CZ200092A3 - Nitrogen oxide intended for inhibition of rhinovirus infection - Google Patents
Nitrogen oxide intended for inhibition of rhinovirus infection Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200092A3 CZ200092A3 CZ200092A CZ200092A CZ200092A3 CZ 200092 A3 CZ200092 A3 CZ 200092A3 CZ 200092 A CZ200092 A CZ 200092A CZ 200092 A CZ200092 A CZ 200092A CZ 200092 A3 CZ200092 A3 CZ 200092A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nitric oxide
- cells
- compound
- rhinovirus
- infection
- Prior art date
Links
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 123
- 206010061494 Rhinovirus infection Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 16
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 58
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 111
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 60
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 50
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 50
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 50
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims description 40
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 35
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 22
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 claims description 17
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 claims description 17
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 claims description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 13
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002840 nitric oxide donor Substances 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims description 8
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 8
- 206010039105 Rhinoviral infections Diseases 0.000 claims description 7
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 claims description 5
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 claims description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 4
- QODRTFHTYGHQMT-NTMALXAHSA-N PAPA NONOate Chemical compound CCCN([N+](\[O-])=N\[O-])CCC[NH3+] QODRTFHTYGHQMT-NTMALXAHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000511 anti-eosinophil effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002128 anti-rhinoviral effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 claims description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 claims description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 claims description 2
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 claims description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 claims 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 claims 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 abstract 1
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N nonanoic acid Chemical class CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 74
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 67
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 41
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 230000021995 interleukin-8 production Effects 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 13
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 10
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 6
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 5
- VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N Budesonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(CCC)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N 0.000 description 4
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 4
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 229960004436 budesonide Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- -1 inhalation Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000710130 Human rhinovirus 1A Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150109636 Inos gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 2
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000007302 negative regulation of cytokine production Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- BPBUJYBQUBMWDT-VQHVLOKHSA-N (E)-hydroxyimino-[methyl-[3-(methylamino)propyl]amino]-oxidoazanium Chemical compound CNCCCN(C)[N+](\[O-])=N/O BPBUJYBQUBMWDT-VQHVLOKHSA-N 0.000 description 1
- MZAGXDHQGXUDDX-JSRXJHBZSA-N (e,2z)-4-ethyl-2-hydroxyimino-5-nitrohex-3-enamide Chemical compound [O-][N+](=O)C(C)C(/CC)=C/C(=N/O)/C(N)=O MZAGXDHQGXUDDX-JSRXJHBZSA-N 0.000 description 1
- HMRRJTFDJAVRMR-UHFFFAOYSA-N 1,1-bis(2-aminoethyl)-2-hydroxy-3-oxotriazane Chemical compound NCCN(CCN)N(O)N=O HMRRJTFDJAVRMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGYFEOSZYEJBK-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-dichlorophenyl)-1-oxa-2-aza-3-azonia-4-azanidacyclopent-2-en-5-imine Chemical compound C1=C(Cl)C(Cl)=CC=C1[N+]1=NOC(=N)[N-]1 VXGYFEOSZYEJBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NCGICGYLBXGBGN-UHFFFAOYSA-N 3-morpholin-4-yl-1-oxa-3-azonia-2-azanidacyclopent-3-en-5-imine;hydrochloride Chemical compound Cl.[N-]1OC(=N)C=[N+]1N1CCOCC1 NCGICGYLBXGBGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical class CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 241001429370 Human rhinovirus A16 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- MNNBCKASUFBXCO-YFKPBYRVSA-N N-acetyl-D-penicillamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S MNNBCKASUFBXCO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 Chemical compound SC#N.NC(N)=N.ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 BFDMCHRDSYTOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710154918 Trigger factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000023385 chemokine (C-C motif) ligand 5 production Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- XEYBHCRIKKKOSS-UHFFFAOYSA-N disodium;azanylidyneoxidanium;iron(2+);pentacyanide Chemical compound [Na+].[Na+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].[O+]#N XEYBHCRIKKKOSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000002884 effect on inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000000531 effect on virus Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003118 histopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124644 immune regulator Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- FKDHHVKWGRFRTG-UHFFFAOYSA-N linsidomine Chemical compound [N-]1OC(=N)C=[N+]1N1CCOCC1 FKDHHVKWGRFRTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002006 linsidomine Drugs 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- XLFWDASMENKTKL-UHFFFAOYSA-N molsidomine Chemical compound O1C(N=C([O-])OCC)=C[N+](N2CCOCC2)=N1 XLFWDASMENKTKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004027 molsidomine Drugs 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- KIWSYRHAAPLJFJ-DNZSEPECSA-N n-[(e,2z)-4-ethyl-2-hydroxyimino-5-nitrohex-3-enyl]pyridine-3-carboxamide Chemical compound [O-][N+](=O)C(C)C(/CC)=C/C(=N/O)/CNC(=O)C1=CC=CN=C1 KIWSYRHAAPLJFJ-DNZSEPECSA-N 0.000 description 1
- TXPUBJSOHAMNEI-BETUJISGSA-N n-[3-[(2s,6r)-2,6-dimethylpiperidin-1-yl]oxadiazol-3-ium-5-yl]-4-methoxybenzenecarboximidate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(\[O-])=N\C1=C[N+](N2[C@@H](CCC[C@@H]2C)C)=NO1 TXPUBJSOHAMNEI-BETUJISGSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960002497 nicorandil Drugs 0.000 description 1
- LBHIOVVIQHSOQN-UHFFFAOYSA-N nicorandil Chemical compound [O-][N+](=O)OCCNC(=O)C1=CC=CN=C1 LBHIOVVIQHSOQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940082615 organic nitrates used in cardiac disease Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 229950010229 pirsidomine Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008593 response to virus Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000010801 sewage sludge Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940083618 sodium nitroprusside Drugs 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/15—Oximes (>C=N—O—); Hydrazines (>N—N<); Hydrazones (>N—N=) ; Imines (C—N=C)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
- A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
- A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0043—Nose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
- A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti virologie. Zejména se týká oblasti lidských rhinovirů.
