CZ2003159A3 - Ligand CRF2 pro kombinační terapii - Google Patents

Ligand CRF2 pro kombinační terapii Download PDF

Info

Publication number
CZ2003159A3
CZ2003159A3 CZ2003159A CZ2003159A CZ2003159A3 CZ 2003159 A3 CZ2003159 A3 CZ 2003159A3 CZ 2003159 A CZ2003159 A CZ 2003159A CZ 2003159 A CZ2003159 A CZ 2003159A CZ 2003159 A3 CZ2003159 A3 CZ 2003159A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
crf
receptor
ligand
antisense
disorder
Prior art date
Application number
CZ2003159A
Other languages
English (en)
Inventor
Siew Peng Ho
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Pharma Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol-Myers Squibb Pharma Co. filed Critical Bristol-Myers Squibb Pharma Co.
Publication of CZ2003159A3 publication Critical patent/CZ2003159A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

'TV A»2~
Oblast techniky
Tento vynález se týká farmaceutického prostředku obsahujícího ligand receptoru CRFi a ligand receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo prekurzory léčiv, a způsobu léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFX a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRF], a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde ligandy receptoru CRF podle tohoto vynálezu jsou agonisty nebo antogonisty recpetorů CRF. Vedle farmaceutického předmětu tohoto vynálezu, kterým jsou receptory CRF, se tento vynález také týká farmaceutických činidel, které jsou zacílena na mRNA receptorů CRFX a CRF2.
Dosavadní stav techniky
Rozsáhlé studie přispěly k objasnění důležitosti faktoru uvolňujícího kortikotropin (corticotropín releasing factor - CRF) při řízení hypofyzárně-adrenokortikálního systému a při zprostředkování behaviorálních, autonomních a imunitních odpovědí na stres. Má se tedy za to, že tento peptid se účastní patofyziologie afektivních poruch.
V současnosti jsou identifikovány dva sedmkrát procházející transmembránové receptory, CRFi a CRF2, které zprostředkovávají účinky CRF. Oba receptory jsou široce exprimovány v mozku, ačkoliv překrytí oblastí s nejvyšší expresí obou podtypů receptorů je málo významné, bylo sděleno, že transgenní myši s nadměrnou expresí CRF vykazují zvýšené anxiogenní (produkující úzkost) chování (Stenzel-Poore a » · * · * · · » » • · · · · « · · · • · · · * · »· · ··· ·» «· kol., Overproduction of corticotropin-releasing factor in transgenic mice: A genetic model of anxiogenic behavior, J. Neuroscience, 14, 2579 až 2584 (1995)). Obzvláštní důležitost má otázka zda anxiogenní odpovědi jsou zprostředkovány přes působení CRF na receptory CRFi, receptory CRF2 nebo obojí.
Antagonisty faktoru uvolňujícího kortikotropin (CRF) jsou zmíněny v US patentech č. 4 605 642, 5 874 227,
962 479, 5 063 245, 5 861 398 a 6 083 948, které jsou zde zahrnuty ve své celistvosti formou odkazu. Několik publikovaných patentových přihlášek také popisuje sloučeniny s antagonistickým účinkem vůči faktoru uvolňujícímu kortikotropin, mezi nimiž je PCT přihláška firem DuPont Merck US94/11050, firmy Pfizer WO 95/33750, firmy Pfizer WO 95/34563, firmy Pfizer WO 95/33727 a US patent č. 5 424 311. Choroby, které se považují za léčitelné pomocí antagonistů CRF jsou diskutovány v US patentu č. 5 063 245 a ve Pharm Rev., 43, 425 až 473 (1991).
Role CRF byla rovněž postulována v etiologii a patofyziologii Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby, Huntingtonovy choroby, anorexia nervosa, progresivní supranukleární parézy a amyotrofické laterální sklerózy, protože se týkají dysfunkce neuronů CRF v centrálním nervovém systému (přehled viz E.B. De Souza, Hosp. Pracice, 23, 59 (1988), G.N. Smagín, L.A. Howell, D.H. ryan, E.B. De Souza a R.B.S. Harris, Neuroreport, 9, 1601 až 1601 (1998) aj. Pharmacol. Exp. Therap., 293, 700 až 806 (2000)). US patent č. 6 051 578, který je zde zahrnut ve své celistvosti formou odkazu,. popisuje antagonisty receptoru (CRF), které jsou užitečné při léčení a prevenci poranění
e · 9 • 9 9 • · · ·
• · · • • • • •
• · · • • « »
• · • · 9 • • · · • • · · • • · • • · • ·
hlavy, poranění míchy, ischemického poškození nervů (např. cerebrální ischemie, jako je cerebrální hippokampální ischemie) excitotoxického poškození nervů, epilepsie, mrtvice, stresem navozených poruch imunity, fóbií, svalových spasmů, Parkinsonovy choroby, Huntingtonovy choroby, močové inkontinence, senilní demence Alzheimerova typu, vícečetné infarktové demence, amyotrofické laterální sklerózy, závislostí na chemických látkách (např. závislostí na alkoholu, kokainu, heroinu, benzodiazepinech nebo dalších léčivech) a hypoglýkémie.
US patent č. 6 001 807, který je zde zahrnut ve své celistvosti formou odkazu, popisuje antagonisty receptoru (CRF), které jsou užitečné při léčení a prevenci zvracení. Antiemetická aktivita antagonistů CRF je ukázána pomocí experimetů provedených například podle popisu, který uvedli Ueno a kol., Life Sciences, 41, 513 až 518 (1987) a Rudd a kol., British Journal of Pharmacology, 119, 931 až 936 (1996).
Rovněž řada publikací popisuje antagonisty receptoru CRFi, například Chen a kol., J. Med Chem., 39,
4358 až 4360 (1996), Whitten a kol., J. Med Chem., 39, 4 354 až 4357 (1996), Chen a kol., J. Med Chem., 40(11), 1749 až 1754 (1997), Lundkvist a kol., Eur. J. Pharmacology, 309, 198 až 200 (1996) a Mansbach a kol., Eur. J. Pharmacology, 323, 21 až 26 (1997), které jsou zde zahrnuty ve své celistvosti formou odkazu. Specifičtěji je popsán ligand receptoru CRFi v Gilligan a kol., BioOrganic Medicinal Chem., 8, 181 až 189 (2000), což je zde zahrnuto ve své celistvosti formou odkazu.
Ligandy receptoru CRF2, například sauvagin, urokortin a další CRF2 peptidy, jsou také popsány v Ho a kol., Mol. Brain Res., 6, 11 (1998), J. Spiess a kol., Trends Endocrinology and Metabolism, 9, 140 až 145 (1998) Molecular Properties of the CRF Receptor, a v D.P. Behan a kol., Mol. Psychiatry, 1, 265 až 277 (1996), což je zde zahrnuto ve své celistvosti formou odkazu.
Zatímco se ukázalo, že blokáda receptoru CRFi selektivními antagonisty vede u zvířat k anxiolytickým (snižujícím úzkost) a antidepresivním účinkům, funkce receptorů CRF2 je méně detailně prostudována. Hybridizace ín sítu a experimenty s receptorovou autoradiografií ukazují, že receptor je lokalizován primárně v límbické a hypotalamícké oblasti mozku, což naznačuje roli CRF při mediaci anxiogenních a anorektíckých účinků. V současnosti byly identifikovány selektivní antagonísté CRF2 (anti-sauvagin-30) (Gulyas a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA,
92, 10575 až 10579 (1995)). Navíc byl identifikován astressin, což je peptid, který má duální aktivitu vůči CRFi i CRF2 (A. Ruhman, I. Bonk, C.R. Lín, M.G. Rosenfeld aj . Spiess, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 95, 15264 až 15269 (1998). Za nepřítomnosti specifických agonistů a antagonistů tohoto receptoru může protismyslová suprese receptoru CRF2 poskytnout důkaz o roli tohoto receptoru v normální fyziologii.
Protismyslové nukleotidy jsou krátké nukleotidy (obvykle v délce od asi 15 do asi 25 nukleotidů), které jsou sestrojeny jako komplementární k části předmětné molekuly mRNA. Hybridizace protismyslového oligonukleotidu na jeho cílové místo v mRNA prostřednictvím Watsonova• · · · ··· «·· <· ««
-Crickova párování bází iniciuje kaskádu událostí, která končí na oligonukleotidy zaměřenou degradací cílové molekuly mRNA. Přímým důsledkem této degradace mRNA je potlačení syntézy kódovaného proteinu. Studie provedené za přítomnosti významně snížených hladin cílového proteinu mohou odhalit jeho funkci. Za nepřítomnosti ligandů s malou molekulou (jako v případě receptoru CRF2) mohou být protismyslové oligonukleotidy mimořádně užitečnými nástroji pro studium funkce proteinů. Navíc je lze použít pro rozlišení mezi blízce příbuznými členy rodiny proteinů (jako je CRFi a CRF2) způsoby, které často nejsou u ligandů s malou molekulou možné.
Design a selekce silných protismyslových sekvencí není jednoduchým úkolem. Protismyslové oligonukleotidy se velmi a nepředvídatelně liší ve své aktivitě, protože jejich mRNA cíle mají významnou sekundární a terciární strukturu, která větší části molekuly mRNA znepřístupňuje hybridizaci. Pouze 20 až 25 protismyslových sekvencí má významnou inhibiční aktivitu (50 % nebo více). Pomocí molekulární techniky kterou původci vyvinuli (Ho a kol., Potent antisense oligonucleotides to the human multidrug resistance-1 mRNA are rationally selected by mapping RNAaccessible sites with oligonucleotide libraries, Nucl.
