CZ2015324A3 - 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo [4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky - Google Patents

5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo [4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky Download PDF

Info

Publication number
CZ2015324A3
CZ2015324A3 CZ2015-324A CZ2015324A CZ2015324A3 CZ 2015324 A3 CZ2015324 A3 CZ 2015324A3 CZ 2015324 A CZ2015324 A CZ 2015324A CZ 2015324 A3 CZ2015324 A3 CZ 2015324A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino
group
pyridyl
alkyl
substituted
Prior art date
Application number
CZ2015-324A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ307147B6 (cs
Inventor
Libor HavlĂ­ÄŤek
turc AntonĂ­n Ĺ
Vladimír Kryštof
Radek Jorda
Tomáš Pospíšil
Stefan Zahler
Angelika Vollmar
Miroslav Strnad
Original Assignee
Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. filed Critical Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2015-324A priority Critical patent/CZ307147B6/cs
Priority to EP15784268.3A priority patent/EP3294741B1/en
Priority to PCT/CZ2015/050006 priority patent/WO2016180380A1/en
Priority to US15/558,151 priority patent/US9957273B2/en
Publication of CZ2015324A3 publication Critical patent/CZ2015324A3/cs
Publication of CZ307147B6 publication Critical patent/CZ307147B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny jsou silnými inhibitory proteinkináz, a to zejména cyklin-dependentních kináz CDK2 a CDK5, a vykazují antileukemické, proapooptotické, antiangiogenní i protinádorové účinky. Vynález se dále týká způsobů jejich přípravy, farmaceutických přípravků obsahujících tyto sloučeniny a jejich použití pro léčbu, a to zejména onemocnění spojených s proliferací, apoptózou, angiogenezí a záněty, jako jsou leukemie a metastázující solidní nádory.

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká 5-substituto váných 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidinů, způsobů jejich přípravy, farmaceutických přípravků obsahujících tyto sloučeniny a jejich použití pro léčbu leukémií a metastazujících solidních nádorů.
Dosavadní stav techniky
Cyklin-dependentní kinázy (CDK) jsou enzymy, které fosforylují serinová a threoninová residua v proteinech, a jsou považovány za hlavní regulatory buněčného cyklu (CDK1, 2, 4, 6) a transkripce (CDK7, 8, 9, 11, 20). V poslední době se však objevují také důkazy o zapojení těchto enzymů do dalších procesů, jako jsou angiogeneze, senescence, exocytóza, spermatogeneze a vývoj neuronů (Malumbres M. Genome Biol 2014; 15:122). Aktivita CDK je závislá na asociaci s regulačními proteiny cykliny, které jsou v buňkách syntetizovány a degradovány pouze během určitých fází buněčného cyklu. K načasování aktivity CDK během cyklu slouží také negativní prvky, jako jsou přirozené proteinové inhibitory CDK (INK4, Cip/Kip) a inhibující kinázy Weel a Myti, jejichž působení revertují fosfatázy cdc25 (Pavletich NP, J Mol Biol 1999;287:821-828; Boutros and Duccomun, Cell Cycle 2008;7:401-406).
Poruchy v regulaci aktivity CDK (jejich hyperaktivita) byly identifikovány jako jedna ze základních společných vlastností nádorů, přičemž k nim může vést několik zcela odlišných molekulárních mechanismů. Mezi nejběžnější mechanismy patří inaktivující mutace (delece, bodové mutace) nebo epigenetické umlčování genů kódujících přirozené inhibitory CDK nebo zvýšená exprese genů kóduj ích cykliny. V některých typech nádorů prsu, močového měchýře, jícnu je pozorována zvýšená produkce cyklinu Dl, zvýšená produkce cyklinu E je typická pro některé nádory tlustého střeva, plic, prsu a některé leukemie, cyklin A bývá nadměrně produkován některými karcinomy plic (Hall and Peters, Adv Cancer Res 1996;68:67-108; Leach et al, Cancer Res 1993;53:1986-1989; Dobashi et al, Am J Pathol 1998;153:963-972;
Keyomarsi et al, Oncogene 1995;11:941-950; lida et al, Blood 1997;90:3707-3713). S menší četností jsou pozorovány také změny související přímo s CDK, a to zejména CDK4 a CDK6, které mohou být hyperaktivní v důsledku amplifikace nebo zvýšené exprese těchto genů (Nagel et al, Leukemia 2008;22:387-392, Faussillon et al, Cancer Lett 2005;221:67-75, Tang et al., Clin Cancer Res 2012;18:4612-4620).
Pro buněčnou transformaci normální buňky v nádorovou a pro udržování nádorového fenotypu mohou být v některých případech významné také nemitotické CDK, tedy ty kinázy, které se nepodílejí přímo na regulaci buněčného cyklu. Zvlášť významným příkladem je kináza CDK9, která reguluje elongační fázi transkripce mRNA a to fosforylací C-terminální domény RNA polymerázy II. Řada nádorů a leukémií se vyznačuje vysokou závislostí na produkci antiapoptotických a prosurvival genů, jako jsou například Mcl-1 a survivin (Chen et al, Blood 2005, 106, 2513; McMillin et al, Br. J. Haematol. 2011, 152, 420). Dalším důležitým příkladem je kináza CDK5, která reguluje buněčnou migraci. Její hyperaktivace byla zjištěna v některých nádorech a zřejmě souvisí s jejich schopností metastázovat (Eggers et al, Clin Cancer Res. 2011; 17(19):6140-5). CDK5 je ale také vysoce aktivní v proliferujících endotelových buňkách (J Cell Biochem. 2004; 91(2): 398-409), v nichž podporuje schopnost migrovat a přispívat tak k nádorové angiogenezi (Liebl et al, J Biol Chem. 2010; 285(46):35932-43).
Z výše uvedených důvodů jsou považovány CDK a s nimi asociované proteiny za významné cíle pro novou generaci protinádorově aktivních sloučenin. Vývoj léčiv v této oblasti je zaměřen převážně na nízkomolekulámí inhibitory. Většina známých inhibitorů CDK vykazuje schopnost inhibovat jak kinázy regulující buněčný cyklus, tedy CDK1, CDK2 a CDK4, tak i transkripční regulátory, CDK7 a CDK9, a jsou proto označovány jako panselektivní inhibitory. Mechanismus jejich účinku zahrnuje kromě zastavení buněčného dělení také indukci apoptózy, k níž jsou nej citlivější buňky s vysokou expresí antiapoptotických proteinů s nízkou stabilitou, jako je zmiňovaný Mcl-1. Je dobře zdokumentováno, že CDK inhibitory roskovitin a flavopiridol jsou poměrně účinné proti mnohočetnému myelomu a několika dalším malignitám, které jsou závislé na kontinuální syntéze mRNA a expresi Mcl-1 (Ráje et al, Blood 2005;106:1042-1047; Gojo et al, Clin Cancer Res 2002;8:3527-3538). Inhibitory transkripčních CDK ovlivňují také expresi nádorového supresoru p53. Činí tak nejspíše tlumením exprese jeho cílových genů, mezi něž patří ubiquitinligáza Mdm2, která negativně zpětnovazebně reguluje p53 (Dai and Lu, J Biol Chem 2004;279:44475-44482). Na základě řady studií in vitro bylo navrženo, že pro silný protinádorový účinek je nutné inhibovat zároveň aktivitu několika CDK najednou (např. CDK1, 2 and 9) a že klinicky nejvýhodnější by měly být právě panselektivní inhibitory CDK (Cai et al, Cancer Res 2006;66:9270-9280).
Dále bylo v preklinických experimentech zjištěno, že inhibice CDK5 vede k potlačení růstu nádorů pankreatu a karcinomu prsu a také ke snižování jejich metastatické progrese (Feldman et al, Cancer Res. 2010;70(l 1 ):4460-9; Feldman et al, Cancer Biol Ther. 2011; 12(7):598-609; Liang et al, Sci Rep. 2013;3:2932). Na molekulární úrovni je CDK5 významná pro epiteliálně-mezenchymální přechod karcinomu prsu indukovaný TGF-b a pro jeho progresi (Liang et al, Sci Rep. 2013;3:2932). Navíc je inhibice CDK5 výhodná také pro tlumení nádorové vaskularizace, neboť blokuje migraci endotelových buněk (Liebl et al., J Biol Chem. 2010;285(46):35932-43; Liebl et al., Angiogenesis. 2011;14(3):281-91). V některých leukemických buňkách fosforyluje CDK5 antiapoptotický protein Noxa, člen rodiny Bcl-2 charakteristický přítomností domény BH3-only; inhibice CDK5 indukovala v leukemických buňkách apoptózu (Lowman et al, Mol Cell 2010;40(5):823-33).
Podstatou tohoto vynálezu jsou nové sloučeniny s vysokou aktivitou protinádorovou, antileukemickou a antiangiogenní.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu jsou 5-substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I
R
N
N
I ve kterém
R je vybráno ze skupiny zahrnující
- heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
- heterocykloalkyl alkyl znamená C3-C10 cykloalkyl skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, a která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C]-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
- R’-X kde X je vybráno ze skupiny-NH- a -N(Ci-Cs alkyl), a
R’ je vybráno ze skupiny zahrnující
- C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl, popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem;
- (dialkylamino)alkyl skupinu, kde alkyl je vybrán nezávisle ze skupiny zahrnující C1-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl;
- C3-C10 cykloalkyl, což znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 10 uhlíkových atomů, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;
- heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu jak je definováno výše, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkyl je popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
- heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu jak je definováno výše, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2
C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkyl alkyl skupina je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
- benzylová skupina, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující fluoro, chloro, hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;
a jejich farmaceuticky přijatelné soli, zejména s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
S výhodou je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl vybrán ze skupiny zahrnující propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, heptyl, oktyl, a nonyl.
Ve výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný hydroxy skupinou vybrán ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethyl, 2(RS, R nebo S)-hydroxypropyl, 3hydroxypropyl, 4-hydroxybut-2(RS, R, nebo S)-yl, 2-hydroxy-2-methylpropyl, 3-hydroxy-3methylbutyl, 2,3-dihydroxypropyl, l-hydroxy-3-methylbut-2-yl a (3RS)-2-hydroxypent-3-yl.
Ve výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný amino skupinou vybrán ze skupiny zahrnující 2-aminoethyl, 3-aminopropyl, 4-aminobutyl, 5aminopentyl, 6-aminohexyl.
V dalším výhodném provedení je C2-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl substituovaný amino a hydroxy skupinou 3-amino-2-hydroxypropyl.
S výhodou je (dialkylamino)alkyl skupina vybrána ze skupiny zahrnující (dimethylamino)methyl, 2-(dimethylamino)ethyl, 3-(dimethylamino)propyl, 3(dimethylamino)butyl, (diethylamino)methyl, 2-(diethylamino)ethyl, 3-(diethylamino)propyl a 4-(diethylamino)butyl.
Ve výhodném provedení je C3-C10 cykloalkyl vybrán ze skupiny zahrnující cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl a cyklohexyl.
