d) Tepelná inaktivace

e) Formulace tablety

f) Příprava lyofilizované tablety

Tři technologické kroky: příprava leukocytámího koncentrátu (transport, skladování, příprava homogenátu), technologie přípravy účinné látky (dialýza nebo ultrafiltrace) a tepelná inaktivace probíhají dle současného stavu techniky.

Známým způsobem získaná účinná látka (dialyzát nebo ultrafiltrát) obsahuje vedle biologicky účinných složek velké množství balastu ve formě solí. Tyto sole mají buď fyziologický původ (přirozené komponenty krevních složek) nebo umělý (protisrážlivé látky, přidávané do krve při jejím odběru). Zároveň tento materiál obsahuje nežádoucí vysoký obsah vody.

Vynález spočívá zejména v zařazení následujících nových kroků při způsobu přípravy léčiva transfer faktor:

odstranění přebytečných solí a přebytečného obsahu vody použitím technologie nanofiltrace přes membránu o vhodné porozitě;

přípravu lyofilizované tablety obsahující transfer faktor jako účinnou látku;

aplikaci účinné látky perorálně ve formě lyofilizované tablety, která se nepolyká a působí přes bukální sliznici;

test biologické účinnosti přípravku, založený na sledování proliferačního efektu na tkáňovou kulturu.

Popis jednotlivých kroků

a) Příprava leukocytámího homogenátu;

Leukocytámí koncentráty od jednotlivých dárců jsou transportovány a skladovány ve zmraženém stavu. Po rozmražení při teplotě do +37 °C se surovina získaná od jednotlivých dárců spojuje do většího objemu. Práce musí probíhat ve výrobních prostorách s definovanou třídou čistoty prostředí. Následně se v leukocytámím homogenátu rozmší všechny membránové komponenty metodou opakovaného zmrazování a rozmrazování, popřípadě rozrušením buněk ultrazvukem, nebo kombinací obou postupů.

al) Příprava homogenátu metodou zmrazení - rozmražení:

Zmrazování se provádí v lázni denaturovaného etylalkoholu při minimální teplotě -35 °C na

- 2 CZ 2020 - 342 A3 rotačních zmrazovacích zařízeních. Rozmrazování se provádí ve vodní lázni při teplotě maximálně +37 °C. Celý cyklus mrazení a rozmrazování se opakuje 6 x. Po ukončení 6. cyklu se homogenát ponechaný v původních lahvích uloží do mrazicího pultu při teplotě min. -17 °C do dalšího zpracování.

a2) Příprava homogenátu pomocí ultrazvuku:

Leukocytámí homogenát se po rozmražení připraví rozrušením buněk ultrazvukem při 20 kHz po dobu 10 minut při teplotě +2 °C až +8 °C. Po této době dezintegrace se získaný homogenát uloží do mrazicího pultu při teplotě min. -17 °C až do dalšího zpracování.

a3) Příprava homogenátu kombinovanou metodou:

Jako alternativní postup výroby se používá kombinovaný postup homogenizace leukocytů. Cyklus zmrazení a rozmražení se opakuje 5 x s následnou dezintegrací ultrazvukem při 20 kHz po dobu 3 minut při teplotě +2 °C až +8 °C. Po této dezintegraci se získaný homogenát uloží do mrazícího pultu při teplotě min. -17 °C až do dalšího zpracování.

U všech teplot uváděných v tomto výrobním kroku by neměl být jejich výkyv větší než 30 °C na obě strany teplotní stupnice a čas by neměl být jiný než v řádu minut.

b) Dialýza

Zpracování leukocytámího homogenátu se provádí v uzavřeném systému na dialyzační koloně. V případě, že leukocytámí homogenát byl před dalším zpracováním zmražen, rozmrazí se ve vodní lázni max. +37 °C teplé. Teplota může být i nižší (do + 4 °C). Je výhodou, pokud se od definované teploty neliší o více než ±33 °C.

Dialýza homogenátu probíhá jako dialýza v uzavřeném systému.

Dialýza se provádí na dialyzační jednotce z umělé ledviny obsahující membránu, zadržující částice o relativní molekulové hmotnosti větší než 10 000. Dialýza se provádí za snížené teploty +2 °C až +8 °C. Tato teplota nemá být odlišná o více než 20 °C. Objem homogenátu leukocytámího koncentrátu zpracovaného v jednom cyklu se pohybuje s výhodu od 1,4 do 2,4 1. Neměl by být vyšší než desítky litrů a menší než 0,2 litru. Množství vody na injekci potřebné k dialýze nízkomolekulámích látek v rozmezí teplot +2 °C až +8 °C se pohybuje v rozmezí 8 až 13 1. Toto množství vody může být při použití jiných teplot různé, nemělo by být jiném objemovém řádu, než jsou litry.

Je výhodou, pokud při vlastním průběhu dialýzy dezintegrovaný leukocytámí koncentrát pomocí čerpadla koluje přes dialyzační jednotku okruhem o průtoku 1,2 až 2,0 1 / hod. a voda na injekci jako dialyzační medium přes stejnou dialyzační jednotkou druhým okruhem rychlostí 0,4 až 0,5 1/hod. Za těchto podmínek se pohybuje doba dialýzy v rozmezí 24 hodin ±4 hod. Pokud jsou v procesu použité jiné cirkulační rychlosti, musí se úměrně upravit i doba dialýzy. Dialýza se ukončí, když hodnota absorbance dialyzátu klesne pod 0,6 při 260 nm. Tato hodnota je doporučená, může být i odlišná.