Acids Res., 24, 1901 až 1907 (1996), Ho a kol., Mapping of RNA accessible sites for antisense experiments with oligonucleotide libraries, Nátuře Biotech., 16, 59 až 63 (1998)) byly na molekule mRNA kódující receptor CRF2 identifikovány četné přístupné oblasti. Protismyslové oligonukleotidy zaměřené proti těmto přístupným místům ínhibovaly vazbu 125I-sauvaginu na receptory CRF2 in vivo alespoň z 50 %.
• · · · · ·
Byly publikovány dvě protismyslové studie zkoumající funkci receptorů CRF2. Žádná z nich nenalezla důkaz pro účast receptorů CRF2 při mediaci anxiogenních účinků CRF. V jedné studii (Heinrichs a kol., Corticotropin-releasing factor CRFi but not CRF2 receptors mediate anxiogenic-like behavior, Reg. Peptides, 71, 15 až 21 (1997)) však byly receptory CRF2 sníženy pouze o 15 až 20 %, přičemž použité oligonukleotidy navodily toxické vedlejší účinky (významná ztráta hmotnosti), což mohlo ovlivnit behaviorální experimenty. V druhé zprávě (Montkovski a kol., Biol. Psychiatry, 22' 566 (1996) a G. Liebsch, R. landgraf, M. Engelmann, P. Lorscher a F. Holsboer, J. Psychiatrie Res., 33, 153 až 163 (1999)) nebyly poskytnuty žádné větší detaily.
Ve studii používající protismyslové oligonukleotidy proti CRF2, které jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/US00/0819 a US patentové přihlášce č. 09/481981, které jsou zde zahrnuty ve své celistvosti, však původci nalezli, že suprese exprese receptorů CRF2 vytváří u zvířat anxiolytický účinek.
Dále původci nalezli, že když se protismyslový oligonukleotid proti receptorů CRF2 podává spolu s ligandem receptorů CRFi, anxiolytický účinek je výrazně posílen.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká způsobu léčení poruchy spojené s aktivitou receptorů CRFX a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptorů CRFi a ligandu • · · · · · receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných soli nebo prekurzorů léčiv.
V jednom ztělesněni předložený vynález poskytuje způsob léčeni poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFX a CRF2, který zahrnuje podáváni pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde ligand receptoru CRFi je agonistou receptoru CRFi.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde ligand receptoru CRFi je antagonistou receptoru CRFi.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFX a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde ligand receptoru CRF2 je agonistou receptoru CRFi.
V ještě jiném ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich ··· · 4 ··· • 4*4 · ···· 4 «44 4 4 · · · 4
4444 4· ··· ·4· »* 4· farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde ligand receptoru CRF2 je antagonistou receptoru CRFi.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a protismyslového oligonukleotidu proti receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde protismyslový oligonukleotid proti receptoru CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % .2 '-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a protismyslového oligonukleotidu proti receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde protismyslový oligonukleotid proti receptoru CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů zvolených z následující skupiny: 2'-methoxyribonukleotidfosfodiestery, 2'-fluorribonukleotidfosfodiestery, 5-(1-propynyl)cytosinfosforthioát, 5-(1-propynyl)uracilfosforthioát, 5-methylcytosinfosforthioát, 2'-deoxyribonukleotid-N3'-P5'-fosforamidát a polyamidové nukleové kyseliny a uzavřenými nukleovými kyselinami obecných vzorců
kde B je purinová nebo pyrimidinová báze.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptorů CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství lígandu receptorů CRFi a protismyslového oligonukleotidu proti receptorů CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde protismyslový oligonukleotid proti receptorů CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů, kde oligonukleotid je dlouhý od asi 15 do asi 25 nukleotidů.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptorů CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptorů CRFi a protismyslového oligonukleotidu proti receptorů CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde protismyslový oligonukleotid proti receptorů CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků protismyslových • · oligonukleotidů je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFx a protismyslového oligonukleotidu proti receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde protismyslový oligonukleotid proti receptoru CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem obsahujícím následující sekvence:
(a) TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG;
(b) GGT GGG CGA TGT GGG AAT G;
(c) GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG 3
(d) TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde poruchou je psychiatrická porucha.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFX a protismyslového oligonukleotidu proti receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů • · * · ·· ·» • · · • ·· • · • · ···· ·· léčiv, kde psychiatrická porucha je zvolena ze skupiny sestávající z úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií, anorexie nervosa a deprese.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFX a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde porucha je zvolena ze skupiny sestávající z poranění hlavy, poranění míchy, ischemického poškození nervů (např. cerebrální ischemie, jako je cerebrální hippokampální ischemie) excitotoxíckého poškození nervů, epilepsie, mrtvice, stresem navozených poruch imunity, fóbií, svalových spasmů, Parkinsonovy choroby, Huntingtonovy choroby, močové inkontinence, senilní demence Alzheimerova typu, vícečetné infarktové demence, amyotrofické laterální sklerózy, závislostí na chemických látkách (např. závislostí na alkoholu, kokainu, heroinu, benzodiazepinech nebo dalších léčivech) a hypoglykémie.
V jiném ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFx a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde podávání ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 je současné.
V ještě jiném ztělesnění předložený vynález
poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, který zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRFi a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde podávání ligandu receptoru CRFX a ligandu receptoru CRF2 je sekvenční.
V ještě jiném ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFX a CRF2, který zahrnuje kontaktování účinného množství ligandu receptoru CRFX a ligandu receptoru CRF2 s prostředkem obsahujícím receptor CRFX a receptor CRF2.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFX a CRF2, který zahrnuje kontaktování účinného množství ligandu receptoru CRFX a protismyslového oligonukleotidů proti receptoru CRF2 s prostředkem obsahujícím receptor CRFX, kde protismyslový oligonukleotid proti receptoru CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % '-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
V dalším ztělesnění se předložený vynález týká léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRF2, které zahrnuje kontaktování účinného množství ligandu receptoru CRF2 s prostředkem obsahujícím receptor CRF2.
V ještě jiném ztělesnění předložený vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující ligand receptoru CRFX a ligand receptoru CRF2 nebo jejich ···· ·· ·· · · ·· • · · · ·· ·· · * • ·· · · · · · farmaceuticky přijatelné soli nebo prekurzory léčiva a farmaceutický nosič.
V ještě jiném ztělesnění předložený vynález poskytuje farmaceutický kit pro léčení nebo prevenci poruchy spojené s .aktivitou receptoru CRFx a CRF2, kde uvedený kit obsahuje řadu oddělených nádob, kde alespoň jedna z uvedených nádob obsahuje ligand receptoru CRFi nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo prekurzor léčiva a alespoň jedna z uvedených nádob obsahuje ligand receptoru CRF2 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo prekurzory léčiva, přičemž uvedené nádoby případně obsahují farmaceutický nosič.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje farmaceutický kit pro léčení nebo prevenci poruchy spojené s aktivitou receptoru CRFi a CRF2, kde uvedený kit obsahuje řadu oddělených nádob, kde alespoň jedna z uvedených nádob obsahuje ligand receptoru CRFi nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo prekurzor léčiva a alespoň jedna z uvedených nádob obsahuje protismyslový oligonukleotid proti receptoru CRF2 nebo jeho farmaceutickypřijatelnou sůl nebo prekurzor léčiva, přičemž uvedené nádoby případně obsahují farmaceutický nosič.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje sloučeninu, která má aktivitu ligandu receptoru CRFi a aktivitu ligandu receptoru CRF2 pro použití při léčení psychiatrických poruch.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje protismyslové oligonukleotidy zaměřené proti mRNA receptoru CRF2, které podstatně snižují expresi receptorů
CRF2 v mozku hlodavců. Suprese funkce receptoru CRF2 pomocí těchto oligonukleotidů navodila u zvířat významné anxiolytické (snižující úzkost) účinky. Tato data poskytují první funkční důkaz, že receptory CRF2 hrají důležitou roli při mediaci anxiogenních (úzkost navozujících) účinků faktoru uvolňujícího kortikotropin. Dále tato data ukazují na potenciál antagonistů receptoru CRF2, včetně malých molekul, mít účinek při léčení široké škály psychiatrických poruch včetně úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií a deprese.
V dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob léčení psychiatrických poruch včetně úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií a deprese, výčet tím však není omezen, u pacienta, kdy se pacientovi, který takové léčení potřebuje, podává terapeuticky účinné množství farmaceutického prostředku obsahujícího protismyslové oligonukleotidy zahrnující protismyslové oligonukleotidy složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález poskytuje způsob screeningu sloučenin k určení aktivity pro léčení psychiatrických poruch včetně úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií a deprese, výčet tím však není omezen.
V ještě dalším ztělesnění předložený vynález ·· ···· • · 9 • · · poskytuje protismyslové oligonukleotidy složené z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Stručný přehled obrázků na výkresech
Jistá ztělesnění tohoto vynálezu byla zvolena za účelem ilustrace a popisu, ale nejsou v žádném případě určena k omezení rozsahu tohoto vynálezu. Tato ztělesnění vynálezu jsou ukázána na doprovázejících obrázcích popsaných dále.
Obr. la: Schéma volby protismyslové sekvence.
Obr. lb: Identita chimérních, polonáhodných oligonukleotidových knihoven.
Obr. 2a: Struktura nejběžněji používaných nukleotidových analogů v protismyslových studiích, fosforthioátová variace navozuje toxické účinky pro CNS.
Obr. 2b: Struktura modifikovaných nukleotidových analogů, které si uchovávají potenci, ale eliminují toxicitu při ínkorporaci do oligonukleotidů pro použití v CNS.