Ve výhodném provedení je C3-C10 cykloalkyl substituovaný amino skupinou vybrán ze skupiny zahrnující /ra/7.s-4-aminocyklohexyl, cz.s-4-aminocyklohexyl, cis,trans-A-aminocyklohexyl, czs-2-aminocyklohexyl, /ra/?.s-2-aminocyklohexyl, cis,trans-2-aminocyklohexyl, 3-aminocyklohexyl a cis, /razzs'-4-hydroxycyklohcxyl.
V dalším výhodném provedení je heterocykloalkyl vybrán ze skupiny zahrnující N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-
- thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-1 -yl, 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1 -yl.
Substituovaný benzyl je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující 2-methoxybenzyl, 3-methoxybenzyl, 4-methoxybenzyl, 3,5-dimethoxybenzyl, 2,6-dimethoxybenzyl, 2,4,6-trimethoxybenzyl, 3,4,5-trimethoxybenzyl, 2-fluorbenzyl, 3-fluorbenzyl, 4-fluorbenzyl, 2•chlorbenzyl, 3-chlorbenzyl a 4-chlorbenzyl.
Ve výhodném provedení je heterocykloalkyl alkyl vybrán ze skupiny zahrnující (aziridin-1—yljethyl, (azetidin-l-yl)ethyl, (azolidin-l-yl)ethyl, (piperidin-l-yl)ethyl, (aziridin-l-yl)propyl, (azetidin-l-yl)propyl, (azolidin-1-yljpropyl a (piperidin-l-yl)propyl.
V případě, že sloučeniny podle předloženého vynálezu mají chirální centrum, vynález zahrnuje všechny opticky aktivní isomery, jejich směsi i racemáty. Tedy sloučeniny obecného vzorce I, nezávisle na (R) nebo (S) konfiguraci na chirálních centrech, jsou zahrnuty v tomto vynálezu.
5-substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I jsou vhodné pro použití jako léčiva. Týká se to zejména jejich použití pro inhibici nekontrolované proliferace buněk a/nebo indukci apoptózy.
V jednom provedení 5-substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I jsou vhodné pro použití při potlačování nádorové angiogeneze.
V dalším provedení 5-substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I jsou vhodné pro použití pro léčbu nádorových onemocnění. Tyto sloučeniny zejména vykazují kombinovanou antiproliferativní, antiangiogenní, protizánětlivou a proapoptotickou aktivitu. Sloučeniny s obecným vzorcem I jsou vhodné zejména pro použití pro léčbu lidských a zvířecích leukémií, metastatických (solidních) nádorů.
V ještě dalším provedení 5-substitutovaných 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I jsou vhodné pro použití inhibici kinázy CDK5, která je jedním z klíčových regulátorů migrace endotělových buněk, a to skrze buněčnou adhezi, aktivitu mikrotubulárního a aktinového cytoskeletu a tvorbu lamelipodií, která je pro migraci nezbytná.
Proto jsou 5-substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I užitečné pro inhibici migrace savčích endotelových buněk a zejména pro inhibici a/nebo léčbu nádorové vaskularizace. Jsou vhodné nejen pro léčbu a/nebo inhibici vaskularizace nádorů, během embryonálního vývoje, menstruačního cyklu a hojení ran.
Dalším předmětem vynálezu je metoda léčby onemocnění spojených s aberantní buněčnou proliferací nebo apoptózou nebo migrací endotelových buněk, jako je rakovina (např. leukemie, solidní nádory, metastazující nádory), vaskularizace během rakoviny, embryonálního vývoje, menstruačního cyklu a hojení ran u savců vyžadujících takovouto léčbu podáváním terapeuticky účinných dávek alespoň jedné ze sloučenin s obecným vzorce I.
Vynález také zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující 5-substituované-7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelné nosiče.
Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou deriváty obecného vzorce I, které nesou substituent R vybraný ze skupiny zahrnující: N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, Npyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4methylpiperazin-1 -yl, 4-(2-hydroxethyl)piperazinyl, (R)-(2-hydroxymcthylpyrrolidine-1 -yl), ethylamino, propylamino, butylamino, (2-hydroxyethyl)amino, (3-hydroxypropyl)amino, 2(R)8 hydroxypropyl]amino, 2(S)-hydroxypropyl]amino, 4-hydroxybut-2(R)-yl]amino, 4hydroxybut-2(S)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(R,S)-yl]amino, 2-(hydroxy-2methyl)propyl]amino, (2,3-dihydroxypropyl)amino, (l-hydroxy-3-methylbutyl)amino, [(R,S)(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(R)-(2-hydroxypent-3-yl)] amino, [(S)-(2-hydroxypent-3yl)]amino, (R)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (S)-[l-isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (2-aminoethyl)amino, (3-aminopropyl)amino, (4-aminobutyl)amino, (5-aminopentyl)amino, (6-aminohexyl)amino, [3-amino-2-hydroxypropyl]amino, [l-(dimethylamino)methyl]amino, [2-(dimethylamino)ethyl]amino, [3-(dimethylamino)propyl]amino, [4(dimethylamino)butyl]amino, [2-(diethylamino)ethyl]amino, [3-(diethylamino)propyl]amino, (aziridin-l-yl)ethylamino, (azolidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (piperidin-1yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)propylamino, cyklopropylamino, cyklobutylamino, cyklopentylamino, cyklohexylamino, (ds-2-aminocyklohexyl)amino, (trans-
2-aminocyklohexyl)amino, (cis, /raz?.s-2-aminocyklohcxyl)amino, (cis, trans-3- aminocyklohexyl)amino, (/ra/7.s-4-aminocyklohexyl)amino, (c/.s-4-aminocyklohexyl)amino, (cis, /rms-4-aminocyklohexy Ijamino, (cw-2-hydroxycyklohexyl)amino, (trcms-2hydroxycyklohexyl)amino, (cis, Zran5-2-hydroxycyklohexyl)amino, (cis, trans-3hydroxycyklohexyl)amino, (řra/?.y-4-hydroxycyklohexyl)amino, (cis-4hydroxycyklohexyl)amino, (cis, íra/w-4-hydroxycyklohexyl)amino, (2-methoxybenzyl)amino, (3-methoxybenzyl)amino, (4-methoxybenzyl)amino, (3,5-dimethoxybenzyl)amino, (2,6dimethoxybenzyl)amino, (3,4,5-trimethoxybenzyl)amino, (2,4,6-trimethoxybenzyl)amino, (2fluorbenzyl)amino, (3-fluorbenzyl)amino, (4-fluorbenzyl)amino, (2-chlorbenzyl)amino, (3chlorbenzyl)amino, (4-chlorbenzyl)amino, (2,4-dichlorbenzyl)amino, (3,4,5trichlorbenzyl)amino.
Způsoby přípravy sloučenin obecného vzorce I
Pyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle tohoto vynálezu, které mají různé substituenty v pozici 5 heterocyklu, mohou být připraveny za použití intermediátů podle postupu zobrazeného ve Schématu 1. Tento postup zahrnuje kroky oxidace methylsulfanyl skupiny na methylsulfonyl a následnou nukleofilní substituci atomu chloru v pozici 7 heterocyklu. Tato nukleofilní substituce v pozici 7 může probíhat za mírných podmínek s vysokým výtěžkem. Tento poslední reakční krok, kterým je nukleofilní substituce v pozici 5 (konverze sloučeniny 7 ve finální sloučeninu 8), vyžaduje mnohem tvrdší podmínky (150 až
160 °C/1 až 20 h). Výsledná sloučenina je izolována pomocí kolonové chromatografie.
Schéma 1.
Farmaceutické kompozice
Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, vazální místní (zahrnující okulámí, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intravitreózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epidurální). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi. Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofilizačními procesy. Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizováných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.
Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo
3,5-di-/er/-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce C8 až C)2 od Huis AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sesamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.
Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.
Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.
Vhodné nosiče jsou obzvláště plnídla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulosové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty.
Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulosových preparátů jako acetylcelulosaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulosaftalát. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.
Farmaceutické přípravky které mohou být užívány orálně jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.
Další formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10 % nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.
Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.
Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofdizátu společně s excipienty kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro infúzní roztoky. Preferovaná konzervo vadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol, propylen glykol, sorbitol a/nebo polyethylen glykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafin, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej z podzemnice olejně, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např. lauryl, cetyl nebo staryl alkoholy, mastné kyseliny, například palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropyl myristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolátum) nebo parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween) dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.
Tento vynález dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.
Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1 ukazuje účinek některých nových sloučenin na buněčný cyklus nádorové buněčné linie MCF7.
Obrázek 2 ukazuje účinek některých nových sloučenin na aktivitu kaspáz 3 a 7 v nádorové buněčné linii K562. Aktivita kaspáz 3 a 7 byla měřena v lyzátech buněk ovlivněných některými novými sloučeninami v jedné dávce po dobu 24 hodin (A) a různými dávkami sloučeniny 33 (B).
Obrázek 3 ukazuje účinek sloučeniny 45 na apoptózu v nádorové buněčné linii HCT116. Aktivita kaspáz 3 a 7 byla měřena v lyzátech buněk ovlivněných různými dávkami sloučeniny 45.
Obrázek 4 ukazuje změny proteinů zapojených do regulace apoptózy v nádorové buněčné linii HCT116 ovlivněné sloučeninou 45 po dobu 24 hodin.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je popsán pomocí následujících příkladů, které ovšem nijak neomezují jeho rozsah.
Body tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nebyly korigovány.Všechny reagencie byly ze standardních komerčních zdrojů a analytické čistoty. Tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na hliníkových destičkách se silikagelem F254 od fy Merck. Skvrny byly vizualizovány pod UV světlem (254 nm). Elementární analýzy (C,H,N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo Finnigan). ESI hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters Micromass ZMD 2000 hmotovém spektrometru (con voltage 20 V). NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,13 MHz (1H), respektive 75,48 MHz (13C). Merck silikagel Kieselgel 60 (zrnitost 230-400) byl použit na sloupcovou chromatografii. Všechny sloučeniny vykázaly uspokojivé elementární analýzy (± 0,4 %).
Příklad 1
3-Isopropyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-lJ7-pyrazolo[4,3-d]pyrimidiii (2).
Roztok 7-chlor-3-isopropyl-177-pyrazolo[4,3-d]pyrimidinu (1) (0,248 g, 1,17 mmol), l-[4-(pyridin-2-yl)fenyl]methanaminu (0,31 g, 1,58 mmol) a ethyldiisopropylaminu (0,4 mL, 2,3 mmol) v CHCI3 / r-BuOH (6 mL /1 mL) byl zahříván po dobu 1 hodiny při 60 °C. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla reakční směs zakoncentrována pod vakuem a obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHCI3 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 1%, 2%, a 4% MeOH v CHCI3. Byla získána amorfní bezbarvá látka. Výtěžek 81 % (0.442 g).
