CZ2003132A3

CZ2003132A3 - Farmaceutický prostředek pro léčení příznaků běžného nachlazení

Info

Publication number: CZ2003132A3
Application number: CZ2003132A
Authority: CZ
Inventors: Susan B. Dillon; Ruth Talsinger
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 2000-07-18
Filing date: 2001-07-16
Publication date: 2003-09-17
Also published as: KR20030019587A; ZA200300474B; WO2002005814A1; AU2001273497A1; BR0112603A; HUP0300754A3; PL365886A1; NZ523659A; MXPA03000500A; JP2004509852A; NO20030201D0; EP1307190A1; IL153921A0; HUP0300754A2; NO20030201L; CN1449285A; EP1307190A4; CA2418162A1; AR033830A1

Description

Farmaceutický prostředek pro léčení příznaků běžného nachlazení

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití antagonisty receptoru IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení v důsledku lidských virových infekcí a vzplanutí příznaků s tím spojených.

Vynález se zvláště týká použití modulátorů IL-8, GROa,

GROp, GROy, NAP-2 a ENA-78 při léčbě virových infekcí.

Dosavadní stav techniky

Lidský rinovirus (HRV), nejčastější příčina běžného nachlazení, je stále více spojován s vážnějšími následky včetně obnovení astmatu, chronické bronchitidy, chronického obstruktivního onemocnění plic (COPD), zánětu středního ucha a zánětu paranazálních dutin (sinusitidy). Nedávno publikované studie u dospělých a dospívajících, za použití PCR k detekci virů ukázaly, že 50 až 80 % obnovení astmatu je spojováno s virovou infekcí horních cest dýchacích, a že rinovirus je nejběžnějším virem nachlazení.

HRV infikuje nazální epiteliální buňky. Nedávné zjištění naznačuje, že tento virus může také infikovat bronchiální epitel. Počáteční příznaky nachlazení jsou zřejmé během 24 hodin po infekci, vrchol onemocnění nastává 2. až 5. den a onemocnění končí během 7 až 14 dnů. Avšak tyto účinky mohou trvat i déle u některých jednotlivců.

Zatímco virus může vymizet, příznaky často trvají. Věří se, že příznaky vznikají více z odezvy hostitele na infekci než z důvodu akutního cytotoxického účinku, neboť pouze malá část epiteliáiních buněk horních cest dýchacích je prokazatelně infikována a nastává minimální poškození • · · · ··· · · · · · • · · · · 9 · · · · · • ·····*· 99 · 9 9 9

9 9 ·· 99 99 epiteliálních buněk. U běžných jedinců infikovaných rinoviry se nachází zvýšené intranazální hladiny kininů, IL-1, IL-8, IL-6, IL-11 a neutrofilů. V několika nedávných studiích byla ukázána korelace mezi koncentrací IL-8 v nazálních sekretech s lokální hladinou myeloperoxidázy a · 00 0000 ·| ·»·» • 00 · 0 «00 0 ,-,0 0 0 · * 0 * — ^/0—»000 0 0 0 000 0 0 • 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 0 0 * ·' 0 0 * * Λ · rovněž i s příznakem intenzity onemocnění. Také intranazáiní koncentrace IL-1 a IL-6 korelovaly s příznakem intenzity onemocnění. Experimentální rinovirová infekce má také za následek prodloužení okamžité a pozdní fáze alergických reakcí a zvýšení infiltrace T lymfocytů a eozinofilů do dolních dýchacích cest. U atopiků a astmatiků tyto účinky přetrvávají až 2 měsíce po infekci. Bylo prokázáno, že buněčné linie z lidského bronchiálního epitelu produkují IL-1, IL-6, IL-8, IL-11 a GM-CSF v odezvě na rinovirovou infekci. Časná tvorba cytokinů epiteliálními buňkami infikovanými rinovirem může proto být zodpovědná za zahájení migrace neutrofilů, T-buněk a aktivovaných eozinofilů do horních a dolních dýchacích cest.

IL-1, IL-6 a IL-8 jsou také vytvářeny v odezvě na infekci dalšími respiračními viry (virus chřipky, respirační syncyciální virus), které mohou způsobit běžné nachlazení a s tím spojené následky.

Interleukin-8 (IL-8) byl nazývám mnoha názvy, jako například neutrofilní atraktant/aktivační protein-1 (NAP1), neutrofilní chemotaktický faktor odvozený z monocytu (MDNCF), neutrofilní aktivační faktor (NAF) a chemotaktický faktor T - buněk lymfocytů. Interleukin-8 je chemoatraktant pro neutrofily, bazofilní granulocyty a podskupinu T buněk. Je vytvářen většinou jaderných buněk včetně makrofágů, fibroblastů, endoteliálních a epiteliálních buněk vystavených TNF, IL-la, IL-Ιβ nebo LPS a neutrofily samotnými po vystavení LPS nebo chemotaktickým faktorům, jako je FMLP. M. Baggiolini a kol., J. Clin. Invest., 84, 1045 (1989); J. Schroder a kol., J. Immunol. 139, 3474 (1987) a J. Immunol., 144, 2223 (1990); Strieter a kol., Science 243, 1467 (1989) a J. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatella a kol., J. Immunol., 148, 3216 (1992).