Obr. 2c: Jedna z několika možných konfigurací chimérních oligonukleotidů.
Obr. 3a: Účinek protismyslových oligonukleotidů na „ztuhnutí krys.
·* ···· ·· ·· • · · · • ·· • · · • · · ···· ·· • · « · · • · · · • · · · · • · · · · • ··· ·« ··
Obr. 3b: Inhibice vazby 125I-sauvaginu v laterálním septu krys ošetřených protismyslovým oligonukleotidem v testu „ztuhnutí.
Obr. 4a: Účinek ošetření protismyslovým oligonukleotidem na chování hlodavců v bludišťovém testu.
Obr. 4b: Inhibice vazby 125I-sauvaginu v laterálním septu krys ošetřených protismyslovým oligonukleotidem v bludišťovém testu.
Obr. 5: Účinek antisauvaginu-30 na „ztuhnutí u krys.
Obr. 6: Účinek kombinace protismyslového oligonukleotidu proti receptoru CRF2 s antagonistou GRFi na „ztuhnutí u krys.
Detailní popis vynálezu
Ne každý protismyslový oligonukleotid má silnou inhibiční aktivitu, přičemž oligonukleotidy směřující vůči mRNA receptoru CRF2 nejsou výjimkou z tohoto pravidla. Identifikace protismyslových sekvencí je jedním z vícerých důležitých parametrů, které rozhodují o úspěchu protismyslových experimentů. Faktory, které ovlivňují potenci protismyslových sekvencí jsou komplexní a ne zcela pochopené, v důsledku toho pouze 20 až 35 % testovaných protismyslových oligonukleotidů je dostatečně aktivních k navození 50% inhibičního účinku na syntézu předmětného proteinu.
Selekce aktivních protismyslových sekvencí byla do značné míry empirická a poněkud časově náročná. Byl tedy • · · · ···· · · é · · ' <* · • ·· · · · · ·
6»·» · « · · « « i *7 ··· · · 4 « · ·
1/ ···· ·· ··· ··· ·· ·· vyvinut způsob lokalizace míst na molekule mRNA,' která jsou nejvíce přístupná hybridizaci s protismyslovými oligonukleotidy (Ho a kol., (1996), HO a kol., (1998)). Toho se dosáhlo (obr. la) sondováním RNA transkriptu s knihovnou chemicky syntetizovaných, polonáhodných oligonukleotidů (obr. 1b). Při jejich vzájemném smísení by měly přístupné oblasti hybridizovat s komplementárními sekvencemi nalezenými v knihovně. Tyto oblasti se následně identifikují pomocí ribonukleázy H (RNáza H), která katalyzuje hydrolytické štěpení fosfodiesterové kostry pouze řetězce RNA hybridního duplexu RNA-DNA. Sekvenování vytvořených fragmentů RNA umožňuje identifikací těchto oblastí v určité sekvenci mRNA, které potom mohou sloužit jako místa pro zacílení protismyslových oligonukleotidů. Aplikace tohoto způsobu mapování RNA na transkript RNA obsahující celou kódující oblast mRNA pro receptor CRF2 vedlo k identifikaci četných míst na RNA, která jsou přístupná hybridizaci s protismyslovými oligonukleotidy (tabulka 1).
Tabulka 1
Přístupné místo Lokalizace
A 315 až 338
B 417 až 455
C 608 až 625
D 677 až 731
E 763 až 813
F 859 až 882
G 911 až 941
H 1018 až 1031
I 1161 až 1185
J 1238 až 1258
K 1385 až 1417
• · · ·
Tabulka 1: místa na mRNA receptoru CRF2, která jsou přístupná oligonukleotidové hybridizaci. Informace o sekvencích lze získat odkazem na RNU16253.GB_RO (sekvence GenBank, přístupové číslo U16253).
Protismyslové oligonukleotidy dlouhé 15 až 25 nukleotidů mohou být designovány cílením 5'-konce protismyslového oligonukleotidu na přístupná místa definovaná podle údajů poskytnutých v tabulce 1. Například protismyslový oligonukleotid použitý ve studiích popsaných dále byla 20-nukleotidová sekvence (TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC) zacílená na polohy 758 až 777 přístupného místa E.
Protismyslové sekvence zaměřené proti několika z těchto míst v buněčných stanoveních inhibují syntézu receptoru CRF2 alespoň z 50 %. To se stanoví pomocí stanovení vazby radioaktivního ligandu využívajícího 125I-sauvagin. Protismyslové inhibice je sekvenčně specifická, protože 4-bázové neshody protismyslových oligonukleotidů navozují pouze minimální snížení vazby 125I-sauvaginu. Navíc tyto sekvence také potlačují syntézu receptoru CRF2 in vivo.
Dvěma chemickými verzemi oligonukleotidů nejběžněji používané v in vivo protismyslových experimentech na CNS jsou 2'-deoxyribonukleotidfosfodiesterové oligonukleotidy a 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátové oligonukleotidy (obr. 2a). Zatímco jsou shodné v chemiské struktuře s dvoušroubovicí DNA v genech, jednošroubovicové fosfodiesterové oligonukleotidy jsou však citlivé na exonukleolytickou a endonukleolytickou degradaci s poločasem v séru 20 minut. Dokonce i v „privilegovaném” • · ·· »9 9 99 9 • ·· · · • · t · · · ♦ • · · · ·
9 99 9 9 999 9 9 9 prostředí mozku s jeho nižší hladinou nukleázové aktivity jsou fosfodiesterové oligonukleotidy degradovány, ačkoliv pomaleji. Fosforthioátové oligonukleotidy, kde jeden z atomů kyslíku fosfátu, který netvoří můstek, je nahrazen atomem síry, jsou mnohem odolnější vůči degradačním enzymům. V experimentech se sérem a tkáňovými kulturami mají fosforthioátové oligonukleotidy poločas delší než 12 hodin a analýza fosforthioátů extrahovaných z krysího mozku ukazuje, že tyto oligonukleotidy jsou chemicky intaktní alespoň po dobu 24 hodin. Podání těchto oligonukleotidů do mozku však navozuje toxické účinky související s chemickou podstatou látky, nikoli s její sekvencí. V současnosti jsou hlášeny febrilní odpovědi, indukce mediátorů zánětu, ztráta hmotnosti a různé klinické projevy. V experimentech provedených původci protismyslové sekvence proti CRF2 obsahující fosforthioátovou chemickou složku navozují u ošetřených zvířat velké inhibiční účinky na receptor CRF2, ale zapříčiňují významný úbytek hmotnosti (podobně jako u Heinrichovy zprávy) a řadu patofyziologických symptomů, tyto účinky se pozorují u mnoha různých sekvencí, protismyslových stejně jako kontrolních, což vylučuje možnost, že jde o cílově specifické účinky.
Strategie, která snižuje celkový obsah fosforthioátů v těchto oligonukleotidech byly nejúčinnější při uchovávání oligonukleotidové potence, přičemž obešly tyto toxické účinky. Chimérní oligonukleotidy kde až 60 % '-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými ribonukleotidfosdiesterovými zbytky (viz obr. 2b) eliminuje ztrátu hmotnosti a všechny ostatní známky toxicity. Zbývajících 40 % 2'-deoxyribonukleotidfosf orthioátových zbytků je přítomno v pokračujícím prodloužení k usnadnění štěpení cílových druhů mRNA RNázou • · * • 9 · ·
9» · · · *
99
H (obr. 2c). Inkorporace jiných chemických analogů, jako je 5-propynyl-2'-deoxycitidin, 5-propynyl-2'-deoxyuridin a 5-methyl-2'-deoxycitidin (ale s fosforthioátovými vazbami, obr. 2b) rovněž významně snižuje tyto toxické účinky. Kromě snížené toxicity jsou tyto zbytky modifikovaných nukleotidů odolnější vůči degradaci buněčnými nukleázami než 2'-deoxyribonukleotidfosfódiesterové zbytky.
Nepřítomnost funkčních změn plynoucí z malých protismyslových inhibičních účinků často vede k neinterpretovatelným výsledkům. Je tomu tak v důsledku nejistoty zda v experimentu vznikly skutečně negativní výsledky nebo zda byla protismyslová inhibice nedostačující k odhalení funkční změny. Vedle protismyslové sekvence je velikost protismyslových inhibičních účinků ovlivněna trváním ošetřování protismyslovou látkou a jejím vztahem k poločasu cílového proteinu. Zatímco poločas receptoru CRF2 je neznámý, poločasy jiných sedmkrát procházejících transmembránových receptorů v mozku hlodavců (jejichž je receptor CRF2 členem) jsou v řádu 2 až 3 dnů. maximální inhibiční účinky se obvykle pozorují po ošetřování protismyslovou látkou alespoň po 3 poločasy proteinu. Zatímco podávání protismyslové látky proti CRF2 po dobu 5 dnů navodí 40 až 50% inhibici receptoru, prodloužení trvání dávkování na 9 dnů vede k70 až 80% inhibičnímu účinku na vazbu receptoru. Navíc kvantitativní hybrídizace in sítu odhalí srovnatelná snížení mRNA pro receptor CRF2. Neshodný kontrolní oligonukleotid s neshodou ve 4 bázích vytvoří za těchto podmínek minimální snížení jak receptoru, tak vazby mRNA. Na rozdíl od Heinrichse a kol., jejichž protismyslový oligonukleotid proti receptoru CRF2 navodil pouze 15 až 20% snížení receptoru CRF2 doprovázené významným úbytkem hmotnosti ošetřovaných zvířat, původci tedy optimalizovali
«··* ·· c·· ··· «· ·· protismyslové činidlo pro studium funkce receptoru CRF2. Volba protismyslové sekvence pomcí metody mapování RNA kombinované s optimalizovaným chemickým složením nukleotidu vede ke vzniku silných protismyslových sekvencí, které při podávání hlodavcům po dobu 8 až 10 dnů navodí velké (okolo 70 %) snížení vazby receptoru CRF2.