Dosavadní stav techniky
Rhinovirové infekce jsou hlavní příčinou obecného nachlazení (18), nejčastěji se vyskytující respirační nemoci u lidí. Nejnovější poznatky implikují rhinovirové infekce jako důležitý spouštěcí faktor při vyvolání astmatu (21, 22, 37), chronické bronchitidy (35), sinusitidy (19, 50) a tánět středního ucha (3). Přes vysoké náklady zdravotnické péče spojené s rhino virovými infekcemi, základní proces, kterým virová infekce vede k symptomatologii je málo pochopena.
Epitheální buňky jsou primárním místem rhino virových infekcí (6, 51). Na rozdíl od jiných respiračními viry, jako je chřipka, nezdá se, že by cytotoxické poškození infikovaných epitheálních buněk hrálo roli v patogenesi rhinovirových infekcí, poněvadž se cytotoxicita nepozoruje ani v infikovaných lidských epiteliálních buněčných kulturách (49, ani v nosním slizu infikovaných jedinců (53, 54). Na základě toho se pozornost soustředila na představu, že symptomy mohou vznikat z akce protizánětlivých mediátorů, které se generují jako důsledek rhinovirové infekce. Tuto hypotézu podpořily dvě větve důkazů: 1) Studie jedinců s experimentálně zavedenými nebo přirozeně získanými nachlazeními demonstrovaly zvýšené úrovně řady mediátorů, včetně kininů (36, 41), IL-1 (40) a IL-6 (55) v nosních sekretech během symptomatických rhinovirových infekcí a 2) ukázalo se, že infekce čištěných lidských respiračních epiteliálních buněčných populací rhinovirů indukuje produkci protizánětlivých cytokinů, včetně IL-8, IL/6 a GM-CSF (49, 55), což by mohlo přispívat k patogenesi nemoci. Dosud jsou však specifické biochemické události působící při produkci každého z těchto cytokinů pochopeny neúplně a úloha specifických cytokinů a jiných mediátorů při patogenesi nachlazení se musí určit.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je zabezpečit způsob pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí.
Jiným cílem vynálezu je zajistit způsob snížení replikace rhinovirů.
Ještě dalším cílem je zajistit způsob snížení produkce cytokinů způsobené rhino viry.
φ · · ♦ φ φ φ φ φ φ φ ·· φ · · · · • φ φ φ φ · · · · • φ φ φ φ · · · φ φ φ · φ ········ ···· ···· ·· ·* ·* ··
Ještě dalším cílem vynálezu je zajistit způsob pro screening sloučenin pro identifikaci kandidátních terapeutických nebo profylakčních činidel pro rhinovirovou infekcí.
Tyto a jiné cíle vynálezu se dosahují zajištěním způsobu pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí, který zahrnuje podávání sloučeniny osobě infikované rhinovirem. Sloučenina uvolňuje oxid dusnatý (NO). Podávané množství je dostatečné k zmírnění jednoho nebo více symptomů spojených s infekcí.
Podle ještě jiného hlediska vynálezu je zajištěn způsob snížení replikace rhinovirů stykem lidských epiteliálních buněk, které jsou infikovány rhinovirem, se sloučeninou. Sloučenina uvolňuje NO. Podává se dostatečné množství, aby se inhibovala replikace rhinovirů.
Podle ještě jiného hlediska vynálezu je zajištěn způsob snížení produkce cytokinů způsobené rhinoviry. Způsob zahrnuje podávání sloučeniny osobě infikované rhinovirem. Sloučenina uvolňuje NO. Podávané množství sloučeniny je dostatečné, aby se inhibovalo produkci cytokinů způsobenou rhinovirem.
Jiné provedení vynálezu je způsob pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí. Způsob zahrnuje podávání účinného množství sloučeniny osobě infikované rhinovirem. Sloučenina indukuje syntasu oxidu dusnatého (NOS) v lidských epiteliálních respiračních buňkách, čímž se zmírňují symptomy infekce.
Ještě další provedení vynálezu je zajištěno způsobem pro snížení replikace rhinovirů. Způsob zahrnuje styk lidských epiteliálních respiračních buněk, které jsou infikované, se sloučeninou. Sloučenina indukuje NOS v lidských epiteliálních respiračních buňkách. Sloučenina se podává v množství dostatečném, aby se inhibovalo replikace rhinovirů.
Také jiným hlediskem vynálezu je způsob snížení produkce cytokinů způsobené rhinovirem. Způsob zahrnuje styk lidských epiteliálních buněk, které jsou infikovány rhinovirem, se sloučeninou, která indukuje NOS v lidských epiteliálních respiračních buňkách. Podává se množství, které je účinné, aby inhibovalo produkci cytokinů způsobenou rhinoviry.
Ještě dalším provedením vynálezu je způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro terapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry. Způsob zahrnuje krok infikování lidských epiteliálních respiračních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství alespoň jednoho protizánětlivého nebo eosinofil-aktivního cytokinů produkovaného v respiračních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství ·· · · ·· produkovaného cytokinu, je kandidátní látkou pro therapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.
Jiným hlediskem vynálezu je další způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro therapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry. Způsob zahrnuje krok infikování lidských epiteliálních respiračních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství rhinovirového genomu replikovaného v respiračních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství replikovaného rhinovirového genomu, je kandidátní látkou pro therapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.
Podle dalšího hlediska vynálezu je zabezpečena farmaceutické kompozice pro léčení rhinovirových infekcí. Kompozice obsahuje kapalnou formulaci obsahující sloučeninu, která uvolňuje NO. Kapalnou formulací jsou nosní kapky.
