CZ2015936A3 - Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití - Google Patents
Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2015936A3 CZ2015936A3 CZ2015-936A CZ2015936A CZ2015936A3 CZ 2015936 A3 CZ2015936 A3 CZ 2015936A3 CZ 2015936 A CZ2015936 A CZ 2015936A CZ 2015936 A3 CZ2015936 A3 CZ 2015936A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- conjugate
- cypate
- hyaluronic acid
- salt
- fluorescent
- Prior art date
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 75
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 59
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 45
- GRAVJJAQKJDGPM-UHFFFAOYSA-N 3-[2-[7-[3-(2-carboxyethyl)-1,1-dimethylbenzo[e]indol-3-ium-2-yl]hepta-2,4,6-trienylidene]-1,1-dimethylbenzo[e]indol-3-yl]propanoic acid;bromide Chemical compound [Br-].OC(=O)CCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)\C1=C/C=C/C=C/C=C/C1=[N+](CCC(O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C GRAVJJAQKJDGPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 claims abstract description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 59
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 37
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 34
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims description 20
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 20
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical class ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims description 17
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 17
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 12
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 12
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 11
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 9
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 8
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims description 6
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- TXXWBTOATXBWDR-UHFFFAOYSA-N n,n,n',n'-tetramethylhexane-1,6-diamine Chemical compound CN(C)CCCCCCN(C)C TXXWBTOATXBWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012048 reactive intermediate Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- FTTATHOUSOIFOQ-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4,6,7,8,8a-octahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine Chemical compound C1NCCN2CCCC21 FTTATHOUSOIFOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N h2o hydrate Chemical compound O.O JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 56
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 35
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 33
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 29
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 28
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 23
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 16
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 16
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 15
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 15
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 14
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 11
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 11
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 11
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 7
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 7
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 239000012973 diazabicyclooctane Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 5
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 4
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- RFFLAFLAYFXFSW-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1Cl RFFLAFLAYFXFSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000143 2-carboxyethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 3
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 3
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 3
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Substances ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Inorganic materials [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- OZGSEIVTQLXWRO-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trichlorobenzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl OZGSEIVTQLXWRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000914 diffusion-ordered spectroscopy Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 125000000814 indol-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C([*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 235000013980 iron oxide Nutrition 0.000 description 2
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- DUWWHGPELOTTOE-UHFFFAOYSA-N n-(5-chloro-2,4-dimethoxyphenyl)-3-oxobutanamide Chemical compound COC1=CC(OC)=C(NC(=O)CC(C)=O)C=C1Cl DUWWHGPELOTTOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 2
- 238000012633 nuclear imaging Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical compound CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- GDIYMWAMJKRXRE-UHFFFAOYSA-N (2z)-2-[(2e)-2-[2-chloro-3-[(z)-2-(1,3,3-trimethylindol-1-ium-2-yl)ethenyl]cyclohex-2-en-1-ylidene]ethylidene]-1,3,3-trimethylindole Chemical compound CC1(C)C2=CC=CC=C2N(C)C1=CC=C1C(Cl)=C(C=CC=2C(C3=CC=CC=C3[N+]=2C)(C)C)CCC1 GDIYMWAMJKRXRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-O 1H-indol-1-ium Chemical compound C1=CC=C2[NH2+]C=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHXNZYCXMFBMHE-UHFFFAOYSA-N 3-bromopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCBr DHXNZYCXMFBMHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGMGHALXLXKCBD-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(2-aminophenyl)benzamide Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1N QGMGHALXLXKCBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMAUSUKGZFZKBA-UHFFFAOYSA-N 5,5,6-trimethylheptane-1,6-diamine Chemical compound CC(C)(N)C(C)(C)CCCCN OMAUSUKGZFZKBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- DGGGLKYJYNKTDI-UHFFFAOYSA-N [Br-].C(=O)(O)CC[NH+]1C(C(C=2C3=C(C=CC1=2)C=CC=C3)C)(C)C Chemical compound [Br-].C(=O)(O)CC[NH+]1C(C(C=2C3=C(C=CC1=2)C=CC=C3)C)(C)C DGGGLKYJYNKTDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- -1 carboxylic acid fatty acid Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 201000009019 intestinal benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- QQIQAVJARACLHE-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[(2z)-2-[(2z)-2-[2-chloro-3-[(e)-2-[3,3-dimethyl-1-(4-sulfonatobutyl)indol-1-ium-2-yl]ethenyl]cyclohex-2-en-1-ylidene]ethylidene]-3,3-dimethylindol-1-yl]butane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=CC=C2C(C)(C)\C1=C/C=C\1C(Cl)=C(\C=C\C=2C(C3=CC=CC=C3[N+]=2CCCCS([O-])(=O)=O)(C)C)CCC/1 QQIQAVJARACLHE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- IRYJRGCIQBGHIV-UHFFFAOYSA-N trimethadione Chemical compound CN1C(=O)OC(C)(C)C1=O IRYJRGCIQBGHIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
- A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
- A61K49/1821—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles
- A61K49/1824—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles
- A61K49/1827—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle
- A61K49/1851—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle having a (super)(para)magnetic core coated or functionalised with an organic macromolecular compound, i.e. oligomeric, polymeric, dendrimeric organic molecule
- A61K49/1863—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles having a (super)(para)magnetic core, being a solid MRI-active material, e.g. magnetite, or composed of a plurality of MRI-active, organic agents, e.g. Gd-chelates, or nuclei, e.g. Eu3+, encapsulated or entrapped in the core of the coated or functionalised nanoparticle having a (super)(para)magnetic core coated or functionalised with an organic macromolecular compound, i.e. oligomeric, polymeric, dendrimeric organic molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or derivative thereof, e.g. chitosan, chitin, cellulose, pectin, starch
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
Abstract
Řešení se týká fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové obsahující cypát nebo jeho soli, hydrofobizovaného konjugátu, způsobů jejich přípravy a použití při medicínských aplikací pro in vivo zobrazování a léčbu novotvarů.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká fluorescenčního esterového konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli, obsahující in vivo diagnostikovatelné heptamethinové indocyaninové barvivo (Cypát) podle vzorce III neboli l-[3-(2-karboxyethyl)-l,l-dimethyl-5,9b-dihydrobenzo[e]indol-3-ium2-yl(chlorid)]-okta-l,3,5,7-tetraenyl]-l,l-dimethyl-2H-benzo[e]indol-3-yl]propanovou kyselinu. Dále je popsán hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a jejich použití pro in vivo zobrazovací aplikace a léčbu novotvarů.
Dosavadní stav techniky
Kyselina hyaluronová
Kyselina hyaluronová nebo její sůl (HA) je lineární polysacharid, jenž patří mezi významné zástupce glykosaminoglykanů. Ze strukturního hlediska se jedná o biopolymer tvořený opakujícími se disacharidovými jednotkami </?-(l—>4) glykosidická vazba), sestávajícími se z kyseliny D-glukuronové a V-acetyl-D-glukosaminu, navzájem propojenými /?-(l—>3) glykosidickou vazbou (viz vzorec 1 níže).
Vzorec 1. Kyselina hyaluronová
Ve fyziologickém prostředí se kyselina hyaluronová vyskytuje převážně ve formě sodné soli jako velmi hydrofilní a vysoce hydratovaný biopolymer (Schanté C. E; et al., Carbohydr. Polym. 2011, 85 (3), 469-489). HA hraje důležitou roli ve struktuře a organizaci extracelulární matrix a vytváří také vhodné prostředí pro buňky, jejich proliferaci, diferenciaci a mobilitu (D'Este M.; et al., Carbohydr. Polym. 2014,108, 239-246; Schanté, C. E.; et al., F. Carbohydr. Polym. 2011, 85 (3), 469-489). U obratlovců se dále nachází ve všech tělních orgánech a extracelulární matrix měkkých pojivových tkání (Eenschooten, C.; et al., Carbohydr. Polym. 2010, 79 (3), 597-605).
* · · · • · · · · ·« • · · · · · ·
Tento ve vodě rozpustný polysacharid je možno relativně dobře podrobit chemické modifikaci a jeví se jako velmi vhodná biomolekula pro konjugaci s jinými sloučeninami, včetně fluorescenčních látek. Předností HA je navíc také existence několika jejich buněčných receptorů, což může být využito pro specifické cílení derivátů např. do nádorových tkání (Garg H. G.; et al., Chemistry and biology ofhyaluronan, lst ed.; Elsevier: Nizozemsko, 2004).
In vivo diagnostika
V současné době je vedle nukleárních zobrazovacích technik, rentgenové radiografie a počítačové tomografie jednou z vhodných metod pro neinvazivní diagnostiku optické zobrazování prostřednictvím fluorescence. Fluorescence se jeví jako slibná metoda pro in vivo diagnostiku, především díky její relativně vysoké senzitivítě, specifitě a zisku obrazu v reálném čase (Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem. 2008,19 (1), 225-234). Výhodou fluorescenčního zobrazování jsou také poměrně nízké náklady, nenáročnost, neinvazivnost a bezpečnost ve srovnání s ionizujícím zářením. Tato technika je velmi perspektivní pro detekci, diagnostiku a prevenci v nádorové terapii, ale také jako doplňující metoda k získání komplexních informací v klinických aplikacích při zobrazování pomocí pozitronové emisní tomografie (PET, z angl. „positron emission tomography“), jednofotonové emisní výpočetní tomografie (SPÉCT z angl. „single-photonemission computed tomography“) nebo magnetické rezonance (MRI, z angl. „magnetic resonance imaging“), (Ye, Y.; et al., Theranostics 2011, 7, 102-106).
Při aplikaci neinvazivních diagnostických metod je penetrace záření tkáněmi vysoce závislá na jejich absorpčních vlastnostech a refraktivním indexu (Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7 (5), 626-634). Za optimální se považují absorpční a emisní vlnové délky pohybující se v oblasti 650 - 900 nm, tedy záření z blízké infračervené oblasti (NIR, z angl. „near-infrared“). Ve srovnání s kratšími vlnovými délkami viditelného spektra záření tyto vlnové délky penetrují hlouběji, zároveň nedochází k jejich absorbci endogenními fluorofory a ke vzniku nežádoucí autofluorescence (Kobayashi, H.; et al., Chem. Rev. 2010,110, 26202640, Luo, S. et al.; Biomaterials 2011, 32 (29), 7127-7138).
NIR fluorescenční látky
V současné době mezi významné exogenní kontrastní látky patří cyaninová fluorescenční barviva, deriváty squarinu, ftalocyaniny, porfyriny a také některé látky odvozené od borondipyrromethenu (BODIPY) (Luo, S.; et al., Biomaterials 2011, 32 (29), 7127-7138).
• · • « · ·
Jednou z velmi frekventovaných látek používaných pro zobrazovací optické metody jsou cyaninová barviva. Strukturně se jedná většinou o dvě heterocyklické struktury, kdy jeden z těchto heterocyklů nese kladně nabitý atom dusíku, a dále jsou navzájem spojené polymethinovým můstkem, znázorněném v obecném vzorci cyaninové fluorescenční látky, kde
X-(CH = CH)„-CH = Y
X a Y jsou heterocyklické dusíkaté struktury a η = 1 - 3, Pokud n = 1, barviva se řadí mezi tricyaninové, n - 2 pentacyaninové a n = 3 heptacyaninové sloučeniny.
Obecně délka polymethinového můstku determinuje fluorescenční vlastnosti daného derivátu a s každým narůstajícím n dochází k nárůstu absorbčních a emisních vlnových délek sloučenin přibližně o 100 nm. Typické vlnové délky pro trimethinová barviva se pohybují okolo 500 nm, pro pentamethinová je to okolo hodnot 600 nm a heptamethinové deriváty dokonce dosahují vlnových délek až blízké infračervené oblasti. Batochromní a hypsochromní posun vlnových délek je dále z části ovlivněn typem heterocyklické struktury, jež také determinuje absorbanci a jas fluorescenčního barviva (Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2. vyd.; Elsevier: Spojené státy americké, 2008).