ESI+ m/z 345.1 [M+H]+, ESI- m/z 343.1 [M-H]'. ‘H (500 MHz; DMSO-íZ6): 1.33 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(C773)2); 3.29 (m, 1H, -CZZ-(CH3)2); 4.78 (bs, 2H, -NH-C//2-); 7.27-7.29 (m, 1H, ArH); 7.46 (d, J= 7.03 Hz, 2H, ArH); 7.80-7.83 (m, 1H); 7.87-7.89 (m, 2H, ArH, -NH-); 8.03 (d, J= 7.03 Hz, 2H, ArH); 8.21 (bs, 1H, ArH); 8.60 (d, J= 4.28 Hz, 1H, ArH); 12.26 (bs, 1H, -NH-). 13C (125 MHz; DMSO-d6): 22.2, 26.8, 43.6, 120.6, 122.4, 123.0, 126.9, 127.1, 128.5, 128.8, 137.7, 138.1, 139.4, 140.3, 149.6, 150.0, 150.7, 151.2, 156.3.
Příklad 2
3-Isopropyl-5-methylsulfanyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l/f-pyrazolo[4,3•“djpyrimidin (5).
7-Chlor-3-isopropyl-5-methylsulfanyi-l//-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (4) (0,56 g, 2,3 mmol), 1~[4-(pyridin-2-yl)fenyl]methanamin (0,48 g, 2,6 mmol) a ethyldiisopropylamin (0,86 mL, 5 mmol) ve 12 mL /-BuOII byly zahřívány za stálého míchání při 70 °C po dobu 2 hodin. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla reakční směs zakoncentrována pod vakuem a obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHCI3 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Krystalizace ze směsi CHCl3/Et2O poskytla bezbarvý produkt o bodu tání 170-173 °C. Výtěžek 87 % (0,79 g).
ESI+ m/z 391.1 [M+H]+, ESI- m/z 389.1 [M-H]’. ‘H (500 MHz; DMSO-í/6): L36 (d, 7.03
Hz, 6H, -CH-(CH3)2); 2.43 (s, 3H, -CH3); 3.31 - 3.35 (m, 1H, -C//-(CH3)2); 4.75 (bs, 2H, NH-C7fy-); 7.32 (ddd, J= 7.34 Hz, J= 4.89 Hz, J= 0.92 Hz, 1H, ArH); 7.48 (d, J= 7.03 Hz, 2H, ArH); 7.84 (dt, J= 7.64 Hz, J= 1.53 Hz, 1H, ArH); 7.92 (d, J= 7.95 Hz, 1H, ArH); 8.05 (bd, 7.03 Hz, 2H, ArH); 8.63 (bd, J= 4.58 Hz, 1H, ArH).
Příklad 3
7-Chlor-3-isopropyl-5-methylsulfonyI-lZ/-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (6).
Roztok OxonuR (monopersulfát fy. Aldrich Katě.: 22,803-6, 36 g) ve vodě (180 mL) byl přidán po kapkách do roztoku 7-chlor-3-isopropyl-5-methylsulfanyl-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidinu (4) (10 g, 41,3 mmol) v EtOH (180 mL) při teplotě 55 °C v průběhu jedné hodiny. Reakční směs byla poté míchána další hodinu při teplotě 60 °C. Po ochlazení na laboratorní teplotu byl EtOH odpařen a reakční koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (100 mL) a CHCI3 (100 mL). Vodná fáze byla extrahována pomocí EtOAc (3 x 50 mL) a spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Krystalizace ze směsi EtOAc/Et2O poskytla produkt s bodem tání 111-114 °C. Výtěžek 81 %, (9,17g).
ESI- m/z 273.1 [M-H]'. ’H NMR (CDC13): 1.49 (d, 6.96 Hz, 6H, CH3); 3.49 (s, 3H, CH3),
3.58 (sept., J= 6.96 Hz, 1H, CH).
Příklad 4
3-Isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-lET-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (8).
7-Chlor-3-isopropyl-5-methylsulfonyl-l/7-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (6) (4,89 g, 17,8 mmol) a ethyldiisopropylamin (4 mL, 22,5 mmol) v /-BuOH (80 mL) byly za stálého míchání zahřátý na teplotu 60 °C. Poté byl přidán roztok l-[4-(pyridin-2-yl)fenyl]methanaminu (3,84 g, 20,9 mmol) v í-BuOH (30 mL), který byl předehřát na 50 °C, a reakční směs byla zahřívána na 60 °C po dobu jedné hodiny. Po 10 minutách začal vykrystalovávat produkt. Po ochlazení na laboratorní teplotu byl produkt odfiltrován, promyt MeOH a usušen pod vakuem. B.t. 213-216 °C, výtěžek 85 %, (6,4 g).
ESI+ m/z 423.3 [M+H]+, ESI- m/z 421.3 [M-H]'.‘H (500 MHz; DMSO-tí6): 1.36 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(CH3)2); 2.43 (s, 3H, -CH3); 3.31 - 3.35 (m, 1H, -C77-(CH3)2); 4.75 (bs, 2H, NH-C7Í2-); 7.32 (ddd, J= 7.34 Hz, J= 4.89 Hz, ./ = 0.92 Hz, 1H, ArH); 7.48 (d, J= 7.03 Hz, 2H, ArH); 7.84 (dt, J= 7.64 Hz, J= 1.53 Hz, 1H, ArH); 7.92 (d, J= 7.95 Hz, 1H, ArH); 8.05 (bd, J= 7.03 Hz, 2H, ArH); 8.63 (bd, 4.58 Hz, 1H, ArH).
Příklad 5
3-Isopropyl-5-(V-inorpholinvl)-7-[4-(2-pyridvl)benzyl]amino-l//-pvrazolo[4,3-djpyrimidin (9).
Směs 3 -isopropyl-5-methylsulfonyl-7- [4-(2-pyridyl)benzyl] amino-1 H-pyrazolo [4,3 -d]pyrimidinu (7) (0,36 g, 0,85 mmol) a morfolinu (3 mL, 27 mmol) byla zahřívána v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 8 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHC13 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografické koloně za použití skokového gradientu ve složení: 2%, 4%, 5% MeOH v CHC13. Byla získána amorfní bezbarvá látka. Výtěžek 41 % (0,15 g).
ESI + m/z 430.1 [M+H]+, ES- m/z 428.1 [M-H]’. ’H (500 MHz; DMSO-tí6): 1.32 (d, J = 7.03 Hz, 6H, -CH-(CH3)2); 3.18 (bs, 1H, -Cř/-(CH3)2); 3.58 - 3.60 (bs, 8H, 4x -C772-); 4.74 (bs, 2H, -NH-C772-); 7.31 (dd, J= 6.72 Hz, J= 5.50 Hz, 1H, ArH); 7.48 (d, J= 7.95 Hz, 2H, ArH);
7.78 (bs, 1H, -NH-); 7.84 (dt, J= 7.64 Hz, J= 1.53 Hz, 1H, ArH); 7.91 (d, J = 7.95 Hz, 1H, ArH); 8.04 (d, J= 5.81 Hz, 2H, ArH); 8.63 (d, J= 3.97 Hz, 1H, ArH); 11.84 (bs, 1H, -NH-).
Příklad 6
3-Isopropyl-5-(piperazin-l-yl)-7-[4-(2-pyridyl)benzyI]amino-l/7-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (13).
Roztok 3 -isopropyl-5 -methylsulfonyl-7- [4-(2-pyridyl)benzyl] amino-1 //-pyrazo lo [4,3
-d]pyrimidinu (7) (0,32 g, 0,76 mmol) v piperazinu (3 mL, 27 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 150 C po dobu 6 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHC13 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografické koloně za použití skokového gradientu ve složení: 2%, 4%, 5% MeOH v CHCI3 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána amorfní bezbarvá látka. Výtěžek 55% (0,18 g).
ESI + m/z 429.1 [M+H]+, ES- m/z 427.1 [M-H]'. ]H (500 MHz; DMSO-í/6): 1.31 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(C773)2); 2.73 - 2.75 (m, 4H, 2x -CH2-), 3.17 (sept., J = 7.03 Hz, 1H, -CH(CH3)2); 3.58 - 3.60 (m, 4H, 2x -CH2-); 4.71 (d, J= 5.20 Hz, 2H, -NH-C7/2-); 7.29 (ddd, J = 7.34 Hz, ./= 4.89 Hz, J= 0.92 Hz, 1H, ArH); 7.48 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 7.84 (dt, J = 7.49 Hz, J= 1.53 Hz, 1H, ArH); 7.91 (d, 8.25 Hz, 1H, ArH); 8.04 (d, J= 7.64 Hz, 2H,
ArH); 8.63 (d, J= 4.58 Hz, 1H, ArH).
Příklad 7
3-lsopropyl-5-(.V-thiomorpholinvl)-7-|4-(2-pyridyl)ben/yl|amino-l//-pyrazoIo|4,3-’djpyrimidin (15).
Směs 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l/7-pyrazolo[4,3-d]pynmidinu (7) (0,2 g, 0,47 mmol) a thiomorfolinu (3 mL, 29 mmol) byla zahřívána v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 5 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHCI3 (3 x 15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografické koloně za použití skokového gradientu ve složení: 2%, 3%, 4% MeOH in CHC13. Byla získána amorfní žlutá látka. Výtěžek 24 % (0,05 g).
ESI + m/z 446.1 [M+H]+, ES- m/z 444.1 [M-H]’. *H (500 MHz; CDC13): 1.33 (d, J= 6.72 Hz, 6H, -CH-(C7f3)2); 2.55 - 2.57 (m, 4H, 2x -CH2-); 3.30 (sept, J= 6.72 Hz, 1H, -C//-(CH3)2); 4.07 - 4.09 (m, 4H, 2x -CH2-); 4.64 (bd, J= 5.20 Hz, 2H, -NH-Cř/2-); 7.17 -7.20 (m, 1H, ArH); 7.28 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 7.60 (d, J= 7.95 Hz, 1H, ArH); 7.69 (dt, J= 7.95 Hz, J = 1.83 Hz, 1H, ArH); 7.79 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 8.60 - 8.62 (m, 1H, ArH).
Příklad 8
3-Isopropyl-5-|4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl|-7-|4-(2-pyridyl)benzyl|ainino-l//_pyrazolo[4,3-d|pyriinidin (17).
Roztok 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l/7-pyrazolo[4,3-d]pyrimidinu (7) (0,21 g, 0,5 mmol) a 2-piperazin-l-ylethanolu (3 mL, 23 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 5 hodin. Po ochlazení na teplotu místnosti byla reakční směs rozpuštěna ve směsi H2O (20 mL) a CHC13 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 2%, 3%, 4% MeOH v CHC13. Byl získán produkt, který byl poté rekrystalovám v CHC13. Výtěžek 15% (0,035 g), b.t. 135-140 °C.