Další provedení vynálezu je nosní sprejová nebo kapací láhev pro podávání farmaceutické kompozice k lidskému nosu. Láhev obsahuje kapalnou formulaci, která uvolňuje NO. Ještě jiným hlediskem vynálezu je inhalátor nebo zamlžovaě pro dodávání antirhinovirové kompozice do lidského respiračního traktu. Zařízení obsahuje kapalnou formulaci, která uvolňuje NO.
Vynález tak zajišťuje obor kompozicemi, zařízeními a způsoby pro léčení rhinovirových infekcí a také způsoby identifikace dalších kandidátních terapeutických nebo profylakčních činidel.
Zjisto se, že lidské rhinoviry indukují produkci protizánětlivých cytokinů z lidských respiračních epiteliálních buněk. Navíc se zjistilo, že oxid dusnatý poznatelně inhibuje replikaci rhinoviru a expresi cytokinů indukovanou viry bez ovlivnění hladin mRNA pro cytokiny. Podávání donorů NO nebo sloučenin indukujících syntházu oxidu dusnatého (NOS) se tedy může použít k dosažení profylaktických a terapeutických cílů. Protože replikace a záněty jsou ovlivněny s NO, takové ošetření vedou ke kratšímu trvání infekce a také k sníženým symptomům.
S výhodou se podávají množství donorů NO nebo sloučenin indukujících NOS, aby se dosáhla významná inhibice symptomů, syntéza protizánětlivých cytokinů, syntéza eosinofilaktivního cytokinu anebo replikace virů. Taková i je alespoň 10%, výhodně alespoň 20%, a postupně více výhodněji alespoň 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 95% nebo 99%. Symptomy, které jsou často spojeny s lidskými rhinoviry zahrnují obecné nachlazení, astma, sinusitidu, zánět
9 4 4 ♦· 4 4 · 4 ·♦ 1 »4·· · · 4 · · 4 • · 4 4 4 444
444 4 444 44
4 4444 4 · 4 »499 9444 44 44 44 <
středního ucha a bronchitidu. Kterékoliv z těchto a z jiných symptomů mohou být ulehčeny nebo inhibovány podle vynálezu.
Způsoby léčení podle vynálezu zahrnují jakýkoliv způsob, kterým aktivní sloučeniny mohou získat přístup k lidským epiteliálním respiračním buňkám. Takové způsoby zahrnují bez omezení: topická aplikace, nosní kapky, inhalace, aerosol, sprej, kloktadlo nebo promytí.
Lze použít sloučeniny, které generují NO in šitu. Takové sloučeniny zahrnují bez omezení nitro glycerin, organické dusičnany, linsidomin, molsidomin, N-acetylpenicilamin, 3morfolinosyndonimin (SIN-1), neuvolňující se deriváty aspirinu, NOC-18, nitroprusid sodný, GEA 3162, GEA 3175, GEA 5171, nicorandil, C87 3754, N-naroxen, S-nitrosogstein, Snitrosoglutathion, FR 144420 a FK409, NOR4, NOC-7, (N(O)NO)-polymery, pirsidomin, 2,2diethyl-l-nitrexylhydrazin, furoxany. Sloučeniny s výhodou zahrnují skupinu N2O2’. Sloučeninou je výhodněji 3-(2-hydroxy-2-nitroso-l-propylhydrazino)-l-propanamin (člen třídy NONOátů). Takové sloučeniny byly známy pro topickou aplikaci k srdeční tkáni v pastách a náplastích. Tyto sloučeniny se mohou aplikovat do nosu, úst, hrdla, průduškek nebo jiné části respirační soustavy. Také se může použít intravenosní podávání a také jako přímá farmakologická injekce. Vhodné dávky budou obecně asi od 0,01 mg do 10 mg na aplikaci, s výhodou 0,1 mg do 5 mg a výhodněji od 1 až 3 mg.
Sloučeniny, které lze použít jako sloučeniny indukující NOS, zahrnují bez omezení interferon gama, TNF-alfa, IL-1 beta a bakteriální lipopolysacharid.
Zařízení pro dodávání kompozic a sloučenin do respiračního traktu mohou být jakékoliv, které se konvenčně používají v oboru pro takové účely. Zahrnují inhalátory, zamlžovače, láhve s nosními kapkami, kapací láhve. Jakákoliv formulace, která je vhodná pro dodávání do nosu, úst, hrdla, průdušek, plic, uší anebo dutin.
Popis výše obecně popisuje vynález. Úplnější pochopení lze získat odkazem na následující specifické příklady, které jsou zde poskytnuty jen pro ilustraci a jsou zamyšleny jako omezení rozsahu vynálezu.
Krátký popis obrázků
Obr. 1: Produkce cytokinů z buněk BEAS-2B 24 hodin po infekci s každým z řady kmenů lidského rhinoviru (HRV). Údaje představují průměr +/- SEM ze tří pokusů. Obr. 1A ukazuje produkci IL-8, zatím co obrázek 1B ukazuje produkci IL-6.
·· ·· · · ·· ·· • · · · · · · ···· • · ··· ···· • · · · · ······ • · · · · · ···· ···· ···· ·· ·· ·· ··
Obr. 2: Časový průběh indukce stálého stavu mRNA hladin a proteinu pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-14. Obr. 2A a 2B ukazují Nothem bloty od každého cytokinů a pro provozní gen, GAPDH. Obrázky 2C a 2D ukazují densitometrické poměry, zatímco obr. 2E a 2F ukazují hladiny proteinu produkované v každém ukázaném časovém bodě. Údaje jsou z reprezentativního pokusu (n = 3).