Konjugáty NIRfluorescenčních látek s různými molekulami
V minulosti bylo možné samotné NIR fluorescenční látky použít pouze k nespecifickému zobrazování, např. krevního oběhu a jeho čištění (Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7 (5), 626-634). Polymethinová cyaninová barviva mají tendenci agregovat ve vodném prostředí, což vede ke ztrátě jejich fluorescence a je tedy nevýhodné při in vivo diagnostice (US6641798 B2 ). Zmíněné fluorescenční látky se dále vyznačují velmi krátkým poločasem rozpadu v oběhovém systému (150-180 s), který limituje akumulaci barviva ve sledované cílové, např. nádorové tkáni a tím snižuje i in vivo kontrast (Hill T. K. et. al., Bioconjug Chem. 2015,; 26(2): 294-303). Jednoduchý a všeobecný přístup, jak zvýšit akumulaci kontrastních činidel v cílových místech a tkáních, popřípadě zajistit lepší rozpustnost ve vodném prostředí, je jejich konjugace s vhodným ligandem z řad peptidů, proteinů, sacharidů aj. (Frangioni, J. N.Curr. Opin. Chem. BzoZ. 2003, 7 (5), 626-634). Konjugace kontrastních činidel k nosičovému polymeru nebo nanočástici se většinou provádí přes linker. Linker je nutné použít pro zajištění fluorescenčních (zamezení zhášení) a/nebo degradabilních vlastností systému (Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7 (5), 626634). Nevýhodou tohoto řešení je, že reakce je vícekroková a velmi náročná, navíc se často * · · · používá derivatizace vstupních látek, což je nevýhodné z hlediska purifikace produktů, a/nebo je nutná isolace reakčních meziproduktů, což je opět nevýhodné. V případě nanočásticových systémů se musí délka linkeru volit tak, aby nedocházelo ke zhášení fluorescence kontrastní látky a kontrastní látka byla in vivo detekovatelná (t.j. linker nesmí být příliš krátký) (US20110104070).
Patentový dokument US6641798 klade nároky na obecnou strukturu nízkomolekulárních konjugátů bioaktivních molekul (např. peptidy, proteiny, protilátky, sacharidy) s cyaninovými fluorescenčními látkami, připravovanými za účelem zvýšení detekce a terapie tumoru. Velkou nevýhodou použitých derivátů v in vivo aplikaci je krátká stabilita fluorescence (cca 45 min) při zobrazování.
V literatuře byly taktéž popsány konjugáty NIR fluorescenční látky Cypát s několika různými ligandy (aminocukry, peptidy, polysacharidy) ve smyslu kontrastních látek pro in vivo diagnostiku. Samostatná příprava NIR fluorescenční látky Cypát je popsána v dokumentu W02002032285, zdokonalená syntéza byla dále zveřejněna v publikaci Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem. 2005,16,51-61. Pro in vivo studie připravil Yunpeng Ye.; etal. (Ye, Y.; etal, J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 7740-7741), polyvalentní sondy, kdy nakarboxylové skupiny Cypátu byly navázány pomocí amidové vazby jeden nebo více monosacharidových jednotek D-(+)-gIukosaminu. Daná NIR fluorescenční látka tvořila jádro dendrimerického útvaru a také zároveň sloužila jako chromofor nanočástic, jejichž biodistribuce byla zkoumána pomocí neinvazivních optických metod in vivo a také následně ex vivo. Nevýhodou tohoto řešení, kdy nebyl použit ke konjugaci polymer, je nerozpustnost systému ve vodných roztocích v absenci organického rozpouštědla.
Dalším typem známé nanočástice pro zobrazení nádoru je duálně-cílená polymerní micela na bázi sukcinyl chitosanu s kovalentně vázaným Cypátem pomocí amidové vazby, dále methioninem a kyselinou listovou (Chen, H.; et al., Polym. Chem. 2014, 5, 4734-4746). Nevýhodou tohoto řešení je použití chitosanu jako nosného polysacharidu, protože chitosan není tělu vlastní látka. Další nevýhodou je velmi omezená rozpustnost nativního chitosanu ve fyziologických podmínkách, přírodní chitosan tedy vždy musí být modifikován, protože jinak by nebylo možné chitosan použít pro intravenózní aplikace. Navíc, i modifikovaný chitosan bývá omezeně rozpustný ve fyziologických podmínkách. Modifikace může způsobit změny v biodegradabilitě a biokompatibilitě chitosanu v závislosti na zamýšlené aplikaci (Balan, V.; et al., European Polymer Journal 2014, 53, 171-188; Dumitriu, S. Polymeric Biomaterials, 2nd ed.; Marcel Dekker, lne.: Spojené státy americké, 2002). Konjugovaný • ·
chitosan s Pluronic F68 a s cyaninovým barvivém (Cy5.5) byl použit na sledování akumulace v nádorovém myším modelu (W. II Choi.; et al., Nanomedicine:Nanotechnology, Biology and Mediáne 2015,11, 359-368). Bez cílení nosičového systému herceptinem zobrazení nádoru in vivo bylo sice možné sledovat, ale po 12ti hodinách intenzita NIR fluorescence se již nezvyšovala a dá se tedy předpokládat, že tento systém neumožní dlouhodobé sledování nádorového onemocnění in vivo bez nutnosti dalšího podání nosiče. Podobná nevýhoda krátkého zobrazovacího času (maximálně 1-2 dny od podání) je známá i u jiných polymerních i nepolymerních konjugátů s NIR barvivý (D. Kokuryo; et al., Journal of Controlled Release 2013,178,125, Tan X.; et al., Biomaterials 2012, 33,2230-2239).
V literatuře byl Cypát dále popsán jako součást multifunkční zobrazovací sondy, kdy na jednu karboxylovou skupinu zmíněné fluorescenční látky byla amidovou vazbou navázána chelatační komponenta kationtů kovů, za účelem tvorby opticko-nukleárního zobrazovacího systému. Cypát byl dále konjugován na cyklický RGD peptid za účelem cílení specifických buněk (Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem. 2008,19,225-234). Nevýhodou tohoto systému je, že jeho fluorescenční vlastnosti se mění v přítomnosti kationtů kovů a v některých případech (přítomnost Fe3+ nebo Cu2+) může dojít až k úplnému zhášení fluorescence (Ye, Y.; et al., Bioconjugate Chem. 2008,19, 225-234).
Konjugáty NIR fluorescenčních látek s kyselinou hyaluronovou.
V publikacích Choi K. (Choi, K. Y.; et al., J. Mater. Chem. 2009,19 (24), 4102-4107 a Choi, K. Y.; et al., Biomaterials 2010, 31 (1), 106-114) byl popsán hydrofobizovaný derivát kyseliny hyaluronové s kyselinou 5p-cholovou. U kyseliny 5p-cholové bylo však zjištěno, že jejím působením dochází k podpoře karcinogeneze střevních nádorů v jejich raném stádiu. (Baijal, K. P.; et al.,Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 1998, 76(12), 10951102). Dále na karboxylovou skupinu kyseliny hyaluronové byla konjugována NIR fluorescenční látka Cy5.5, pomocí ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu/hydroxybenzotriazolu. (EDC/HOBt) a linkeru dihydrazidu kyseliny adipové. Nevýhodou je nejen vícekroková syntéza, ale také použití aktivátoru EDC/HOBt, který může způsobovat nežádoucí intramolekulární síťování hyalurononu a stím související snížení rozpustnosti finálního produktu (Huerta-Angeles, G.; et al., Carbohydr. Polym. 2014,111 (13), 883-891). Derivát kyseliny hyaluronové s konjugovaným Cy5.5 přes amidovou vazbu byl dále použit pro povrchovou úpravu superparamagnetických nanočástic oxidů železa (ŠPION) za účelem vzniku multimodálních sond pro kombinaci in vivo
MRI/optickou detekci aktivity hyaluronidázy (Lee, D.; et al., Macromol. Res. 2011,19 (8), 861-867). Vzhledem kin vivo diagnostice prostřednictvím optických metod není ideální volbou fluorescenční látka Cy5.5 z řad pentamethinových derivátů. Na rozdíl od heptamethinových derivátů nedosahují tak vysokých absorbčních a emisních vlnových délek, které jsou pro in vivo neinvazivní diagnostiku doporučovány, respektive při použití vlnových délek typických pro pentamethinové deriváty může vznikat nežádoucí autofluorescence endogenních fluoroforů.
V případě heptamethinových derivátů cyaninu je známý konjugát kyseliny hyaluronové s komerčně dostupnou NIR fluorescenční látkou IR-783, modifikovanou čtyřkrokovou syntézou za vzniku IR-783-S-Ph-COOH, kdy tento derivát byl následně navázaný pomocí amidové vazby na kyselinu hyaluronovou. Derivát byl připraven za účelem studia hlubšího porozumění farmakokinetiky HA in vivo, její degradace a role ve fyziologických a patologických podmínkách (Wang, W.; Cameron, A. G.; Shi, K. Molecules 2012,17, 1520-1534). Bohužel velmi složitá syntéza není převeditelná do průmyslového měřítka a to jak z hlediska ekonomického, tak z důvodu velmi nízkého výtěžku (Wang, W.; Cameron, A. G.; Shi, K. Molecules 2012,17, 1520-1534).
Mezi další zástupce tohoto typu fluorescenčních látek patří indocyaninová zeleň (ICG). HA konjugovaný s indocyaninovou zelení a polyethylenglykolem (PEG) tvořil ve vodném prostředí zagregované částice, s možností in vivo duálního zobrazení tumoru pomocí optických metod a fotoakustické detekce (Miki, K.; et al., Biomacromolecules 2015,16, 219-227). Velkou nevýhodou při použití indocyaninové zeleně in vivo je hepatobiliární toxicita a rychlé odstranění tohoto barviva játry (G. R. Cherrick, et al. J. Clinical Investigation, 1960, 39, 592600). Nevýhodou u derivátů HA sNIR fluorescenčními látkami, kdy dochází kjejich konjugaci na karboxylovou skupinu kyseliny hyaluronové je, že při modifikaci karboxylové funkce HA dochází k neutralizaci přirozeného záporného náboje biopolymeru, dále může být ovlivněna rozpustnost HA ve fyziologickém prostředí a v neposlední řadě taktéž narušeno rozpoznání HA buněčnými receptory (Mero, A.; et al., Carbohydr. Polym. 2010, 79 (3), 597— 605).
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody stavu techniky překonává fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl podle obecného vzorce I • 1
(I), kde R+je H+ nebo fyziologicky přijatelná sůl vybraná ze skupiny obsahující Na+, K+, Mg24nebo Ca2+,
R1 je -H nebo zbytek cypátu vzorce II, kde ~ je místo kovalentní vazby zbytku cypátu vzorce II
přičemž v alespoň jedné opakující se jednotce je jeden Rl zbytek cypátu vzorce II s tím, že pokud v jednotce je R1 zbytek cypátu vzorce II, pak ostatní R1 v jednotce jsou H, a kde n je celé číslo v rozmezí 2 až 625.
Podle výhodného provedení vynálezu je zbytek cypátu vzorce II substituován v pozici 6 glukosaminové části fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I.
♦
Cypát I je po aktivaci navázán hydroxylovou skupinu kyseliny hyaluronové (viz Schéma 1 a 2, níže), což je výhodné zejména z hlediska zachování biologických vlastností kyseliny hyaluronové a dále zachování její rozpustnosti ve fyziologickém prostředí. Rozpustnost konjugátu podle vynálezu je 1 až 3 mg na 100 μΐ fyziologického roztoku. Fluorescenční konjugát podle vynálezu je excitován a absorbuje světlo v oblasti v oblasti 570 nm až 790 nm a emituje světlo v oblasti 680 až 850 nm, s výhodou při 850 nm.
Stupeň substituce zbytku cypátu vzorce II navázaného v konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I je od 0,1 do 2%, s výhodou 1,0%. Nízký stupeň substituce zbytku cypátu v konjugátu podle vynálezu je výhodný, protože umožňuje zobrazovat distribuci konjugátu in vivo, aniž by struktura HA musela být výrazně modifikovaná.
Příprava samotného konjugátu spočívá v syntéze fluorescenční látky: Cypátu, dále v aktivaci karboxylové skupiny fluorescenční látky a následné esterifikaci kyseliny hyaluronové.
Aktivace karboxylové skupiny Cypátu I vzorce III se provádí pomocí N,N'karbonyldiimidazolu vaprotickém polárním rozpouštědle (viz. Schéma 1, níže) s výhodou vybraného ze skupiny obsahující dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylformamid (DMF), formamid, nebo acetonitril, výhodněji DMSO. Tato aktivace je velmi efektivní již za mírných reakčních podmínek, přičemž dochází k reakci karboxylové skupiny sN,N’karbonyldiimidazolem (CDI) za vzniku reaktivního intermediátu mono-imidazolidu (Cypát II vzorce IV), kdy hnací silou reakce je uvolňování oxidu uhličitého a imidazolu (viz. Schéma 1, níže). Aktivační reakce probíhá po dobu 10 min. až 24 hod., s výhodou 0,5 až 2 hod. Reakční teplota může být v rozsahu od 20 °C do 60 °C, s výhodou v rozsahu 22°C až 25°C.
Cypát I (vzorec III)
• · · ·
Schéma 1: Aktivace karboxylové skupiny Cypátu pomocí CDI.