• · • · · • · · · * · k · * · · φφφ » q · · · · · · · ♦ ·

O · ····*· ♦' · · · » · • A ···» · ··· ···«> $ · · · · · · ··

GROa, GROP, GROy a NAP-2 také patří do skupiny chemokinů. Podobně jako IL-8 byly také tyto chemokiny označovány různými názvy. Například GRO α, β, γ byly označovány jako MGSA α, β a γ (Melanoma Growth Stimulating Activity), viz Ríchmond a kol., J. Cell Physiology, 129,

375 (1986) a Chang a kol., J. Immunol., 148, 451 (1992). Všechny chemokiny z a -skupiny, které mají vzor ELR přecházející na vzor CXC, se váží na B receptor IL-8 (CXCR2).

IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2 a ENA-78 stimulují mnoho funkcí in vitro. Bylo prokázáno, že všechny tyto látky mají chemoatraktační vlastnosti vůči neutrofilům, zatímco IL-8 a GROa mají rovněž chemotaktickou aktivitu vůči Tlymfocytům a bazofilním granulocytům. Dále IL-8 může indukovat uvolňování histaminu z bazofilních granulocytů jak u normálních, tak i atopických jedinců. GRO-α a IL-8 mohou také navíc indukovat uvolnění lysozomálního enzymu a respirační puknutí u neutrofilů. Bylo také prokázáno, že IL-8 zvyšuje povrchovou expresi Mac-1(CDllb/CD18) na netrofilech bez nové syntézy proteinu.

In vitro IL-8, GROa, GROP, GROy a NAP-2 indukují změny tvaru neutrofilů, chemotaxi, uvolňování granulí a respirační puknutí, vazbou a aktivováním receptorů 7transmembrány, G-protein - příbuzná skupina, zejména vazbou na receptory IL-8, nejvíce na β-receptor IL-8 (CXCR2). Thomas a kol., J. Biol.Chem. 266, 14839 (1991); Holmes a kol., Science, 253, 1278 (1991).

Byly charakterizovány dva vysoce podobné lidské receptory IL-8 (homologie 77%): IL-8RA, který váže pouze IL-8 s vysokou afinitou a IL-8RB, který má vysokou afinitu k IL-8 a rovněž i k GRO-α, GROp, GROy a NAP-2. Viz Holmes a kol., výše; Murphy a kol., Science 253, 1280 (1991); Lee a kol., J. Biol. Chem. 267, 25402 (1992); a Gayle a kol.,

J.Biol. Chem. 268, 7283 (1993).

Zasahování do biochemických procesů epiteliálních buněk v důsledku virové infekce představuje nový vhodný terapeutický cíl pro antagonisty receptoru IL-8. Tento vynález je zaměřen na nový způsob řešení tohoto terapeutického cíle.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití antagonisty receptoru IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení způsobeného lidským rinovirem, jiným enterovirem, herpesvirem, koronavirem, virem chřipky, virem parainfluenzy, respiračním syncyciálním virem nebo adenovirovou infekcí u člověka.

Předmětem tohoto vynálezu také je použití popsané výše, antagonisty receptoru IL-8 s druhou terapeuticky účinnou látkou.

Dále se uvádí podrobnější popis tohoto vynálezu.

Tento vynález umožňuje způsob léčby nemocí zprostředkovaných chemokinem, přičemž tento chemokin se váže na receptor IL-8 A nebo B. Způsob zahrnuje podávání účinného množství antagonisty receptoru IL-8 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli. Tento vynález umožňuje použití antagonisty receptoru IL-8 pro léčbu, včetně profylaxe a zabránění/zmírnění intenzity onemocnění způsobeného virovou infekcí, jako je například, lidský rinovirus, enteroviry, koronavirus, virus chřipky, virus parainfluenzy, respirační syncyciální virus a adenovirus, v případě potřeby u lidí, přičemž tento způsob zahrnuje • · • · • · podávání účinného množství antagonisty receptoru IL-8 tomuto člověku.

IL-8 a další cytokiny ovlivňují mnoho buněk a tkání a tyto cytokiny a rovněž i další cytokiny odvozené od leukocytů jsou důležité a rozhodující mediátory zánětů, zodpovědné za příznaky mnoha virových infekcí. Inhibice těchto, cytokinů je prospěšná pro potlačování, snížení a zmírnění mnoha z těchto příznaků respirační virové infekce. Aplikace tohoto vynálezu vede k léčení příznaků způsobených virovou infekcí u lidí, které jsou způsobeny • · ·Φ «« • A • · · · • · Φ « · ·

C *. · * ♦ » ♦ · » v

-J* ····>· A « a a « * * · · * · · A * · ···· 4 94 ·« ·· ·· lidským rinovirem, jiným enterovirem, koronavirem, herpesviry, virem chřipky, virem parainfluenzy, respiračním syncyciálním virem nebo adenovirem. Dále tento vynález se týká respiračních virových infekcí, které obnovují „skryté chronické stavy, jako je astma, chronická bronchitida, chronické obstruktivní onemocnění plic, . zánět středního ucha a zánět paranazálních dutin. Mělo by také být poznamenáno, že respirační virová infekce, která je popisována v tomto vynálezu, může být spojena s druhotnou bakteriální infekcí, jako je zánět středního ucha, zánět paranazálních dutin nebo zápal plic.

Tento vynález bude demonstrovat, že antagonisté receptorů IL-8 jsou užiteční při léčbě příznaků spojovaných s respirační virovou infekcí a zabránění/zmírnění intenzity opětného vzplanutí skrytých stavů, jako je astma, zánět středního ucha, chronické obstruktivní onemocnění plic (COPD), zánět paranazálních dutin, chronická bronchitida atd.