Protismyslové oligonukleotidy proti CRF2 se podávají intracerebroventrikulárně do cílového laterálního septa, což je oblast mozku obsahující vysoké hladiny receptoru CRF2 a mRNA kódující CRF2. Laterální septum je součástí limbické oblasti mozku, která je známa svou účastí při modulaci strachu a emocí. Krysy ošetřované fyziologickým roztokem, protismyslovou látkou a neshodnými kontrolními oligonukloeotidy se testují ve dvou různých behaviorálních modelech úzkosti. Hlodavci vykazují při strachu a úzkosti charakteristické ztuhnutí. V modelu sledování úzkosti pomocí ztuhnutí se takové chování indukuje expozicí krátkým elektrickým ranám do nohou. Pokud se takové krysy vrátí do boxu s elektrickými ranami po několikadenní přestávce, pozoruje se u nich ztuhnutí dokonce i když nedochází k další aplikaci ran. Podání anxiolytických léčiv, jako jsou benzodiazepiny a selektivní inhibitory zpětného příjmu serotoninu, snižuje trvání ztuhnutí, pokud se do boxu dají zvířata, jež byla předtím vystavena elektrickým ranám. V experimentech s protismyslovými látkami započne podávání oligonukleotidů po dvou po sobě jdoucích dnech expozice elektrickým ranám do nohou. Dvě hodiny po posledním podání oligonukleotidu v den 8 dávkování se krysy vrátí do boxu a pozorují se 10 minut.
V této části experimentu, který vyšetřuje účinek farmakologického činidla na podmíněné strachy, protismyslový oligonukleotid, nikoli však neshodná • « a a » a a a a a a a a a a a a a a a a a a • · · · · · · · • a a a a a a a a aaaa aa aaa aaa a a ·· kontrola, snížil trvání ztuhnutí o 50 % (obr. 3a). Po této počáteční 10-minutové periodě se krysy' vystaví dvěma krátkým elektrickým ranám do nohou a pozorují se dalších 10 minut. A opět krysy ošetřené protismyslovou látkou vykázaly 50% snížení trvání ztuhnutí ve srovnání s krysami, kterým byl podán fyziologický roztok nebo neshodný oligonukleotid (obr. 3a). Tato data představují první ukázku funkce receptorů CRF2. Receptorová autoradiografická analýza oblasti septálního mozku u těchto krys ukázala 70% snížení vazby 125I-sauvaginu na receptory CRF2 u krys ošetřených protismyslovou látkou (obr. 3b). Inhibice receptorů CRF2 tedy vede ke snížení hladin úzkosti, což ukazuje že anxiogenní účinky peptidu CRF jsou zprostředkovány nikoli pouze prostřednictvím receptorů CRFi, ale také receptorů CRF2. Mocná suprese receptorů CRF2 navíc vytvoří důležité funkční důsledky, které nemusejí být zřejmé při nižších hladinách inhibice receptoru CRF2. Z těchto výsledků plyne, že receptor CRF2 se účastní odpovědí při modulaci strachu a úzkosti.
Zvýšené plus bludiště (elevated plus maze, EPM) se rozsáhle používá k určení anxiolytických nebo anxíogenních účinků léčiv. Přístroj sestává z +-tvarovaného bludiště, které je 50 nad podlahou. Proti sobě ležící ramena jsou otevřena a exponována prostředí, zatímco druhá dvě ramena jsou uzavřena bočnicemi z černého organického skla. U hlodavců vede expozice EPM ke konfliktu přístup/vyhnutí se, který obecně vede k tomu, že zvíře tráví většinu času v uzavřených ramenech bludiště. Takovéto konflikty přístup/vyhnutí se se považují za důležité složky tvořící pozadí výskytu některých typů úzkostných poruch u lidí. Je důležité, že léčiva v současnosti předepisované • ♦ * · • · · ♦ • ·· k léčení úzkostných poruch jsou účinná při navozování anxiolytických odpovědí u savců testovaných v EPM.
V experimentu s protismyslovou látkou se krysám látka podává 8 dní a poté se po podání poslední injekce oligonukleotidu 2 hodiny testují v EPM. Krysy ošetření protismyslovým oligonukleotídem stráví významně delší čas v otevřenéých, exponovaných ramenech bludiště (obr. 4a). takové chování ukazuje na snížení stavu úzkosti. Krysy ošetřené neshodným oligonukleotídem se statisticky významně neliší od krys ošetřených fyziologickým roztokem. Vazba 125I-sauvaginu na receptory CRF2 v laterálním septu je v tomto experimentu protismyslovým oligonukleotídem snížena o 60 % (obr. 4b).
Analýza součtu vstupů do otevřených a uzavřených ramen bludiště neodhalí žádné rozdíly mezi třemi ošetřovanými skupinami (data nejsou uvedena). Navíc v testu lokomoční aktivity všechny tři ošetřované skupiny jsou opět nerozlišitelné (data nejsou uvedena). Dohromady vzato, tato data ukazují, že motorická funkce krys není ošetřováním oligonukleotidy významně narušena.
Bylo ukázáno, že protismyslová ínhibice systémů sedmkrát procházejících transmembránových receptorů navozuje fyziologické účinky, které jsou podobné účinkům získaným prostřednictvím blokády receptoru selektivními antagonisty s malými molekulami (Ho a kol., (1998)).
Výsledky z experimentů s protismyslovými látkami proti CRF2, které získali původci tedy vedou k závěru, že vedle protismyslové suprese receptorů CRF2 by blokáda tohoto receptoru ligandy s malými molekulami také vedla t · · · · · · · • · · a · ···· e • · · · · « « « · «· · · «» · · · 9·· «· * · k anxiolytickým účinkům. Antagonisté receptorů CRF2 s malou molekulou nebo peptidoví antagonisté tohoto receptorů by mohly být účinnými anxiolytickými činidly s přínosnou terapeutickou hodnotou.
Pojem „farmaceuticky přijatelné prekurzory léčiv, jak se zde používá, znamená prekurzory léčiv sloučenin užitečných podle předloženého vynálezu, které jsou, v rámci zdravého lékařského úsudku, vhodná pro použití v kontaktu s tkáněmi lidí a nižších živočichů bez nevhodné toxicity, dráždění, alergické odpovědi apod., souměřitelná pokud jde o poměr přínos/rizíko a účinná v zamýšleném použití, stejně jako jejich zwitterionové formy, kde jsou možné, sloučenin podle tohoto vynálezu. Pojem „prekurzor léčiva znamená sloučeniny, které jsou in vivo rychle transformovány k získání mateřské sloučeniny, například hydrolýzou v krvi. Funkční skupiny, které mohou být rychle transformovány metabolickým štěpením tvoří in vivo třídu skupin reaktivních s karboxylovou skupinou sloučenin podle tohoto vynálezu. Zahrnují takové skupiny jako je alkanoyl (jako je acetyl, propionyl, butyryl apod.), nesubstituovaný a substituovaný aroyl (jako je benzoyl a substituovaný benzoyl), alkoxykarbonyl (jako je ethoxykarbonyl), trialkylsilyl (jako je trimethyl- a triethylsilylú, monoestery vytvořené s dikarboxylovými kyselinami (jako je sukcinyl) apod., výčet tím však není omezen. V důsldku snadnosti, s jakou jsou metabolicky odštěpitelné skupiny sloučeniny užitečných podle tohoto vynálezu štěpeny in vivo, působí sloučeniny, které takové skupiny nesou jako prekurzory léčiv. Sloučeniny nesoucí metabolicky odštěpitelné skupiny mají tu výhodu, že mohou vykazovat zlepšenou biologickou dostupnost v důsledku zvýšené rozpustnosti a/nebo míry absorpce v porovnání • · · · • · · · ·· ·· « • ·» · · · s mateřskou sloučeninou v důsledku přítomnosti metabolicky odštěpitelné skupiny. Důkladná diskuze týkající se prekurzorů léčiv je k nalezení v následujících publikacích: Design of Prodrugs, H. Bundgaard, redaktor, Elsevier, 42, 309 až 396 (1985), A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen a H. Bundgaard, redaktoři, kapitola 5, „Design and Applications of Prodrugs 113 až 191 (1991), Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgaard, až 38 (1992), Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988), N. Nakeya a kol., Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984), Prodrugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi a V. Stella, A.C.S. Symposium Series, 14, Edward B. Roche, redaktor, Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987), které jsou zde zahrnuty formou odkazu.
Pojem „farmaceuticky přijatelné soli znamená relativně netoxické, anorganické a organické adiční soli s kyselinou a adiční soli s bází sloučenin podle předloženého vynálezu. Tyto soli lze připravit in šitu během konečné izolace a čištění sloučenin. Obzvláště lze adiční soli s kyselinou připravit oddělenou reakcí vyčištěné sloučeniny ve formě její volné báze s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou a izolací soli takto vzniklé. Příklady adičních solí s kyselinou zahrnují hydrobromidové, hydrochloridové, síranové, dvoj síranové, fosfátové, dusičnanové, acetátové, šťavelanové, valerátové, oleátové, palmitátové, stearátové, laurátové, borátové, benzoátové, laktátové, fosfátové, toluensulfonátové, citrátové, maleátové, fumarátové, jantaranové, vinanové, naftylátové, mesylátové, glukoheptonátové, laktobionátové, sulfamátové, jablečnanové, salicylátové, propionátové, methylen-bis-b~hydroxynaftoátové, gentisátové, • · isethionátové, di-p-toluoylvinanové, methansulfonátové, ethansulfonátové, benzensulfonátové, p-toluensulfonátové, cyklohexylsulfamátové a chínátlaurylsulfonátové soli apod.