Při samotné esterifíkaci kyseliny hyaluronové, znázorněné na Schématu 2 (R+ je, jak definováno výše), potom dochází k odštěpení imidazolu z Cypátu II ze Schématu 1, k formaci esterové vazby mezi alespoň jednou hydroxylovou skupinou kyseliny hyaluronové a Cypátem vzorce IV.
Schéma 2: Reakce aktivovaného Cypátu s kyselinou hyaluronovou.
Pro přípravu daného konjugátu je s výhodou použita kyselá forma kyseliny hyaluronové nebo jiná organická sůl jako např. tetrabutylamoniová (TBA) (Schéma 2), která je použita pro solubilizaci kyseliny hyaluronové v organickém rozpouštědle (DMSO). Vhodná molekulová hmotnost kyselé formy nebo jiné organické soli kyseliny hyaluronové pro danou reakci je v rozmezí 5,000-250,000 g/mol, s výhodou (10,000-32,000 g/mol). Jiná molekulová hmotnost nebo HA soli není pro reakci překážkou. Esterifikace hydroxylových skupin HA v aprotickém polárním rozpouštědle je dále uskutečněna přidáním fluorescenční látky s aktivovanou karboxylovou skupinou pomocí CDI (Ν,Ν'-karbonyldiimidazolu). Reakce probíhá v přítomnosti organické báze generované in šitu ve formě imidazolu nebo přidané organické báze vybrané například ze skupiny obsahující DABCO (l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan), Ν,Ν,Ν',Ν'tetramethyl-l,6-hexanediamin, N-methylmorfolin, imidazol, triethylamin (TEA) nebo N,N'diisopropylethylamin (DIPEA), s výhodou imidazolu generovaného in šitu a polárního aprotického rozpouštědla, jak je definováno výše. Reakce tvorby konjugátu probíhá při teplotě 40 °C až 80 °C, s výhodou 40 °C až 60°C, výhodněji 60°C po dobu 12 až 48 hod., s výhodou 24 hod. Bližším studiem reakce bylo zjištěno, že stupeň substituce HA fluorescenční látkou je • · • · · ♦ závislý na ekvivalentním množství Cypátu I a také kladně ovlivněn přítomností ekvivalentu organické báze, výhodná kombinace je 0,5 molární ekvivalent Cypátu 1: 1 molámí ekvivalent HA : 0,5 molární ekvivalent Ν,Ν'-karbonyldiimidazolu : 0,5 až 3,5 molámí ekvivalenty organické báze, výhodněji 1 molární ekvivalent organické báze. Platí tedy, že molární poměr Cypátl: kyselina hyaluronová nebo její sůl: Ν,Ν'-karbonyldiimidazolu: organická báze je 0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 až 3,5 v reakční směsi, s výhodou je molární poměr 0,5 : 1 : 0,5 : 1.
Konjugát hyaluronanu s heptamethinovou indocyaninovou fluorescenční látkou (neboli Cypátem) podle obecného vzorce I, může být s výhodou dále modifikovaný za vzniku hydrofobizovaného fluorescenčního konjugátu obecného vzorce I podle vynálezu, kde R+, R1 a n jsou, jak definováno výše, přičemž zároveň platí, že v alespoň jedné opakující se jednotce alespoň jeden R1 je -C(=O)R2, kde R2je CxHy substituent, kde x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y je celé číslo v rozmezí 11 až 35, přičemž jde o lineární nebo rozvětvený, nasycený nebo nenasycený Có-Cis alifatický řetězec.
Stupeň substituce -C(=O)R2 v konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I je od 1 do 70 %, s výhodou 5 až 12%. Hydrofobizovaný fluorescenční konjugát podle vynálezu je excitován a absorbuje světlo v rozmezí vlnových délek 570 nm až 790 nm a emituje světlo v oblasti 680 až 850 nm, s výhodou při 850 nm.
Có - Cis acylový řetězec je řetězec mastných kyselin, který je navázán pomocí esterové vazby na alespoň jednu hydroxylovou skupinu HA. S výhodou se naváže na primární hydroxylovou skupinu (víz Schéma 3), která je obecně vhodná k esterifikaci. Mastná kyselina může mít krátký (SCFA), střední (MCFA), nebo dlouhý (LCFA) alifatický řetězec a může být esenciální nebo neesenciální. Aktivace mastné kyseliny obecného vzorce V
R2COOH (V), kde R2 je definováno výše, je uskutečněna např. substituovaným nebo nesubstituovaným benzoyl chloridem obecného vzorce VI
Cl (VI), kde R3 je jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny obsahující Η, -NO2, -COOH, halogenidy, C1-C6 alkylalkoxy, s výhodou H;
v přítomnosti organické báze vybrané ze skupiny obsahující např. DABCO (1,4diazabicyclo[2.2.2]oktan), N,N,N',N'-tetramethyl-l ,6-hexanediamin, N-methylmorfolin, triethylamin (TEA) nebo Ν,Ν'-diisopropylethylamin (DIPEA), s výhodou TEA. Příklad aktivace je uveden ve Schématu 3A. Reakční prostředí je tvořeno polárním rozpouštědlem vybrané ze skupiny obsahující isopropylalkohol (IPA), tetrahydroíuran (THF), s výhodou isopropylalkohol, za vzniku reaktivního anhydridu obecného vzorce VII
(VII), kde
R2 a R3 jsou, jak je definováno výše, který esterifíkuje fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl obecného vzorce I podle vynálezu (například ukázáno ve Schématu 3B).
(A)
O
o
báze, IPA
OH
OH báze, IPA/H;.O
OH
OH • · · ·
Schéma 3. (A) Aktivace karboxylové skupiny mastné kyseliny. (B) Hydrofobizace fluorescenčního konjugátu hyaluronanu s nasycenou nebo nenasycenou mastnou kyselinou. Definice n a R2 jsou uvedeny výše.
Tato esterifikace se uskutečňuje aktivovanou karboxylovou skupinou mastné kyseliny ve směsi vody a vodou mísitelného polárního organického rozpouštědla například isopropylalkohol (IPA), dimethylsulfoxid (DMSO) nebo tetrahydrofuran (THF), s výhodou isopropylalkohol. Esterifikace probíhá ve směsi voda a vodou mísitelné polární rozpouštědlo, přičemž množství vody je v rozmezí od 50 do 80 % obj/obj, s výhodou 50% obj/obj.
Reakce také probíhá v přítomnosti organické báze, s výhodou aminu vybraného ze skupiny obsahující např. DABCO (l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan), N,N,N',N'-tetramethyl-l,6hexanediamin, N-methylmorfolin, imidazol, triethylamin (TEA) nebo N,N'diisopropylethylamin (DIPEA), výhodněji triethylamin. Ve způsobu přípravy hydrofobizovaného konjugátu podle vynálezu probíhá aktivace mastné kyseliny obecného vzorce V po dobu 0,5 až 24 hod., při teplotě v rozmezí 0 °C až 60 °C, s výhodou 0,5 hod. při teplotě od 0 °C do 25 °C a esterifikace fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli se provádí po dobu 0,5 až 2 hod., s výhodou 2 hod., při laboratorní teplotě, tedy při teplotě v rozmezí 22°C až 25 °C.
Podle výhodného provedení způsobu přípravy hydrofobizovaného konjugátu podle vynálezu množství organické báze odpovídá 2 až 6 molámím ekvivalentům, s výhodou 4 molárním ekvivalentům na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli. Množství substituovaného nebo nesubstituovaného benzoyl chloridu odpovídá 0,2 až 2,0 molárním ekvivalentům, s výhodou 0,6 molárním ekvivalentům na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli. Množství mastné kyseliny odpovídá 0,2 až 2,0 molárním ekvivalentům, s výhodou 0,6 molárním ekvivalentům na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli. Bližším studiem reakce bylo zjištěno, že stupeň substituce hydrofobizovaného konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli podle vynálezu mastnou kyselinou je závislý na ekvivalentním množství aktivované mastné kyseliny a také kladně ovlivněn přítomností organické báze.
Hydrofobizovaný konjugát hyaluronanu s heptamethinovou indocyaninovou fluorescenční látkou (Cypát) obecného vzorce I podle vynálezu, může být s výhodou použit na enkapsulaci (nekovalentní vazbu) nepolárních látek, s výhodou léčiv nebo nanočástic s hydrofobním povrchem. Hydrofobizovaný konjugát je totiž schopen agregace a tvorby systémů podobných svým chováním polymerním micelám. Vzniká tak kompozice na bázi
agregovaného hydrofobizovaného fluorescenčního konjugátu podle vynálezu, která obsahuje agregáty hydrofobizovaných fluorescenčních konjugátů a alespoň jednu nebo více nepolárních látek, s výhodou léčiv, výhodněji cytostatik, nejlépe doxorubicin nebo paklitaxel, a/nebo nanočástic, s výhodou superparamagnetických nanočástic (tj. špionů). Špiony jsou s výhodou na bázi oxidů železa (FežCh, FeaCU), kde množství železa v kompozici je 0,3 až 3 hmotn.% s výhodou 1 až 1,5 hmotn.%. Velikost superparamagnetických nanočástic je 4 až 6 nm, s výhodou 5 nm. Podle výhodného provedení kompozice obsahuje agregovaný hydrofobizovaný fluorescenční konjugát podle vynálezu, kde R1 -C(=O)Ci7H33 a nanočástice, kterými jsou s výhodou superparamagnetické nanočástice na bázi oxidů železa (FežCh, FesCU). Takováto kompozice může dále výhodněji obsahovat cytostatikum, nejlépe doxorubicin nebo paklitaxel.
Podle dalšího provedení vynálezu kompozice obsahuje 2 až 15 hmotn.% nepolárních látek vzhledem k hmotnostnímu obsahu hydrofobizovaného fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli podle vynálezu, s výhodou 2 až 6 hmotn.%.
Kompozice podle vynálezu je možné použít při medicínských aplikacích pro in vivo zobrazování novotvarů, nebo k léčbě novotvarů.
Ve srovnání s doposud popisovanými postupy přípravy konjugátů kyseliny hyaluronové s cyaninovými fluorescenčními látkami s sebou uvedený způsob přípravy konjugátu podle vynálezu přináší několik výhod. Na rozdíl od technik popsaných v publikacích se jedná se o přímou syntézu bez použití linkeru nebo předchozí modifikace kyseliny hyaluronové, resp. fluorescenční látky. Během aktivace dochází k uvolňování imidazolu a CO2, které nejsou toxické, a lze je jednoduše odstranit z reakční směsi. Uvolněný imidazol navíc může být při přípravě konjugátu využit jako šitu generovaná organická báze a nemusí se tedy přidávat jiná organická báze nutná pro průběh reakce. Esterifikace kyseliny hyaluronové probíhá v organickém rozpouštědle, například v DMSO. Aktivátorem cypátu je CDI. CDI je možno použít pro konjugaci Cypátu k HA bez nutnosti izolace meziproduktu. Výhodou v tomto případě je, že dochází k selektivní modifikaci primárního hydroxylu HA i v případě nechráněněných sekundárních hydroxylových skupin HA a nedochází k nechtěným vedlejším reakcím jako je oxidace HA v DMSO (reakce Pfitzner-Moffatt).
I když struktura Cypátu obsahuje dvě funkční karboxylové skupiny, překvapující je, že nedochází k síťování fluorescenčního konjugátu HA (viz. Obr. 3-5), což by vedlo k snížení rozpustnosti finálního produktu.
• · · ·
Podobné esterové deriváty HA nelze snadno získat za použití jiných metod, resp. aktivátorů jako jsou benzoylchlorid (BC) a 2,4,6-trichlorbenzoylchlorid (TBC) (W02014082609). Nelze použít ani ethylchloroformiát, kterým je možno aktivovat karboxylovou skupinu (WO 2012034544), jelikož jeho působením dochází k degradaci chromoforu (cypátu) a ztrátě fluorescenčních vlastností. Jako další aktivátor karboxylových skupin hyaluronanu v organickém rozpouštědle se často používá dicyklohexylkarbodiimid (DCC), jeho velkou nevýhodou však je to, že je označován jako silný alergen (Derm_Beruf_Umwelt 1986; 34(4):110-1.) a je vysoce toxický (Macrom. Rapid Commun. 2004,25, 916-920).
Konjugát kyseliny hyaluronové s Cypátem obecného vzorce I i jeho hydrofobizovaný konjugát podle vynálezu mohou být s výhodou excitovány v oblasti 570 nm až 790 nm a emitují při 680 až 850 nm, a jsou tedy vhodné pro použití při medicínských aplikacích pro in vivo zobrazování distribuce konjugátu podle vynálezu, s výhodou pro in vivo zobrazování orgánů vybraných ze skupiny obsahující například játra, kůži; nebo zobrazování novotvarů po intravenózním, intraperitoneálním nebo subkutánním podání.