Obdobným způsobem lze postupovat v případě, že je dialýza nahrazena ultrafiltrací.

c) Odstranění solí a koncentrace nanofiltrací

V tomto výrobním kroku se získaný dialyzát zbavuje nežádoucích solí a zároveň se koncentruje nanofiltrací na požadovaný objem. V tomto výrobním kroku jde především o to, že získaný dialyzát, který obsahuje pro další zpracování příliš velký objem solí a vody musí být odsolen a zakoncentrován tak, aby byl přímo použitelný pro konstrukci lyofilizované tablety, tedy bez další

- 3 CZ 2020 - 342 A3 nutnosti dořeďování nebo zahušťování nebo obohacování nebo jakékoliv jiné dodatečné úpravy získaného roztoku. Metody zahušťování mohou být různé. Použitá metoda řeší dva technologické požadavky: šetrným postupem, zbavuje produkt solí a nežádoucího nadměrného objemu vody. Proti tepelnému namáhání je produkt chráněn chlazením celého procesu. Teplota při nanofiltraci by neměla překročit +30 °C a je výhodou, když se tato teplota, pohybují v rozsahu 14 až 25 °C a zpracovávaný objem tekutiny není větší než 50 litrů a menší než 5 litrů. Ideální objem se pohybuje kolem 15 litrů. Pracovní tlak na filtru je 20 bar ±5 bar. Vždy je třeba se vyhnout statickému protitlaku na straně permeátu. Filtrace se provádí systémem maximálního oddělení permeátu z filtrovaného vzorku. Zbývající vzorek je ve filtračním zařízení přímo naředěný demineralizovanou vodou v množství odebraného permeátu. Po promíchání takto naředěné tekutiny následuje vlastní filtrace. Tento postup se opakuje 4x. Pro nanofiltraci se s výhodou používá polyamidový tenkovrstvý kompozit jako membrána o porozitě umožňující propustnost do lOOODa. Předmětem patentové ochrany v tomto výrobním krokuje krok odstranění přebytečných solí a vody popsanou metodou nanofiltrace.

d) Tepelná inaktivace

Pro bezpečnost produktu je třeba zajistit jeho inaktivaci. Transfer faktor je tepelně inaktivován pasterizací při +60 °C po dobu 10 hodin ve vodní lázni. Popsaný postup zaručuje, že produkt je bezpečný a zároveň je natolik šetrný, že nezpůsobí jeho poškození. Tento technologický krok probíhá rovněž dle současného stavu techniky.

e) Formulace matrice tablety

Z hlediska obsahu zahušťovadel a plnidel má tableta toto definované složeni:

Formulace jedné tablety reprezentuje tyto komponenty:

Dextranum 40 0,05 g (C6H10O5)n lota karagenan 0,0015 g (P-3-D-galaktosa-4-sulfát; 3,6-anhydrid-a-D-galaktosa-2-sulfát)

Macrogolum 300 0,005 g (Polyethylenglycolum 300)

Saccharinum natricum 0,0003333g (Sodná sůl l,l-dioxid-l,2-benzothiazol-3(2H)-onu; C7H4NNaO3S)

Účinná látka (transfer faktor) 1 léčivá dávka

Aqua purificata ad 0,5 g

Vlastní příprava tablet:

Předem se připraví roztok účinné látky (transfer faktoru) tak, aby jedna dávka byla rozpuštěna v 0,25 ml vody v kvalitě „voda pro injekce.

Následuje příprava vlastní matrice:

0,0015 g karagenanu iota se rozpustí za zvýšené teploty ve vodní lázni (60 °C) v 0,17 g čištěné vody. K tomuto roztoku se přidá 0,05 g dextranu 40 a mícháním se rozpustí. K urychlení rozpouštění dextranu lze použít ultrazvukovou lázeň po dobu 1 min nebo lze směs udržovat mírně zahřátou ve vodní lázni (40 °C).

- 4 CZ 2020 - 342 A3

Po ochlazení na laboratorní teplotu se přidá 0,005 g makrogolu 300 a 0,0003 g sodné soli sacharinu, doplní se čištěnou vodou na 0,25 g a míchá se do rozpuštění všech složek. Následně se matrice smísí s předem připraveným roztokem TFI. Následuje dávkování po 0,5 ml do blistru, který slouží jako primární obal lyofilizované tablety. Předmětem vynálezu v tomto výrobním krokuje matrice tablety.

f) Příprava lyofilizované tablety

Dle předpisu pro formulaci jedné tablety se připraví roztok matrice tablet a vhodným dávkovacím zařízením se tento roztok rozplní přímo do jednotlivých jamek blistrů po 0,5 ml.

Před rozplněním přípravku do blistrů se lyofilizační zařízení nastaví do modu vymražení desek do nadefinované teploty -50 °C. Vymražení desek do této teploty proběhne do cca 2 hodin.