ESI + m/z 473.1 [M+H]+, ES- m/z 471.1 [M-H]’. 'H (500 MHz; CDCI3 + DMSO-í/6): 1.23 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(C//3)2); 2.45 - 2.46 (m, 6H, 3x -CH2-); 3.14 (sept., J= 6.72 Hz, 1H, C//-(CH3)2); 3.50 - 3.52 (m, 2H, -CH2-); 3.67 (m, 4H, 2x -CH2-); 4.60 - 4.61 (m, 2H, -NHCH2-); 7.05 -7.09 (m, 1H, ArH); 7.18 (bs, 1H, -NH-); 7.31 - 7.32 (m, 2H, ArH); 7.54 - 7.59 (m, 2H, ArH); 7.78 - 7.79 (m, 2H, ArH); 8.47 - 8.48 (m, 1H, ArH); 11.3 (bs, 1H, -NH-). 13C (125 MHz; CDCI3 + DMSO-<76): 21.6, 26.5, 44.0, 44.6, 52.9, 57.7, 59.8, 120.3, 122.2, 126.9,
128.4, 136.8, 138.3, 140.0, 149.6, 156.7, 157.9.
Příklad 9
3-Isopropyl-5-(/?)-(2-hydroxypropyl)amino-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-17/-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (27).
Roztok 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-177-pyrazolo[4,3- d]pyrimidinu (7) (1,25 g, 2,96 mmol) v Á-(-)-l-amino-2-propanolu (10 mL, 110 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 3 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 50 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHCI3 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 2%, 4%, 5% MeOH v CHCI3 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 52%, (0,65 g).
ESI+ m/z 418.1 (100%) [M+H]+, 209.6 (20%) [M+2H]2+, ESI- m/z 416.1 [M-H]’. *H (500 MHz; DMSO-íZ6 + CDC13): 0.99 (d, J= 6.42 Hz, 3H, -CH3); 1.27 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH(CJ73)2); 3.06-3.11 (m, 2H, -CH2-); 3.20-3.23 (m, 1H, -C77-(CH3)2); 3.72-3.75 (m, 1H, -CH-);
4.69 (bs, 2H, -NH-Ctt2-); 6.02 (bs, 1H, -NH-CH2-); 7.27-7.30 (m, 1H, ArH); 7.45 (d, J= 7.34 Hz, 2H, ArH); 7.63 (bs, 1H, -NH-); 7.82 (dt, J= 7.64 Hz, J= 1.53 Hz, 1H, ArH); 7.88-7.89 (m, 1H, ArH); 8.01 (s, 2H, ArH); 8.60 (d, J= 3.97 Hz, 1H, ArH); 11.76 (bs, 1H, -NH-). 13C (125 MHz; DMSO-d6 + CDC13): 21.9, 22.2, 26.6, 43.4,49.9, 66.7, 120.5, 122.8, 127.2, 128.4, 137.7, 149.8, 156.3. aD23 = +2.6° (MeOH, c = 0.499 g/dl)
Příklad 10
3-Isopropyl-5-(2-hydroxy-2-methyIpropyl)amino-7-[4-(2-pyridyl)benzyl|ainino-l//•pyrazolo[4,3-d|pyrimidin (33).
Směs 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l//-pyrazolo[4,3- d]pyrimidinu (7) (0,6 g, 1,42 mmol) a l-amino-2-methyl-2-propanolu (1,25 g, 14 mmol) byla zahřívána v zatavené ampuli na teplotu 155 °C po dobu 10 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti byla reakční směs rozpuštěna ve směsi H2O (20 mL) a CHC13 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 3%, 5%, 7% MeOH v CHC13. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 33 % (0,2 g).
ESI+ m/z 432.1 [M+H]+, ES- m/z 430.1 [M-H]'. ]H (500 MHz; DMSO-^): 1.06 (s, 6H, -C(CZZ3)2); 1.29 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(C//3)2); 3.14 (sept., J = 7.03 Hz, 1H, -C/7-(CH3)2); 3.20 (d, J = 5.81 Hz, 2H, -NH-CH2-); 4.73 (d, J= 4.89 Hz, 2H, -NH-C772-); 6.12 (bs, 1H, N7f-CH2-); 7.31 (dd, J= 7.03 Hz, J= 5.50 Hz, 1H, ArH); 7.48 (d, J= 7.95 Hz, 2H, ArH); 7.84 (dt, J= 7.64 Hz, J = 1.53 Hz, 1H, ArH); 7.91 (d, J= 7.95 Hz, 1H, ArH); 8.04 (d, J= 7.64 Hz, 2H, ArH); 8.63 (d, J= 4.28 Hz, 1H, ArH).
Příklad 11
3-Isopropyl-5-(3-ainino-2-hydroxypropyl)ainino-7-[4-(2-pyridyI)benzyl]ainino-l/7-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (45).
Směs 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzylamino]-lH-pyrazolo[4,3—d]pyrimidinu (7) (0,69 g, 1,64 mmol), l,3-diamino-2-propanolu (10 mL, 95 mmol) a 1 methyl-2-pyrrolidonu (2 mL) byla zahřívána v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 6 hodin Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHC13 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 5%, 8%, 11% 14% MeOH v CDCI3 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 24% (0,17 g).
ESI+ m/z 433.1 (100%) [M+H]+, 217.6 (90%) [M+2H]2+, ESI- m/z 431.1 [M-H]’. 'H (500 MHz; DMSO-t/6): L27 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(C7f3)2); 2.40 - 2.50 (m, 2H, -CH2-); 3.103.20 (m, 2H, -CH2-); 2.28-2.33 (m, 1H, -CH-); 3.45-3.49 (m, 1H, -CH-(CH3)2); 4.69 (bs, 2H, NH-C7/2-); 6.06 (app. bt, 1H, -NZ/-CH2-); 7.26-7.29 (m, 1H, ArH); 7.44 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 7.81 (dt, J= 7.64 Hz, 1.83 Hz, 1H, ArH); 7.87-7.89 (m, 2H, ArH, -NH-); 8.01 (d, J = 8.56 Hz, 2H, ArH); 8.59 - 8.60 (m, 1H). 13C (125 MHz; DMSO-c/6): 22.1, 22.2, 26.2, 43.1, 45.7, 46.0, 72.8, 120.6, 123.0, 126.7, 127.0, 127.8, 128.4, 137.7, 137.9, 140.9, 150.0, 156.3, 158.9.
Příklad 12
3-Isopropyl-5-[2-(dimethylamino)ethyl]amino-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l//-pyrazolo[4,3-d]pyrimídin (47).
Roztok 3 -isopropyl-5 -methylsulfonyl-7- [4-(2-pyridyl)benzyl] amino-177-pyrazolo [4,3 ,d]pynmidinu (7) (0,3 g, 0,71 mmol) v 2-(dimethylamino)ethylaminu (3 mL, 27 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 1 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 50 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3 x 15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 5%, 10%, 14% MeOH v CHCI3 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 20% (0,06 g).
ESI+ m/z m/z 431.2 (100%) [M+H]+, 216.1 (30%) [M+2H]2+, ESI- m/z 429.2 [M-H]’. 'H (500 MHz; CDC13): 1.31 (d, J= 7.03 Hz, 6H, -CH-(CH3)2); 2.23 (s, 6H, 2x -CH3); 2.65 (t, J = 7.64 Hz, 2H, -CH2-); 3.20 (t, J = 7.34, 2H, -CH2-); 3.27 (kvint.; J = 7.03 Hz, 1H, -CH22 (CH3)2); 4.61 (bs, 2H, -NH-C7/2-); 6.97 (bs, 1H, -N//-CH-); 7.14 - 7.18 (m, 3H, ArH); 7.55 (d, J= 8.25 Hz, 1H, ArH); 7.66 (dd, J= 7.64 Hz, J= 1.83 Hz, 1H, ArH); 7.69 (d, J= 7.95 Hz, 2H, ArH); 8.55 (d, J = 3.97 Hz, 1H, ArH). 13C (125 MHz; CDC13): 21.8; 26.4; 28.1; 44.0; 45.1; 59.1; 120.9; 122.3; 127.1; 128.0; 137.2; 138.2; 139.1; 149.4; 150.7; 157.0; 161.7.
Příklad 13
3-Isopropvl-5-(trans-2-aininocyclohexyl)amino-7-|4-(2-pyridyl)benzyl]ainino-l//-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine (64).
Roztok 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l/7-pyrazolo[4,3-d]pyrimidinu (7) (1,4 g, 3,32 mmol) v 1,2-/razw-diaminocyklohexanu (30 mL, 68 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 155 °C po dobu 20 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografícké koloně za použití skokového gradientu ve složení: 4%, 8%, 11%, 14% MeOH v CHC13 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 13% (0,20 g).
ESI+ m/z 457.3 (100%) [M+H]+, 229.1 (50%) [M+2H]2+, ESI- m/z 455.3 [M-H]'.!H (500 MHz; CDCI3): 1.13 - 1.20 (m, 4H, -CH2-); 1.25 (bs, 6H, -CH-(C7/3)2); 1.57 - 1.59 (m, 2H, CH2-); 1.86 (bs, 2H, -CH2-); 2.47 (bs, 1H, -CH-); 3.15 (sept, J= 6.42 Hz, 1H, -C//-(CH3)2); 3.56 (bs, 1H, -CH-); 4.57 (bs, 2H, -NH-CZA-); 7.13 (dd, J= 7.34 Hz, J= 4.89 Hz, 1H, ArH); 7.28 (d, J= 7.95 Hz, 2H, Ar); 7.53 (d, J= 7.95 Hz, 1H, ArH); 7.63 (d, J= 7.64 Hz, 1H, ArH); 7.73 (d, </ = 7.95 Hz, 2H, ArH); 8.58 (d, J= 4.58 Hz, 1H, ArH). I3C (125 MHz; CDC13): 18.3; 21.7; 21.8; 24.7; 25.0; 25.9; 32.5; 34.0; 43.7; 46.0; 56.3; 57.2; 57.9; 120.4; 121.9; 126.8; 127.0; 127.4; 127.7; 136.7; 137.9; 139.6; 149.3; 149.6; 151.8; 156.9; 158.0.
Příklad 14
3-Isopropyl-5-(trans-4-aminocycIohexyl)amino-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amíno-17/-pyrazolo|4,3-d|pyrimidin (67).
3-Isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin (7) (0,3 g, 0,71 mmol) v roztaveném 1,4-rrara-diaminocyclohexanu (5 g, 44 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 150 °C po dobu 20 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHC13 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHCI3 (3 x 15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografické koloně za použití skokového gradientu ve složení: 4%, 8%, 11%, 14% MeOH v CHCI3 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 19% (0,06 g).