(viz například S.M. Berge a kol., „Pharmaceutical Salts,
J. Pharm. Sci., 66, 1 až 19 (1977) který je zde zahrnut formou odkazu). Adiční soli s bází lze rovněž připravit oddělenou reakcí vyčištěné sloučeniny v její kyselé formě s vhodnou organickou nebo anorganickou' bází a izolací soli takto vytvořené. Adiční soli s bází zahrnují farmaceuticky přijatelné soli kovů a aminů. Vhodné soli kovů zahrnují soli sodné, draselné, vápenaté, barnaté, zinečnaté, hořečnaté a hlinité. Sodné a draselné soli jsou výhodné. Vhodné adiční soli s anorganickou bází se připraví z kovových bází, které zahrnují hydrid sodný, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid hlinitý, hydroxid lithný, hydroxid hořečnatý a hydroxid zinečnatý. Vhodné adiční soli s aminovou bází se připraví z aminů, které jsou dostatečně bázické k vytvoření stabilní soli a výhodně zahrnují ty aminy, které se často používají ve farmaceutické chemii na základě jejich nízké toxicity a přijatelnosti pro lékařské použití. Příkladné báze zahrnují amoniak, ethylendiamin, N-methylglukamin, lysin, arginin, ornithin, cholin, N,N'-dibenzylethylendiamin, chlorprokain, diethanolamin, prokain, N-benzylfenethylamin, diethylamin, piperazin, tris(hydroxymethyl)aminomethan, hydroxid tetramethylamonia, triethylamin, dibenzylamin, efenamin, dehydroabietylamin, N-ethylpíperidin, benzylamín, tetramethylamonium, tetraethylamonium, methylamin, dimethylamin, trimethylamin, ethylamin, bázické aminokyseliny, např. lysin a arginin, a dicyklohexylamin apod.
• 9 ♦ ·
Pojem „protismyslové oligonukleotidy proti CRF2, jak se zde používá, odkazuje na krátké oligonukleotidy (obvykle dlouhé od asi 15 do asi 25 nukleotidů), které jsou navrženy jako komplementární k části mRNA receptoru CRF2. hybridizace protismyslového oligonukleotidů na jeho cílové místo v mRNA prostřednictvím Watson-Crickova párování bází iniciuje kaskádu dějů, které končí degradací cílové mRNA receptoru CRF2 zaměřenou podle oligonukleotidů.
Pojem „receptor (receptory) CRF2, jak se zde používá, odkazuje na buněčné povrchové receptory, jak jsou popsány v US patentu č. 5 786 203, který byl vydán 28. července 1998, jehož obsah je zde zahrnut formou odkazu.
Pojem „definované přístupné místo, jak je zde používán, odkazuje na mnohočetná místa v mRNA kódující receptor CRF2, která jsou přístupná hybridizaci s protismyslovými oligonukleotidy. Tato místa jsou dále uvedena v tabulce 1 uvedené výše.
Pojem „modifikovaný zbytek nukleotidu, jak je zde používán, zahrnuje 2'-methoxyrubonukleotidfosfodiestery, 2'-methoxyethoxyrubonukleotidfosfodiestery,
2'-fluorrubonukleotidfosfodiestery, 5-(1-propynyl)cytosinfosforthioát, 5-(1-propynyl)uracilfosforthioát, 5-methylcytosinfosforthioát, 2'-deoxyribonukleotid-N3'-P5'-fosforamidát, polyamidové nukleové kyseliny a uzamčené nukleové kyseliny obecného vzorce
nebo
• ·· * * • · *··· » · kde Β je purinová nebo pyrimidinová báze, výčet tím však není omezen.
Ztělesnění tohoto vynálezu poskýtuje způsob léčení psychiatrických poruch včetně úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií, anorexie nervosa a deprese, výčet tím však není omezen, u pacienta, kdy se pacientovi, který takové léčení potřebuje, podává terapeuticky účinné množství farmaceutického prostředku obsahujícího protismyslové oligonukleotidy zahrnující protismyslové oligonukleotidy složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodné ztělesnění poskytuje, že modifikované zbytky nukleotidů protismyslových oligonukleotidů jsou zvoleny z následující skupiny: 2'-methoxyribonukleotidfosfodiestery, 2'-fluor-ribonukleotidfosfodiestery,
5-(1-propynyl)cytosinfosfor-thioát, 5-(1-propynyl)uracilfosforthíoát, 5-methyl-cytosinfosforthioát, 2'-deoxyribonukleotid-N3'-P5'-fosfor-amidát a polyamidové nukleové kyseliny.
Výhodnější ztělesnění poskytuje protismyslové oligonukleotidy, které jsou dlouhé od asi 15 do asi 25 nukleotidů.
Další ztělesnění poskytuje způsob léčení pacienta, který má chorobu zprostředkovanou proteinem receptoru CRF, který zahrnuje » ·* • ··
a) designování chimérního protismyslového oligonukleotidů specifického pro mRNA receptoru CRF,
b) stanovení prostředku, který napodobuje biologický účinek protismyslového oligonukleotidu a
c) podávání pacientovi prostředku, který inhibuje vazbu endogenního ligandu na jeho receptor CRF.
Další ztělesnění poskytuje způsob léčení pacienta, který má chorobu zprostředkovanou proteinem receptoru CRF, který zahrnuje
a) designování chimérního protismyslového oligonukleotidů specifického pro mRNA receptoru CRF,
b) stanovení prostředku, který napodobuje biologický účinek protismyslového oligonukleotidu a
c) podávání pacientovi prostředku, který napodobuje působení endogenního ligandu na receptoru CRF.
Další ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje způsob léčení pacienta, který má chorobu zprostředkovanou CRF, který zahrnuje podávání pacientovi prostředku, který účinně inhibuje vazbu CRF nebo jiného blízce příbuzného peptidu na receptor CRF2.
Další ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje způsob designování inhibitoru receptoru CRF2, který zahrnuje kroky stanovení trojrozměrné struktury takového
receptoru, analýzu trojrozměrné struktury pravděpodobných vazebných míst substrátů, syntézu molekuly, která inkorporuje prediktivní reaktivní místo a stanovení inhibiční aktivity sloučeniny vůči receptoru.
Další ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 15 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 20 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 25 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 30 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 35 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 40 do 70 %
2’-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 45 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 50 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Výhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde od 55 do 70 %
2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
·♦ ·· ···· 99
Výhodnější ztělesnění předloženého.vynálezu poskytuje sekvence protismyslových oligonukleotidů složených z chimérních oligonukleotidů, kde 60 do 70 %od 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových' zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
Další výhodné ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje protismyslové oligonukleotidy, které mají cílovou bázi umístěnou uvnitř definovaného přístupného místa, které mají výchozí bod na jakékoli bázi umístěné uvnitř definovaného přístupného místa a mají délku od asi 15 do asi 25 bází.
Nejvýhodnější ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje protismyslové oligonukleotidy obsahující následující sekvence:
(a) TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG;
(b) GGT GGG CGA TGT GGG AAT G;
(c) GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG 3.
(d) TGA CGC. AGC GGC ACC AGA CC.
Další ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje screeningový způsob určování sloučenin užitečných při léčení psychiatrických poruch včetně úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií, anorexie nervosa a deprese, výčet tím však není omezen, pomocí protismyslových oligonukleotidů.
Další ztělesnění předloženého vynálezu poskytuje způsob určování struktury vazebné oblasti receptorů CRF2.
• · · · · · ·····« •· * · · - · · · · · · · • ·· · · · · · ···· · «4·· « • · · · · · · · « ···· ·4 ··· ··· «· «·
Podání ligandu receptoru CRFi v kombinaci s ligandem receptoru CRF2 může umožnit výhodu pokud jde o účinnost ve srovnání se samotným ligandem receptoru CRFi nebo samotným ligandem receptoru CRF2 a může se tak stát za současného snížení dávky obou. Nižší dávka minimalizuje potenciální vedlejší účinky, čímž poskytuje rozšířený rámec bezpečnosti. Kombinace sloučeniny podle předloženého vynálezu s takovými dalšími terapeutickými činidly je výhodně synergickou kombinací. Synergie, jak ji popsali například Chou a Talalay, Adv. Enzyme Regul., 22, 27 až 55 (1984) nastává když terapeutický účinek sloučeniny a činidla při podání v kombinaci je vyšší, než součet účinků jak samotného ligandu receptoru CRFi, tak samotného ligandu receptoru CRF2 pokud by se podaly samotné. Obecně se synergický účinek nejjasnšji ukáže v hladinách, které jsou (terapeuticky) suboptimální jak pro samotný ligand receptoru CRFi, tak samotný ligand receptoru CRF2, ale které jsou vysoce účinné v kombinaci.
Antagonisré receptoru CRFi jsou aktivní u několika zvířecích modelů úzkosti (J. Lundkvist, Z. Chai,
R. Teheranian, H. Hasanvan, T. Bartfai, F. Jenck, U. Widmer a J.-L.. Moreau, Eur. J. Pharmacol., 309, 195 až 200 (1996) a S. C. Weniger, A. J. Dunn, L. J. Muglia, P. Dikkes, K. A. Miczek, A. H. Swiergiel, S. W. Berridge aj. A. Majzoub,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 96, 8283 až 8288 (1999)). Látka DPC904 (P. J. Gilligan, C. Baldauf, A. Cocuzza, D.