Po dosažení požadované teploty -50 °C se na vymražené desky lyofilizačního zařízení založí blistry s rozplněným materiálem. Následně se lyofilizační zařízení přepne do modu primárního sušení (sublimace), nastaví se hodnoty pro vymražení kondenzátoru na hodnotu -55 °C a hodnotu vakua na 0,3 mbar. Po dosažení nastavené teploty kondenzátoru -55 °C se spustí lyofilizační proces.

Lyofilizační sušící proces lze nastavit v automatickém nebo poloautomatickém režimu.

V automatickém režimu nelze zasahovat do nastavených parametrů po celou dobu lyofilizace, poloautomatický režim umožňuje v případě potřeby upravovat a přepínat jednotlivé fáze (vymražení, primární sušení, sekundární sušení) ručním ovládáním. Po 2 hodinách se proces lyofilizace mění do modu sekundárního sušení (desorbce).

Teplota desek se nastaví na hodnotu -30 °C, vakuum na 0,005 mbar. V dalším postupu se teplota desek vždy po 1 hodině snižuje postupně na -20 °C, -10 °C, 0 °C, +10 °C a +25 °C. Celý lyofilizační proces se ukonči maximálně do 24 hodin od jeho zahájení. Reálný čas ukončení lyofilizace se odvíjí od dosažení popsaných teplotních hodnot desek a hodnot vakua. Po ukončení lyofilizace se lyofilizační zařízení zavzdušní, blistry s vysušeným produktem se vyjmou a na blistrovacím zařízení uzavřou zatavovací krycí fólii. Předmětem vynálezu v tomto výrobním krokuje příprava lyofilizované tablety.

Výše uvedeným způsobem je připraveno léčivo transfer faktor, z leukocytů periferní krve, obsahující bílkovinné složky a složky nukleových kyselin, jejichž poměr v léčivu vyjadřuje index absorbance, což je poměr získaný spektrofotometrickým měřením absorbance v UV oblasti při 260 nm a 280 nm. Tento index nesmí mít hodnotu menši než 1,7 s výhodu v rozpětí 1,7 až 2,1. Léčivo je zbavené balastních soli metodou nanofiltrace. Žádná ze složek léčiva nemá molekulovou hmotnost větší než 10 000 daltonů.

Léková forma podání, kterou je lyofilizovaná tableta. V jedné lyofilizované tabletě je obsažena jedna léčivá dávka přípravku, která představuje množství biologicky aktivních látek získaných z cca 200 milionů periferních leukocytů, schopných normalizovat porušenou buněčnou imunitu příjemce. Lyofilizovaná tableta se vyrábí lyofilizací tekuté matrice. Tekutá matrice se vyznačuje hodnotou osmolality v rozpětí 150 až 400 mmol/kg. V lyofilizované tabletě lze prokázat účinnost biologicky aktivních látek.

Test biologické účinnosti

Test biologické účinnosti je založený na sledování účinku transfer faktoru na viabilitu modelové buněčné linie po jejím předchozím ovlivnění imunosupresivní látkou azathioprinem.

Jako modelová buněčná linie se používá imortalizovaná T- lymfocytámí buněčná linie Jurkat CCL81. Viabilita buněk je měřena na průtokovém cytometru s použitím komerčního MTT testu. MTT

- 5 CZ 2020 - 342 A3 měří metabolickou aktivitu buněk a je tak vhodný pro stanovení buněčné viability. Test je založen na redukci tetrazoliové soli MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazolium bromid) na nerozpustný formazan. Množství vytvořeného formazanu je pak přímo úměrné počtu živých buněk.

Buněčná linie Jurkat je kultivována v RPMI médiu obohaceném 10 % fetálního bovinního séra, 2 mM glutaminu a směsi penicilín (1001/ml) -streptomycin (100 pg/ml). Pro supresi modelové buněčné linie se použije azathioprin o koncentraci 5 pg/ml.

Pro test biologické účinnosti se přidá transfer faktor ředěný 80 až 160 krát. Inkubace buněk probíhá po dobu 72 h. Po této době inkubace se ke každé jamce v destičce přidá 20 μΐ zásobního roztoku MTT (5 mg/ml) a destička je nadále inkubována 3 h při 37 °C. Poté se odstraní supernatant a vytvořené krystalky formazanu se solubilizují ve 150 μΐ dimethylsulfoxidu. Výsledná optická denzita roztoků se měří při 570 nm na destičkovém spektrofotometru a vyhodnocuje se jako viabilita buněk.

Při vlastním testuje výhodné použít tyto srovnávací skupiny:

Kontrolní skupina - samotné neovlivněné Jurkat buňky;

Jurkat buňky suprimované azathioprinem;

Jurkat buňky ovlivněné transfer faktorem;

Jurkat buňky suprimované azathioprinem a následně ovlivněné transfer faktorem.

Vyhodnocení výsledků:

Přidaný samotný transfer faktor nijak neovlivní viabilitu buněk oproti kontrolní skupině.

Vzhledem ke kontrole přidaný azathioprin sníží viabilitu buněk pod 50 % hodnoty kontrolní skupiny.