Vhodné inhibitory IL-8 jsou dobře známy v oboru a zkouška pro stanovení inhibice IL-8 je také snadno dostupná. Například viz U.S. patentové spisy 5886044, 5780483,' 6005008, 5929250, 6015908; 5919776,

U.S. patentové přihlášky

09/111663, 09/125279, 09/240354, 09/202570, 09/202586,

09/202569, 09/202568, 09/230120, 09/230290, 09/230952,

09/230977, 09/230981, 09/230980, 09/242187, 09/341378,

09/341382, 09/341262, 09/463673, 09/508039 nebo 09/486986,

WO99/65310, W00012489, W00009511, WO 9942464 ,WO 9942463, WO 9942461, WO00/05216, WO99/36069, W099/36070 nebo WO 00/06557, PCT/US99/23776 nebo PCT/US99/29940, U.S.

prozatímní přihlášky 60/134728, 60/136666, 60/136665, 60/136717, 60/136667, 60/139675, 60/139680, 60/139678, 60/139673, 60/140024, 60/139677, 60/139674, 60/140025, ·* ····

-··< fi· * · · « — (-*-····♦» · · 4 · « * • p « 4 · · · · > é ·«·· « ·» 44 4· 49

60/145756, 60/164350, 60/186239, 60/186183, 60/186182, 60/188410, 60/188243, 60/189176, 60/189175, 60/189848, 60/192132 nebo 60/196022.

Antagonista receptorů IL-8 může také být podáván s druhou terapeuticky účinnou látkou. Druhá terapeuticky účinná látka může být látka účinná proti virům, jako je ribavirin, amantidin, rimantidin, relenza, tamiflu, BTA 188, RWJ-270210 (BCX-1812), sICAM-1, tICAM453, Pleconaril nebo AG7088; také může být antihistaminikum, jako je Benadryl, chlorfeneramin a jeho soli, bromfeneramin a jeho soli atd.; látka snižující překrvení, jako je fenylpropanolamin a jeho soli, pseudoefedrein a jeho soli; steroidy, jako je dexamethason, prednison nebo prednisolon atd.; různá antibiotika, jako jsou chinolony, cefalosporiny, inhibitory β-laktamasy atd.; protizánětlivé látky, jako jsou inhibitory CSAIDS, COX-1 nebo COX-2, ASA nebo indomethacin atd.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek I - Inhibice mobilizace vápníku indukované RV nebo Gro-beta v lidských neutrofilech prostřednictvím CXCR2 antagonisty X.

Obrázek II - Inhibice chemotaxe indukované RV u lidských neutrofilů prostřednictvím CXCR2 antagonisty X.

Obrázek III - Mobilizace vápníku indukovaná RV, groa, groP, groP~T v neutrofilech.

Způsob léčby

Tento antagonista receptorů IL-8 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl mohou být použity při výrobě léčiva pro profylaktickou nebo terapeuticku léčbu příznaků • to« ·

9« ♦ ··♦ to» to • toto ·· ··· » »·· toto ♦ · · 9 _ 1··! ··· ·*(.· · ·' « · · 9 to ···· • c« to « 99 ·- * ·» * * nebo následků virové infekce u lidí nebo savců, které jsou obnoveny nebo způsobeny nadměrnou nebo neregulovanou tvorbou cytokinu IL-8 savčími buňkami, jako jsou například monocyty a/nebo makrofágy, nebo jiné chemokiny, které se váží na receptor IL-8 A nebo B, které jsou také označovány jako receptor typu I nebo typu II.

Tento vynález poskytuje způsob léčby virové infekce, kde tento chemokin se váže na receptor IL-8 A nebo B. Tento způsob zahrnuje podávání účinného množství tohoto inhibitoru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Chemokiny jsou zejména IL-8, GROa, GROp, GROy, NAP-2 nebo ENA-78.

Pro léčebné použití bude tento antagonista receptoru IL-8 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl běžně připravován do farmaceutického prostředku v souladu se standardní farmaceutickou praxí. Tento vynález se proto také týká farmaceutického prostředku obsahujícího účinné netoxické množství tohoto antagonisty receptoru IL-8 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

Tyto antagonisty receptoru IL-8, jejich farmaceuticky přijatelné soli a z nich vytvořené farmaceutické prostředky mohou být vhodně podávány jakýmikoli způsoby běžně používanými pro aplikaci léčiv, jako je orální, místní, bukální, parenterální nebo inhalační podávání. Tyto antagonisty mohou být podávány v běžných dávkovačích formách připravených smícháním této sloučeniny se standardními nosiči podle běžných pracovních postupů. Tyto sloučeniny mohou také být podávány v běžných dávkách společně se známou druhou terapeuticky účinnou sloučeninou. Tyto pracovní postupy mohou zahrnovat míchání, granulování, lisování nebo rozpouštění vhodných složek na požadovaný přípravek. Je zřejmé, že forma a charakter farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla závisí na množství aktivní složky, se kterou má být spojována, na způsobu podávání a

0· 0000

0 • 00 <0 000 0

000 00 0 00 0

-Qř>j00»»0 · 000 0 · r t 0 · > · φ··#

0000 « 00 90 0» 0· na dalších dobře známých proměnných. Nosič(e) musí být „přijatelný ve smyslu kompatibility s jinými složkami přípravku a nesmí škodit jeho příjemci.