ESI+ m/z 457.3 (100%) [M+H]+, 229.1 (50%) [M+2H]2+, ESI- m/z 455.3 [M-H]’. 'H (500 MHz; DMSO-<4): 1.08 - 1.18 (m, 4H, 2x -CH2-); 1.27 (d, J = 7.03 Hz, 6H, -CH-(CH3)2); 1.71-1.72 (m, 2H, -CH2-); 1.85 - 1.87 (m, 2H, -CH2-); 2.50-2.52 (m, 1H, -C//-NH-); 3.11 (sept., J= 7.03 Hz, 1H, -CZ/-(CH3)2); 3.54 - 3.56 (m, 1H, -CH-NH-); 4.68 (bd, J= 4.58 Hz, 2H, -NH-C7/2-); 5.69 (bd, 7.34 Hz, 1H, -N//-CH-); 7.26 (m, 1H, ArH); 7.44 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 7.79 - 7.82 (m, 2H, ArH, -NH-); 7.86 - 7.88 (m, 1H, ArH); 8.00 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 8.59 - 8.60 (m, 1H, ArH). 13C (125 MHz; DMSO-/4): 22.1; 26.4, 31.8, 34.9, 43.2, 50.0, 50.4, 120.6, 122.9, 127.0, 128.3, 137.7, 137.8,141.2, 150.0, 156.3, 157.8.
Příklad 15 3-Isopropyl-5-(4-methoxybenzyl)amino-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l/f-pyrazolo[4,3-djpyrimidin (73).
Roztok 3-isopropyl-5-methylsulfonyl-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-177-pyrazolo[4,3-djpyrimidinu (7) (0,5 g, 1,18 mmol) v 4-methoxybenzylaminu (10 mL, 58 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 155 °C po dobu 5 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHC13 (3x15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografické koloně za použití skokového gradientu ve složení: 3%, 5%, 7% MeOH v CHC13. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 26 % (0,15 g). ESI+ m/z 480.3 [M+H]+, ES- m/z 478.3 [M-H]’. ’H (500 MHz; CDC13): 1.29 (d, J= 6.72 Hz, 6H, -CH-(C//3)ž); 3.21 (sept., J = 6.72 Hz, 1H, -Ctt-(CH3)2); 3.67 (s, 3H, -CH3); 4.50 (bd, J= 3.97 Hz, 2H, -NH-CH2-); 4.69 (bs, 2H, -NH-Ctt2-); 6.72 (d, J= 8.56 Hz, 2H, ArH); 7.17 7.22 (m, 3H, ArH, -NH-); 7.29 (d, J = 8.25 Hz, 2H, ArH); 7.59 (d, J = 7.95 Hz, 1H, ArH); 7.69 (dt, J = 7.64 Hz, J = 1.83 Hz, 1H, ArH); 7.78 (d, J = 8.25 Hz, 2H, ArH); 8.60 - 8.61 (m, 1H, ArH). 13C (125 MHz; CDC13): 21.8, 26.1, 44.2, 45.4, 55.3, 113.8, 120.7, 122.3, 127.1,
128.1, 128.4, 128.9, 129.0, 137.4, 138.4,149.6, 157.0, 158.7.
Příklad 16
3-Isopropyl-5-(lř)-[l-(hydroxymethyl)propyl]amino-7-[4-(2-pyridyl)benzyl]amino-l/Fpyrazolo[4,3-d]pyrimidin (83).
Roztok 3 -isopropyl-5 -methylsulfonyl-7- [4-(2-pyridyl)benzyl] amino-1 H-pyrazolo [4,3 -
d]pyrimidinu (7) (0,5 g, 1,19 mmol) v 7?-(-)-2-amino-l -butanolu (5 mL, 50 mmol) byl zahříván v zatavené ampuli na teplotu 154 °C po dobu 8 hodin. Přebytek aminu byl vakuově oddestilován při teplotě pod 70 °C. Obdržený koncentrát byl rozpuštěn ve směsi H2O (20 mL) a CHCI3 (20 mL). Vodná fáze byla vyextrahována pomocí CHCI3 (3 x 15 mL), spojené organické fáze byly vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn na silikagelové chromatografické koloně za použití skokového gradientu ve složení: 3%, 5%, 7% MeOH v CHCI3 s malým přídavkem koncentrovaného vodného amoniaku. Byla získána bezbarvá amorfní látka. Výtěžek 27 % (0,14 g).
ESI+ m/z 432.1 [M+H]+, ESI- m/z 430.1 [M-H]’. 'Η (500 MHz; DMSO-d6): 0.81 (t, J= 6.72 Hz, 3H, -CH2-CZ/3); 1.39 - 1.45 (m, 7H, -CH(C//3)2, -CHa-CH3); 1.55 - 1.59 (m, 1H, -Cř/βCH3); 3.43 - 3.47 (m, 1H, -C/f(CH3)2); 3.77 - 3.80 (m, 1H, -CZ7-NH-); 4.49 - 4.67 (m, 4H, CZÍ2-OH, -NH-CH2-); 5.82 (d, J = 7.64 Hz, 1H, -W-CH2-); 7.29 - 7.31 (m, 1H, ArH); 7.44 (d, J= 7.95 Hz, 2H, ArH); 7.78 (s, 1H); 7.83 (t, J= 8.01 Hz, 1H, ArH); 7.89 (d, J= 7.95 Hz, 1H, ArH); 7.99 (d, J= 8.25 Hz, 2H, ArH); 8.62 (bd, J= 4.58 Hz, 1H, ArH).
aD23 = +45.5° (MeOH, c = 0.191 g/dl).
Tabulka 1: Látky připravené podle metod ukázaných v příkladech 1-16.
č. SUBSTITUENT R CHN ANALÝZA [%] MS (ZMD)ANALÝZY
[M-H]’ a) [M+H]+b)
9 N-morfolinyl C = 64,11; H = 6,34; N = 22,83 428,2 430,2
10 N-pyrrolidinyl C = 69,70; H = 6,59; N = 23,70 412,2 414,2
11 N-pyrazolidinyl C = 66,64; H = 6,31; N = 27,02 413,2 415,2
12 N-imidazolidinyl C = 66,63; H = 6,32; N = 27,03 413,2 415,1
13 N-piperazinyl C = 67,27; H = 6,59; N = 26,15 427,2 429,2
14 N-piperidinyl C = 70,23; H = 6,84; N = 22,93 426,3 428,2
15 N-thiomorfolinyl C = 64,69; H = 6,11; N = 22,00 444,2 446,2
16 4-methylpiperazin-1 -yl C = 67,85; H = 6,82; N = 25,32 441,3 443,2
č. SUBSTITUENT R CHN ANALÝZA [%] MS (ZMD)ANALÝZY
[M-H]' a) [M+H]+b)
17 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1 -yl C = 66,08; H = 6,83; N = 23.71 471,3 473,2
18 ethylamino C = 68,19; H = 6,50; N = 25,30 386,2 388,2
19 propylamino C = 68,80; H = 6,77; N = 24,41 400,2 402,2
20 butylamino C = 69,38; H = 7,03; N = 23,60 414,2 416,2
21 pentylamino C = 69,90; H = 7,27; N = 22.82 428,2 430,2
22 hexylamino C = 70,41; H = 7,50; N = 22,10 442,3 444,2
23 heptylamino C = 70,87; H = 7,71; N = 21,42 456,3 458,3
24 oktylamino C = 71,30; H = 7,90; N = 20,79 470,3 472,3
25 (2-hydroxyethyl)amino C = 65,49; H = 6,25; N = 24,30 402,2 404,2
26 (R/S)-(2-hydroxypropyl)amino C = 66,17; H = 6,52; N = 23,48 416,2 418,2
27 (R)-(2-hydroxypropyl)amino C = 66,18; H = 6,52; N = 23,48 416,2 418,2
28 (S)-(2-hydroxypropyl)amino C = 66,17; H = 6,53; N = 23,48 416,2 418,2
29 (3-hydroxypropyl)amino C = 66,17; H = 6,52; N = 23,47 416,2 418,2
30 (R/S)-(4-hydroxybut-2-yl)amino C = 66,80; H = 6,77; N = 22,72 430,2 432,2
31 (R)-(4-hydroxybut-2-yl)amino C = 66,80; H = 6,78; N = 22,72 430,2 432,2
32 (S)-(4-hydroxybut-2-yl)amino C = 66,81; H = 6,77; N = 22,72 430,2 432,2
33 (2-hydroxy-2- methylpropyl)amino C = 66,80; H = 6,77; N = 22,72 430,2 432,2
34 (3 -hydroxy-3 -methy Ibuty l)am ino C = 67,39; H = 7,01; N = 22,01 444,3 446,2
35 (2,3-dihydroxypropyl)amino C = 63,72; H = 6,28; N = 22,62 432,2 434,2
36 (l-hydroxy-3-methylbut-2yl)amino C = 67,39; H = 7,01; N = 22,01 444,3 446,2
37 (R/S)-(2-hydroxypent-3 -y l)am ino C = 67,39; H = 7,01; N = 22,01 444,2 446,2
38 (R)-(2-hydroxypent-3-yl)amino C = 67,39; H = 7,02; N = 22,01 444,2 446,2
39 (S)-(2-hydroxypent-3-yl)amino C = 67,39; H = 7,01; N = 22,02 444,2 446,2
40 (2-aminoethyl)amino C = 65,65; H = 6,51; N = 27,84 401,2 403,2
41 (3-aminopropyl)amino C = 66,32; H = 6,78; N = 26,90 415,2 417,2
42 (4-aminobutyl)amino C = 66,95; H = 7,02; N = 26,03 429,3 431,2
43 (5-aminopentyI)amino C = 67,54; H = 7,26; N = 25,20 443,3 445,2
44 (6-aminohexyl)amino C = 68,10; H = 7,47; N = 24,43 457,3 459,3
45 (3-amino-2-hydroxypropyl)amino C = 63,87; H = 6,53; N = 25,91 431,2 433,2
46 [ 1 -(dimethylamino)methyl]amino C = 66,32; H = 6,78; N = 26,90 415,2 417,2
47 [2-(dimethylamino)ethyl]amino C = 66,95; H = 7,02; N = 26,03 429,2 431,2
48 [3-(dimethylamino)propyl]amino C = 67,54; H = 7,26; N = 25,20 443,3 445,3
49 [4-(dimethylamino)butyl]amino C = 68,09; H = 7,47; N = 24,43 457,3 459,3
50 [2-(diethylamino)ethyl]amino C = 68,09; H = 7,47; N = 24,43 457,3 459,3
51 [3-(diethylamino)propyl]amino C = 68,61; H = 7,68; N = 23,71 471,3 473,3
52 [3-(diethylamino)butyl]amino C = 69,10; H = 7,87; N = 23,03 485,3 487,3
53 2-(aziridin-1 -yl)ethylamino C = 67,27; H = 6,59; N = 26,15 427,2 429,2
54 2-(azetidin-l-yl)ethylamino C = 67,85; H = 6,83; N = 25,32 441,3 443,3
Č. SUBSTITUENT R CHN ANALÝZA [%] MS (ZMD)ANALÝZY
[M-H]’ a) (M+H]+b)
55 2-(azolidin-1 -yl)ethylamino C = 68,39; H = 7,06; N = 24,54 455,3 457,3
56 2-(piperidin-1 -y l)ethylamino C = 68,91; H = 7,28; N = 23,81 469,3 471,3
57 2-(aziridin-1 -yl)propylamino C = 67,85; H = 6,83; N = 25,32 441,2 443,2
58 2-(azetidin-l-yl)propylamino C = 68,39; H = 7,06; N = 24,54 455,3 457,3
59 cyklopropylamino C = 69,15; H = 6,31; N = 24,54 398,2 400,2
60 cyklobutylamino C = 69,71; H = 6,58; N = 23,71 412,2 414,2
61 cyklopentylamino C = 70,23; H = 6,84; N = 22,93 426,2 428,2
62 cyklohexylamino C = 70,72; H = 7,08; N = 22,20 440,3 442,3