Obr. 3: Časový průběh indukce stálého stavu mRNA hladin a proteinu pro IL-8 (vlevo) a IL6 (vpravo) z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-16. Obrázky 3 A a 3B ukazují Nothem bloty od každého cytokinů a pro provozní gen, GAPDH. Obr. 3C a 3D ukazují hodnoty průměr +/SEM densitometrických poměrů pro 4 pokusy. Obr. 3E a 3F ukazují hodnoty průměr +/- SEM proteinu produkovaného ve 4 pokusech v každém časovém bodě. Hvězdičky označují významná zvýšení každého parametru vztaženo ke kontrole v čase nula (p < 0,05 v každém případě).
Obr. 4: Cykloheximid nemění stálý stav mRNA hladin pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) měřené 1 hodinu po infekci s HRV-16. Obr. 4A a 4B ukazují reprezentativní Nothem bloty, zatímco obr. 4C a 4D ukazují hodnoty průměr +/- SEM densitometrických poměrů pro 4 pokusy.
Obr. 5: Účinky Budenosidu (107 M) na stálý stav mRNA hladin a protein pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-16. Obr. 5A a 5B ukazují reprezentativní Nothern bloty s použitím mRNA extrahované 1 hodinu po infekci. Obr. 5C a 5D ukazují hodnoty průměr +/- SEM densitometrických poměrů pro 3 pokusy. Obr. 5E a 5F ukazují hodnoty průměr +/- SEM produkované 7 hodin po infekci ve 3 pokusech.
Obr. 6: Inhibice produkce cytokinů NONOátem z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-16. Obr. 6A ukazuje hodnoty průměr +/- SEM ve 4 pokusech produkce IL-8 4 hodiny a 24 hodin po infekci s HRV-168, zatímco obr. 6B ukazuje údaje pro produkci IL-6. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými v stejné době po infekci v nepřítomnosti NONOátu (p < 0,05 v každém případě).
Obr. 7: Na dávce závislá inhibice NONOátem HRV-16 titrů v supematantech BEAS-2B získaných 24 hodin po expozici virům. Údaje představují průměr +/- SEM ze 4 pokusů. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými v nepřítomnosti NONOátu (p < 0,05 v každém případě).
Obr. 8: Srovnání účinků neaktivního NONOátu a aktivního NONOátu přidaných v různých dobách během postupu infekce na produkci cytokinů indukovanou HRV-16 z buněk BEAS-2B. NONOát se použil při konečné koncentraci 1000 μΜ a hladiny proteinu 4 hodiny po infekci. Obr. 8A ukazuje hodnoty průměr +/- SEM pro IL-8 ze 3 pokusů. Obr. 8A ukazuje údaje pro IL·· ···· ·· ·· • · · · • · · · · • · · · ···♦ ···· *· ·♦ »· • · · · · • · · ♦ • · · · · · • · · · · • · ··
6. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými samotným virem (p < 0,05 v každém případě).
Obr. 9: Účinek NONOátu (500 μΜ) na stálý stav mRNA hladin a protein pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) v různých dobách po infekci s HRV-16. Obrázky 9A a 9B ukazují reprezentativní Nothern bloty od každého cytokinu a pro provozní gen, GAPDH. Obr. 9C a 9D ukazují hodnoty průměr +/- SEM densitometrických poměrů pro 3 pokusy. Obr. 9E a 9F ukazují hodnoty průměr +/- SEM proteinu produkovaného ve 3 pokusech v každém časovém bodě. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými samotným virem (p < 0,05 v každém případě).
Obr. 10: Účinek NONOátu (500 mikromolů) na produkci GM-CSF (vlevo) a RANTES (vpravo) z buněk BEAS-2B 24 hodiny po infekci s HRV-16. Údaje představují průměr +/- SEM ze 4 pokusů.
Obr. 11: HRV infekce lidských bronchiálních epiteliálních buněk indukuje expresi mRNA pro iNOS. Buňky se vystavily samotnému mediu (sloupce 2 a 4) nebo HRV-16 (sloupce 3 a 5). Celková buněčná RNA se extrahovala a podrobila se RT-PCR na iNOS při 24 hodin (sloupce 2 a 3) a při 48 hodin (sloupce 4 a 5). Pro tuto PCR se použily priméry k amplifikaci na produkt s 500 bp. Sloupec 1 obsahuje DNA sloupec k ukázání velikosti molekuly.
Příklady provedení vynálezu
Byly provedeny následující studie, aby se dále vymezila kinetika a mechanismy produkce cytokinů způsobené rhinoviry v epiteliálních buňkách a pro vyhodnocení účinků možných terapeutických zásahů na těchto cestách. Kladl se důraz na virovou produkci IL-8 a IL-6, protože tyto cytokiny jsou produkované v relativně velkých množstvích a mají biologické vlastnosti, které jsou zajímavé s ohledem na patogenesi nachlazení. IL-8 je silný chemoatraktant a aktivátor neutrofilů (5) a také má chemotaktickou aktivitu pro lymfocyty (28), dva dominantní buněčné typy v nosní mukose během rhinovirových infekcí (29, 54). IL-6 je nejen schopný stimulovat aktivaci T buněk, indukováním diferenciace B buněk a produkcí protilátek (1), ale také stimuluje mukózní IgA immuní odpovědi (42). Na základě šikých rozsahů immunomodulatomích a protizánětlivých účinků glukokortikoidů (44), včetně jejich schopnosti inhibovat produkci řady cytokinů v rozmanitých buněčných typech (45), vyzkoušeli jsme účinky silného glukokortikoidu, budesonidu na rhinovirovou infekci epiteliálních buněk. Jako nový alternativní přístup jsme také prozkoumali schopnost donoru oxidu dusnatého inhibovat replikaci virů a viry indukovanou produkci cytokinů v epiteliálních buňkách. Studie ukázaly, že vasodilatomí oxid dusnatý (NO) •4 ···· ·· ·« • · · · · · • · · · • · · · · • · · · ········ ·« ·* ·· • · · · · • · · » « • · · · · » • · · · · · ·· ·« ·· může vykonávat modulační účinky na záněty (39) a ukázalo se, že oxid dusnatý má antivirové účinky v některých zvířecích modelech (7, 12, 20, 24, 32), avšak tato vlastnost se nevyzkoušela na lidských respiračních epiteliálních buňkách. Naše studie ukazují, že budesonid mírně inhibuje tvorbu cytokinů indukovanou rhinoviry bez ovlivnění replikace virů. Naopak, NO značně inhibuje tvorbu cytokinů indukovanou rhinoviry a také replikaci virů a může hrát terapeutickou úlohu při rhinovirových infekcích.