Transfer faktor v kombinaci s azathioprinem vrátí viabilitu buněk potlačenou azathioprinem o cca 40 % směrem zpět k normálu. Předmětem vynálezu v tomto výrobním kroku je in vitro test biologické účinnosti transfer faktoru.

Použití

Vynález je využitelný při komerční přípravě jakéhokoliv transfer faktoru, specifického i nespecifického, připraveného z homogenátu leukocytů periferní krve. Vynález je využitelný jak při výrobě humánního přípravku, tak i u modifikací určených pro veterinární použití.

Předmětem ochrany je i doporučené podání transfer faktoru, které spočívá v podání lyofilizované tablety do oblasti bukální sliznice.

Podání transfer faktoru v této formě zabrání spolknutí tablety, v průběhu několika sekund dojde k jejímu rozpuštění na sliznici.

Hlavní terapeutický efekt je tak zprostředkovaný průnikem léčiva pouze přes ústní sliznici.

-6CZ 2020 - 342 A3

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Způsob přípravy léčiva transfer faktor

a) Přípravu leukocytámího koncentrátu

b) Dialýza nebo ultrafiltrace

c) Odstranění solí a koncentrace nanofiltrací

d) Tepelná inaktivace

e) Formulace tablety

f) Příprava lyofilizované tablety

a) Příprava leukocytámího koncentrátu

Leukocytámí koncentráty jsou uskladněny ve zmraženém stavu. Následně se při teplotě max. +37 °C leukocytámí koncentrát spojí do pracovního objemu. Práce musí probíhat ve výrobních prostorách s definovanou třídou čistoty „C prostředí. Následně se v leukocytámím homogenátu rozruší všechny membránové komponenty metodou opakovaného zmrazování a rozmrazování, popřípadě rozrušením buněk ultrazvukem, nebo kombinací obou postupů.

a 1) Příprava homogenátu metodou zmrazení - rozmražení:

Zmrazování se provádí v lázni denaturovaného etylalkoholu při minimální teplotě -35 °C na rotačních zmrazovacích zařízeních.

Rozmrazování se provádí ve vodní lázni při teplotě maximálně +37 °C. Celý cyklus mrazení a rozmrazování se opakuje 6x. Po ukončení 6. cyklu se homogenát ponechaný v původních lahvích uloží do mrazicího pultu při teplotě min. -17 °C do dalšího zpracování.

a 2) Příprava homogenátu pomocí ultrazvuku:

Leukocytámí homogenát se po rozmražení připraví rozrušením buněk ultrazvukem při 20 kHz po dobu 10 minut při teplotě +2 °C až + 8 °C. Po této době dezintegrace se získaný homogenát uloží do mrazicího pultu při teplotě min. - 17 °C až do dalšího zpracování.

a 3) Příprava homogenátu kombinovanou metodou:

U všech teplot uváděných v tomto výrobním kroku by neměl být jejich výkyv větší než 30 C na obě strany teplotní stupnice a čas by neměl být jiný než v řádu minut.

b) Dialýza

Zpracování leukocytámího homogenátu se provádí v uzavřeném systému na dialyzační koloně. V případě, že leukocytámí homogenát byl před dalším zpracováním zmražen, rozmrazí se ve vodní lázni max. + 37 °C teplé. Teplota může být i nižší (do + 4 °C). Je výhodou, pokud se od definované teploty neliší o více než 20 °C.

- 7 CZ 2020 - 342 A3

Je výhodou, pokud při vlastním průběhu dialýzy dezintegrovaný leukocytámí koncentrát pomocí čerpadla koluje přes dialyzační jednotku okruhem o průtoku 1,2 až 2,01/hod. a voda na injekci jako dialyzační medium přes stejnou dialyzační jednotkou druhým okruhem rychlostí 0,4 až 0,5 1/hod. Za těchto podmínek se pohybuje doba dialýzy v rozmezí 24 hodin ±4 hod. Pokud jsou v procesu použité jiné cirkulační rychlosti, musí se úměrně upravit i doba dialýzy. Dialýza se ukončí, když hodnota absorbance dialyzátu klesne pod 0,6 při 260 nm. Tato hodnota je doporučená, může být i odlišná.

c) Odstranění solí a koncentrace nanofiltrací

V tomto výrobním kroku se získaný dialyzát zbavuje nežádoucích solí a zároveň se koncentruje nanofiltrací na požadovaný objem.

Cílem je, aby dialyzát, který obsahuje pro další zpracování příliš velký objem solí a vody, byl odsolen a zakoncentrován tak, aby byl přímo použitelný pro konstrukci lyofilizované tablety. Proti tepelnému namáhání je produkt chráněn chlazením celého procesu. Teplota při nanofiltrací by neměla překročit +30 °C a je výhodou, když se tato teplota, pohybují v rozsahu 14 až 25 °C a zpracovávaný objem tekutiny není větší než 50 litrů a menší než 5 litrů. Ideální objem se pohybuje kolem 15 litrů. Pracovní tlak na filtru je 20 bar ±5 bar. Vždy je třeba se vyhnout statickému protitlaku na straně permeátu. Filtrace se provádí systémem maximálního oddělení permeátu z filtrovaného vzorku. Zbývající vzorek je ve filtračním zařízení přímo naředěný demineralizovanou vodou v množství odebraného permeátu. Po promíchání takto naředěné tekutiny následuje vlastní filtrace. Tento postup se opakuje 4x. Pro nanofiltrací se s výhodou používá polyamidový tenkovrstvý kompozit jako membrána o porozitě umožňující propustnost do 1000 Da.

d) Tepelná inaktivace - tento technologický krok probíhá rovněž dle současného stavu techniky.