Použitý farmaceutický nosič může být například buď tuhá látka nebo kapalina. Mezi tuhé nosiče například patří laktóza, kaolín, sacharóza, mastek, želatina, agar, pektin, arabská guma, stearat hořečnatý, kyselina stearové a podobně. Mezi kapalné nosiče například patří sirup, podzemnicový olej, olivový olej, voda a podobně. Nosič nebo ředidlo může obsahovat stabilizační látku dobře známou v oboru, jako je glycerylmonostearát nebo glyceryldistearat samotný nebo s voskem.

Může být použita široká škála farmaceutických forem. Jestliže je použit tuhý nosič, potom přípravek může být tabletován, vkládán do tvrdých želatinových kapslí ve formě prášku nebo kuliček nebo může být ve formě pilulek a pastilek. Množství tuhého nosiče se bude výrazně lišit, ale výhodně bude od asi 25 mg do asi 1 g. Jestliže je použit kapalný nosič, potom přípravek bude ve formě sirupu, emulze, měkké želatinové kapsle, sterilní injektovatelné kapaliny v ampuli nebo nevodné kapalné suspenze.

Tyto antagonisty mohou být podávány místně, tj. nesystémovým podáváním. To zahrnuje podávání této sloučeniny zevně na pokožku, do dutiny ústní nebo vkapáváním takové sloučeniny do ucha, oka a nosu tak, aby tato sloučenina významně nevstupovala do krevního řečiště. Naopak systémové podávání označuje orální, intravenózní, intraperitoneální a intramuskulární podávání.

Mezi přípravky vhodné pro místní podávání patří tekuté a polotekuté přípravky vhodné pro pronikání přes kůži k místu zánětu jako jsou mazání, lotion, krémy, masti nebo pasty a kapky vhodné pro podávání do ucha nebo nosu, roztoky nebo suspenze vhodné pro inhalaci. U místního •0 « ·» 0000 44 ·«*· f 0 · « « » · · « _ 0 0 « 0 » · • * 0 0*0 · 0 · 0

0 0 0 · · * ·· · · podávání může přípravek obsahovat od 0,001 % do 10 .% hmotn./hmotn. aktivní složky, například od 1 do 2 % z hmotnosti přípravku. Ačkoliv může obsahovat až 10 % hmotn./hmotn. aktivní složky, výhodně bude obsahovat méně než 5 % hmotn./hmotn., výhodněji od 0,1 % do 1 % hmotn./hmotn..

Mezi lotion podle tohoto vynálezu patří ty, které jsou vhodné pro aplikaci na kůži nebo do oka. Oční lotion mohou obsahovat sterilní vodný roztok, případně obsahující baktericidní látku a mohou být připraveny podobnými způsoby, které jsou používány při přípravě kapek. Lotion a mazání pro aplikaci na kůži mohou také obsahovat činidlo urychlující vysoušení a ochlazení kůže, jako je alkohol nebo aceton, a/nebo zvlhčovač, jako je glycerol nebo olej, jako je ricinový olej nebo podzemnicový olej.

Krémy, masti nebo pasty podle tohoto vynálezu jsou polotuhé přípravky aktivní složky pro zevní aplikaci. Mohou být připraveny mícháním aktivní složky v jemně rozptýlené nebo práškové formě, samotné nebo v roztoku nebo suspenzi ve vodné nebo nevodné kapalině za pomoci vhodného strojního zařízení s mastným nebo nemastným základem. Tento základ může obsahovat uhlovodíky, jako je tvrdý, měkký nebo tekutý parafin, glycerol, včelí vosk, kovové mýdlo; rostlinné lepidlo; olej přírodního původu, jako je mandlový olej, kukuřičný olej, podzemnicový olej, ricinový olej nebo olivový olej; tuk z ovčí vlny nebo jeho deriváty nebo mastnou kyselinu, jako je kyselina stearová nebo kyselina olejová společně s alkoholem, jako je propylenglykol nebo makrogel. Přípravek může obsahovat jakékoliv vhodné povrchově aktivní činidlo jako je anionaktivní, kationaktivní nebo neionogenní tenzid, jako je ester sorbitanu nebo jeho polyoxyethylenový derivát. Také mohou být použita suspenzační činidla, jako jsou přírodní gumy, • » · · · ♦ • · · ·

- ιο’4.:.

• * ♦ · · · » · · » « * · 4

4 9 4 4 «φ « • φ *« · * · * deriváty celulózy nebo anorganické látky, jako jsou oxidy křemíku, a další složky, jako je lanolin.

Kapky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat sterilní vodné nebo olejovité roztoky nebo suspenze a mohou být připraveny rozpuštěním aktivní složky ve vhodném vodném roztoku baktericidního a/nebo fungicidního činidla a/nebo jakékoliv jiné vhodné konzervační látky a výhodně s povrchově aktivní látkou. Výsledný roztok může být potom čištěn filtrací, převeden do vhodného obalu, který je potom uzavřen a sterilizován v autoklávu nebo zahříván při teplotě 98 - 100 °C po dobu 30 minut. Alternativně může být tento roztok sterilizován filtrací a převeden do obalu aseptickým pracovním postupem. Mezi vhodné baktericidní a fungicidní činidla vhodná pro použití v kapkách například patří fenylmerkuriumnitrát nebo acetat (0,002 %), benzalkoniumchlorid (0,01 %) a chlorhexidinacetat (0,01 %). Mezi vhodná rozpouštědla pro přípravu olejovitého roztoku patří glycerol, zředěný alkohol a propylenglykol.