Chidester, R. Zaczek, L. Fitzgerald, J. Elroy, M. A. Smith, H.S.-L. Shen, J. Saye, D. Chríst, G. L. Trainor, D. W. Robertson a P. R. Hartig, Bioorganic Med. Chem., 8_, 181 až 189 (2000), což je vysoce selektivní a mocný pyrazolopyrimidinový antagonista receptoru CRFj. byl testován
v testu podmíněné úzkosti a bylo nalezeno na dávce závislé snížení trvání ztuhnutí (obr. 7a). Protože se receptory CRFi a CRF2 v centrální nervové soustavě významně nepřekrývají ve své anatomické distribuci (D. T. Chalmers, T. W. Lovenberg a E. B. De Souza, J. Neuroscience, 15, 6340 až 6350 (1995) a D. H. Rominger, C. M. Rominger, L. W. Fitzgerald, R. Grzanna, B. L. Largent a R. Zaczek, J. Pharmacol. Exp. Ther., 286, 459 až 468 (1998)) byla studie uspořádána tak, že se stanoví zda současná inhibice obou podtypů receptorů by navodila mocnější snížení ztuhnutí. Zvířatům se dávka podává intracerebroventrikulárně po dobu 7 dní buď s fyziologickým roztokem nebo s protismyslovým oligonukleotidem. 24 hodin po poslední intracerebroventriulární dávce se krysám podá orální dávka buď vehikula (methocel) nebo látky DPC904. Zvířata, která dostala buď DPC904 nebo protismyslový oligonukleotid samotné vykázaly významná snížení ztuhnutí jak bylo pozorováno předtím. U zvířat, která dostala jak látku DPC904, tak protismyslový oligonukleotid bylo v testu podmíněné úzkosti ztuhnutí sníženo významně pod hladinu dosaženou u zvířat ošetřených látkou DPC904 nebo protismyslovou látkou (obr. 7b). Ačkoliv akutní ošetření látkou DPC904 sníží trvání ztuhnutí v testu opětovné expozice šoku, současná inhibice obou receptorů nenavodila účinky, které by se lišily od účinů dosažených samotným protismyslovým oligonukleotidem proti CRF2 (obr.
7b). Vazba na receptorů CRF2 byla snížena v podobném rozsahu u obou ošetřených skupin zvířat (fyziologický roztok/methocel: 1,20 + 0,05 nCi/mg, fyziologický roztok/látka DPC904: 1,21 + 0,05 nCi/mg, protismyslový oligonukleotid/methocel: 0,51 + 0,08 nCi/mg, protismyslový oligonukleotíd/látka DPC904: 0,45 + 0,04 nCi/mg; p<0,001 pro obě skupiny s protismyslovou látkou versus skupiny neoŠetřené protismyslovou látkou).
·· ·· • · · « • · ·
Rozumí se, že tento vynález pokrývá všechny příhodné kombinace obzvláštních a výhodných seskupení nebo ztělesnění, na něž se zde odkazuje.
Tento vynález lze dále pochopit na následujících příkladech, ve kterých díly a procenta jsou hmotnostní, pokud není uvedeno jinak.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza a čištění oligonukleotidů pro experimenty in vivo
Oligonukleotidy se syntetizují na automatizovaném syntezátoru RNA/DNA ABI 394 pomocí standardního protokolu syntézy. Protismyslové a neshodné oligonukleotidy použité v experimentech popsaných na obrázcích 3 a 4 sestává z následujících sekvencí:
protismyslová: TGA CGC arg ggc acC AGA CC neshodná: TGA CGC acc gga acC ACA CC kde velká písmena značí 2'-methoxyribonukleotidfosfodiesterové zbytky a malá písmena značí 2 '-deoxyribonukleotidfosforthioátové zbytky.
2'-Methoxyribonukleotidfosforamidáty se zakoupí u firmy Chem Genes, propynyl- a 5-methylcytidinfosfor-amidáty se zakoupí u firmy Glen research a 2'-fluor-fosforaidáty se zakoupí u firmy NeXstar. Beaucageho činidlo pro syntézu fosforthioátových vazeb a fluorsceinfosforamidit pro • · • · ···· • ·
značení 5' konce oligonukleotidů se zakoupí u firmy Glen Research, tato činidla se použijí podle pokynů výrobce.
Surové směsi oligonukleotidů se vyčistí HPLC se reverzní fází na sloupci PRP-3 (Hamilton Co.) pomocí gradientu acetonitrilu a O,1M vodného roztoku triethylamonium-acetátu. Frakce zachycené ze sloupce HPLC se dvakrát lyofilizují k odstranění přebytku triethylamonium-acetátu. Vodný roztok oligonukleotidů se poté několikrát extrahuje butanolem. Kationtová výměna se uskuteční pomocí srážení v ethanolu za přítomnosti 0,3M roztoku octanu sodného. Hodnota pH roztoku oligonukleotidů se poté upraví na 7,0 přidáním 0,01M hydroxidu sodného. Oligonukleotid se dále vyčistí chromatografií s vyloučením dle velikosti pomocí sloupců NAP-25 (Pharmacia) k odstranění reziduálního fluoresceinfosforamiditového činidla. Sterilizace se provede filtrací přes celulóza-acetátový filtr s velikostí pórů 0,2μπι (Rainin) a kvantifikuje se pomocí UV spektrmetrie. Čistota oligonukleotidů se stanoví kapilární gelovou elektroforézou (PACE2100, Beckman Instruments). Zásobní roztoky oligonukleotidů v destilované vodě se uchovávají při teplotě -20 °C.
Příklad 2
Zvířata a zákroky
Samci krys kmene Sprague Dawley (Charles River) o hmotnosti v době zákroku 320 až 360 g se individuálně umístí do klecí z nerezové oceli a umožní se jim volný přístup k potravě a vodě. Po dni 4 adaptačního období se krysám stereotakticky bilaterálně implantuje, pod anestezií přípravkem Rompun (100 mg/kg) a ketaminem (9 mg/kg),
• · • · ···· *· chronická vývodová kanyla vedoucí do laterálních komor. Stereotaktickými koordinátami jsou: incisní tyčinka 3,3 mm pod interaurální linii, 0,2 posteriorně vůči bregma, + 2,7 mm laterálně vůči střední linii, 3,8 mm ventrálně k povrchu lebky a ve 24°úhlu. Injektor (cévka 33) se projikuje za vrchol zaváděcí kanyly o 0,5 mm. Zvířata se adaptují pomocí každodenního zacházení počínajícího 2 dny po zákroku.
Veškerá péče o zvířata a použití popsaných postupů schválí Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)). DuPont Pharmaceutical Research Laboratories je akreditována Association for the Assesment and
Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)
International).
Příklad 3
Podání oligonukleotidu
Infuze oligonukleotidu započnou 8. den po zákroku, kdy krysy mají hmotnost asi o 20 vyšší, než v době zákroku. Každý den se připraví čerstvé roztoky oligonukleotidu rozpuštěním lyofilizovaných pelet oligonukleotidu ve sterilních fyziologickém roztoku. Krysy se váží každý den v 9:00 dopoledne před infuzí oligonukleotidu. Pomocí mikroprocesorem řízené stříkačkové pumpy (Stoelting) se do každé komory injikuje během 2 minut 1 μΐ roztoku. Injektor se nechá v zaváděcí kanyle další minutu. Oddělené injektory pro každou jednotlivou krysu se propláchnou ethanolem a sterilní vodou a mezi každodenními injekcemi se vysuší.
Příklad 4
• · • · · ·
Stanovení úzkosti pomocí ztuhnutí
Elektrický box sestává z komory z černého organického skla se stěnami a příklopem. Dvířka boxu jsou zkonstruována z čirého organického skla, na nějž jsou přilepeno jedno-směrná zrcadla umožňující pozorování. Dno boxu obsahuje Coulbournovu elektrickou mřížku z nerezové oceli, přičemž tyčky mřížky jsou od sebe vzdáleny 1 cm.
Osmý den po chirurgické implantaci zaváděcích kanyl se krysy umístí do boxu a nechají se 2 minuty přivykat. Poté se do mřížky dna aplikují ve 20-sekundových intervalech celkem 3 rozdělené, randomizované elektrické rány do nohou, před kterými nelze uniknout (1,0 mA, trvání 1 sekunda). Krysy se pozorují se zaměřením na ztuhnutí po dobu 15 minut před tím, než se vrátí do své domovské klece.
Ošetřování oligonukleotidem započne den následující po vystavení elektrickým ranám. Zvířatům se látka podává 7 po sobě jdoucích dní. 2.4 hodin poté se krysy vloží zpátky do elektrického boxu a 10 minut se sledují se zaměřením na ztuhnutí. Poté následují 2 elektrické rány do nohou (1,0 mA, trvání 1 sekunda, interval 20 sekund) načež se krysa pozoruje dalších 10 minut se zaměřením na ztuhnutí. Ihned po tomto 10-minutovém intervalu se krysy šetrně usmrtí.
Příklad 5
Test ve zvýšeném plus bludišti (EPM)
Ošetřování oligonukleotidem započne 8. den po chirurgickém zákroku. Krysy se testují v EPM 2 hodiny po podání dávky osmého den ošetřování, na' počátku testu se krysy umístí na centrální dvorec bludiště a pomocí videokamery se zaznamená jejich průzkumové chování v následujících 10 minutách. Pozorovatel sedící mimo testovací místnost zaznamená čas, který zvíře stráví v otevřených a uzavřených ramenech, stejně jako počet vstupů do každého ramene bludiště. Krysy se šetrně usmrtí ihned po uzavření testu.