Tyto konjugáty jsou schopny penetrovat po intravenózním nebo intraperitoneálním podání do nádorových tkání (tj. novotvarů), s výhodou do hmatných nádorů a/nebo do velmi malých (nehmatných) nádorů, a proto jsou vhodné k zobrazování za účelem diagnostiky onemocnění, zejména nádorového onemocnění. Ve srovnání s pentamethinovými sloučeninami je heptamethinový cyaninový konjugát hyaluronanu výhodnější z hlediska fluorescenčních vlastností - zejména větší dosažené hloubce penetrace záření a dále omezení nežádoucí autofluorescence. Diagnostika nádorového onemocnění je s výhodou aplikovatelná pro nádorové tkáně selektivně vychytávající nízkomolekulární hyaluronan (např. tkáně se zvýšenou expresí CD44). Rozpustnost hydrofobizovaného konjugátu podle vynálezu je 1 až 3 mg na 100 μΐ fyziologického roztoku.
Hydrofobizovaný konjugát podle vynálezu je z hlediska fluorescenčních vlastností velmi stabilní a s výhodou ho po intravenózním podání lze zobrazovat minimálně po dobu 15 dnů bez nutnosti opakovaného podání konjugátu. Konjugát podle vynálezu se velmi dobře zakoncentrovává i v malých (pohmatem nedetekovatelných) nádorech. Další výhodou hydrofobizovaného konjugátu podle vynálezu je možnost nekovalentního vázání protinádorové látky (cytostatika) a tedy jejích využití ke konstrukci teranostik, tedy nosiče se současně diagnostickou a terapeutickou funkcí. Hlavní výhodou hydrofobizovaného konjugátu podle vynálezu jako teranostika je využití jeho schopnosti se akumulovat v nádorových tkáních (zejména prsních nádorech), dlouhodobé zobrazování a aplikace k samotné léčbě nádoru.
• ·
Definice pojmů:
Cypát zahrnuje strukturu podle vzorce III (cypát I) neboli l-[3-(2-karboxyethyl)-l,ldimethyl-5,9b-dihydrobenzo [e]indol-3-ium-2-yl(chlorid)]-okta-1,3,5,7-tetraenyl]-1,1dimethyl-2H-benzo[e]indoí-3-yl]propanovou kyselinu, heptamethinové indocyaninové barvivo.
SS = stupeň substituce ~ procentuální množství modifikovaných disacharidových jednotek hyaluronanu na 100 disacharidových jednotek hyaluronanu (100 % udává, že na 100 disacharidových jednotek hyaluronanu bylo detekováno 100 modifikujících skupin)
Termín „laboratorní teplota“ znamená rozsah teplot místnosti 22°C až 25°C
Ekvivalent (ekv.) se vztahuje na dimer kyseliny hyaluronové, jedná se o molární ekvivalent, pokud není uvedeno jinak.
Vazebná kapacita je množství navázané látky vyjádřené v hmotnostních procentech, pokud není uvedeno jinak.
Termín „nepolární látka“ znamená látku se symetrickou distribucí nábojů. Jde o látku, která je nerozpustná v polárním prostředí (voda).
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: 'H NMR (D2O) konjugátu HA-Cypát.
Obr. 2: DOSYNMR spektrum (D2O) konjugátu HA-Cypát.
Obr. 3: Záznam chromatogramu SEC-MALLS (HA-Cypát 14,000g/mol) konjugátu HA-Cypát (příklad 3).
Obr. 4: Záznam chromatogramu SEC-MALLS (HA-Cypát 14,000g/mol) konjugátu HA-Cypát (příklad 5).
Obr. 5: Záznam chromatogramu SEC-MALLS (HA-Cypát 58,000g/mol) konjugátu HA-Cypát (příklad 6).
Obr. 6: Záznam chromatogramu SEC-MALLS (HA-Cypát 72,000g/mol) konjugátu HA-Cypát (příklad 7).
···· · · · · ··· · • · ···· ·· ·
Obr. 7: Emisní spektrum fluorescence konjugátu HA-Cypát ve vodném roztoku při excitaci 650, 660,665 a 670 nm.
Obr. 8: Emise fluorescence konjugátu ve vodném roztoku při excitaci laserem λ= 632,8 nm bez (snímek vlevo) a v kombinaci s filtrem propouštějící vlnové délky nad λ = 635 nm (snímek vpravo).
Obr. 9: Iv vivo fluorescenční zobrazování: HA-Cypát aplikován subkutánně. Místo aplikace je vyznačeno písmenem S. Obrázky ukazují detekci emise za použití různých excitačních a emisních filtrů.
Obr. 10: In vivo fluorescenční zobrazování v čase po intraperitoneální aplikaci HA-Cypát.
Obr. 11:7« vivo fluorescenční zobrazování v čase po intravenózní aplikaci HA-Cypát-Cl8:1.
Obr. 12: In vivo fluorescenční zobrazování v čase po intravenózní aplikaci HA-Cypát-C18:l (myš s nádorem, nádorové buňky značené chemiluminiscentní luciferázou).
Obr. 13: Vyhodnocení in vivo luminiscence nádoru po podání (i) HA-Cypát-C18:l (=HA cyp), (ii) HA-Cypát-C18:l+doxorubicin (=HA cyp dox), (iii) HA-CypátCl 8:1+doxorubicin+spion (=HA cyp dox+spiony).
Obr. 14: Porovnání hmotnosti sleziny a jater po podání (i) HA-Cypát-Cl 8:1 (=HA cyp), (ii) HA-Cypát-Cl8:1+doxorubicin (=HA cyp dox), (iii) HA-Cypát-Cl8:1+doxorubicin+spion (=HA cyp dox+spions).
Obr. 15:7« vivo efluorescenční zobrazování v čase po intraperitoneální aplikaci HA-CypátCl 8:1 (myš s nádorem, nádorové buňky značené luminiscentní luciferázou).
Obr. 16: Hmotnostní spektrum dimeru HA-Cypát získaného enzymatickou degradací konjugátu HA-Cypát hyaluronan lyázou.
Příklady provedení vynálezu
Popis přístrojového vybavení
NMR spektra byla naměřena na BRUKER AVANCE 500 při frekvenci 500,13 MHz (lH). Pro zpracování experimentálních dat byl použit software firmy Bruker TOPSPIN 1.2 nebo software SpinWorks 3.1. Pro interpretaci spekter z NMR analýz byly použity zkratky: s (singlet), d (dublet), t (triplet), m (multiplet). Pro naměření UV/Vis spekter v rozmezí vlnových • · · · délek 190 - 800 nm byl použit UV/Vis spektrofotometr Varian Cary 100. Fluorescenční spektra byla zaznamenána na přístroji PTI Quantamaster 400. ESI-MS analýzy Cypátu byly realizovány na hmotnostním spektrometru s iontovou pastí amaZon X (BrukerDaltonics) vybaveném elektrosprejovým ionizačním zdrojem a kvadrupólovým hmotnostním analyzátorem. Měření byla provedena v pozitivním a negativním módu. Struktura konjugátu HA-cypát byla potvrzena pomoci LC-MS analýzy konjugátu po jejím enzymatickém štěpení hyaluronan lyázou. Směs oligosacharidů byla separovaná na koloně Kinetex 1.7 um F5 100A (Phenomenex) gradientem 0.1%-ní HCOOH v H2O a acetonitrilu. Detekce byla prováděna na Synapt G2-Si v negativním resolution módu s ionizací elektrosprejem. Analýza vzorků a molekulová hmotnost výchozího hyaluronanu byla stanovena metodou SEC-MALLS (HPLC Alliance) s s UV/VIS 2489 a refraktometrickým detektorem RID 2414. a detektorem rozptylu světla mini DAWN TREOS. Data byla zpracována pomocí softwaru Astra Version 5.3.4.20 (Wyatt Technology EuropeGmbH). Veškeré in vivo zobrazovací analýzy byly provedeny na přístroji IVIS Luminia XR Series III) na laboratorních myších z kmene Balb/c.
Příklad 1. Syntéza 3-(2-karboxyethyl)-l,2,2-trimethyl-lH-benzo[e]indolium-bromidu
2,0 g (9,6 mmol) l,l,2-trimethyl-777-benzindolu a 2,2 g (14,3 mmol) 3-brompropanové kyseliny bylo rozpuštěno v 10 ml 1,2-dichlorbenzenu a za stálého míchání zahříváno na 115 °C po dobu 16 hod. Surová reakční směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a vzniklá sraženina promyta 1,2-dichlormethanem (10 x 50 ml). Finální produkt byl oddělen filtrací, sušen pod vakuem na rotační vakuové odparce (RVO) a získán ve formě světle šedého krystalického prášku (výtěžek 2,2 g (64 %)).
Ή NMR (DMSO-í/ň, 500 MHz): δ 8,38 (d, J= 8,35, lHarom), 8,29 (d, J = 9,00, lHarom), 8,23 (d, J= 8,35, lHarom), 8,18 (d, J= 9,00, lHarom), 7,80 - 7,71 (m, 2Harom), 4,79 (t, 6,95,
2H, -CH2-), 3,05 (t, J= 6,95, 2H, -CH2-), 2,98 (s, 3H, -CH3), 1,76 (s, 6H,-CH3) ppm
ESI-MS: +MS [M]+= 282
Příklad 2. Příprava Cypátu
0,8 g (2,8 mmol) glutaconic dialdehyd dianilin hydrochloridu bylo rozpuštěno v 8 ml 1,2dichlormethanu a vytemperováno na 0 - 5 °C. Do roztoku bylo postupně přidáváno po kapkách 521 μΐ (5,5 mmol) anhydridu kyseliny octové a 481 μΐ (2,8 mmol) DIPEA v malém množství 1,2-dichlormethanu (0,5 ml), reakční směs ponechána za stálého chlazení a míchání reagovat 3 hod. Mezitím byly 2 g (5,5 mmol) 3-(2-karboxyethyl)-l,2,2-trimethyl-177-benzo[e]indolium18
bromidu připraveného v příkladu 1 a 0,9 g (11,0 mmol) octanu sodného ve směsi rozpouštědel acetonitril/voda 95/5 o objemu 15 ml přivedeno k refluxu a po kapkách přidána první reakění směs. Reakce běžela 18 hod. za stálého míchání a refluxu ve tmě. Surová reakění směs byla ochlazena na laboratorní teplotu, promyta 400 ml ethyl-acetátu a 400 ml 1M HC1, produkt zfiltrován a sušen za nízkého tlaku. Výsledný produkt byl získán ve formě tmavě zeleného krystalického prášku ve výtěžku 1,62 g (88 %).
Ή NMR (DMSO-ďó, 500 MHz): δ 8,25 (d, J= 8,75,2H), 8,07 - 7,97 (m, 6H), 7,82 (t, J= 12,65,1H), 7,73 (d, J= 8,75,2H), 7,69 - 7,62 (m, 2H), 7,54 - 7,48 (m, 2H), 6,60 (t, J= 12,65, 2H), 6,47 (d, J= 13,75, 2H), 4,43 (bt, 4H -CH2-), 2,77 (t, J= 6,9, 4H -CH2-), 1,92 (s, 12H CH3) ppm
ESI-MS: +MS [M]+= 625; ’MS [M-2H] - 623 m/z
UV/Vis: LabS.max= 782 nm (MeOH)
Příklad 3: Příprava konjugátu HA-Cypát mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) Cypátu z příkladu 2 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO, přidáno 22 mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) N,N -karbonyldiimidazolu a za stálého míchání ponecháno aktivovat 2 hod. při laboratorní teplotě. Mezitím bylo rozpuštěno 100 mg (0,27 mmol, 1 ekv.) kyselé formy kyseliny hyaluronové o Mw 14,000 g/mol v DMSO při 60°C. Do tohoto roztoku bylo následně přidáno 15 μΐ (0,13 mmol, 0,5 ekv.) V-methylmorfolinu a první reakění směs bez předchozí izolace. Reakce běžela za stálého míchání ve tmě při 60 °C 24 hod. Reakce byla ukončena přidáním desetinásobku 100% isopropylakoholu (AIPA) vzhledem k původnímu objemu reakční směsi a nasyceného roztoku NaCl, kdy došlo kvysrážení požadovaného produktu. Surový produkt byl purifikován 5 x 100 ml AIP A, rozpuštěn v 50 ml demineralizované vody a přenesen do dialyzačního střeva. Protonovaná forma HA byla neutralizována 1. den v 0,5% roztoku NaCl a 0,5% NaHCCh, dále dialyzována 2. a 3. den v demineralizované vodě. Obsah střeva byl zamražen a následně lyofilizován. Výsledný produkt ve formě hyaluronanu byl získán jako zelený lyofilizát o hmotnosti 89 mg (87 %).