Pro bezpečnost produktu je třeba zajistit jeho inaktivaci. Transfer faktor je tepelně inaktivován pasterizací při +60 °C po dobu 10 hodin ve vodní lázni. Popsaný postup zaručuje, že produkt je bezpečný a zároveň je natolik šetrný, že nezpůsobí jeho poškození.

e) Formulace tablety

Velikost šarže (120 tablet)

Dextranum 40 6,0g lota karrageenan 0,18 g

Macrogolum 300 0,6g

Saccharinum natricum 0,04g

TFI 30 dávek

Aqua purificata ad 60,0 g

Předem se připraví roztok transfer faktoru (30 dávek) v 30 ml čištěné vody (případně vody na injekci). Následně se připraví matrice: 0,18 g karagenanu iota se rozpustí za zvýšené teploty ve

-8CZ 2020 - 342 A3 vodní lázni (60 °C) v 20 g čištěné vody (odpovídá celkovému množství vzorku 60 g k přípravě 120 tablet). K tomuto roztoku se přidá 6,0 g dextranu 40 a mícháním se rozpustí. K urychlení rozpouštění dextranu lze použít ultrazvukovou lázeň po dobu 1 min nebo lze směs udržovat mírně zahřátou ve vodní lázni (40 °C).

Po ochlazení na laboratorní teplotu se přidá 0,6 g makrogolu 300 a 0,04 g sodné soli sacharinu, doplní se čištěnou vodou na 30,0 g a míchá se do rozpuštěni všech složek. Vzniklá matrice se smísí s roztokem transfer faktoru

f) Příprava lyofilizované tablety

Připravená tekutá matrice tablet, obsahující účinnou látku transfer faktor se automatickou dávkovači pipetou rozplní do jednotlivých jamek blistrů po 0,5 ml. Před rozplněním přípravku TFI do blistrů se lyofilizátor nastaví do modu funkce mražení - vymražení desek do definované teploty -50 °C. Toto vymražení desek proběhne za cca 2 hodiny.

Po dosažení požadované teploty se založí blistry s rozplněnou matrici tablet na vymražené desky, lyofilizátor se přepne do modu primárního sušení (sublimace), nastaví se definované hodnoty pro vymražení kondenzátoru na hodnotu -55 °C a hodnota vakua na 0,3 mbar. Po dosažení nastavené teploty kondenzátoru se spustí lyofilizační proces. Lyofilizační proces lze nastavit v automatickém nebo poloautomatickém režimu. V automatickém režimu nelze zasahovat do nastavených parametrů po celou dobu lyofilizace. Poloautomatický režim umožňuje upravovat a přepínat jednotlivé fáze ručním ovládáním (vymražení, primární sušení, sekundární sušení).

Po cca 2 hodinách přechází lyofilizace do modu sekundárního sušení (desorbce), teplota desek se nastaví na -30 °C, vakuum na 0,005 mbar. Následně se teplota desek postupně v intervalech po 1 hodině snižuje na -20 °C, -10 °C, 0 °C, +10 °C a +25 °C.

Lyofilizační proces se ukonči maximálně do 24 hodin, čas ukončeni lyofilizace se odvíjí od dosažení nastavených hodnot desek a vakua.

Po ukončeni lyofilizace se lyofilizátor zavzdušní, blistry s lyofilizátem se vyjmou a na blistrovacím zařízení zakryjí fólii. Použité lyofilizační zařízení: LYOBETA 15

Příklad 2

Léčivo transfer faktor

Výše uvedeným způsobem je připraveno léčivo transfer faktor, z leukocytů periferní krve, obsahující bílkovinné složky a složky nukleových kyselin, jejichž poměr v léčivu vyjadřuje index absorbance, což je poměr získaný spektrofotometrickým měřením absorbance v UV oblasti při 260 nm a 280 nm. Tento index nesmí mít hodnotu menší než 1,7 s výhodu v rozpětí 1,7 až 2,1. Léčivo je zbavené balastních solí metodou nanofiltrace. Žádná ze složek léčiva nemá molekulovou hmotnost větší než 10 000 daltonů.

Příklad 3

Metodika testováni biologické účinnosti léčiva podle popsaného vynálezu

Test biologické účinnosti

Pro měření viability byl použitý průtokový cytometr Guava EasyCyte, Luminex, USA a komerční MTT test Sigma-Aldrich, USA. Pro stanoveni viability buněčné linie byl použit kit GuavaViaCount, Luminex, USA, který rozlišuje živé a mrtvé buňky na principu rozdílné permeability buněčné membrány pro DNA-vázající značky. Buněčná linie Jurkat byla kultivována v RPMI

-9CZ 2020 - 342 A3 médiu obohaceném 10 % fetálního bovinního séra, 2 mM glutaminu a směsi penicilín (100 I/ml) streptomycin (100 pg/ml).