Příklad 1
Účinky pasažování buněk
Předběžné studie naznačily výrazný účinek opakovaného pasažování buněk na produkci cytokinů z buněk BEAS-2B. Ačkoliv získané údaje byly vždy kvalitativně identické pro každé pasážování, existoval progresivní účinek pasážování buněk na absolutní hladiny produkovaných cytokinů. Například ve čtyřech pokusech, provedených s použitím identického postupu s opakovaným pasážováním buněk, produkce IL-8 se snížila z 7690 pg/ml na 3090 pg/ml. Z tohoto důvodu se každý typ pokusu provedený níže se vždy prováděl ve shodných pokusech s použitím pasážování stejných buněk.
Srovnání účinků řady kmenů rhinovirů na produkci cytokinů z buněk BEAS-2B
Účinky na produkci cytokinů ve stejných účinných dávkách čtyř různých kmenů rhinovirů se srovnávaly v kulturách buněk BEAS-2B. Tři použité kmeny, typy 14, 16 a 39 jsou členy hlavní skupiny rhinovirů, které používají mezibuněčnou adhesní molekulu-1 (ICAM-l) jako svého receptoru, zatímco typ 1A je člen menší skupiny nezávislé na ICAM-1. Všechny tyto kmeny indukovaly produkci IL-8 a IL-6, měřenou 24 hodiny po infekci (Obr. 10). U všech kmenů virů byly generované hladiny IL-8 přibližně 10-krát vyšší než u IL-6.
Materiály
Získala se následující činidla: Dullbeccovo minimální nezbytné medium (DMEM), Eaglovo minimální nezbytné medium (EMEM), Hamovo F-12 medium, HBSS, L-glutamin, penicilin/streptomycin/fungizon, stopové prvky a kyselina retinová (Biofluids, Rockville, MD), hydrokortizon, růstový faktor epiteliálních buněk, růstový doplněk endotheliálních buněk (Collaborative Research, Bedford, MA), hovězí sérum plodu (Genini Bio Products, lne., Calabasa, CA), transferrin a insulin (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 3-(2-hydroxy-2-nitroso-lpropylhydrazino)-l-propanamin (NONOát) od Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI), RNAzoI™B (Tel-Test, lne., Friendswood, TX), agaróza (Bioproducts, Rockland, ME), Mops »4 *4 444» »444 · » · 4 4 4 4
Ο «4*4 4 4444
O 4 4··· * 4 I 4 β 4 • · · · 4 4 4 4 4 4
4444 ···« *4 44 44 44 (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) a alfa ^p.^CTP (Amersham, Arlington Heights, IL). Všechny ostatní chemikálie se získaly od Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Budesonid byl získán laskavostí dr. Per Anderssona a dr. Ralph Brattsanda (Astra Pharmaceutical Production, Lund, Sweden).
Použily se následující zásobní ústoje: 10X Mops (0,2 M Mops, 0,05 M octan sodný, 0,01 M EDTA, 50X Denhartův (1% ficoll, 1% polyvinylpyrrolidin, 1% albumin z hovězího séra) a 20X SSPE (175,3 g NaCl, 27,6 g NaH2PO4.H2O, 7,4 g EDTA v 1 litru H2O, pH 7,4).
Viry a buněčné linie
Typy lidského rhinoviru 14 (HRV-14), 16 (HRV-16), 39 (HRV-39) a 1A (HRV-1A) a buňky HeLa se získaly American Type Culture Collection (Rockville, MD). Další zásoby virů HRV-14 a HRV-16 se generovaly pasážováním v HeLa nebo WI-38 buňkách, jak se popisovalo výše (49). Nebylo možné generovat ekvivalentní zásoby těchto dvou virových kmenů s použitím stejné hostitelské buněčné linie, protože tyto dva kmeny vykazovaly vyznačené výhody v termínech schopnosti infikovat a replikovat v těchto buněčných liniích. Tato proměnná citlivost hostitelských buněk k různým kmenům rhinoviru se doložila dříve (11). HRV-16 se čistil pro některé pokusy, aby se odstranily ribosomy a rozpustné faktory pocházející z WI-38 centrifugací v sacharose podle publikovaných metod (16). Inaktivace HRV-16 se provedla expozicí UV na 30 minut, jak se popisovalo dříve (49). Pro pokusy užívající HRV-39 a 1A se použily přímo zásoby virů, jak se získaly od dodavatele. Dodaná zásoba HRV-16 se připravila v WI-38 buňkách, zatímco dodaná zásoba HRV-1A se generovala v HELa buňkách. Buněčná linie BEAS-2B (43) byla získána laskavostí dr. Curtis Harrise (National Cancer Institute, Bethesda, MD).