Ή NMR (D2O) (Obr. 1): cypát: δ 8,80 (s, 2H), 8,50- 8,47 (m, 2H), 8,46 - 8,43 (m, 2H), 8,29 - 8,19 (m, 2H), 8,16 - 8,10 (m, 2H), 8,08 - 7,89 (m, 2H), 7,88 - 7,81 (m, 2H), 7,79 - 7,73 (m, 2H), 7,58 (s, 2H), 7,51 -7,46 (m, 2H), 5,16, - 5,14 (m, 4H), 3,14-3,09 (m, 4H), 2,02 (12H, CH3, překryto signály HA), HA: δ 4,62 - 4,39 (m, 2H anomerní), 4,01 - 3,28 (m, 10H skeletální), 2,02 (s, 3H, -CH3) ppm ♦ · · · · · • · · · · · · · ·· • · · · ·«·« • · · · · · ·· • · · · · ·* ···· ·· ··· ···· ♦ ·····
DOSY (D2O): (Obr. 2)
SS = 1,5 % (stanoveno z 1II NMR)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (Obr. 3)
Fluorimetr: Xem.max 695 nm (pri Xexc.. 665 nm; H2O); (Obr. 7)
Fluorescence konjugátu excitovaná vlnovou délkou laseru λ= 632,8 nm (Obr. 8)
ESI-MS: [M-H]~= 984 m/z (Obr. 16, dimer detekovaný po enzymatické degradaci konjugátu lyázou)
Příklad 4: Příprava konjugátu HA-Cypát mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) Cypátu z příkladu 2 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO, přidáno 22 mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) TýV-karbonyldiimidazolu a za stálého míchání ponecháno aktivovat 30 min. při laboratorní teplotě. Mezitím bylo rozpuštěno 100 mg (0,27 mmol, 1 ekv.) kyselé formy kyseliny hyaluronové o Mw 14,000 g/mol v DMSO při 60°C. Reakce běžela za stálého míchání ve tmě při 60 °C 24 hod. Reakce byla ukončena přidáním desetinásobku 100% isopropylakoholu (AIPA) vzhledem k původnímu objemu reakční směsi a nasyceného roztoku NaCl, kdy došlo k vysrážení požadovaného produktu. Surový produkt byl purifikován 5 x 100 ml AIPA, rozpuštěn v 50 ml demineralizované vody a přenesen do dialyzačního střeva. Protonovaná forma HA byla neutralizována 1. den v 0,5% roztoku NaCl a 0,5% NaHCCh, dále dialyzována 2. a 3. den v demineralizované vodě. Obsah střeva byl zamražen a následně lyofilizován. Výsledný produkt ve formě hyaluronanu byl získán jako zelený lyofilizát o hmotnosti 89 mg (87 %).
’H NMR (D2O) (Obr. 1): cypát: δ 8,80 (s, 2H), 8,50- 8,47 (m, 2H), 8,46 - 8,43 (m, 2H), 8,29 - 8,19 (m, 2H), 8,16 - 8,10 (m, 2H), 8,08 - 7,89 (m, 2H), 7,88 - 7,81 (m, 2H), 7,79 - 7,73 (m, 2H), 7,58 (s, 2H), 7,51 - 7,46 (m, 2H), 5,16,-5,14 (m, 4H), 3,14 - 3,09 (m, 4H), 2,02 (12H, CH3, překryto signály HA), HA: δ 4,62 - 4,39 (m, 2H anomerní), 4,01 - 3,28 (m, 10H skeletální), 2,02 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1 % (stanoveno z !H NMR)
Fluorimetr: Xem.max— 695 nm (pri λβχο.. ~ 665 nm; H2O)
Příklad 5: Příprava konjugátu HA-Cypát • · 4 · « · ·· · · · · · ··· ·· · · · · · · • · · · · · · · • ··*·· · · »··· ·· ··· ···· ··· ··· mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) Cypátu z příkladu 2 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO, přidáno 22 mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) CDI a za stálého míchání ponecháno aktivovat 2h při laboratorní teplotě. Mezitím bylo rozpuštěno lOOmg (0,27 mmol, 1 ekv.) kyselé formy kyseliny hyaluronové o Mw (14,000 g/mol) v DMSO při 60°C. Do tohoto roztoku bylo následně přidáno 138 μΐ (0,79 mmol, 3 ekv.) DIPEA a první reakční směs. Reakce běžela za stálého míchání ve tmě při 60 °C 24 hod.
Reakce byla ukončena přidáním desetinásobku AIP A vzhledem k původnímu objemu reakční směsi a nasyceného roztoku NaCl, kdy došlo k vysrážení požadovaného produktu. Produkt byl purifikován 5 x 100 ml AIP A, rozpuštěn v 50 ml demineralizované vody a přenesen do dialyzačního střeva. Protonovaná forma HA byla neutralizována 1. den v 0,5% roztoku NaCl a 0,5% NaHCCh, dále dialyzována 2. a 3. den v demineralizované vodě. Obsah střeva byl zamražen a následně lyofilizován. Výsledný produkt ve formě hyaluronanu byl získán jako lyofilizát o hmotnosti 86 mg (84 %).
Ή NMR (D2O): cypát: δ 8,81 (s, 2H), 8,50- 8,47 (m, 2H), 8,46 - 8,43 (m, 2H), 8,29-8,19 (m, 2H), 8,16 - 8,10 (m, 2H), 8,08 - 7,89 (m, 2H), 7,88 - 7,81 (m, 2H), 7,79 - 7,73 (m, 2H),
7,58 (s, 2H), 7,51 - 7,46 (m, 2H), 5,16, - 5,14 (m, 4H), 3,14 - 3,09 (m, 4H), 2,03 (12H, CH3, překryto signály HA), HA: δ 4,62 - 4,38 (m, 2H anomemí), 4,01 - 3,26 (m, 10H skeletální), 2,03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1,5 % (stanoveno z Ή NMR)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (Obrázek 4)
Fluorimetr: Xem.max= 695 nm (při Xexc.max “ 665 nm; H2O)
Příklad 6: Příprava konjugátu HA-Cypát mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) Cypátu z příkladu 2 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO, přidáno 22 mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) CDI a za stálého míchání ponecháno aktivovat 2h při laboratorní teplotě. Mezitím bylo rozpuštěno 100 mg (0,27 mmol, 1 ekv.) kyselé formy kyseliny hyaluronové o Mw (5,8 x 104 g/mol) v DMSO při 60°C Do tohoto roztoku bylo následně přidáno 15 μΐ (0,13 mmol, 0,5 ekv.) A-methylmorfolinu a první reakční směs bez předchozí izolace. Reakce běžela za stálého míchání ve tmě při 60°C 24 hod.
9f · * *· · e · · · * * · · · · ·· * · ···
Reakce byla ukončena přidáním desetinásobku AIPA vzhledem k původnímu objemu reakční směsi a nasyceného roztoku NaCl, kdy došlo k vysrážení požadovaného produktu. Surový produkt byl purifikován 5 x 100 ml AIPA, rozpuštěn v 50 ml demineralizované vody a přenesen do dialyzačního střeva. Protonovaná forma HA byla neutralizována 1. den v 0,5 % roztoku NaCl a 0,5% NaHCO3, dále dialyzována 2. a 3. den v demineralizované vodě. Obsah střeva byl zamražen a následně lyofílizován. Výsledný produkt ve formě hyaluronanu byl získán jako zelený lyofílizát o hmotnost 95 mg (93 %).
TlNMR (D2O): cypát: δ 9,2 (m, 2H), 8,82- 8,77 (m, 2H), 8,46 - 8,43 (m, 2H), 8,29 - 8,19 (m, 2H), 8,16 - 8,10 (m, 2H), 8,08 - 7,89 (m, 2H), 7,89 - 7,81 (m, 2H), 7,79 - 7,73 (m, 2H),
7,58 (s, 2H), 7,51 - 7,46 (m, 2H), 5,16, - 5,14 (m, 4H), 3,14 - 3,09 (m, 4H), 2,03 (12H, CH3, překryto signály HA), HA: δ 4,64 - 4,38 (m, 2H anomerní), 4,04 - 3,21 (m, 10H skeletální), 2,03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1,0 % (stanoveno z 'H NMR)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (Obr.5)
Fluorimetr: Xem.max= 695 nm (při Xexc. = 665 nm; H2O)
Příklad 7: Příprava konjugátu HA-Cypát mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) Cypátu z příkladu 2 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO, přidáno 22 mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) ΛζΤ/'-karbonyldiimidazolu a za stálého míchání ponecháno aktivovat 2h při laboratorní teplotě. Mezitím bylo rozpuštěno 1 OOmg (0,27 mmol, 1 ekv.) kyselé formy kyseliny hyaluronové o Mw (7,2 x 104 g/mol) v DMSO při 60°C. Do tohoto roztoku bylo následně přidáno 15 μΐ (0,13 mmol, 0,5 ekv.) A-methylmorfolinu a první reakční směs. Reakce běžela za stálého míchání ve tmě při 60 °C 24 hod.
Reakce byla ukončena přidáním desetinásobku AIPA vzhledem k původnímu objemu reakční směsi a nasyceného roztoku NaCl, kdy došlo k vysrážení požadovaného produktu. Surový produkt byl purifikován 5 x 100 ml 100% AIPA, rozpuštěn v 50 ml demineralizované vody a přenesen do dialyzačního střeva. Protonovaná forma HA byla neutralizována 1. den v 0,5% roztoku NaCl a 0,5% NaHCO3, dále dialyzována 2. a 3. den v demineralizované vodě. Obsah střeva byl zamražen a následně lyofílizován. Výsledný produkt ve formě hyaluronanu byl získán jako lyofílizát o hmotnosti 96 mg (94 %).
«· ·«* » » ‘H NMR (D20): cypát: δ 9,2 (m, 2H), 8,83- 8,5 (m, 2H), 8,45 - 8,43 (m, 2H), 8,30 - 8,18 (m, 2H), 8,16 - 7,99 (m, 2H), 7,99 - 7,89 (m, 2H), 7,89 - 7,81 (m, 2H), 7,79 - 7,73 (m, 2H),
7,58 (s, 2H), 7,51 - 7,46 (m, 2H), 5,16, - 5,14 (m, 4H), 3,14 - 3,09 (m, 4H), 2,03 (12H, CH3, překryto signály HA), HA: δ 4,64 - 4,38 (m, 2H anomerní), 4,04 - 3,21 (m, 10H skeleletální), 2,03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 1,0 % (stanoveno z 'II NMR)
SEC-MALLS-LS-UV/Vis-RI: (Obr. 6)
Fluorimetr: 7.cm.max= 695 nm (pri Xexc. — 665 nm; H2O)
Příklad 8: Příprava konjugátu HA-Cypát mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) Cypátu z příkladu 2 bylo rozpuštěno ve 2 ml DMSO, přidáno 22 mg (0,13 mmol, 0,5 ekv.) N, N -karbonyldiimidazolu a za stálého míchání ponecháno aktivovat 2h při laboratorní teplotě. Mezitím bylo rozpuštěno lOOmg (0,27 mmol, lekv.) kyselé formy kyseliny hyaluronové o Mw (2,5 x 105 g/mol) v DMSO při 40 °C. Do tohoto roztoku bylo následně přidáno 15 μΐ (0,13 mmol, 0,5 ekv.) V-methylmorfolinu a první reakční směs. Reakce běžela za stálého míchání ve tmě při 40 °C 24 hod..
Reakce byla ukončena přidáním desetinásobku AIPA vzhledem k původnímu objemu reakční směsi a nasyceného roztoku NaCl, kdy došlo k vysrážení požadovaného produktu. Surový produkt byl purifíkován 5 x 100 ml 100% AIPA, rozpuštěn v 50 ml demineralizované vody a přenesen do dialyzačního střeva. Protonovaná forma HA byla neutralizována 1. den v 0,5% roztoku NaCl a 0,5% NaHCCh, dále dialyzována 2. a 3. den v demineralizované vodě. Obsah střeva byl zamražen a následně lyofílizován. Výsledný produkt ve formě hyaluronanu byl získán jako lyofilizát o hmotnosti 93 mg (92 %).