63 czs-(2-aminocyklohexyl)amino C = 68,39; H = 7,06; N = 24,54 455,3 457,2
64 /raws-(2-aminocyklohexyl)amino C = 68,39; H = 7,05; N = 24,54 455,3 457,2
65 cis,trans-(2- aminocyklohexyl)amino C = 68,39; H = 7,06; N = 24,53 455,3 457,2
66 cis,trans-(3- aminocyklohexyl)amino C = 68,40; H = 7,06; N = 24,54 455,3 457,2
67 rra«s-(4-aminocyklohexyl)amino C = 68,39; H = 7,06; N = 24,54 455,3 457,2
68 trans-(2hydroxy cykl ohexy I )am ino C = 68,25; H = 6,83; N = 21,43 456,2 458,2
69 trans-(3- hydroxycyklohexyl)amino C = 68,25; H = 6,83; N = 21,44 456,2 458,2
70 trans-(4- hydroxycyklohexyl)amino C = 68,24; H = 6,83; N = 21,43 456,2 458,2
71 (2-methoxybenzyl)amino C = 70,12; H = 6,10; N = 20,44 478,2 480,2
72 (3 -methoxybenzy l)am ino C = 70,13; H = 6,09; N = 20,44 478,2 480,2
73 (4-methoxybenzy l)am ino C = 70,12; H = 6,10; N = 20,45 478,2 480,2
74 3,5-dimethoxybenzylamino C = 68,35; H = 6,13;N= 19,24 508,2 510,2
75 2,6-dimethoxybenzylamino C = 68,35; H = 6,13; N = 19,24 508,2 510,2
76 2,4,6-trimethoxybenzylamino C = 66,77; H = 6,16; N = 18,17 538,2 540,2
77 3,4,5-trimethoxybenzylamino C = 66,77; H = 6,16; N= 18,17 538,2 540,2
78 2-fluorobenzylamino C = 69,36; H = 5,61; N = 20,97 466,2 468,2
79 3-fluorobenzylamino C = 69,36; H = 5,61; N = 20,97 466,2 468,2
80 4-fluorobenzylamino C = 69,36; H = 5,61; N = 20,97 466,2 468,2
81 2-chlorobenzylamino C = 67,00; H = 5,41; N = 20,26 482,2 484,2
82 3-chlorobenzylamino C = 67,00; H = 5,41; N = 20,26 482,2 484,2
82 4-chlorobenzylamino C = 67,00; H = 5,41; N = 20,26 482,2 484,2
83 (R)-[l- (hydroxymethyl)propyl]amino C = 66,80; H = 6,77; N = 22,72 430,2 432,2
84 (S)-[l- (hydroxymethyl)propyl]amino C = 66,80 H = 6,77; N = 22,71 430,2 432,2
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 17
Antileukemická aktivita nových sloučenin in vitro
Jednou ze schopností sloučeniny s antileukemickou aktivitou je cytotoxicita. Testování cytotoxicity bývá nej častěji založeno na sledování metabolické aktivity živých buněk. Nejčastěji používané metody pro kvantifikaci buněčné proliferace a cytotoxicity využívají (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid (MTT) nebo Calcein AM. Tyto metody jsou využívány pro screening nových sloučenin nebo při testování chemosensitivity. Tyto metody detekují pouze živé buňky, neboť jen tyto jsou schopné redukovat MTT na odpovídající formazan. Množství redukovaného MTT a vzniklého formazanu pak odpovídá počtu živých buněk v kultuře.
Sloučeniny byly testovány s následujícími buněčnými liniemi:: K562 (lidská chronická myelogenní leukemie), HL60 (lidská promyelocytická leukemie), CEM (lidská lymfoblastická leukemie), THP1 (lidská monocytická leukemie), MV4;11 (lidská akutní myelocytická leukemie). Tyto linie byly kultivovány v kultivačním médiu RPMI obsahujícím 10 % fetálního séra, penicilín (100 U/ml) a streptomycin (100 pg/ml) při 37 °C vatmostféře doplněné 5% CO2. Pro testování cytotoxicity byly buňky vysazeny do 96-jamkových mikrotitračních destiček v počtu 2000-5000 buněk na jamku a po 8 hodinách byly k buňkám přidány testované látky v různých koncentracích od 100 to 0,01 μΜ vždy v triplikátu. Po třech dnech byl k buňkám přidán roztok MTT (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, USA) a po 5 hodinách bylo médium nahrazeno DMSO. Absorbance byla měřena destičkovým readerem při 620 nm. Měření cytotoxicity pomocí MTT bylo zopakováno třikrát a jako negativní kontrola byly použity neovlivněné buňky. Hodnoty IC50 stanovující koncentraci látky, která je letální pro 50 % nádorových buněk, byly odečteny z křivek závislosti buněčné viability na koncentraci testované látky.
Signifikantní cytotoxické aktivity byly u všech pěti použitých buněčných linií odvozených od pacienů s různými formami leukémií (příklady výsledků uvádí Tabulka 2). Získané výsledky jasně ukazují, že nové sloučeniny jsou účinné vůči poměrně širokému spektru různých leukémií a nijak výrazně nezávisí na genetickém pozadí.
Tabulka 2. Antileukemická aktivita některých nových sloučenin in vitro.
sloučenina IC50 (μΜ)
K562 HL60 CEM THP1 MV4;11
2 1,00 0,92 0,80 0,56 0,47
5 0,78 0,86 0,94 0,32 0,60
7 0,64 0,52 0,93 1,64 1,69
9 0,11 0,10 0,07 0,18 0,36
13 0,02 0,02 0,01 0,03 0,04
15 0,59 0,60 0,23 0,31 0,87
17 0,15 0,26 0,11 0,30 0,37
27 0,06 0,02 0,01 0,03 0,06
29 0,10 0,18 0,09 0,14 0,27
31 0,39 0,24 0,21 0,26 0,31
33 0,03 0,02 0,01 0,01 0,07
35 0,24 0,17 0,18 0,26 0,20
40 0,34 0,22 0,14 0,11 0,25
41 0,47 0,56 0,43 0,27 0,35
45 0,70 0,62 0,54 0,49 0,51
47 0,13 0,09 0,07 0,06 0,12
50 0,18 0,14 0,11 0,08 0,17
54 0,36 0,29 0,24 0,37 0,24
57 0,44 0,32 . 0,27 0,29 0,53
64 0,10 0,09 0,05 0,04 0,09
65 0,30 0,22 0,14 0,11 0,38
67 0,59 0,24 0,23 0,30 0,19
73 3,95 0,78 0,89 0,67 0,97
83 0,07 0,02 0,06 0,01 0,07
Příklad 18
Aktivita vůči buněčným liniím odvozeným od solidních nádorů
V experimentech byly použity následující buněčné linie: G361 (maligní melanom), MCF7 (adenokarcinom prsu), PLC/PRF/5 (jatemí karcinom), PANC-1 (karcinom pankreatu) a HCT116 (karcinom tlustého střeva). Buněčné linie byly kultivovány v kultivačním médiu DMEM obsahujícím 10 % fetálního séra, glutamin, penicilín a streptomycin při 37 °C v atmosféře doplněné 5% CO2. Pro testování cytotoxicity byly buňky vysazeny do 96jamkových mikrotitračních destiček vpoětu 4000-10000 buněk na jamku. Po 16 hod byly k buňkám přidány testované látky v různých koncentracích od 100 do 0.01 μΜ vždy v triplikátu. Po třech dnech byl k buňkám přidán roztok MTT (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, USA) a po 5 hodinách bylo médium nahrazeno DMSO. Absorbance byla měřena destičkovým readerem při 620 nm. Měření cytotoxicity pomocí MTT bylo zopakováno třikrát a jako negativní kontrola byly použity neovlivněné buňky. Hodnoty IC50 stanovující koncentraci látky, která je letální pro 50 % nádorových buněk, byly odečteny z křivek závislosti buněčné viability na koncentraci testované látky.
Všechny testované sloučeniny vykázaly významné cytotoxické aktivity ve všech pěti buněčných liniích odvozených od nádorů s různým histopatologickým původem a s různými molekulárním alteracemi. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 3.
Tabulka 3. Aktivita nových sloučenin vůči buněčným liniím odvozeným od solidních nádorů.
sloučenina IC50 (μΜ)
G361 MCF7 PLC/PRF/5 PANC-1 HCT116
2 0,78 1,19 0,97 0,46 1,20
5 0,24 0,81 0,70 0,65 1,30
7 0,43 0,46 0,21 1,56 1,97
9 0,25 0,16 0,21 0,30 0,42
13 0,02 0,02 0,05 0,06 0,03
15 0,42 0,53 0,20 0,34 0,69
17 0,24 0,19 0,73 0,34 0,40
27 0,08 0,03 0,04 0,07 0,10
33 0,03 0,02 0,05 0,01 0,04
45 0,22 0,31 0,20 0,32 0,37
47 0,47 0,23 0,24 0,20 0,34
64 0,15 0,22 0,14 0,08 0,34
65 0,04 0,06 0,05 0,02 0,08
67 0,36 0,47 0,29 0,50 0,37
73 2,62 5,30 3,94 0,44 0,99
83 0,04 0,05 0,02 0,02 0,03
Příklad 19
Inhibice CDK
Kináza CDK2/cyklin E byla připravena pomocí bakulovirové infekce v hmyzích buňkách Sf9 a purifíkována na koloně NiNTA (Qiagen). Reakce probíhala za přítomnosti 1 mg/ml histonu Hl a 15 μΜ ATP, 0,05 μθ [γ-33Ρ]ΑΤΡ a testované sloučeniny v celkovém objemu 10 μΐ v reakčním pufru (60 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 3 mM MgCl2, 3 mM MnCl2, 3 μΜ Naorthovanadát, 1,2 mM DTT, 2,5 pg / 50 μΐ PEG2O.ooo)·
CDK5/p35 byla zakoupena od společnosti ProQinase GmbH. Reakce probíhala za přítomnosti 1 mg/ml histonu Hl a 0,15 μΜ ATP, 0.05 pCi [γ-33Ρ]ΑΤΡ a testované sloučeniny v celkovém objemu 10 μΐ v reakčním pufru (60 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 3 mM MgCl2, 3 mM MnCl2, 3 μΜ Na-orthovanadát, 1.2 mM DTT, 2,5 μg / 50 μΐ PEG2O.Ooo).