Kultura epiteliálních buněk
Primární lidské tracheální epiteliální buňky se získaly štěpením lidské tkáně proteázou, jak se popisovalo dříve (10). Jak primární buňky, tak BEAS-2B buňky rostly v kultivačním mediu složeném z Hamova F-12 výživného media s penicilinem (100 U/ml), streptomycinem (100 U/ml), fungizonem (250 ng/ml), L-glutaminem (2 mM), fosfoethanolamin/ethanolaminem (0,5 mM), transferrinem (0,010 mg/ml), doplňkem endotheliálních buněk (0,00375 mg/ml), epidermálním růstovým faktorem (12,5 ng/ml), insulinem (0,005 mg/ml), hydrokortizonem (10'? M), toxinem cholery 10 ng/ml), 3,3',5-triodothyroninem (3 x 109 Μχ kyselinou retinovou (0,1 ng/ml) a stopovými prvky. Toto medium se následovně uvádí jako F12/10X. Buňky se inkubovaly při 37 °C v 95% vzduchu a 5% CO2. Pro tyto pokusy se buňky mezi pasážováním 35
• · ·· ·· ···· • · · · · · · η ··«·· y ······ • · · · · · ···· ···· «· a 50 daly na desky s 6 jamkami nebo na75 cm^ misky (Costar, Cambridge, MA) při hustotě 2,5 104 buněk/cmÁ
Virová infekce buněk BEAS-2B
Monovrstvy buněk BEAS-2B (70-80% souvislý nárůst) se třikrát promyly s HBSS. Rhinoviry (kmeny 14, 16, 39 a 1A) se přidaly k buňkám při koncentraci 104 TCID5Q jednotek/ml HBSS. To odpovídí infekční dávce 0,01 TCID50 jednotek/buňka BEAS-2B, ačkoliv není jasné, co toto představuje ve vztahu k multiplicitě infekce (MOI - infekční jednotky na buňku) pro buňky BEAS-2B, poněvadž schopnost rhinoviru infikovat různé hostitelské buňky je dost proměnná (viz výše). Buňky se inkubovaly při 34 °C 1 hodinu, třikrát se promyly s F12/10X a pak se přidalo čerstvé F12/10X mediu k buňkám. Z buněk se supematanty odstranily v různých dobách po infekci a skladovaly se při -80 °C pro pozdější analýzu produkce proteinu cytokinu a obsah viru. V některých pokusech se extrahovala z buněk celková buněčná RNA v různých dobách po infekci a skladovala se při -80 °C pro pozdější analýzu.
Kvantifikace IL-8 a IL-6
Hladiny cytokinů v supematantech buněk se stanovily s použitím specifických ELIS A testů. Měření IL-8 se prováděly s použitím dříve popsané ELISA, citlivé na 30 pg/ml cytokinu (49), zatímco hladiny IL-6 se testovaly s použitím komerční soupravy citlivé na 15 pg IL-6/ml (Biosource International, Camarillo, CA). Ani kultivační medium, ani vehikly pro léky použité v našich pokusech nepůsobily žádné nespecifické rušivé účinky v obou testech.
Statistická analýza
Údaje se vyjadřují jako průměr +/- SEM. Srovnání kinetiky exprese RNA, vylučování proteinu a titry viru se prováděly s použitím jednocestné ANOVA. Účinky cykloheximidu a glukokortikoidu na expresi RNA se srovnávaly za použití Studentova t-testu pro párové vzorky. Srovnání účinků NONOátu na tvorbu cytokinu, titry viru a na expresi RNA se prováděly s dvojcestnou ANOVA s jedním opakovaným měřením, s výjimkou pokusů srovnávajících aktivní a neaktivní NONOát, které se analyzovaly jednocestnou ANOVA. Když se získaly významné variační poměry, prováděly se párová srovnání průměrů s použitím Testu nejméně významné diference s mnohonásobným rozsahem (47). Diference se považovaly za významné pro hodnoty p < 0,05.
ΦΦΦΦ • · · * • · φ · • · ♦ φ · • · · · 9 • · · Φ
Příklad 2
Kinetiky exprese RNA a vylučování proteinu
Obr. 2 ukazuje, že mRNA pro IL-8 a IL-6 byly významně zvýšené během 1 hodiny po infekci HRV-14. K maximální expresi došlo při hodině 3, avšak mRNA hladiny byly ještě vyšší než neinfikované kontroly 24 hodin po infekci. Indukce mRNA byla následovaná významnými zvýšeními IL-8 a IL-6 proteinů v supematantech. Ke zvýšené produkci cytokinu došlo 3 hodiny po infekci a dosáhlo maximální koncentrace při 24 hodinách. Je zajímavé, že časový průběh produkce IL-8 a IL-6 po infekci HRV-16 byl rychlejší, než se pozorovalo u HRV-14 (Obr. 3). K maximální expresi mRNA došlo během 1 hodiny po infekci a k maximální produkci proteinu došlo během 7 hodin. Ve shodě s údaji ukázanými výše (Obr. 1), velikost tvorby cytokinu byla asi 4-krát větší po infekci HRV-14 (Obr. 3 proti Obr. 2). Poněvadž HRV-16 umožňoval rychlejší a robustnější produkci cytokinů a je kmenem, který se bude používat v pozdějších studiích in vivo, následující experimenty s mechanismem generace cytokinu indukovaná virem se prováděly za použití HRV-16. Aby se potvrdila specifita účinků HRV-16, provedly se tři uspořádané pokusy srovnávající generaci IL-8 aktivními a UV desaktivovánými preparacemi viru. Aktivní virus generoval 3307 +/- 1156 pg/ml IL-8, zatímco UV desaktivovaný virus produkoval jen 520 +/- 90 pg/ml (kontrolní neinfikované buňky produkovaly 345 +/- 110 pg/ml). Specifita se dále potvrdila demonstrováním, že podobná množství IL-8 se generovala v uspořádaných pokusech, kdy se buňky infikovaly naší standardní preparací viru nebo stejnou infekční dávkou stejného zásobního HRV-16 čištěného hustotní centrifugací v sacharose (2080 +/- 340 pg/ml a 1750 +/500 pg/ml, n = 3). Časový průběh virové indukce IL-8 a IL-6 byl také totožný se standardními a čištěnými preparacemi HRV-16 (není ukázáno).