*H NMR (D2O): cypát: δ 9,2 (m, 2H), 8,83- 8,5 (m, 2H), 8,45 - 8,43 (m, 2H), 8,30 - 8,17 (m, 2H), 8,16 - 7,99 (m, 2H), 7,99 - 7,89 (m, 2H), 7,89 - 7,81 (m, 2H), 7,79 - 7,73 (m, 2H),
7,58 (s, 2H), 7,51 - 7,42 (m, 2H), 5,16, - 5,14 (m, 4H), 3,14 - 3,09 (m, 4H), 2,03 (12H, CH3, překryto signály HA), HA: δ 4,62 - 4,38 (m, 2H anomerní), 4,01 - 3,26 (m, 10H skeleletální), 2,03 (s, 3H, -CH3) ppm
SS = 0,5 % (stanoveno z ’H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 695 nm (při Xexc. “ 665 nm; H2O)
Příklad 9: Esterífikace HA-Cypát kyselinou hexanovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 13 ml AIP A, následně bylo přidáno 382 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) DIPEA a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv) DMAPu. Mezitím bylo 165 μΐ (1,32 mmol, 1,8 ekv.) kyseliny hexanové rozpuštěno ve 2 ml AIPA, přidáno 255 μΐ (1,46 mmol, 2 ekv.) DIPEA, 153 μΐ (1,32 mmol, 1,8 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při 0 °C. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. oproti 0,5% NaHCCh, 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 230 mg (73 %).
*H NMR signály navíc oproti příkladu 3 (D2O, 500 MHz): δ 2,4 (m, 2H, 01CH2), 1,6 (m, 2H, pCH2), 1,31 (m, 4H, yCH2), 0,8 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 70 % (stanoveno z *H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 700 nm (při Xexc. = 665 nm; H2O)
Příklad 10: Esterífikace HA-Cypát kyselinou palmitovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody, následně bylo přidáno 306 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) TEA a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 94 mg (0,37 mmol, 0,5 ekv.) kyseliny hexadekanové rozpuštěno ve 3 ml THF, přidáno 153 μΐ (1,10 mmol, 1,5 ekv.) TEA, 43 μΐ (0,37 mmol, 0,5 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
• · * ·
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 189 mg (61 %).
‘H NMR signály navíc oproti příkladu 3 (D2O, 500 MHz): δ 2,76 - 2,66 (m, 2H, 01CH2),
1,64 -1,48 (m, 2H, PCH2), 1,31-1,08 (m, 24H, CH2), 0,98 - 0,78 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS acylace = 7 % (stanoveno z 'H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 710 nm (při λεχο. ~ 685 nm; H2O)
Příklad 11: Esterifikace HA-Cypát kyselinou palmitovou
200 mg (0,49 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody, následně bylo přidáno 136 μΐ (0,98 mmol, 2 ekv.) TEA a 3 mg (0,02 mmol, 0,04 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 38 mg (0,16 mmol, 0,3 ekv.) kyseliny palmitové rozpuštěno ve 3 ml THF, přidáno 68 μΐ (0,48 mmol, 1 ekv.) TEA, 17 μΐ (0,16 mmol, 0,3 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 76 mg (37 %).
'H NMR (D2O, 500 MHz) signály navíc oproti příkladu 3: δ 2,76 - 2,66 (m, 2H, C1CH2),
1,64 - 1,48 (m, 2H, PCH2), 1,31-1,08 (m, 24H, CH2), 0,98 - 0,78 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 5 % (stanoveno z ’H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 710 nm (při Zexc. = 685 nm; H2O)
Příklad 12: Esterifikace HA-Cypát kyselinou palmitovou
200 mg (0,49 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 10 ml demi vody, následně bylo přidáno 255 μ 1 (1,47 mmol, 3 ekv.) DIPEA a 3 mg (0,02 mmol, 0,04 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 38 mg (0,15 mmol, 0,3 ekv.) kyseliny palmitové rozpuštěno ve 3 ml THF, přidáno 85 μΐ (0,4-9 mmol, 1 ekv.) DIPEA, 17 μΐ (0,15 mmol, 0,3 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 h oproti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 93 mg (45 %).
‘H NMR (D2O, 500 MHz) signály navíc oproti příkladu 3: δ 2,76 - 2,66 (m, 2H, 0CH2),
1,64 - 1,48 (m, 2H, PCH2), 1,31-1,08 (m, 24H, CH2), 0,98 - 0,78 (m, 3H, -CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 5 % (stanoveno z 'H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 710 nm (pri λεχε.= 685 nm; H2O)
Příklad 13: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg HA-Cypát (0,73 mmol, 1 ekv.) z příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 13 ml AIPA, následně bylo přidáno 306 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) TEA a 4,5 mg (0,04 mmol, 0.05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 186 μΐ (0,59 mmol, 0,8 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIPA, přidáno 306 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) TEA, 68 μΐ (0,59 mmol, 0,8 ekv.) benzoylchloridu a vše ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 h proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 210 mg (66 %).
• ·
!HNMR (D2O, 500 MHz)signály navíc oproti příkladu 3: δ 5,41 - 5,34 (m, 2H,CH-CH),
2,48 - 2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)12), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 10 % (stanoveno z ίΗ NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 710 nm (při λεχο. = 685 nm; H2O)
Příklad 14: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 13 ml AIP A, následně bylo přidáno 306 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) TEA a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 116 μΐ (0,36 mmol, 0,5 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIP A, přidáno 153 μΐ (1,08 mmol, 1,5 ekv.) TEA, 43 μΐ (0,36 mmol, 0,5 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakění směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 205 mg (73 %).
‘H NMR (D2O, 500 MHz) signály navíc oproti příkladu 3: 5,41 - 5,34 (m, 2H, CH-CH),
2,48 - 2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)i2), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH?-CH3) ppm
SS (acylace) - 8 % (stanoveno z (H NMR)
Fluorimetr: Áem.max= 710 nm (při Xexc. = 685 nm; H2O)
Příklad 15: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 13 ml AIPA, následně bylo přidáno 382 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) DIPEA a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 139 μΐ (0,45 mmol, 0,6 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIP A, přidáno 229 μΐ (1,32 mmol, 1,8 ekv.) DIPEA, 51 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při 0°C. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakění směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. oproti proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 204 mg (65 %).
lH NMR (D2O, 500 MHz)signály navíc oproti příkladu 3: δ 5,41 - 5,34 (m, 2H, CH=CH), 2,48-2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2.-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)i2), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 12 % (stanoveno z 'H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 710 nm (při λεχο. 685 nm; H2O)
Příklad 16: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 11 ml AIPA, následně bylo přidáno 306 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) TEA a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 231 μΐ (0,73 mmol, 1 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIPA, přidáno 204 μΐ (1,46 mmol, 2 ekv.) TEA, 85 μΐ (0,73 mmol, 1 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 226 mg (70 %).
• · · ·
[H NMR (D2O, 500 MHz)signály navíc oproti příkladu 3: δ 5,41 - 5,34 (m, 2H, CH-CH),
2,48 - 2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)i2), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 12 % (stanoveno z Ti NMR)
Fluorimetr: Zem.max= 710 nm (při λβχο. 685 nm; H2O)
Příklad 17: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 11 ml AIP A, následně bylo přidáno 375 μΐ (1,76 mmol, 2,4 ekv.) N,N,N',N'-tetramethyl-l,6-hexanediaminu a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 139 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIP A, přidáno 375 μΐ (1,76 mmol, 2,4 ekv.) N,N,N',N'-tetramethyl-l,6-hexanediaminu, 51 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakění směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 h při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. oproti proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 217 mg (70 %).
*H NMR (D2O, 500 MHz)signály navíc oproti příkladu 3: δ 5,41 - 5,34 (m, 2H, CH=CH),
2,48 - 2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)i2), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 6 % (stanoveno z [H NMR)
Fluorimetr: kem.max= 710 nm (při Xexc.= 685 nm; H2O)
Příklad 18: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 11 ml AIPA, následně bylo přidáno 241 μΐ (2,20 mmol, 3 ekv.) • · · · ···· ·· ··· »··· ··· ···
N-methylmorfolínu a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 139 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIP A, přidáno 193 μΐ (1,76 mmol, 2,4 ekv.) N-methylmorfolínu, 51 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod. oproti proti 0,5% NaHCO3 a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofilizátu ve výtěžku 264 mg (82 %).
*H NMR (D2O, 500 MHz)signály navíc oproti příkladu 3: δ 5,41 - 5,34 (m, 2H, CH=CH),
2,48 - 2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2.-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)i2), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH?-CH3) ppm
SS (acylace) = 12 % (stanoveno z *H NMR)
Fluorimetr: Xem.max^ 710 nm (při Xexc, = 685 nm; H2O)
Příklad 19: Esterifikace HA-Cypát kyselinou olejovou
300 mg (0,73 mmol, 1 ekv.) konjugátu HA-Cypát připraveného podle příkladu 3 bylo rozpuštěno v 15 ml demi vody a 11 ml AIPA, následně bylo přidáno 246 mg (2,20 mmol, 3 ekv.) DABCO a 4,5 mg (0,04 mmol, 0,05 ekv.) DMAPu. Mezitím bylo 139 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) kyseliny cis-oktadek-9-enové rozpuštěno ve 2 ml AIPA, přidáno 148 mg (1,32 mmol, 1,8 ekv.) DABCO, 51 μΐ (0,44 mmol, 0,6 ekv.) benzoylchloridu a ponecháno reagovat za stálého míchání 30 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí dané doby bylo vše kvantitativně přeneseno k první reakční směsi, kdy probíhala esterifikace po dobu 2 hod. při laboratorní teplotě.
Reakce byla ukončena přidáním velkého nadbytku AIPA a nasyceného roztoku NaCl, přičemž došlo k vysrážení produktu. Surový produkt byl promyt 4 x 200 ml AIPA, dále rozpuštěn v demineralizované vodě a přenesen do dialyzačního střeva. Dialýza probíhala 24 hod.
oproti proti 0,5% NaHCCh a 0,5% NaCl a dále 48 hod. v demineralizované vodě. Produkt byl získán ve formě zeleného lyofílizátu ve výtěžku 183 mg (60 %).
]H NMR (D2O, 500 MHz)signály navíc oproti příkladu 3: δ 5,41 - 5,34 (m, 2H, CH=CH),
2,48 - 2,40 (m, 2H, -CH2-CO-), 1,68 - 1,54 (m, 2H, -CH2-CH2,-CO-), 1,40 - 1,23 (m, 24 H, (CH2)i2), 0,91 - 0,68 (m, 3H.-CH2-CH3) ppm
SS (acylace) = 3 % (stanoveno z *H NMR)
Fluorimetr: Xem.max= 710 nm (při λεχο. 685 nm; H2O)
Příklad 20: Loadování hydrofobizovaného HA-Cypát nepolární látkou
150 mg acylovaného konjugátu HA-cypát připraveného podle příkladu 14 bylo 2 hod. rozpouštěno v 15 ml demi vody za stálého míchání na magnetické míchačce. Po té bylo postupně přidáno 10 mg paklitaxelu ve 2 ml chlorofomu a výsledná směs byla odpařena (RVO) do sucha a následně hydratována demi vodou (15 ml). Nenavázaný paklitaxel byl odstraněn filtrací přes 1,0 pm skleněný filtr a výsledný produkt byl zlyofilizován.
Množství navázaného paklitaxelu (HPLC stanovení): 4,2% (hmotn.)
Příklad 21: Loadování hydrofobizovaného HA-Cypát nepolární látkou
150 mg acylovaného konjugátu HA-cypát připraveného podle příkladu 16 bylo 2 hod. rozpouštěno v 15 ml demi vody za stálého míchání na magnetické míchačce. Po té bylo postupně přidáno 15 mg doxorubicinu ve 2 ml chlorofomu a výsledná směs byla nejprve sonikována (pulsní sonikace, cca 15 min, 200 W, amplituda 65%, cyklus 0.5s) do dosažení homgenní směsi a po té odpařena (RVO) do sucha a následně hydratována demi vodou (15 ml). Nenavázaný doxorubicin byl odstraněn filtrací přes 1,0 pm skleněný filtr a výsledný produkt byl zlyofilizován.
Množství navázaného doxorubicinu (HPLC stanovení): 7,5% (hmotn.)
Příklad 22: Loadování hydrofobizovaného HA-Cypát nepolární látkou • · · · · · • · · · · · · • · · · · · •· ······· ······
150 mg acylovaného konjugátu HA-cypát připraveného podle příkladu 16 bylo 2 hod. rozpouštěno v 15 ml demi vody za stálého míchání na magnetické míchačce. Po té bylo postupně přidáno 2 mg špionů na bázi oxidů železa (FeaCh, Fe3O4) (5mm) a 20 mg doxorubicinu v 5 ml chlorofomu a výsledná směs byla nejprve sonikována (pulsní sonikace, cca 15 min, 200 W, amplituda 65%, cyklus 0.5s) do dosažení homgenní směsi a po té odpařena (RVO) do sucha a následně hydratována demi vodou (15 ml). Nenavázaný doxorubicin byl odstraněn filtrací přes 1,0 pm skleněný filtr a výsledný produkt byl zlyofilizován.