Tito antagonisté mohou být podávány parenterálně, tj. intravenózně, intramuskulárně, podkožně, intranazálně., intrarektálně, intravaginálně nebo intraperitoneálně.

Obecně jsou preferovány podkožní a intramuskulární formy parenterálního podávání. Vhodné dávkovači formy pro takové podávání mohou být připraveny běžnými pracovními postupy. Tito antagonisté mohou být také podávány inhalačně, tj. intranazálním a orálním inhalačním podáváním. Vhodné dávkovači formy pro takové podávání, jako je aerosolový přípravek nebo dávkovači inhalátor, mohou být připraveny běžnými pracovními postupy.

U všech způsobů použití popsaných v tomto vynálezu pro tyto antagonisty bude výhodně denní orální dávka od asi 0,01 do 80 mg/kg celkové tělesné hmotnosti. Denní parenterální dávka bude výhodně od asi 0,001 do asi 80 mg/kg celkové tělesné hmotnosti. Denní místní dávka bude

9· 3 «· ·«·· ·* ···· ··« t · ·9· » · 9 4 9 ♦ · ♦ Λ

- 41··*· · · · · · · · · _β -U J. _{r β} · » * · · » · »··· « «9 ·· »· ·♦ výhodně od 0,1 mg do 150 mg, podávaná 1 až 4 krát, výhodně 2 až 3 krát denně. Denní inhalační dávka bude výhodně od asi 0,01 mg/kg do asi 1 mg/kg. Odborníkům je zřejmé, že optimální množství a časování jednotlivých dávek tohoto antagonisty nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli bude záviset na povaze a rozsahu onemocnění, na formě, způsobu a místě podávání, a zejména na konkrétním léčeném pacientu. Optimální dávkování může být stanoveno běžnými postupy. Odborníkům je také zřejmé, že optimální průběh léčby, tj. počet dávek této sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli podávaných denně po definovaný počet dnů, může být zjištěn odborníkem za použití běžných testů pro stanovení doby trvání léčby.

Dále bude tento vynález charakterizován následujícími biologickými příklady, které jsou pouze ilustrativní a nemají být chápány jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Biologické příklady

Inhibiční účinky sloučenin podle tohoto vynálezu vůči chemokinům IL-8 a GRO-α byly stanoveny následující in vitro zkouškou:

Zkoušky vazby na receptor:

Lidský rekombinantní [¹²⁵I ] IL-8 byl získán od Amersham Corp., Arlington Heights, IL měl specifickou aktivitou 2000 Ci/mmol. GRO-α byl získán od NEN-New England Nuclear. Všechny další chemikálie byly analytické kvality. Vysoké koncentrace receptorů rekombinantního lidského IL-8, typu a a β byly individuálně podrobeny expresi ve vaječníkových buňkách čínského křečka, jak bylo dříve popsáno (Holmes a • · · · · · • flfl «fl · fl · a

- 1<2 ·♦*· · · · · ♦ t · * • » · · · · · « > · flflflfl fl flfl 0« fl* · ♦ kol., Science, 1991, 253, 1278). Vaječníkové membrány z čínského křečka byly homogenizovány podle dříve popsaného protokolu (Haour a kol., J. Biol. Chem., 249, pp. 2195-2205 (1974), s tou výjimkou, že homogenizační pufr byl změněn na 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgSO₄, 0,5 mM EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina), 1 mM PMSF (atoluensulfonylfluorid), 0,5 mg/1 Leupeptinu, pH 7,5) . Koncentrace membránových proteinů byla stanovena za použiti testovací mikrosoupravy od Pierce Co. s hovězím sérovým albuminem jako standardem. Všechny zkoušky byly prováděny v 96-jamkové mikrodestičce. Každá reakční směs obsahovala ¹²⁵I IL-8 (0,25nM) nebo ¹²⁵I GRO-α a 0,5 pg/ml IL-8Ra nebo 1,0 pg/ml IL-8Rp membrán v 20mM Bis-Trispropanu a 0,4mM Tris HCl pufry, pH 8,0, obsahující 1,2 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl a 0,03 % CHAPS. Dále bylo přidáno léčivo nebo testovaná sloučenina, která byla rozpuštěna v DMSO tak, aby konečná koncentrace byla mezi 0,01 nM a 100 μΜ. Zkouška byla zahájena přidáním ¹²⁵I-IL-8. Po 1 hodině při pokojové teplotě byla deska sklízena za použití sklízecího zařízení Tomtec 96-well na filtrační plachetku z skleněných vláken impregnovanou 1% polyethyleniminem/0,5% BSA a byla 3 krát promyta 25 mM- NaCl, 10 mM TrisHCl, 1 mM MgSO4, 0,5 mM EDTA, 0,03 % CHAPS, pH 7,4. Filtr byl potom vysušen a byla zjišťována četnost pulsů na Betaplate detektoru s kapalným scintilátorem. Receptor rekombinantního IL-8Ra nebo typu I je také označován v tomto textu jako nepermisivní receptor a receptor rekombinantního IL-8RP nebo typu II je také označován v tomto textu jako permisivní receptor.