Příklad 3
Titry viru po infekci s HRV-16
Odebíraly se supematanty v různých dobách po infekci a testovaly se na titry viru v testech cytotoxicity v buňkách WI-38 na HRV-16. Virus se detekoval v kultivačním mediu počínaje asi 7 hodin po infekci a postupně se zvyšoval mezi 7 hodinami a 24 hodinami po infekci (Tabulka 1). Supematanty odebrané během druhé 24 hodinové periody po infekci obsahovaly hladiny viru podobné těm, které se pozorovaly po 24 hodinách (viz Tabulku 2 níže). Tento vzor titrů viru je téměř shodný s dříve pozorovaným u HRV-14 (49).
• · • · • · · · * « · · 1 ♦ · · · · I • · · · <
• · · · · ·
Tabulka 1
Obsah viru v kalových vodách z buněk BEAS-2B v různých dobách po infekci lidským rhinovirem-16.
Doba po infekci Titr viru (hodin) (log TCIDgn jednotek)
Přiklad 4
ND
ND
ND
1.25 +/- 0,25
2.25 +/- 0,25 2,4+/-0,13
Údaje představují průměr +/- SEM ze 4 pokusů.
Tabulka 2
Účinky NONOátu na titry viru se snižují s časem.
Titr viru (log TCID50 jednotek)*
Ošetření
HRV-16
HRV-16 + 0,300 mmol NONOátu HRV-16 + 1,000 mmol NONOátu
0-24 hodin 2,8+/-0,1 2,5 +/- 0,3 0,5 +/- 0,5+
24-48 hodin 2,9 +/- 0,1 2,8 +/- 0,1 2,4 +/- 0,2 * Údaje představují průměr +/- SEM ze 3 pokusů. + p < 0,05 proti samotnému HRV-16.
Účinky cykloheximidu na IL-8 a IL-6 expresi mRNA
Hladiny pro IL-8 a IL-6 z buněk infikovaných HRV-16 ošetřených cykloheximidem (0,010 mg/ml) nebyly rozdílné od infikovaných kontrolních buněk (Obr. 4). Provedla se srovnání 1 hodinu po infekci virem, době vrcholné exprese mRNA v kinetických studiích popsaných výše.
Účinek cykloheximidu na IL-8 a IL-6 expresi mRNA indukovanou HRV-16
Buňky BEAS-2B se ošetřovaly cykloheximidem (0,010 mg/ml) nebo kontrolním mediem po 1 hodinu před infekci virem. Lék byl také přítomný během a po injekci s HRV-16.
• β · · • · · · 0 0 « 9 · 0 φ • · ··· · 0 « « * · ® ♦ · ····«· • · · · 0 · 0 0 0 0 ···· 0000 00 00 «·
Při 1 hodině po infekci se RNA sklidila pro Nothem analýzu. Použila se tato koncentrace cykloheximidu, protože se dříve ukázalo, že inhibuje expresi indukovanou TNFa a IFNg u RANTES mRNA v této buněčné linii (48).
Příklad 5
Účinek předběžného ošetření glykokortikoidem na produkci cytokinů a na titry viru
Buňky se ošetřovaly Budenosidem (1()-7 M) nebo kontrolním mediem po 24 hodin před infekci virem. Srovnání exprese mRNA a produkce proteinu se provedly v časech maximální odpovědi, jak se stanovila v kinetických pokusech popsaných výše, 1 hodina pro mRNA a 7 hodin pro produkci proteinu cytokinů. Exprese mRNA IL-8 a IL-6 v buňkách BEAS-2B infikovaných budenosidem se významně nezměnila (Obr. 5). V každém pokuse však produkce proteinů IL-8 a IL-6 z buněk BEAS-2B ošetřovaných budenosidem byla nižší než z kontrolních infikovaných buněk (p < 0,05 pro párová srovnání normalizovaných dat). Titry viru (2,2 +/- 0,6 log TCID5Q jednotek) se vystavením budenosidu nezměnily.
Účinek budenosidu na produkci cytokinů a na replikaci viru
Budenosid se připravil jako 10^ M zásobní roztok. Protože buňky BEAS-2B se obvykle udržovaly v růstovém mediu obsahujícím nízké hladiny hydrokortizonu, buňky se pro tyto pokusy daly do media bez hydrokortizonu na 24 hodin před ošetřením glukokortikoidem. Buňky se pak ošetřily Budenosidem (107 M) nebo vhodně zředěným kontrolním vehiklem po 24 hodin před infekci virem. Budenosid se po infekci opět zařadil do media. Koncentrace použitého budenosidu se vybrala, protože se dříve ukázalo, že maximálně inhibuje TNFa indukovanou RANTES produkci z buněk BEAS-2B (48). Supematanty z buněk s budenosidem a bez něj se odstranily v různých dobách po infekci a skladovaly se při -70 °C pro stanovení IL-8 a IL-6 proteinu a obsahu viru. V některých pokusech se použila Nothem analýza, aby se srovnala RNA extrahovaná 1 hodinu po infekci z buněk ošetřených Budenosidem s RNA extrahovanou z kontrolních infikovaných buněk.