Pro test biologické účinnosti se použije transfer faktor ředěný 80 až 160 krát. Inkubace buněk probíhá 72 h. Po této době inkubace se ke každé jamce v destičce přidá 20 μΐ zásobního roztoku MTT (5 mg/ml) a destička je nadále inkubována 3 h při 37 °C. Poté se odstraní supernatant a vytvořené krystalky formazanu se solubilizují ve 150 μΐ dimethylsulfoxidu. Výsledná optická denzita roztoků se měří při 570 nm na destičkovém spektrofotometru a vyhodnocuje se jako viabilita buněk. Optická denzita roztoku byla měřena při 570 nm na destičkovém spektrofotometru (Beckman Coulter, USA).

Při vlastním testu je výhodné použit tyto srovnávací skupiny: Kontrolní skupina - samotné neovlivněné Jurkat buňky;

Jurkat buňky suprimované azathioprinem;

Jurkat buňky ovlivněné transfer faktorem;

Vyhodnoceni výsledků:

Přidaný samotný transfer faktor nijak neovlivni viabilitu buněk oproti kontrolní skupině.

Transfer faktor v kombinaci s azathioprinem vrátí viabilitu buněk potlačenou azathioprinem o cca 40 % směrem zpět k normálu.

Příklad 4

Léková forma

Léková forma podáni, kterou je lyofilizovaná tableta. V jedné lyofilizované tabletě je obsažena jedna léčivá dávka přípravku, která představuje množství biologicky aktivních látek získaných z cca 200 milionů periferních leukocytů, schopných normalizovat porušenou buněčnou imunitu příjemce. Lyofilizovaná tableta se vyrábí lyofilizací tekuté matrice. Tekutá matrice se vyznačuje hodnotou osmolality v rozpětí 150 až 400 mmol/kg. V lyofilizované tabletě lze prokázat účinnost biologicky aktivních látek.

Léková forma je připravena způsobem:

Před rozplněním přípravku do blistrů se lyofilizační zařízeni nastaví do modu vymraženi desek do nadefinované teploty -50 °C. Vymraženi desek do této teploty proběhne do cca 2 hodin.

Po dosaženi požadované teploty -50 °C se na vymražené desky lyofilizačního zařízení založí blistry s rozplněným materiálem. Následně se lyofilizační zařízení přepne do modu primárního sušení (sublimace), nastaví se hodnoty pro vymraženi kondenzátoru na hodnotu -55 °C a hodnotu vakua na 0,3 mbar. Po dosažení nastavené teploty kondenzátoru -55 °C se spustí lyofilizační proces.

V automatickém režimu nelze zasahovat do nastavených parametrů po celou dobu lyofilizace,

- 10 CZ 2020 - 342 A3 poloautomatický režim umožňuje v případě potřeby upravovat a přepínat jednotlivé fáze (vymražení, primární sušení, sekundární sušení) ručním ovládáním. Po 2 hodinách se proces lyofilizace mění do modu sekundárního sušení (desorbce).

Teplota desek se nastaví na hodnotu -30 °C, vakuum na 0,005 mbar. V dalším postupu se teplota desek vždy po 1 hodině snižuje postupně na -20 °C, -10 °C, 0 °C, +10 °C a +25 °C. Celý lyofilizační proces se ukončí maximálně do 24 hodin od jeho zahájení. Reálný čas ukončení lyofilizace se odvíjí od dosažení popsaných teplotních hodnot desek a hodnot vakua. Po ukončení lyofilizace se lyofilizační zařízení zavzdušní, blistry s vysušeným produktem se vyjmou a na blistrovacím zařízení uzavřou zatavovací krycí fólií. Předmětem vynálezu v tomto výrobním krokuje příprava lyofilizované tablety.

Přiklad 5

Použití lékové formy

a) Použití transfer faktoru podle tohoto vynálezu jako lékové formy lyofilizované tablety k podáni do ústní dutiny, při kterém lyofilizovaná tableta bezprostředně adheruje ke sliznici, tím je zabráněno jejímu polknuti a je rychle na bukální sliznici rozpuštěna, přičemž se nedostane se přímo do trávícího systému.

b) Použití transfer faktoru podle tohoto vynálezu jako humánního nebo veterinárního léčiva.

c) Použití transfer faktoru podle tohoto vynálezu jako humánního nebo veterinárního doplňku stravy.

d) Použití transfer faktoru podle tohoto vynálezu jako humánního nebo veterinárního jako přípravku k nápravě chorobných stavů souvisejících s poruchou buněčné imunity, tedy chronické: infekce, septické stavy, atopický ekzém, recidivující mykózy, psoriázy imunodeficience spojené s onkologickou léčbou.

e) Použití transfer faktoru podle tohoto vynálezu jako humánního nebo veterinárního profylaktického přípravku.