Zkouška na chemotaxi

Inhibiční vlastnosti těchto sloučenin- in vitro byly stanoveny zkouškou na chemotaxi u neutrofilů, jak je popsáno v Current Protocols in Immunology, Vol. I, Suppl 1, ·· ····

- 1.3 «« · • « • ·

Unit 6.12.3., na který se tímto odkazuje. Neutrofily byly izolovány z lidské krve, jak je popsáno v Current Protocols in Immunology, Vol. I, Suppl 1, Unit 7.23.1., na který se tímto odkazuje. Chemoatraktanty IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2 a ENA-78 byly vloženy do dolní komůrky 48multijamkové destičky (Neuro Probe, Cabin John, MD) v koncentračním rozsahu mezi 0,1 a 100 nM. Dvě komůrky jsou odděleny polykarbonátovým filtrem o šířce 5 pm. Když bylyu testovány sloučeniny podle-tohoto vynálezu, byly smíchány s buňkami (0,001 - 1000 nM) téměř před přidáním buněk do horní komůrky. Buňky byly inkubovány po dobu 45 až 90 minut při teplotě asi 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s 5% CO₂.

Na konci inkubační doby byly polykarbonátová membrána odstraněna a vrchní strana byla promyta, potom byla membrána obarvena pomocí barvícího protokolu Diff Quick (Baxter Products, Mc Gaw Park, IL, USA). Buňky, které se pohybovaly pomocí chemotaxe k chemokinu byly vizuálně počítány na mikroskopu. Obecně bylypočítány 4 pole z každého vzorku, tyto hodnoty byly průměrovány, a tím lze stanovit průměrný počet buněk, které se pohybovaly. Každý vzorek byl testován v triplikátech a každá sloučenina byla alespoň 4 krát testována. K určitým buňkám (pozitivní kontrolní buňky) nebyla přidána žádná sloučenina, tyto buňky reprezentují maximální chemotaktickou odezvu buněk. V případě, že byla požadována negativní kontrola (nestimulovaná), do dolní komůrky nebyl nepřidán žádný chemokin. Rozdíl mezi pozitivní a negativní kontrolou představuje chemotaktickou aktivitu buněk.

Zkouška na uvolňování elastázy

Sloučeniny podle tohoto vynálezu byly testovány na jejich schopnost zabránit uvolňování elastázy z lidských neutrofilů. Neutrofily byly izolovány z lidské krve jak je « φ · « φ « · · ·

- «, «··. ··· · « » * φ — — · ».·· φφ·φ

Φ · Φ φ Φ ΦΦ · Λ φ * · * popsáno v Protocols in Immunology, Vol. I, Suppl. 1, Unit 7.23.1. Buňky PMNs 0,88 χ 10⁶ suspendované v Ringerově roztoku (NaCl 118 mM, KC1 4,56 mM , NaHCO₃ 25 mM, KH₂PO₄1,03 mM, glukóza 11,1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4) byly pipetovány do každé jamky na 96-jamkové mikrodestičce v objemu 50 μΐ. K této destičce byla přidána testovaná sloučenina (0,001 - lOOOnM) v objemu 50 μΐ, cytochalasin B v objemu 50 μΐ (20 pg/ml) a Ringerův pufr v objemu 50 μΐ. Tyto buňky byly inkubovány po dobu 5 minut při teplotě 37 °C v inkubátoru (5% CO₂ a rel. vlhkosti 95 %), potom k nim byl přidán IL-8, GROa, GROP, GROy, NAP-2, aby byla dosažena konečná koncentrace v rozsahu od 0,01 do 1000 nM. Reakce probíhala po dobu 45 minut, potom byla 96-jamková destička podrobena odstředění (800 xg, 5 min.) a 100 μΐ supernatantu bylo odtaženo. Tento supernatant byl přidán na druhou 96jamkovou destičku, potom byl přidán umělý substrát elastázy (MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC, Nova Biochem, La Jolla, CA) rozpuštěný ve fosfátovém pufrovaném fyziologickém roztoku, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 6 pg/ml. Okamžitě byla deska vložena do fluorescentního čtecího zařízení pro mikrodestičky (Cytofluor 2350, Milipore, Bedford, MA) a údaje byly shromažďovány v 3 minutových intervalech podle způsobu popsaném v (Nakajima a kol., J. Biol. Chem, 254, 4027 (1979). Množství uvolněné elastázy z PMN bylo vypočteno měřením rychlosti degradace MeOSuc-Ala-Ala-ProVal-AMC.

Rinovirové metody

Buněčné linie a serotyp 39 rinoviru byly zakoupeny od Americké sbírky typů kultur (American Type Culture Collection -ATCC). Buňky BEAS-2B byly kultivovány podle pokynů poskytnutých ATCC za použití BEGM (bronchiálního epiteliální růstového média) zakoupeného od firmy Clonetics ···· • · Φ Φ 9 Φ Φ · «

ΦΦΦ ΦΦ · φφ φ («·* « · Φ Φ · φ φ φ

Α Ο “ * φ * ® · φ - « # · φ φ · · · φφ ·« φ « ·«

Corp. Buněčné kultury HELA, používané pro detekci a titrací virů, byly uchovávány v Eaglově minimálním esenciálním mediu obsahujícím 10 % fetálního telecího séra, 2 mM 1glutaminu a 10 mM pufr HEPES (MEM).