Reakce byly zastaveny přidáním 5 μΐ 3% vodného roztoku H3PO4 Vzorky byly naneseny na
P-81 fosfocelulosovou membránu (Whatman), která byla následně 3x promyta 0,5% vodným roztokem H3PO4 a usušena na vzduchu. Kinázová inhibice byla stanovena za pomoci digitálního analyzátoru obrazu FLA-7000 (GE Healthcare Life Sciences) a byla vyjádřena jako reziduální kinázová aktivita nebo jako hodnota IC50 udávající koncentraci testované látky způsobující snížení aktivity CDK na 50 %.
Tabulka 4 ukazuje výsledky měření a dokládá, že všechy testované látky velmi účinně inhibovaly CDK2 i CDK5 v nanomolámích koncentracích. Inhibice CDK2 vede k zastavené buněčného cyklu na předchodu Gl/s a v S fázi, kdy dochází k replikaci DNA. Důsledkem toho je pak inhibice proliferace nádorových buněk.
Tabulka 4: Inhibice kináz některými nově připravenými sloučeninami.
sloučenina IC50 (μΜ)
CDK2 CDK5
2 0,197 0,183
5 0,048 0,229
7 0,070 0,165
9 0,018 0,005
13 0,050 0,119
14 0,042 0,180
15 0,061 0,114
17 0,132 0,422
27 0,021 0,005
29 0,039 0,0149
33 0,009 0,001
35 0,012 0,017
40 0,027 0,038
45 0,051 0,017
47 0,467 2,136
54 0,322 0,204
55 0,640 0,182
64 0,046 0,088
65 0,023 0,048
67 0,096 0,179
73 1,483 4,415
83 0,054 0,009
84 0,098 0,021
Příklad 20
Nové sloučeniny ovlivňují buněčný cyklus nádorových buněk
Subkonfluentní buňky byly ovlivněny různými koncentracemi nových sloučenin po dobu 24 hod. 30 min před ukončením inkubace byly buňky naznačeny pulsem 10 mM 5-brom-20
-deoxyuridinu. Buňky byly poté opláchnuty PBS, fixovány 70% ethanolem a denature vány 2 M HC1. Po neutralizaci byla provedena inkubace s fluorescenčně značenou protilátkou proti anti-BrdU, buňky byly opět promyty, nabarveny propidiumjodidem a analyzovány průtokovým citometrem s 488 nm laserem.
Antiproliferativní aktivita sloučenin 15, 45, 47 a 84 byla sledována v asynchronně rostoucí kultuře buněčné linie adenokarcinomu prsu MCF7. Jak ukazuje obrázek 1, nové sloučeniny velmi účinně blokovaly buněčný cyklus v S, G2 a M fázích.
Příklad 21
Nové sloučeniny aktivují v nádorových buňkách kaspázy 3 a 7
Stanovení proapoptotických vlastností nových sloučenin bylo založeno na kvantifikaci enzymatické aktivity kaspasy-3/7. Aktivita buněčné kaspasy-3/7 byla měřena podle protokolu Carrasco et al., 2003, BioTechniques, 34(5): 1064-67. Buňky linie Hep3B a PLC/PRF/5 byly vysazeny do 96-jamkových mikrotitračních destiček v počtu 10000 buněk na jamku. Druhý den byly k buňkám přidány testované látky v různých koncentracích a buňky byly inkubovány 24 hodin. Po uplynutí doby inkubace byl do jamek přidán reakční pufr (150 mM HEPES pH
7,4, 450 mM NaCl, 150 mM KC1, 30 mM MgCl2, 1,2 mM EGTA, 1,5% Nonidet P40, 0,3% CHAPS, 30% sacharosa, 30 mM DTT, 3 mM PMSF) obsahující 150 μΜ substrát Ac-DEVDAMC (Sigma-Aldrich) a destičky byly inkubovány při 37 °C. Aktivita kaspas-3/7 byla změřena po 6 hodinách za pomoci přístroje Fluoroskan Ascent (Labsystems) při 346 nm/442 nm (ex/em).
Fluorimetrické měření aktivity kaspas-3/7 v buňkách K562 odhalilo silnou proapoptotickou aktivitu nových sloučenin ve srovnání s neovlivněnými buňkami (obrázek 2A).
V dalším experimentu byla sloučenina 33 studována detailněji. Fluorimetrická detekce aktivity kaspas-3/7 v buňkách odhalila jasnou a silnou koncentračně-závislou aktivaci kaspáz již nanomolárními koncentracemi sloučeniny 33 (obrázek 2B).
V dalším experimentu byl sledován vliv sloučeniny 45 na aktivaci kaspáz v buněčné linii HCT116 odvozené od karcinomu tlustého střeva. Fluorimetrická detekce aktivity kaspas-3/7 v buňkách odhalila jasnou a silnou koncentračně-závislou aktivaci kaspáz již nanomolárními koncentracemi sloučeniny 45 (obrázek 3).
Příklad 22
Vliv nových látek na antiapoptotické proteiny v nádorových buňkách
Vliv nových látek na aktivaci apoptózy byl dále ověřen studiem exprese vybraných apoptotických proteinů pomocí metody imunoblottingu. Buňky byly sklizeny, třikrát promyty vychlazeným PBS a zlyzovány v extrakčním pufru (50 mM Tris, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1% Nonidet P40) obsahujícím směs inhibitorů proteas a fosfatas (Sigma-Aldrich, USA). 20 pg celkových proteinů bylo separováno pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a následně přeneseno na nitrocelulosovou membránu. Membrány byly blokovány v roztoku PBS s 0,1% Tweenem 20 obsahujícím 5 % sušeného mléka a inkubovány přes noc se specifickými protilátkami: anti atubulin (klon DMI A), anti-Mcl-1 (klon S-19), anti-PARP (klon F-2), anti-Mdm-2 (SMP14), anti-PUMA, anti-p53 (klon DO-1). Všechny primární protilátky byly naředěný do blokovacího roztoku. Jako sekundární byly použity protilátky konjugované s peroxidasou (králičí protilátka proti myším imunoglobulinům a prasečí protilátka proti králičím imunoglobulinům; DAKO, Denmark), které byly vizualizovány pomocí reagencií ECL (GEHealthcare Life Sciences).
Výsledky analýzy několika proteinů souvisejících s apoptózou jsou ilustrovány obrázkem 4. Za jednoznačný důkaz indukce apoptózy sloučeninou 45 v buňkách HCT116 lze považovat nárůst fragmentu proteinu PARP-1 o velikosti 89 kDa; tento nárůst koreloval s postupným poklesem hladiny proteinu PARP-1, neboť tento je známým substrátem kaspázy 3. Aktivaci mitochondriální apoptózy dokládá také postupný pokles antiapoptotického proteinu Mcl-1, a to opět koncentrančně-závislým způsobem. Sloučenina 45 také rychle stabilizovala nádorově supresoncký protein p53, který je významným regulátorem apoptózy. Tento nárůst byl provázen paralelním poklesem hladiny ligázy Mdm-2, která je negativním regulátorem p53.
Příklad 23
Antivaskularizační účinky nových sloučenin
Pro ověření antivaskularizačních schopností nových sloučenin byly provedeny proliferační a migrační experimenty s buněčným modelem HUVEC (lidské pupečníkové endotelové buňky). Buňky byly získány od společnosti Promocell (Heidelberg, Germany) a kultivovány v médiu ECGM (Promocell, Heidelberg, Germany) doplněném 10% fetálního telecího séra (Biochrom, Berlin, Germany). Experimenty byly provedeny s buňkami v pasáži 3.
Pro měření proliferace bylo použito vždy 1,5x107 buněk HUVEC. 24 hod po vysazení byly buňky ošetřeny novými sloučeninami na 72 hod. Měření proliferace bylo provedeno krystalovou violetí, která barví živé buňky, podle popsaného postupu (Koltermann et al. 2007, Cell Mol. Life Sci. 64:1715-1722).
Pro měření vlivu na migraci byla v kontinentní vrstvě buněk HUVEC vytvořena rýha škrábnutím plastikovou špičkou mikropipety a kultura pak byla ihned převedena buď do média Ml99 (serum-free, negativní kontrola; PAN Biotech) nebo do plného média ECGM (pozitivní kontrola). Po 16 hod byly buňky zafixovány 3% formaldehydem a fotografovány systémem TILLvisON (Lochham, Germany) připojeným k mikroskopu Axiovert 200 (Zeiss, Germany). Kvantitativní vyhodnocení bylo provedeno společností S.CO LifeScience (Garching, Germany). Migrace byla kvantifikována jako poměr plochy pokryté buňkami a plochy bez buněk (původní rýha).
Tabulka 5: Anti-vaskularizační účinky nových látek.
sloučenina inhibice proliferace (EC50) inhibice migrace (EC50)
5 234 nM
7 648 nM 550 nM
8 569 nM
9 136 nM
13 9nM 26 nM
15 153 nM
17 95 nM
27 33 nM 35 nM
33 14 nM 22 nM
45 176 nM 500 nM
47 181 nM
65 5 nM 77 iiM
67 69 nM
73 2,278 μΜ
81 1,331 μΜ
83 34 nM 39 nM
Příklady výsledků jsou uvedeny v tabulce 5. Nové sloučeniny signifikantně inhibovaly proliferaci buněk HUVEC v nanomolámích koncentracích. Důležitým poznatkem je, že se jedná o čistě antiproliferativní účinek s minimální cytotoxicitou. Rada nových sloučenin byla schopná inhibovat migraci buněk HUVEC stimulovaných fakturem VEGF. Inhibice migrace HUVEC na volnou plochu (rýhu) novými sloučeninami popisovanými v tomto vynálezu byla jednoznačně koncentračně-závislá a byla pozorovatelná již při nanomolámích koncentracích nových sloučenin.