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný při komerční přípravě jakéhokoliv transfer faktoru, specifického i nespecifického, připraveného z leukocytů periferní krve. Vynález je dále použitelný jak při výrobě humánního léčivého přípravku, tak i u léčivých přípravků určených pro veterinární použiti. Vynález je využitelný při komerční přípravě jakéhokoliv transfer faktoru, specifického i nespecifického, využitelného jako součást doplňků stravy. Přípravek získaný postupem přípravy podle vynálezu je použitelný u chorobných stavů souvisejících s poruchou buněčné imunity (chronické: infekce, septické stavy, atopický ekzém, recidivující mykózy, psoriázy; imunodeficience spojené s onkologickou léčbou). Přípravek je použitelný i profylakticky. Doporučené podáni: lyofilizovaná tableta je vložena do úst, kde dojde k jejímu ulpění na sliznici a k rychlému rozpuštění. Tableta se nepolyká.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy léčiva transfer faktor z leukocytů periferní krve, který vychází

a) z připraveného leukocytámího koncentrátu

b) dialýzy anebo ultrafiltrace, vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje následné postupné kroky:

c) Odstranění solí a koncentrace nanofiltrací;

d) Tepelná inaktivace;

e) Formulace tablety;

f) Příprava lyofilizované tablety
2. Způsob přípravy transfer faktoru podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok odstranění solí nanofiltrací z produktu a koncentrace produktu nanofiltrací spočívá v tom, že získaný dialyzát se zbavuje nežádoucích solí a zároveň se koncentruje nanofiltrací na požadovaný objem, přičemž teplota při nanofiltrací je v rozsahu 14 až 25 °C a neměla by překročit +30 °C při zpracovávaném objemu tekutiny, který není větší než 50 litrů a menší než 5 litrů ideálně kolem 15 litrů, přičemž pracovní tlak na filtru je 20 bar ±5 bar s vyloučením statického protitlaku na straně permeátu, přičemž nanofiltrace je prováděna systémem maximálního oddělení permeátu z filtrovaného vzorku dialyzátu postupem, že zbývající vzorek dialyzátu je ve filtračním zařízení přímo naředěný demineralizovanou vodou v množství odebraného permeátu, po promíchání takto naředěné tekutiny následuje vlastní ultrafiltrace, kdy tento cyklus se opakuje 4x.
3. Způsob přípravy transfer faktoru podle nároku 2, vyznačující se tím, že pro koncentraci nanofiltrací je použit polyamidový tenkovrstvý kompozit jako membrána o porozitě umožňující propustnost do 1000 Da.
4. Způsob podle nároků 1, 2 a nebo 3, vyznačující se tím, že účinná látka transfer faktor je připravena jako lyofilizovaná tableta, která sestává z: Dextranum 40, lota karagenan, Macrogolum 300, Saccharinum natricum, transfer faktor a Aqua purificata.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků:

a) příprava roztoku transfer faktoru v čištěné vodě nebo vodě na injekci;

b) příprava matrice v následujících krocích:

- karagenan iota se rozpustí za zvýšené teploty ve vodní lázni (60 °C) v čištěné vody;

- k tomuto roztoku se přidá dextran 40 a mícháním se rozpustí, přičemž k urychlení rozpouštění dextranu lze použít ultrazvukovou lázeň nebo lze směs udržovat mírně zahřátou ve vodní lázni (40 °C);

- po ochlazení na laboratorní teplotu se přidá makrogol 300 a sodná sůl sacharinu, doplní se čištěnou vodou a míchá se do rozpuštění všech složek;

c) smísení matrice s připraveným roztokem transfer faktoru;

d) dávkování do blistru, tedy primárního obalu lyofilizované tablety.

- 12 CZ 2020 - 342 A3
6. Způsob podle jakékoli kombinace předchozích nároků, vyznačující se tím, že účinná látka transfer faktor je připravena jako lyofilizovaná tableta, která je lyofilizována přímo v jamce blisteru, přičemž jedna jamka představuje jednu dávku přípravku.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že účinná látka transfer faktor je lyofilizována v blisteru po dobu 24 hodin a teplotách v rozsahu postupně od -55 °C do +25 °C a tlaku 0,005 mbar.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že lyofilizace účinné látky transfer faktor probíhá v následujících krocích:

- příprava roztoku matrice tablet;

- nastavení lyofilizačního zařízení do modu vymražení desek do nadefinované teploty -50 °C tedy vymražení desek do této teploty za cca 2 hodiny;

- rozplnění roztoku dávkovacím zařízením do jednotlivých jamek blistrů;

- založení blistrů s rozplněným materiálem po dosažení požadované teploty -50 °C na vymražené desky lyofilizačního zařízení;

- lyofilizační zařízení se přepne do modu primárního sušení (sublimace), nastaví se hodnoty pro vymražení kondenzátoru na hodnotu -55 °C a hodnotu vakua na 0,3 mbar;

- po dosaženi nastavené teploty kondenzátoru -55 °C se spustí lyofilizační proces.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že lyofilizace účinné látky transfer faktor probíhá v automatickém režimu nebo v poloautomatickém režimu, který umožňuje upravovat a přepínat jednotlivé fáze (vymražení, primární sušení, sekundární sušení) ručním ovládáním v jednotlivých krocích:

- po 2 hodinách se proces lyofilizace mění do modu sekundárního sušení (desorbce) a teplota desek se nastaví na hodnotu -30 °C, vakuum na 0,005 mbar;