Množství navázaného doxorubicinu (HPLC stanovení): 6,5% (hmotn.), navázaných špionů: 2% (hmotn.)
Příklad 23: In vivo experiment - fluorescence konjugátu HA-Cypát
Pro in vivo experimenty byl HA-Cypát, připravený podle Příkladu 3, rozpuštěn ve fyziologickém roztoku (c = 3,8 mg derivátu ve 100 μΐ roztoku) a následně sterilizován filtrací (0,22 pm). Laboratorní myši typu Balb/c v narkóze bylo aplikováno subkutánně 50 μΐ (Obr. 9) a nebo intraperitoneálně 150 μΐ (Obr. 10) sterilizovaného roztoku daného derivátu. Fluorescence byla detekována za použití kombinací různých excitačních vlnových délek a emisních filtrů
Obr. 9 a 10 ukazuje dostatečnou intenzitu fluorescence derivátu po subkutánním a intraperitoneálním podání pro in vivo zobrazování. Zobrazování lze uskutečnit za použití různých excitačních délek (530-745 nm), a filtrů pro emisi (ICG, Cy5.5). Filtr DsRed nelze použít. Z Obr. 10 je dále zřejmá stabilita derivátu jako fluoroforu po intraperitoneálním podání.
Příklad 24: In vivo experiment -fluorescence konjugátu HA-Cypát-C18:l
HA-Cypát-C18:l (SS =10 %) připravený podle Příkladu 13 byl rozpuštěn ve fosfátovém pufru (c = 3,6 mg konjugátu ve 100 μΐ roztoku a sterilizován filtrací (0,22 pm). 100 μΐ takto připraveného roztoku bylo aplikováno intravenózně dvěma modelovým myším Balb/c (pod narkózou) a pozorována jeho fluorescence in vivo po dobu 7 dnů (Obr. 11).
Obr. 11 ukazuje, že HA-Cypát-C18:l se distribuje po i.v. podání u zdravé myši zejména do jater. Fluorescence konjugátu je dostatečná pro in vivo zobrazování, fluorescence konjugátu je dále velmi stabilní, po jednom podání lze zobrazení provádět po dobu 2 týdnů.
• · ·· v · • · · · · · · ·· · · · · · · ·· ·· · · ·· · ♦ • · ♦ · · · ·· • · ♦ · · ·· ···· ·· ··· ···· ··· ··*
Přiklad 25: In vivo experiment - fluorescence konjugátu HA-Cypát-C18:l
HA-Cypát-C18;l (SS =10 %) připravený podle Příkladu 13 byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku (c = 1,8 mg konjugátu ve 100 μΐ roztoku) a sterilizován filtrací (0,22 pm). 100 μΐ takto připraveného roztoku bylo aplikováno intravenózně 3 modelovým myším Balb/c (pod narkózou) s nehmatným prsním nádorem (ortotopické podání 4T1 luc buněk, zobrazitelných pomocí chemiluminiscence -detekce luciferázové aktivity po i.p. injikaci luciferinu) a pozorována jeho fluorescence in vivo po dobu 72 hod. (Obr. 12).
Obr. 12 ukazuje, že HA-Cypát-C18:l se distribuje po i.v. podání do jater a dále po 24 hodinách do velmi malého (nehmatného) nádoru. V nádoru se akumulace HA-Cypát-C18:l s časem zvyšuje a přítomnost konjugátu v nádoru je velmi výrazná i po 15ti dnech od podání konjugátu. Fluorescence konjugátu in vivo je tedy velmi stabilní a konjugát lze použít na zobrazení velmi malých nádorů a dále k časovému sledování růstu nádoru. V levém poli obrázku je kontrolní zobrazení nádoru luminiscentním zobrazením (detekce luciferázové aktivity).
Příklad 26: In vivo experiment - fluorescence konjugátu HA-Cypát-C18:l modelovým myším Balb/c (pod narkózou) byly ortotopicky podány 4T1 luc buňky, (buňky zobrazitelné pomocí chemoluminiscence -detekce luciferázové aktivity po i.p. aplikaci luciferinu) a prsní nádor se nechal 14 dnů růst. 14. den byly myši rozděleny do 3 skupin (1 skupina = 3 zvířata). Každé skupině byl 14., 21. a 28. den intravenózně podán 1 mg vybraného konjugátu ve 100 μΐ fosfátového pufru následovně: první skupině byl podán HA-Cypát-C18:l připravený v příkladu 13, druhé skupině HA-Cypát-C18:l loadovaný doxorubicinem, připravený v příkladě 21a třetí skupině HA-Cypát-C18:l loadovaný doxorubicinem a špiony, připravený v příkladě 22. Po dobu 35 dní byla vyhodnocována radiance in vivo (Obr. 13), po té byly myši utraceny a byla porovnána hmotnost nádoru a sleziny v jednotlivých skupinách (Obr. 14).
Obr. 13 ukazuje, že nádor nejvíce rostl ve skupině, které byl podán pouze HA-Cypát. Oproti tomu pomalejší růst byl zaznamenán u léčených skupin, kterým byl podán HA-CypátC18:l+doxorubicin, a/nebo HA-Cypát-C18:l+doxorubicin+spion.
Obr. 14 ukazuje, že první (neléčená) skupina měla největší hmotnost sleziny a nádoru. V daném modeluje zvětšená slezina indikací progrese nemoci (duPre et al., Experimental and Molecular Pathology 2007, 82, 12-24). Druhá (léčená) a třetí (léčená) skupina měla slezinu výrazně menší a nádor menší oproti první skupině. Nejmenší nález nádoru byl zjištěn u třetí skupiny. Nosičový systém tedy může nejenom zobrazit, ale i léčit nádor a plní funkci teranostika.
Příklad 27: In vivo experiment - fluorescence konjugátu HA-Cypát-C18:l
HA-Cypát-C18:l (SS =10 %) připraveného podle Příkladu 13 byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku (c = 0; 0,625; 1,25; 2,5 mg konjugátu ve 100 μΐ roztoku) a sterilizován filtrací (0,22 μιη). 100 μΐ takto připravených roztoků bylo aplikováno intraperitoneálně 4 modelovým myším Balb/C (pod narkózou) s prsním nádorem (35.den od ortotopické podání 4T1 luc buněk, zobrazitelných pomocí chemoluminiscence -detekce luciferázové aktivity po
i.p. injikaci luciferinu) a pozorována jeho fluorescence in vivo po dobu 7 dnů (Obr. 15).
Obr. 15 ukazuje, že HA-Cypát-C18:l se distribuje po i.p. podání do nádoru a jater. Nádor je bez problému zobrazitelný in vivo minimálně po dobu 7 dnů od podání konjugátu ve všech použitých koncentracích. V levém poli obrázku je kontrolní zobrazení nádoru luminiscentním zobrazením (detekce luciferázy). Pravé pole obrázku ukazuje 4 myši, kterým byl podán roztok derivátu - z leva do prava koncentrace roste: (0;0,625;1.25; 2,5 mg konjugátu podaného ve 100 μΐ roztoku).
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl obecného vzorce I, (I), kde R+je H+ nebo fyziologicky přijatelná sůl vybraná ze skupiny obsahující Na+, K+, Mg2+ nebo Ca2+,R1 je -H nebo zbytek cypátu vzorce II, kde ~ je místo kovalentní vazby zbytku cypátu vzorce IIO • · · · přičemž v alespoň jedné opakující se jednotce je jeden R1 zbytek cypátu vzorce II s tím, že pokud v jednotce je R1 zbytek cypátu, pak ostatní R* v jednotce jsou H, a kde n je celé číslo v rozmezí 2 až 625.
- 2. Fluorescenční konjugát podle nároku 1, kde zbytek cypátu vzorce II je v pozici 6 glukosaminové části fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I.
- 3. Fluorescenční konjugát podle nároku 1 nebo nároku 2, kde stupeň substituce zbytku cypátu vzorce II v konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I je od 0,1 do 2%, s výhodou 1,0%.
- 4. Fluorescenční konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který absorbuje světlo v oblasti 570 nm až 790 nm a emituje světlo v oblasti 680 nm až 850 nm, s výhodou při 850 nm.
- 5. Hydrofobizovaný fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho soli podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde R+, R1 a n jsou, jak definováno v nároku 1, přičemž zároveň platí, že v alespoň jedné opakující se jednotce alespoň jeden R1 je -C(=O)R2, kde R2 je CxHy substituent, kde x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y je celé číslo v rozmezí 11 až 35, přičemž jde o lineární nebo rozvětvený, nasycený nebo nenasycený C6-C18 alifatický řetězec.
- 6. Hydrofobizovaný fluorescenční konjugát podle nároku 4, kde stupeň substituce C(=O)R2 v konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I je od 3 do 70 %, s výhodou 5 až 12%.
- 7. Hydrofobizovaný fluorescenční konjugát podle nároku 4 nebo nároku 5, který absorbuje světlo v rozmezí vlnových délek 570 nm až 790 nm a emituje světlo při 680 až 850 nm, s výhodou 850 nm.
- 8. Způsob přípravy konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že cypát I vzorce III je aktivován pomocí Ν,Ν'-karbonyldiimidazolu (CDI) v aprotickém polárním rozpouštědle vybraném ze skupiny obsahující dimethylsulfoxid, dimethylformamid, formamid nebo acetonitril, s výhodou dimethylsulfoxid; za vzniku reaktivního intermediátu mono-imidazolidu vzorce IV který reaguje s kyselinou hyaluronovou nebo její solí v přítomnosti organické báze, která je buď generovaná in šitu ve formě ímidazolu, nebo přidaná do reakční směsi a vybraná ze skupiny obsahující (l,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan), A(V,V',V-tetramethyl-l,6hexandiamin, V-methylmorfolin, imidazol, triethylamin, nebo ΛζΝ'-diisopropylethy lamin, s výhodou imidazol generovaný in situ\ a polárního aprotického rozpouštědla, jak definováno výše.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že aktivace cypátu se provede při teplotě v rozsahu 20°C až 60 °C, s výhodou při 22°C až 25 °C; po dobu 10 min. až 20 hod., s výhodou 0,5 až 2 hod.
- 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že tvorba konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli se provede při teplotě 40 °C až 80°C, s výhodou 40 °C až 60 °C, výhodněji 60°C; po dobu 12 až 48 hod, s výhodou 24 hod.
- 11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že molární poměr cypát I : kyselina hyaluronová nebo její sůl: Ν,Ν'-karbonyldiimidazolu : organická báze je 0,5 : 1 : 0,5 : 0,5 až 3,5 v reakční směsi, s výhodou je hmotnostní poměr 0,5 : 1 : 0,5 : 1.• ·
- 12. Způsob přípravy hydrofobizovaného fluorescenčního konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že se provede aktivace mastné kyseliny obecného vzorce VR2COOH (V), kde R2 je CxHy, přičemž x je celé číslo v rozmezí 5 až 17 a y je celé číslo v rozmezí 11 až 35 a CxHy je lineární nebo rozvětvený, nasycený nebo nenasycený řetězec; pomocí substituovaného nebo nesubstituovaného benzoyl chloridu obecného vzorce VI kde R3 je jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny obsahující Η, -NO2, -COOH, halogenidy, Ci-Cealkylalkoxy, s výhodou H;v přítomnosti organické báze vybrané ze skupiny obsahující (l,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan), N,N,N',N'-tetramethyl-I,6-hexandiamin, N-methylmorfolin, triethylamin nebo N,N'diisopropylethylamin, s výhodou triethylamin; a polárního rozpouštědla vybraného ze skupiny obsahující isopropylalkohol, tetrahydrofuran, s výhodou isopropylalkohol za vzniku reaktivního anhydridu obecného vzorce VII (Vil), kdeR2 a R3 jsou, jak je definováno výše, který esterifikuje fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl obecného vzorce (I), jak je definován ve kterémkoliv z nároků 1 až 3, v přítomnosti organické báze, s výhodou aminu vybraného ze skupiny obsahující (l,4-diazabi-cyklo[2.2.2]oktan), N,N,N',N'-tetramethyl-l,6-hexandiamin, N-methylmorfolin, imidazol, triethylamin nebo Ν,Ν'-diisopropylethylamin, výhodněji triethylamin; směsi vody a vodou mísitelného polárního rozpouštědla vybraného ze skupiny obsahující izopropylalkohol, dimethylsulfoxid nebo tetrahydrofuran, s výhodou izopropylalkohol.