Příklad 24
Suché tobolky
5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 1250 g
Talek180 g
Pšeničný škrob120 g
Magnesium stearát 80 g
Laktosa20 g
Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 25
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
Lauroglykol 2 litry
Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 26
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
PEG 400 1 litr
Tween 80 1 litr
Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., lne., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I
    ve kterém
    R je vybráno ze skupiny zahrnující
    - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
    - heterocykloalkyl alkyl znamená C3-C10 cykloalkyl skupinu, kde jeden nebo více, s výhodou
    1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, a která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2-C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkylová skupina může být případně substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
    - R’-X kde X je vybráno ze skupiny-NH- a -N(Ci-Cg alkyl), a
    R’ je vybráno ze skupiny zahrnující
    - C2-Cio lineární nebo rozvětvený alkyl, popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy a amino substituent, s výhodou jedním hydroxy a/nebo jedním amino substituentem;
    - (dialkylamino)alkyl skupinu, kde alkyl je vybrán nezávisle ze skupiny zahrnující C1-C10 lineární nebo rozvětvený alkyl;
    - C3-C10 cykloalkyl, což znamená monocyklickou nebo polycyklickou alkylovou skupinu obsahující 3 až 10 uhlíkových atomů, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;
    - heterocykloalkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu jak je definováno výše, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, přičemž heterocykloalkyl je popřípadě substituovaný alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
    - heterocykloalkyl alkyl, což znamená C3-C10 cykloalkylovou skupinu jak je definováno výše, kde jeden nebo více, s výhodou 1 až 3, uhlíků kruhu je nahrazeno heteroatomem vybraným ze skupiny zahrnující N, O, S, která je vázána přes C1-C4 alkylenový můstek, s výhodou přes C2C3 alkylenový můstek, přičemž heterocykloalkyl alkyl skupina je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl, a amino substituent;
    - benzylová skupina, která je popřípadě substituovaná alespoň jedním substituentem vybraným ze skupiny zahrnující fluoro, chloro, hydroxy, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 hydroxyalkyl a amino substituent;
    a jejich farmaceuticky přijatelné soli, zejména s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
  2. 2. 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)phenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-
    - d]pyrimidiny obecného vzorce I podle nároku 1, které nesou substituent R vybraný ze skupiny zahrnující N N-morfolinyl, N-pyrrolidinyl, N-pyrazolidinyl, N-imidazolidinyl, N-piperazinyl, N-piperidinyl, N-thiomorfolinyl, 4-methylpiperazin-l-yl, 4-(2-hydroxethyl)piperazinyl, (R)-
    -(2-hydroxymethylpyrrolidine-l-yl), ethylamino, propylamino, butylamino, (2-
    - hydroxyethyljamino, (3-hydroxypropyl)amino, 2(R)-hydroxypropyl] amino, 2(S)
    -hydroxypropyl]amino, 4-hydroxybut-2(R)-yl]amino, 4-hydroxybut-2(S)-yl]amino, 4-
    - hydroxybut-2(R,S)-yl]amino, 2-(hydroxy-2-methyl)propyl]amino, (2,3-
    -dihydroxypropyl)amino, (l-hydroxy-3-methylbutyl)amino, [(R,S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(R)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, [(S)-(2-hydroxypent-3-yl)]amino, (R)-[l~isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (S)-[ 1 -isopropyl-2-hydroxyethyl]amino, (2-aminoethyljamino, (3-aminopropyl)amino, (4-aminobutyl)amino, (5-aminopentyl)amino, (6-aminohexyl)amino, [3-amino-2-hydroxypropyl]amino, [l-(dimethylamino)methyl] amino, [2-(dimethylamino)ethyl]amino, [3-(dimethylamino)propyl]amino, [4-
    - (dimethylamino)butyl]amino, [2-(diethylamino)ethyl]amino, [3-(diethylamino)propyl]amino, (aziridin-l-yl)ethylamino, (azolidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (piperidin-l-
    -yljethylamino, (azetidin-l-yl)ethylamino, (azetidin-l-yl)propylamino, cyklopropylamino, cyklobutylamino, cyklopentyiamino, cyklohexylamino, (cz.v-2-aminocyklohexyl)amino, (/rmw-2-aminocyklohexyl)amino, (cis, /rms-2-aminocyklohexyl)amino, (cis, trans-3-aminocyklohexyl)amino, (/ran.s-4-aminocyklohexyl)amino, (czs-4-aminocyklohexyl)amino, (cis, trara-4-aminocyklohexyl)amino, (czs-2-hydroxycyklohexyl)amino, (trans-2-hydroxycyklohexyljamino, (cis, //Y/m-2-hydroxycyklohexyl)amino, (cis, trans-3-hydroxycyklohexyljamino, (Z/O/?.s-4-hydroxycyklohexyl)amino, (cis-4-
    - hydroxycyklohexyl)amino, (cis, rrans-4-hydroxycyklohexyl)amino, (2-methoxybenzyl)amino, (3-methoxybenzyl)amino, (4-methoxybenzyl)amino, (3,5-dimethoxybenzyl)amino, (2,6-
    -dimethoxybenzyljamino, (3,4,5-trimethoxybenzyl)amino, (2,4,6-trimethoxybenzyl)amino, (2-fluorbenzyl)amino, (3-fluorbenzyl)amino, (4-fluorbenzyl)amino, (2-chlorbenzyl)amino, (3-chlorbenzyljamino, (4-chlorbenzyl)amino, (2,4-dichlorbenzyl)amino, (3,4,5—trichlorbenzyl)amino.
  3. 3. 5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jako léčiva.
  4. 4. 5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 pro použití při léčbě onemocnění spojených s aberantní buněčnou proliferaci a/nebo apoptózou.
  5. 5. 5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 pro použití pro inhibici migrace endotelových buněk, zejména pro inhibici a/nebo léčbu vaskularizace nádorů.
  6. 6. 5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 pro použití pro inhibici CDK5.
  7. 7. 5-Substitutované 7-(4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 pro použití při léčbě nádorových onemocnění.
  8. 8. 5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 pro použití při léčbě leukémií a/nebo solidních nádorů.
  9. 9. 5-Substitutované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 pro použití pro inhibici a/nebo léčbu vaskularizace při nádorech, embryonálním vývoji, menstruačním cyklu a hojení ran.
  10. 10. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden 5-substitutovaný 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.
CZ2015-324A 2015-05-14 2015-05-14 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky CZ307147B6 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-324A CZ307147B6 (cs) 2015-05-14 2015-05-14 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky
EP15784268.3A EP3294741B1 (en) 2015-05-14 2015-10-02 5-substituted 7-[4-(2-pyridyl)phenylmethylamino]-3-iso propylpyrazolo[4,3-d]pyrimidine derivatives, use thereof as medicaments and pharmaceutical compositions
PCT/CZ2015/050006 WO2016180380A1 (en) 2015-05-14 2015-10-02 5-substituted 7-[4-(2-pyridyl)phenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo4,3-d]pyrimidine derivatives, use thereof as medicaments, and pharmaceutical compositions
US15/558,151 US9957273B2 (en) 2015-05-14 2015-10-02 5-substituted 7- [4-(2-pyridyl)phenylmethylamino] -3-isopropylpyrazolo4,3-D]pyrimidine derivatives, use thereof as medicaments, and pharmaceutical compositions

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-324A CZ307147B6 (cs) 2015-05-14 2015-05-14 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2015324A3 true CZ2015324A3 (cs) 2016-11-23
CZ307147B6 CZ307147B6 (cs) 2018-02-07

Family

ID=54345401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2015-324A CZ307147B6 (cs) 2015-05-14 2015-05-14 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9957273B2 (cs)
EP (1) EP3294741B1 (cs)
CZ (1) CZ307147B6 (cs)
WO (1) WO2016180380A1 (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116854693A (zh) * 2016-09-30 2023-10-10 阿沙纳生物科学公司 P2x3和/或p2x2/3化合物及方法
CN108484613B (zh) * 2018-05-22 2020-07-07 江南大学 一种吡唑并[1,5-a]嘧啶类化合物及其应用
JP2024519215A (ja) 2021-05-07 2024-05-09 カイメラ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｄｋ２分解剤およびそれらの使用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE478872T1 (de) * 2002-03-28 2010-09-15 Ustav Ex Botan Av Cr V V I I O Pyrazoloä4,3-düpyrimidine, verfahren zu ihrer herstellung und therapeutische anwendung
ES2351624T3 (es) * 2003-05-06 2011-02-08 Ústav Experimentálni Botaniky Av Cr, V.V.I. (Institute Of Experimental Botany Academy Of Sciences Of The Czech Republic, Pro) Pirazolo[4,3-d]pirimidinas, procedimiento para su preparación y uso.
CZ2009358A3 (cs) * 2009-06-03 2010-12-15 C3 Bio Gmbh 5,7-Disubstituované 3-isopropylpyrazolo[4,3-d]pyrimidiny pro použití jako lécivo a farmaceutické prípravky tyto látky obsahující
CZ306894B6 (cs) * 2013-02-08 2017-08-30 Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci 2-Substituované-6-biarylmethylamino-9-cyklopentyl-9H-purinové deriváty, jejich použití jako léčiva a farmaceutické přípravky tyto sloučeniny obsahující

Also Published As

Publication number Publication date
CZ307147B6 (cs) 2018-02-07
US20180072736A1 (en) 2018-03-15
US9957273B2 (en) 2018-05-01
WO2016180380A1 (en) 2016-11-17
EP3294741A1 (en) 2018-03-21
EP3294741B1 (en) 2019-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6968141B2 (ja) 新規ｕｌｋ１阻害剤およびそれを使用する方法
USRE47739E1 (en) 2-(pyridin-2-ylamino)-pyrido[2,3-D]pyrimidin-7-ones
EP4011882B1 (en) 4-substituted aminoisoquinoline derivatives
EP0964864B1 (en) Pyrido 2,3-d pyrimidines and 4-aminopyrimidines as inhibitors of cellular proliferation
EP3004060B1 (en) Compounds for kinase modulation, and indications therefor
EP1641805B1 (en) Thiazolo-, oxazalo and imidazolo-quinazoline compounds capable of inhibiting protein kinases
US10130629B2 (en) Pharmaceutical combinations
US20100184790A1 (en) Pyrrolo[2,3-b]pyridine compounds, azaindole compounds used for synthesizing said pyrrolo[2,3-b]pyridine compounds, methods for the production thereof, and uses thereof
HUP0401293A2 (hu) Új dihidropteridinonok, eljárás előállításukra és alkalmazásuk gyógyszerként
US20180297995A1 (en) Pyrimidine or pyridopyridone compound and application thereof
EA005287B1 (ru) Птеридиноны в качестве ингибиторов киназ
US20140045826A1 (en) Methods and compositions for treating neurodegenerative diseases
JP2008503515A (ja) 新規２−ベンジルアミノジヒドロプテリジノン、それらを製造する方法及び薬剤としてのそれらの使用
IL186270A (en) Compositions comprising alkynyl pyrrolopyrimidines and uses thereof for preparing medicaments
CZ20022475A3 (cs) Pyrido[2,3-d]pyrimidin-2,7-diaminové inhibitory kinázy
JP2006511458A (ja) アザプリン誘導体
AU2002247059B2 (en) Method of treating inflammatory and immune diseases using inhibitors of IkappaB kinase (IKK)
US20240245634A1 (en) Pcna inhibitors and egfr inhibitors for cancer treatment
ES2865424T3 (es) Análogos de quinolina como inhibidores de la fosfatidilinositol 3-quinasa
US20230416221A1 (en) Dihydroisoquinolinone and isoindolinone derivatives and uses thereof
CZ2015324A3 (cs) 5-Substituované 7-[4-(2-pyridyl)fenylmethylamino]-3-isopropylpyrazolo [4,3-d]pyrimidiny, jejich použití jako léčiva, a farmaceutické přípravky
EP4491626A1 (en) Phenylsulfonamide derivatives, preparation method therefor, and pharmaceutical composition for prevention or treatment of cancer containing same as active ingredient
CA2434085A1 (en) Cyclin dependent kinase inhibiting purine derivatives
CZ2009359A3 (cs) Substituované deriváty 6-(2-hydroxybenzylamino)purinu, jejich použití jako léciva a farmaceutické prípravky tyto slouceniny obsahující
CZ306987B6 (cs) 2,6-disubstituované puriny pro použití jako léčiva a farmaceutické přípravky je obsahující

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20200514