- dále se teplota desek vždy po 1 hodině snižuje postupně na -20 °C, -10 °C, 0 °C, +10 °C a +25 °C;

- celý lyofilizační proces se ukončí maximálně do 24 hodin od jeho zahájení;

- lyofilizační zařízení se zavzdušní, blistry s vysušeným produktem se vyjmou a na blistrovacím zařízení se uzavřou zatavovací krycí fólií.
10. Léčivo transfer faktor připravený způsobem podle nároků 1 až 9 sestávající z dialyzátu nebo ultrafiltrátu leukocytů periferní krve zbavený balastních solí, obsahující bílkovinné složky a složky nukleových kyselin, jejichž poměr v léčivu, tedy index absorbance není menší než 1,7, ve kterém žádná ze složek léčiva nemá molekulovou hmotnost větší než 10 000 daltonů.
11. Léčivo transfer faktor připravený způsobem podle nároků 1 až 9 sestávající z dialyzátu nebo ultrafiltrátu leukocytů periferní krve zbavený balastních solí, obsahující bílkovinné složky a složky nukleových kyselin, jejichž poměr v léčivu, tedy index absorbance je v rozpětí 1,7 až 2,1, ve kterém žádná ze složek léčiva nemá molekulovou hmotnost větší než 10 000 daltonů.
12. Metodika in vitro testování biologické účinnosti léčiva transfer faktor podle kterékoli kombinace předchozích nároků, vyznačující se tím, že je prováděna sledováním účinku transfer faktoru na viabilitu modelové buněčné linie po jejím předchozím ovlivnění imunosupresivní látkou azathioprinem.

- 13 CZ 2020 - 342 A3
13. Metodika testování biologické účinnosti léčiva transfer faktor podle kterékoli kombinace předchozích nároků, vyznačující se tím, že ke sledování účinku léčiva transfer faktoru se využije imunosupresivní látka azathioprinem.
14. Metodika in vitro testování biologické účinnosti léčiva transfer faktor podle nároků 12 a 13, je prováděna v jednotlivých krocích:

- buněčná linie Jurkat je kultivována v RPMI médiu obohaceném 10 % fetálního bovinního séra, 2 mM glutaminu a směsi penicilín (1001/ml) -streptomycin (lOOpg/ml), kdy pro supresi modelové buněčné linie se použije azathioprin o koncentraci 5 pg/ml;

- pro určení biologické účinnosti se přidá transfer faktor ředěný 80 až 160 krát;

- inkubace buněk probíhá po dobu 72 h;

- ke každé jamce se na destičce přidá 20 μΐ zásobního roztoku MTT (5 mg/ml) a destička je nadále inkubována 3 h při 37 °C;

- odstraní se supernatant a vytvořené krystalky formazanu se solubilizují ve 150 μΐ dimethylsulfoxidu;

- výsledná optická denzita roztoků se měří při 570 nm na destičkovém spektrofotometru a vyhodnocuje se jako viabilita buněk.
15. Metodika in vitro testování biologické účinnosti léčiva transfer faktor podle nároků 12 až 14, je založena na použití imortalizovaná T-lymfocytámí buněčná linie Jurkat CCL-81 jako modelové buněčné linie.
16. Metodika in vitro testování biologické účinnosti léčiva transfer faktor podle nároků 12 až 16, zahrnuje krok měření na průtokovém cytometru s použitím komerčního MTT testu viability buněk pro stanovení buněčné viability,které je založeno na redukci tetrazoliové soli MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazolium bromid) na nerozpustný formazan, přičemž množství vytvořeného formazanu je pak přímo úměrné počtu živých buněk.
17. Léková forma testovaná a připravená způsobem podle nároků 1 až 16, je lyofilizovaná tableta, ve které lze prokázat účinnost biologicky aktivních látek, která je připravená lyofílizací tekuté matrice, přičemž v jedné lyofilizované tabletě je obsažena jedna léčivá dávka přípravku, která představuje množství biologicky aktivních látek získaných z cca 200 milionů periferních leukocytů, schopných normalizovat porušenou buněčnou imunitu příjemce.
18. Použití lékové formy transfer faktoru podle nároků 1-17 jako lékové formy lyofilizované tablety k podání do ústní dutiny, při kterém lyofilizovaná tableta bezprostředně adheruje ke sliznici, tím je zabráněno jejímu polknutí a je rychle na bukální sliznici rozpuštěna, přičemž se dostane přímo do trávícího systému.
19. Použití lékové formy transfer faktoru podle nároků 1-17 jako humánního nebo veterinárního léčiva.
20. Použití transfer faktoru podle nároků 1-17 jako humánního nebo veterinárního doplňku stravy.
21. Použití lékové formy transfer faktoru podle nároků 1-17 jako humánního nebo veterinárního přípravku u chorobných stavů souvisejících s poruchou buněčné imunity, tedy chronické infekce, septické stavy, atopický ekzém, recidivující mykózy, psoriázy imunodefícience spojené s onkologickou léčbou.

- 14 CZ 2020 - 342 A3
22. Použití lékové formy transfer faktoru podle nároků 1-17 jako humánního nebo veterinárního profylaktického přípravku.