- 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že aktivace mastné kyseliny obecného vzorce V se provádí po dobu 0,5 až 24 hod., při teplotě v rozmezí 0 °C až 60 °C, s výhodou 0,5 hod. při teplotě od 0 °C do 25 °C, a esterifikace fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli se provádí po dobu 0,5 až 2 hod., s výhodou 2 hod., při teplotě v rozmezí 22 °C až 25 °C.
- 14. Způsob podle nároku 12 nebo nároku 13 vyznačující se tím, že množství organické báze odpovídá 2 až 6 molární ekvivalent, s výhodou 4 molární ekvivalent na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli;množství substituovaného nebo nesubstituovaného benzoyl chloridu odpovídá 0,2 až 2,0 molární ekvivalent, s výhodou 0,6 molární ekvivalent na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli;množství mastné kyseliny odpovídá 0,2 až 2,0 molárním ekvivalentům, s výhodou 0,6 molárnímu ekvivalentu na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli.
- 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14 vyznačující se tím, že množství vody ve směsi voda a vodou mísitelné polární rozpouštědlo je 50 až 80 % obj/obj, s výhodou 50% obj/obj.
- 16. Fluorescenční konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro použití při medicínských aplikacích pro in vivo zobrazování distribuce konjugátu, s výhodou pro in vivo zobrazování orgánů nebo novotvarů.
- 17. Fluorescenční konjugát podle nároku 16 pro použití při intravenózním, intraperitoneálním nebo subkutánním podání.
- 18. Fluorescenční konjugát podle nároku 16 pro použití při podání pro in vivo zobrazování nehmatných a/nebo hmatných nádorů.
- 19. Fluorescenční konjugát podle nároku 18 pro použití při intravenózním, intraperitoneálním podání.
- 20. Kompozice na bázi agregovaného hydrofobizovaného fluorescenčního konjugátu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 vyznačující se tím, že obsahuje agregáty hydrofobizovaných fluorescenčních konjugátů a alespoň jednu nebo více nepolárních látek, s výhodou léčiv a/nebo nanočástic.
- 21. Kompozice podle nároku 20 vyznačující se tím, že léčivem je cytostatikum, s výhodou doxorubicin nebo paklitaxel.
- 22. Kompozice podle nároku 20 vyznačující se tím, že hydrofobizovaným fluorescenčním konjugátem je konjugát podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, kde R1 -C(=O)Ci7H33 a nanočástice jsou superparamagnetické nanočástice.
- 23. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 20 až 22 vyznačující se tím, že obsahuje 2 až 15 hmotn.%, s výhodou obsahuje 2 až 6 hmotn.% nepolárních látek vzhledem k hmotnostnímu obsahu hydrofobizovaného fluorescenčního konjugátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli.
- 24. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 20 až 23 pro použití při medicínských aplikacích pro in vivo zobrazování novotvarů.
- 25. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 20 až 23 pro použití k léčbě novotvarů.
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-936A CZ307511B6 (cs) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití |
| PCT/CZ2016/050048 WO2017108015A1 (en) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Fluorescent cypate conjugate of hyaluronic acid or salt thereof, hydrophobized conjugate, methods of perparation and use thereof |
| ES16840310T ES2751091T3 (es) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Conjugado fluorescente de cypate y de ácido hialurónico o sal del mismo, conjugado hidrofobizado, métodos de preparación y uso del mismo |
| HUE16840310A HUE045756T2 (hu) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Hialuronsav vagy annak sójának fluoreszcens cypate konjugátuma, hidrofóbizált konjugátum, eljárás ezek elõállítására és alkalmazására |
| RU2018123820A RU2018123820A (ru) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Флуоресцентный конъюгат гиалуроновой кислоты или ее соли, гидрофобизованный конъюгат, способы его получения и применение |
| PL16840310T PL3393527T3 (pl) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Fluorescencyjny koniugat cypate i kwasu hialuronowego lub jego soli, hydrofobizowany koniugat, sposoby wytwarzania i jego zastosowanie |
| EP16840310.3A EP3393527B1 (en) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Fluorescent cypate conjugate of hyaluronic acid or salt thereof, hydrophobized conjugate, methods of preparation and use thereof |
| DK16840310.3T DK3393527T3 (da) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Fluorescerende cypatkonjugat af hyaluronsyre eller salt deraf, konjugat der er gjort hydrofobt, fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf |
| US16/061,748 US20190001000A1 (en) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | Fluorescent Cypate Conjugate of Hyaluronic Acid or Salt Thereof, Hydrophobized Conjugate, Methods of Preparation and Use Thereof |
| BR112018012554A BR112018012554A2 (pt) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | conjugado fluorescente de ácido hialurônico ou seu sal, derivado hidrofobizado de conjugado fluorescente de ácido hialurônico ou seu sal, método de preparação do conjugado fluorescente, método de preparação do derivado hidrofobizado do conjugado fluorescente, composição a base do agregado de derivado hidrofobizado do conjugado fluorescente |
| JP2018533195A JP2019501262A (ja) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | ヒアルロン酸又はその塩の蛍光Ｃｙｐａｔｅ複合体，疎水化複合体，それらの調製方法及び使用 |
| KR1020187021096A KR20180096761A (ko) | 2015-12-23 | 2016-12-22 | 히알루론산 또는 이의 염의 형광 접합체, 소수성화된 접합체, 제조 방법 및 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-936A CZ307511B6 (cs) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2015936A3 true CZ2015936A3 (cs) | 2017-07-07 |
| CZ307511B6 CZ307511B6 (cs) | 2018-10-31 |
Family
ID=59089116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-936A CZ307511B6 (cs) | 2015-12-23 | 2015-12-23 | Fluorescenční konjugát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl, hydrofobizovaný konjugát, způsoby jejich přípravy a použití |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20190001000A1 (cs) |
| EP (1) | EP3393527B1 (cs) |
| JP (1) | JP2019501262A (cs) |
| KR (1) | KR20180096761A (cs) |
| BR (1) | BR112018012554A2 (cs) |
| CZ (1) | CZ307511B6 (cs) |
| DK (1) | DK3393527T3 (cs) |
| ES (1) | ES2751091T3 (cs) |
| HU (1) | HUE045756T2 (cs) |
| PL (1) | PL3393527T3 (cs) |
| RU (1) | RU2018123820A (cs) |
| WO (1) | WO2017108015A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115501204B (zh) * | 2022-10-25 | 2023-07-21 | 河北工业大学 | 一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6180087B1 (en) | 2000-01-18 | 2001-01-30 | Mallinckrodt Inc. | Tunable indocyanine dyes for biomedical applications |
| US6669926B1 (en) | 2000-10-16 | 2003-12-30 | Mallinckrodt, Inc. | Hydrophilic light absorbing indole compounds for determination of physiological function in critically ill patients |
| WO2006078914A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Washington University In St. Louis | Compounds having rd targeting motifs |
| WO2008025005A2 (en) * | 2006-08-24 | 2008-02-28 | Baylor College Of Medicine | Method of measuring propulsion in lymphatic structures |
| US8758727B2 (en) | 2008-03-31 | 2014-06-24 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Site specific fluorescence and contrast marker for same |
| CZ305040B6 (cs) | 2010-09-14 | 2015-04-08 | Contipro Biotech S.R.O. | Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové |
| JP2012149034A (ja) * | 2010-12-27 | 2012-08-09 | Canon Inc | 複合粒子、光音響イメージング用造影剤、及び光音響イメージング方法 |
| KR20130085294A (ko) * | 2012-01-19 | 2013-07-29 | 충남대학교산학협력단 | 림프노드 탐지용 형광 고분자 나노젤 및 이를 이용한 림프노드 확인 방법 |
| US20160067357A1 (en) * | 2012-08-17 | 2016-03-10 | Apellis Pharmaceuticals, Inc. | Detection of high risk drusen |
| CZ2012842A3 (cs) | 2012-11-27 | 2014-08-20 | Contipro Biotech S.R.O. | Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití |
| JP6230443B2 (ja) * | 2013-02-22 | 2017-11-15 | キヤノン株式会社 | 近赤外色素結合ヒアルロン酸誘導体およびそれを有する光イメージング用造影剤 |
-
2015
- 2015-12-23 CZ CZ2015-936A patent/CZ307511B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-12-22 US US16/061,748 patent/US20190001000A1/en not_active Abandoned
- 2016-12-22 EP EP16840310.3A patent/EP3393527B1/en not_active Not-in-force
- 2016-12-22 PL PL16840310T patent/PL3393527T3/pl unknown
- 2016-12-22 JP JP2018533195A patent/JP2019501262A/ja not_active Withdrawn
- 2016-12-22 BR BR112018012554A patent/BR112018012554A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-12-22 DK DK16840310.3T patent/DK3393527T3/da active
- 2016-12-22 ES ES16840310T patent/ES2751091T3/es active Active
- 2016-12-22 WO PCT/CZ2016/050048 patent/WO2017108015A1/en active Application Filing
- 2016-12-22 RU RU2018123820A patent/RU2018123820A/ru not_active Application Discontinuation
- 2016-12-22 HU HUE16840310A patent/HUE045756T2/hu unknown
- 2016-12-22 KR KR1020187021096A patent/KR20180096761A/ko not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019501262A (ja) | 2019-01-17 |
| DK3393527T3 (da) | 2019-10-07 |
| EP3393527B1 (en) | 2019-08-28 |
| WO2017108015A1 (en) | 2017-06-29 |
| BR112018012554A2 (pt) | 2018-12-04 |
| RU2018123820A3 (cs) | 2020-03-03 |
| CZ307511B6 (cs) | 2018-10-31 |
| ES2751091T3 (es) | 2020-03-30 |
| RU2018123820A (ru) | 2019-12-30 |
| PL3393527T3 (pl) | 2020-03-31 |
| KR20180096761A (ko) | 2018-08-29 |
| US20190001000A1 (en) | 2019-01-03 |
| EP3393527A1 (en) | 2018-10-31 |
| HUE045756T2 (hu) | 2020-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Tumor microenvironment (TME)-activatable circular aptamer-PEG as an effective hierarchical-targeting molecular medicine for photodynamic therapy | |
| ES2863982T3 (es) | Formación de imágenes fluorescentes ópticas que utiliza colorantes cianina | |
| EP2682131B1 (en) | Switching-type fluorescent nanoparticle probe, and fluorescent molecular imaging method using same | |
| EP2609935B1 (en) | Switching fluorescent nanoparticle probe and fluorescent particle imaging method using same | |
| JP2012520856A (ja) | 光学イメージング剤 | |
| PT988060E (pt) | ''compostos corantes lábeis na presença de ácidos e dissociáveis enzimaticamente para o diagnóstico com luz de infravermelhos próximos e para o uso em terapia'' | |
| Hu et al. | 6-Aminocaproic acid as a linker to improve near-infrared fluorescence imaging and photothermal cancer therapy of PEGylated indocyanine green | |
| KR100825939B1 (ko) | 근적외선 형광체가 결합된 양친성 고분자의 나노 입자를포함하는 암 진단용 조영제 | |
| KR102280761B1 (ko) | 후코이단 기반의 쎄라그노시스 조성물 | |
| Yuan et al. | Sharp pH-sensitive amphiphilic polypeptide macrophotosensitizer for near infrared imaging-guided photodynamic therapy | |
| Dong et al. | Development of a novel sialic acid-conjugated camptothecin prodrug for enhanced cancer chemotherapy | |
| EP3393527B1 (en) | Fluorescent cypate conjugate of hyaluronic acid or salt thereof, hydrophobized conjugate, methods of preparation and use thereof | |
| KR102041246B1 (ko) | 양쪽이온성 알긴산 유도체 및 이를 포함하는 조영제 조성물 | |
| Chen et al. | Dual fluorescence nano-conjugates based on gold nanoclusters for tumor-targeting imaging | |
| US20130331690A1 (en) | Vascular imaging agents | |
| KR101732796B1 (ko) | 당화합물(sugar chemical compound)-탁산화합물(taxane compound) 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조 방법 | |
| KR102266865B1 (ko) | 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법 | |
| WO2017191219A1 (en) | Nano-systems for therapy and/or diagnosis and/or therapy monitoring and/or theranostics of disease | |
| WO2016143017A1 (ja) | 光音響イメージング用ナノ粒子 | |
| KR20150095108A (ko) | 히알루로니다제의 생체 내 활성 모니터링을 위한 나노하이드로젤 및 그 제조 방법 | |
| 이재영 | Phenylboronic acid-decorated chondroitin sulfate A-based nanoparticles for solid tumor targeting and penetration | |
| KR101352616B1 (ko) | 하이드로시아닌으로 컨쥬게이션된 기능성 나노캐리어를 포함한 활성산소종 검출장치 및 이를 포함하는 생체 내 종양부위 이미징 장치 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20221223 |