Příklad 6
Příprava tkáně
Krysy se usmrtí pomocí oxidu uhličitého. Vyjmou se mozky a zmrazí se v methylbutanu chlazeném na suchém ledu před uskladněním při teplotě -80 °C. Na kryostatu (Kopf Instruments) se nařežou 20μιη řezy laterálního septa pro receptorovou radiografii.
Příklad 7
Autoradiografie receptorů CRF2
Po ohřívání na teplotu místnosti po dobu 1 hodiny se mozkové řezy preinkubují 5 minut v 50mM Tris-HCl (pH 7,5) obsahujícím lOmM MgCl2, 2mM EGTA (ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraoctová kyselina),
0,1% ovalbumin, 0,08TIU aprotinin a 0,lmM bacitracin. Celková vazba se definuje pomocí přítomnosti ΙμΜ SC-241, což je selektivní antagonista receptorů CRF2 (D. H.
Rominger a kol., J. Pharmacol. Exp. Therap., 286, 459 až 468 1998)). Nespecifická vazba se stanoví pomocí ΙμΜ ahelikálního CRF (American Peptide). Inkubace se provádějí • · • · · e * V ·· · » 9 • ·· · · · · · .Λ ···»♦·*··· ·«·»··«»« ···· · 9 · » » ··· · * · * v preinkubačním pufru obsahujícícm radioligand a příhodného antagonistu po dubu 150 minut. Tkáňové řezy se dvakrát promývají vždy po 5 minutách v PBS obsahujícím 0,01% Triton X-100. Po konečném propláchnutí vodou se přebytečná voda odsaje a řezy se přes noc vysuší na vzduchu. Řezy a 125I standard strips (Amersham) se vystaví působení Hyperfilm μMax (Amersham) po dobu 72 hodin.
Kvantifikace CRF2 specifické vazby se provede pomocí programu NIH ImageMG 1.44. Odečty optické hustoty se převedou na nCi ligandu navázaného na mg tkáňového proteinu pomocí 125I standard strips. Na jednu krysu se kvantifikuje od 7 do 9 sousedících řezů.
Příklad 8
Kombinační ošetřování antagonistou receptoru CRFi a protismyslovým oligonukleotidem proti CRF2 až 40 kry se podrobí podmíněným elektrickým ranám do nohou podle popisu v příkladu 4 (první odstavec).
Po elektrických ranách do nohou se zvířata rovnoměrně rozdělí do dvou skupin. První skupina obdrží intracerebroventrikulární injekce fyziologického roztoku po 7 po sobě jdoucích dní, zatímco druhá skupina zvířat obdrží íntracerebroventrikulární injekce protismyslového oligonukleotidu po 7 po sobě jdoucích dní (2,5 nmol do každé laterální komory). Osmého dne se každá skupina zvířat dále rozdělí na dvě skupiny. Polovina zvířat ošetřovaných fyziologickým roztokem dostane látku DPC904 (v methocelu) v dávce 10 mg/kg p.o. (označena jako skupina S/Rl). Druhá polovina zvířat ošetřovaných fyziologickým roztokem dostane vehikulum methocel (označena jako skupina S/M). Krysy, ·· · · · « «····< • 4 » 9 · · « · · 4 * • · · · f · · * β « 4 · · · · « « « ··· · · · · »4 ·<··· ·« ··· ··· »· «· kterým se podával protismyslový oligonukleotid se ošetří podobně, tj. polovina zvířat dostane látku DPC904 (v methocelu) v dávce 10 mg/kg p.o. (označena jako skupina R2/R1). Druhá polovina zvířat ošetřovaných protismyslovým oligonukleotidem dostane vehikulum methocel (označena jako skupina R2/M). 30 minut po orálním podání se zvířata testují v elektrickém boxu podle popisu v příkladu 4 (druhý odstavec).
Předložený vynález může být ztělesněn v jiných specifických formách aniž by došlo k odchýlení od jeho ducha nebo podstatných složek.

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRF^. a receptoru CRF2, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRF^ a ligandu receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv.
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že ligand receptoru CRF-^ je agonistou receptoru CRF-^.
  3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že ligand receptoru CRF-]_ je antagonistou receptoru CRF^.
  4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že ligand receptoru CRF2 je agonistou receptoru CRF2.
  5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že ligand receptoru CRF2 je antagonistou receptoru CRF2.
  6. 6. Způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptoru CRF^ a receptoru CRF2, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptoru CRF^ a proti smyslového oligonuk-leotidu proti receptoru CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv, kde ligandem receptoru CRF2 je protismyslovým oligonukleotidem složeným z chimérních oligonukleotidů, kde od 10 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
    « · 9 9 ·
    9 9 9 9 9 9
    9 99 9
    9 9 9 9 « • » 9 · « · ·· · «► 9 9 9 « · · 9999
    9 9 9 9
    9 9 9 9
    9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9
    99 9 9 99
  7. 7. Způsob podle nároku 6,vyznačující se tím, že modifikované zbytky nukleotidů jsou zvoleny z následujícího souboru:
    2'-methoxyribonukleotidfosfodiestery,
    2'-fluorribonukleotidfosfodiestery,
    5-(1-propynyl)cytosinfosforthioát,
    5-(1-propynyl)uracilfosforthioát,
    5-methylcytosinfosforthioát,
    2'-deoxyribonukleotid-N3'-P5'-fosforamidát a polyamidové nukleové kyseliny a uzavřené nukleové kyseliny vzorce kde B je purinová nebo pyrimidinová báze.
  8. 8. Způsob podle nároku 6,vyznačující se tím, že oligonukleotid je dlouhý od asi 15 do asi 25 nukleotidů.
  9. 9. Způsob podle nároku 6,vyznačující se tím, že od 60 do 70 % 2'-deoxyribonukleotidfosforthioátových zbytků protismyslových oligonukleotidů je nahrazeno modifikovanými zbytky nukleotidů.
  10. 10. Způsob podle nároku 6,vyznačující se tím, že protismyslové oligonukleotidy obsahují následující sekvence:
    • · · ·
    (a) TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG; (b) GGT GGG CGA TGT GGG AAT G; (c) GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG a (d) TGA CGA AGC GGC ACC AGA CC.
  11. 11. Způsob podle nároku 1 nebo 6,vyznačující se tím, že poruchou je psychiatrická porucha.
  12. 12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že psychiatrická porucha je zvolena ze skupiny sestávající z úzkosti, obsedantně kompulzivní poruchy, panických úzkostných stavů, posttraumatické stresové poruchy, fóbií a deprese.
  13. 13. Způsob podle nároku 1 nebo 6,vyznačující se tím, že porucha je zvolena ze skupiny sestávající z poranění hlavy, poranění míchy, ischemického poškození nervů (např. cerebrální ischemie, jako je cerebrální hippokampální ischemie), excitotoxického poškození nervů, epilepsie, mrtvice, stresem navozených poruch imunity, fóbií, svalových spasmů, Parkinsonovy choroby, Huntingtonovy choroby, močové inkontinence, senilní demence Alzheimerova typu, vícečetné infarktové demence, amyotrofické laterální sklerózy, závislostí na chemických látkách (např. závislostí na alkoholu, kokainu, heroinu, benzodiazepinech nebo dalších léčivech) a hypoglykémie.
  14. 14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že podávání ligandu receptoru CRF1 a ligandu receptoru CRF2 je souběžné.
  15. 15. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící a » a « • · a· »· • «a · a» a* tím, že podávání ligandu receptorů CRF-]_ a ligandu receptorů CRF2 je sekvenční.
  16. 16. Způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptorů CRF1 a receptorů CRF2, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování účinného množství ligandu receptorů CRF^ a ligandu receptorů CRF2 s prostředkem obsahujícím receptor CRF^ a receptor CRF2.
  17. 17. Způsob léčení poruchy spojené s aktivitou receptorů CRF2, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování účinného množství ligandu receptorů CRF2 s prostředkem obsahujícím receptor CRF2.
  18. 18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje ligand receptorů CRF^, ligand receptorů CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo prekurzory léčiva a farmaceutický nosič.
  19. 19. Farmaceutický kit pro léčení nebo prevenci poruchy spojené s aktivitou receptorů CRF^ a CRF2, vyznačující se tím, že obsahuje řadu oddělených nádob, kde alespoň jedna z uvedených nádob obsahuje ligand receptorů CRF^ nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo prekurzor léčiva a alespoň jedna jiná z uvedených nádob obsahuje ligand receptorů CRF2 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo prekurzory léčiva, přičemž uvedené nádoby případně obsahují farmaceutický nosič.
  20. 20. Sloučenina s aktivitou ligandu receptorů CRF^ a aktivitou ligandu receptorů CRF2 pro použití při léčení psychiatrické poruchy.
    • ·
  21. 21. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že ligandem receptorů CRF1 je látka DPC904 nebo SC-241.
  22. 22. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že ligandem receptorů CRF2 je sauvagin, urokortin nebo jiné CRF2 peptidy.
  23. 23. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že ligandem receptorů CRF2 je antisauvagin.
  24. 24. Způsob potenciace léčení psychiatrické poruchy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství ligandu receptorů CRF-l a ligandu receptorů CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv.
  25. 25. Způsob potenciace léčení psychiatrické poruchy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, terapeuticky účinného množství sloučeniny, která má aktivitu ligandu receptorů CRF^ a aktivitu ligandu receptorů CRF2 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo prekurzorů léčiv.