V těchto studiích byla použita modifikace způsobu popsaného Subauste a kol., výše, pro in vitro infekci lidských bronchiálních epiteliálních buněk rinovirem. BEAS2B buňky (2 x 10⁵/jamka) byly kultivovány v jamkách potažených kolagenem po dobu 24 hodin před infekcí rinovirem. Serotyp 39 rinoviru byl přidán k buněčným kulturám k 1 hodinové inkubaci při teplotě 34° C, potom bylo inokulum nahrazeno novým médiem a kultury byly inkubovány dalších 72 hodin při teplotě 34° C. Shromážděné supernatanty v čase 72 hodin po infekci byly testovány na koncentraci cytokinového proteinu metodou ELISA za použití komerčně, dostupných souprav (R&D Systems). Virový výtěžek byl také stanoven z kultivačních supernatantu za použití mikrotitrační zkoušky v buněčných kulturách HELA (Subauste a kol., výše, 1995). V kulturách ošetřených inhibitory IL-8 bylo přidáno léčivo 30 minut před infekcí. Zásobní roztoky sloučenin byly připraveny v DMSO (10 mM léčiva) a byly skladovány při teplotě -20 °C.

Pro detekci inhibice IL-8R byly kultury inkubovány v základním médiu bez růstových faktorů a přísad z důvodu snížení endogenních hladin aktivovaného IL-8. Supernatanty byly sklizeny v různém čase po přidání rinoviru a byly koncentrovány. Koncentráty byly frakcíonovány na kolonách Superose 6. Supernatanty byly koncentrovány >50-krát za použití koncentrátoru Amicon s vylučovací hranicí 5000 (relativní molekulová hmotnost). Jediný nástřik (0,5 ml) byl aplikován na frakcionační kolonu Superose 6 s průtokem (0,2 ml/min). Frakce (0,5 ml) byly shromažďovány a testovány na uvolňování Ca²⁺ z čerstvě izolovaných lidských

PMN S FURA-2.

• · 44 4 4 • · · ·

4 4 • 4 4

- is*«:..

4

4 ♦ « • · * 4 4 4 • '· 4 4 '4 · 4 • 4 4 · 4 4 « ♦ ·· ·* 4 · ·♦

Výsledky

Charakterizace chemokinů vytvořených lidskými epiteliálními buňkami BEAS-2B infikovaných RV

V klidovém stavu lidské epiteliální buňky BEAS-2B vytvářely malé množství alespoň 3 známých chemokinů, Groa, IL-8 a ENA-78. Po infikování buněk rinovirem vzrostla tvorba.těchto 3 ELR chemokinů 6,6 až 20-krát oproti klidovému stavu (Tabulka 1) .

Tabulka 1: Tvorba ELR chemokinů z epiteliálních buněk BEAS2B v klidovém a infikovaném stavu (n=6).

Ošetření	Groa(pg/ml)	IL-8 (pg/ml)	ENA-78 (pg/ml)
Kontrola	1568+402	143+86	164+33
HRV-39	1213513599	28701645	1083+194

Když byl supernatant z epiteliálních buněk infikovaných HRV-39 podroben vylučovací frakcionací na koloně Superose 6, byl eluován jediný pík s aktivitou uvolňovaného Ca²⁺ při testování za použití lidských neutrofilů (obrázek III) nebo buněčné linie transfektované buď CXCR1 nebo CXCR2 receptorem. Mobilizace Ca²⁺ v neutrofilů se objevuje ve stejných frakcích jako eluce chemokinů IL-8, ENA-78 a Groa.

K stanovení, jestli jsou vytvářeny další chemokiny buňkami BEAS-2B infikovanými HRV-39, pro které autoři neměli ELISA soupravy, byl zkoušen supernatant BEAS-2B vůči dalším čerstvě izolovaným lidským periferním buňkám, které exprimují řadu chemokinových receptorů včetně CCR1, CCR2, CCR3 a CCR5. Když výše aktivní frakce odvozené od epiteliálních buněk BEAS-2B byly zkoušeny na uvolňování • · • tt · · · . tt · · · ^tttttt · · tttttt · _ 2 /♦-····· · · tttttttt tt • · · · · · tt··» tttttt · · tttttttt tttt··

Ca²⁺ za použití eozinofilů s Fura-2 nebo periferních mononukleárních krvinek (PBLs), žádná s frakcí neuvolňovala Ca²⁺. To naznačuje, že chemokiny kromě IL-8, Groa a ENA-78 nejsou přítomny ve významných koncentracích, aby podporovaly mobilizaci Ca .

K určení potenciálu pro další PMN aktivující chemokiny a pro možnost, že IL-8 bude aktivovat PMN prostřednictvím CXCR2 byla stanovena schopnost antagonistu receptoru IL-8 inhibovat uvolňování Ca²⁺ vyvolané grop, koncentrovaným supernatantem BEAS-2B nebo aktivními frakcemi ze separace na koloně superose6 s PMN s Fura-2. Jak může být vidět z obrázku 1, dávka sloučeniny X závisle a úplně inhibovala RV koncentrovaný supernatant a frakce obsahující chemokiny z kolony superose 6 s ICsos mezi 1,7 a 2 nM. Tato IC₅₀ je podobná IC₅₀ odvozené od Grop.samotného, (IC50 = 5 nM) a naznačuje, že veškerá aktivita uvolňování Ca²⁺ obsažena v koncentrátu nebo frakcích působí prostřednictvím CXCR2 receptoru.

Pro zjištění, zda RV supernatant působí pouze prostřednictvím CXCR2 receptoru, byla zjištěna korelace počtu selektivních CXCR2 antagonistů a schopnosti inhibovat uvolňování Ca²⁺ vyvolané koncentrovaným RV supernatantem a Grop. Existuje výborná korelace mezi divergentní sadou antagonistů CXCR2 a jejich schopností inhibovat uvolňování Ca²⁺ vyvolané RV a Grop, která naznačuje, že aktivita uvolňování Ca²⁺ vyvolaná RV supernatantem působí pouze prostřednictvím CXCR2 receptoru na PMNs.