  26. 26. Způsob podle nároku 25,vyznačující se tím, že sloučeninou je astressin.
  27. 27. Způsob podle nároku 6,vyznačující se tím, že protismyslový oligonukleotid je zaměřen na oblasti popsané v tabulce 1.
    • · · · · «
    7v
    RNáza
    Transkript RNA
    Oligonukleotidová knihovna
    Obr. la • · ♦ · · · 5'mmmGNNNmmmm3’ 5mmmANNNmmmrn3, 5'mmmCNNNmmmm3' 5'mmmTNNNmmmm3'
    Knihovna G
    Knihovna A
    Knihovna C
    Knihovna T m: randomizované 2'-methoxyribonukleotidy N: randomizované 2'-deoxyribonukleotidy
    A, G, C, T: 2'-deoxyribonukleotidy
    Obr. lb ·♦ · · (a)
    2 '-deoxyribonukleotidfosfodiester
    2 '-deoxyribonukleotíd fosforthioát
    Obr. 2a • · · · · ···· ···« ·· ··· ··· ·· *·
    2 '-methoxyribonukleotidfosfodiester
    2 '-methoxyethoxyribonukleotidfosfodiester
    5-(1-propynyl)cytosinfosforthioát
    5- (1-propynyl)uracilfosforthioát
    2'-fluorribonukleotidfosfodiestery
    5-methylcytosinf osf o.rthioát
    2'-deoxyribonukleotid-N3'-P5'-fosforamidát
    Obr.
    polyamidová nukleová kyselina
    2b (C) «MWWaMMWMMMM IIUlil/lllllltlllllllllllllllll MaNaa···!
    ribonukleotidfosfodiester modifikovaný v poloze 2'-ďeoxyribonukleotidfosforthíoát
    Obr. 2c • · •· ····
    ÍU>02~
    Stanovení pomocí ztuhnutí 'jggL expozicí elektrické raně
    Čas ztuhnutí (sekundy)
    Fyziologický roztok Neshodný oligonukleotid
    Protismyslový oligonukleotid
    Podmíněný test
    Ρί d
    c
    Φ w
    Ή +J d
    N
    CO >O
    Fyziologický roztok Neshodný oligonukleotid
    Protismyslový oligonukleotid ·· • · ♦ · • ·· • · * · • · · • ··· 9 · ·· ···· • · · • 99 ♦ ♦ · · • · * 9 ·· 99 'ty
    Inhibice receptorů CRF2 ve stanovení pomocí ztuhnutí
    Denzita receptorů (nCi/mg tkáně)
    Fyziologický roztok Neshodný Protismyslový oligonukleotid oligonukleotid
    Obr. 3b
    I
    Test ve zvýšeném plus bludišti
CZ2003159A 2000-07-19 2001-07-19 Ligand CRF2 pro kombinační terapii CZ2003159A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21939100P 2000-07-19 2000-07-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2003159A3 true CZ2003159A3 (cs) 2004-02-18

Family

ID=22819077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003159A CZ2003159A3 (cs) 2000-07-19 2001-07-19 Ligand CRF2 pro kombinační terapii

Country Status (20)

Country Link
US (2) US20020035083A1 (cs)
EP (1) EP1383460A2 (cs)
JP (1) JP2004513880A (cs)
KR (1) KR20040014926A (cs)
CN (1) CN1501976A (cs)
AU (1) AU2001280632A1 (cs)
BG (1) BG107364A (cs)
BR (1) BR0111937A (cs)
CA (1) CA2416986A1 (cs)
CZ (1) CZ2003159A3 (cs)
EE (1) EE200300025A (cs)
HU (1) HUP0301833A3 (cs)
IL (1) IL153264A0 (cs)
IS (1) IS6673A (cs)
MX (1) MXPA02012721A (cs)
NO (1) NO20030214L (cs)
PL (1) PL365955A1 (cs)
RU (1) RU2003104509A (cs)
WO (1) WO2002005749A2 (cs)
ZA (1) ZA200300088B (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007073149A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
JP2009528289A (ja) * 2006-02-27 2009-08-06 ミシャロウ、アレクサンダー 対抗適応を誘発することにより神経伝達物質系を調節する方法
CA2692039C (en) 2007-06-13 2019-07-02 Research Development Foundation Methods for treatment and prevention of tauopathies and amyloid beta amyloidosis by modulating crf receptor signaling
CN104231059B (zh) * 2013-06-19 2016-12-28 深圳翰宇药业股份有限公司 一种多肽及其制备方法和用途
MX2019004401A (es) 2016-10-20 2019-09-26 Cortene Inc Metodos de tratamiento y enfermedades resultantes de una respuesta de tension mal adaptada.

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4605642A (en) * 1984-02-23 1986-08-12 The Salk Institute For Biological Studies CRF antagonists
US5063245A (en) * 1990-03-28 1991-11-05 Nova Pharmaceutical Corporation Corticotropin-releasing factor antagonism compounds
TW530047B (en) * 1994-06-08 2003-05-01 Pfizer Corticotropin releasing factor antagonists
EP0724637B2 (en) * 1994-06-14 2002-06-05 Neurocrine Biosciences, Inc. Corticotropin-releasing factor 2 receptors
US5786203A (en) * 1994-06-14 1998-07-28 Neurocrine Biosciences, Inc. Isolated nucleic acid encoding corticotropin-releasing factor2 receptors
US5663292A (en) * 1994-12-12 1997-09-02 The Salk Institute For Biological Studies Cyclic CRF analogs
US6214797B1 (en) * 1995-06-13 2001-04-10 The Salk Institute For Biological Studies Urocortin peptides, nucleic acid encoding same methods for using same
US6051578A (en) * 1996-02-12 2000-04-18 Pfizer Inc. Pyrazolopyrimidines for treatment of CNS disorders
ZA973884B (en) * 1996-05-23 1998-11-06 Du Pont Merck Pharma Tetrahydropteridines and pyridylpiperazines for treatment of neurological disorders
US5861398A (en) * 1996-08-26 1999-01-19 Alanex Corporation Benzoperimidine-carboxylic acids and derivatives thereof
GB9717087D0 (en) * 1997-08-12 1997-10-15 Ciba Geigy Ag Improvements in or relating to organic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
BR0111937A (pt) 2005-04-12
NO20030214D0 (no) 2003-01-16
PL365955A1 (en) 2005-01-24
IS6673A (is) 2003-01-08
BG107364A (bg) 2003-07-31
JP2004513880A (ja) 2004-05-13
HUP0301833A3 (en) 2005-12-28
IL153264A0 (en) 2003-07-06
WO2002005749A3 (en) 2003-11-06
AU2001280632A1 (en) 2002-01-30
MXPA02012721A (es) 2003-04-25
EE200300025A (et) 2005-04-15
RU2003104509A (ru) 2004-08-27
EP1383460A2 (en) 2004-01-28
CA2416986A1 (en) 2002-01-24
KR20040014926A (ko) 2004-02-18
US20020035083A1 (en) 2002-03-21
HUP0301833A2 (hu) 2003-09-29
ZA200300088B (en) 2005-05-09
NO20030214L (no) 2003-01-16
CN1501976A (zh) 2004-06-02
WO2002005749A2 (en) 2002-01-24
US20050059627A1 (en) 2005-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7662948B2 (en) Antisense oligonucleotides against VR1
JP2015518713A (ja) Ｕｔｒｎ発現を調節するための組成物及び方法
JP2015523855A (ja) Ａｐｏａ１及びａｂｃａ１発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518712A (ja) Ｍｅｃｐ２発現を調節するための組成物及び方法
JP2015523853A (ja) Ａｔｐ２ａ２発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518711A (ja) Ｂｄｎｆ発現を調節するための組成物及び方法
US20020115667A1 (en) Methods for therapeutic use of glucosylceramide synthesis inhibitors and composition thereof
JP2015518710A (ja) ヘモグロビン遺伝子ファミリー発現を調節するための組成物及び方法
JP2015523854A (ja) Ｓｍｎ遺伝子ファミリー発現を調節するための組成物及び方法
JP2003144184A (ja) 免疫調節オリゴヌクレオチド
HUE030913T2 (en) A TGF-beta antagonist is a combination therapy associated with a chemotherapeutic agent
US20200054746A1 (en) Methods for increasing neuronal survival
Chang et al. Inhibition of nitric oxide production by the carbazole compound LCY-2-CHO via blockade of activator protein-1 and CCAAT/enhancer-binding protein activation in microglia
US8178507B2 (en) Method for the modulation of function of transcription factors
CZ2003159A3 (cs) Ligand CRF2 pro kombinační terapii
US20180055869A1 (en) Compositions and methods for modulating rna
US20230383292A1 (en) Targeting xist and rna methylation for x reactivation therapy
WO2021177418A1 (ja) Ｃａｌｍ２のアンチセンスオリゴヌクレオチド
CA2457131A1 (en) Oligonucleotides and other modulators of the nk-1 receptor pathway and therapeutic uses thereof
US20210040481A1 (en) 2&#39;f-ana-let7 mediated utrophin upregulation for dmd therapy
WO2016164977A1 (en) A method of treatment
WO2000042178A2 (en) Antagonist blockade of crf2 receptors for the treatment of psy chiatric disorders and the use of chimeric antisense oligonucleotides in in vivo cns studies of gene function
Wright et al. κ-Opioid receptor antisense oligonucleotide injected into rat hippocampus causes hypertension
WO2021107143A1 (ja) アンチセンス核酸の毒性を軽減する方法
US20110034381A1 (en) Methods for Therapeutic Treatment of Benign Prostatic Hypertrophy (BPH)