Inhibice chemotaxe PMN byla také stanovena v jak koncentrovaném, tak i frakcionovaném vzorku. Chemotaxe byla inhibována specifickými CXCR2 antagonisty, jak je znázorněno na obrázku II.

Tyto výsledky ukazují, že buňky BEAS-2B produkují řadu ELR chemokinů, které působí prostřednictvím CXCR2 receptoru · ·

4444

4 4 ····

4 4 • · * 9 4

9 4 0 »

4 · · a které mohou být blokovány selektivním antagonistou CXCR2. Ačkoliv IL-8 je přítomen v supernatantu, je také úplně blokován antagonistou CXCR2. To je nepravděpodobné z důvodu jeho nízké koncentrace ve srovnání s Groa.

Na všechny publikace, které zahrnují patenty a patentové přihlášky, ale nejsou na ně omezeny, které jsou citovány v tomto popise, se tímto odkazuje, jako by každá individuální publikace byla specificky a individuálně zahrnuta v celé své úplnosti.

Popis výše plně ukazuje vynález včetně jeho výhodného provedení. Modifikace a vylepšení těchto provedení specificky popsaných v tomto textu spadají do rozsahu následujících nároků. Bez dalších pokusů může odborník za použití předcházejícího popisu použít tento vynález v jeho plném rozsahu. Proto příklady v tomto textu mají být chápány pouze jako ilustrativní a neomezují rozsah tohoto vynálezu v žádném směru. Provedení tohoto vynálezu, pro které je nárokováno výlučné vlastnictví a práva, jsou uvedena v následujících nárocích.

• · · · ·»· ·» ·» · · ··· « · · · · • · · · 9 · · · · · · · • 9999999 · · · · ♦ · 9 « · · · 9 9 9 999«

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití antagonisty receptorů IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení způsobeného lidským rinovirem, jiným enterovirem, herpesvirem, koronavirem, virem chřipky, virem parainfluenzy, respiračním syncyciálním virem nebo adenovirovou infekcí u člověka.
2. Použití antagonisty receptorů IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení, kde respirační virová infekce obnovuje astma.
3. Použití antagonisty receptorů IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení, kde respirační virová infekce obnovuje chronickou bronchitidu.
4. Použití antagonisty receptorů IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení, kde respirační virová infekce obnovuje chronické obstruktivní onemocnění plic.
5. Použití antagonisty receptorů IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení, kde respirační virová infekce obnovuje zánět středního ucha.
6. Použití antagonisty receptorů IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení, kde respirační virová infekce obnovuje sinusitidu.

• · • · · « » · · · φ
7. Použití antagonisty receptoru IL-8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení příznaků běžného nachlazení, kde respirační virová infekce je spojena se sekundární bakteriální infekcí, jako je zánět středního ucha, zánět sinusitida nebo zápal plic.
8. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, antagonisty receptoru IL-8 s druhou terapeuticky účinnou látkou.
9. Použití podle nároku 8, kde druhá terapeuticky účinná látka je vybrána ze skupiny sestávající z látky účinné proti virům, antihistaminika, látky snižující překrvení, steroidů, antibiotika a protizánětlivé látky.
10. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9,'pro výrobu farmaceutického prostředku pro orální, bukální, místní (intranazální) podávání nebo podávání prostřednictvím inhalace (aerosolem), nebo podávání jak místně, tak i prostřednictvím inhalace.
11. Použití podle nároku 10, této sloučeniny s druhou terapeuticky účinnou látkou pro výrobu farmaceutického prostředku.
12. Použití podle nároku 11, pro výrobu farmaceutického prostředku, kde druhá terapeuticky účinná látka je vybrána ze skupiny sestávající z látky účinné proti virům, antihistaminika, látky snižující překrvení, steroidů, antibiotika a protizánětlivé látky.
13. Použití podle nároku 1, pro výrobu farmaceutického prostředku, kde antagonista receptoru IL-8 je vybrán ze sloučenin popsaných v:

- 21 44 4 44 4

US patentu č. 5 886 044, 5 780 483, 6 005 008, 5 929 250, 6 015 908 nebo 5 919 776,

US patentových přihláškách č.

09/111663, 09/125279, 09/240354, 09/202570, 09/202586,

09/202569, 09/202568, 09/230120, 09/230290, 09/230952,

09/230977, 09/230981, 09/230980, 09/242187, 09/341378,

09/341382, 09/341262, 09/463673, 09/508039 nebo 09/486986,

WO 99/65310, WO 00/12489, WO 00/09511, WO 99/42464, WO 99/42463, WO 99/42461, WO 00/05216, WO 99/36069, WO 99/36070 nebo WO 00/06557,

PCT/US99/23776 nebo PCT/US99/29940, nebo

US prozatímních přihláškách č.

60/134728,

60/139675,

60/139677,

60/186239,

60/189176,

60/136666,

60/139680,

60/139674,

60/186183,

60/189175,

60/136665,

60/139678,

60/140025,

60/186182,

60/189848,

60/136717, 60/136667, 60/139673, 60/140024, 60/145756, 60/164350, 60/188410, 60/188243, 60/192132 nebo 60/196022

00 · ·· 0000 0« 0000

0 00. 00 0 00 0

000 00 0 00 0 0000000 0 000 0 0

0 0 0 00 0 0 00 « 0000 0 00 00 00 00