Příklad 6
Účinek donoru oxidu dusnatého na produkci cytokinů a na titry viru
Sebraly se supematanty z buněk BEAS-2B 4 a 24 hodin po infekci s HRV-16, inkubovaných v nepřítomnosti nebo v přítomnosti NONOátu a testovaly se na titry viru a hladiny cytokinů. NONOát významně inhiboval produkci IL-8 a IL-6 způsobem závislým na » · · · · · · · · · · • · · * « · · · ·
-- · ·♦·· ···«·· · · ········ ···· ···· ·· ·· · ·· dávce (Obr. 6). Produkce IL-6 byla významně inhibovaná dávkami NONOátu tak nízkými, jak je 0,1 mM. Hladiny vytvořených cytokinů byly více inhibovány při 4 hodinách než při 24 hodinách, asi v důsledku mizících hladin NO při 24 hodinách. Titry viru byly také významně inhibované NONOátem (Obr. 7). Obsah viru v supernatantech sebraných při 24 hodinách byl téměř úplně eliminován 1 mM NONOátu. Supematanty z druhé kolekce při 24 hodinách však obsahovaly podobné množství viru, ať byly buňky ošetřeny NONOátem či nikoliv (Tabulka 2).
V souběžných studiích se hodnotily účinky NONOátu na životnost epitheální buňky při jakékoliv dávce a času. Existovalo malé, ale významné snížení počtu buněk jen s 1 mM NONOátu při 24 hodinách (1,7 +/- 0,4 x 1(Ú buněk na jamku bez NONOátu proti 1,2 +/- 0,4 x 1CÚ buněk na jamku s NONOátem, n - 3, p < 0,05). Žádné takové účinky se nepozorovaly při nižších dávkách NONOátu. Účinky NONOátu se také potvrdily při použití čištěného HRV-16 (není ukázáno).
Inhibiění účinky NONOátu se neomezovaly na HRV-16 infekci. Cytokiny produkované z buněk BEAS-2B infikovaných jiným hlavním kmenem HRV-14 nebo menším kmenem HRV1A byly také významně inhibované NONOátem. V přítomnosti 0,5 mM NONOátu virem indukovaná produkce IL-8 v buňkách BEAS-2B byla inhibována z asi 60 % při 4 hodinách (350 +/- 51 až 117 +/- pg/ml pro HRV-14 a 1857 +/- 58 až 670 +/- 64 pg/ml pro HRV-1A, n = 3, p < 0,05). Mimoto NONOát inhiboval titry viru v supernatantech sebraných při 24 hodinách z buněk BEAS-2B po infekci s HRV-14 (údaje nejsou ukázané). Schopnost NONOátu inhibovat produkci cytokinů indukovanou rhinovirem se také pozorovala v primárních lidských buňkách.
V jednom pokusu 1 mM NONOátu redukovalo virově indukované hladiny IL-8, měřené 4 hodiny po infekci, z 1400 pg/ml na 366 pg/ml, zatímco ve druhém pokusu IL-8 byl redukován z hladin 3420 pg/ml v buňkách infikovaných virem na 1980 pg/ml s 0,5 mM a 1 mM NONOátu.
Aby se dále prozkoumaly účinky NONOátu, provedly se další pokusy, při kterých se NONOát přidával jen během nebo po infekci virem. Obr. 8 ukazuje, že NONOát přítomný jen během expozice viru, nebo jen po infekci virem, inhiboval produkci IL-8 a IL-6 z 50-60 %. Úplná inhibice produkce proteinu se pozorovala, pokud NONOát byl přítomný jak během, tak po expozici viru.
Aby se zjistilo, zda pozorovaná inhibice byla specificky způsobena oxidem dusnatým, provedly se pokusy s aktivním NONOátem a s NONOátem, který už uvolnil všechen dostupný NO. Obr. 8 ukazuje, že neaktivní sloučenina neinhibovala produkci IL-8.
• · 9 9 9 9 • 9
Účinek NONOátu na produkci cytokinu a na replikaci viru
NONOát se připravil v alkalickém roztoku ( 0,01 M NaOH) jako 100 mM zásobní roztok, který se před použitím udržoval při 4 °C. Pro každý pokus se připravily nové zásobní roztoky NONOátu a použily se během 1 hodiny po přípravě. Definovaný poločas uvolňování NO z NONOátu je 76 minut při pH 7,4 a 22 °C Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Za alkalických podmínek NONOát neuvolňuje oxid dusnatý. Alikvotní podíly alkalického zásobního roztoku se přidávaly přímo ke kultivačnímu mediu BEAS-2B (pH 7,4) v rozsahu konečných koncentrací od 0,1 mM do 1 mM. Ve většině pokusů byl NONOát přítomný jak během expozice viru, tak po expozici viru. V některých pokusech se NONOát přidal jen během expozice viru nebo pouze po expozici viru. Supematanty buněk BEAS-2B inkubovaných s NONOátem a bez něj se odstranily v různých dobách po infekci virem a skladovaly se při -70 °C pro pozdější stanovení IL-8 a IL-6 proteinu a obsahu viru. V některých případech RNA extrahovaná v různých dobách po infekci z buněk ošetřených NONOátem a z kontrolních infikovaných buněk se vyhodnocovala Nothem analýzou. Jako kontrola pro nespecifické účinky sloučeniny NONOátu se provedly pokusy, ve kterých se buňky ošetřily neaktivním roztokem NONOátu. Inaktivace se dosáhla umístěním 1 mM roztoku NONOátu v mediu při pH 7,4 při teplotě místnosti na 24 hodin, aby se umožnilo NONOátu uvolnit všechen dostupný NO před jeho přidáním k buněčným kulturám.
Kinetika a mechanismy produkce IL-8 a IL-6 inhibované NONOátem
Aby se prozkoumal časový průběh inhibice NONOátem, studovaly se buňky BEAS-2B v přítomnosti a nepřítomnosti 0,5 mM NONOátu v různých dobách po infekci HRV-16. Inhibiční účinek NONOátu byl nejvýraznější v nejčasnějších časových bodech s 60-70 % snížením hladin proteinu při 1 hodině, 50% při 3 hodinách a 30-40 při 7 hodinách (Obr. 9). Tyto výsledky pravděpodobně odrážení klesající koncentraci oxidu dusnatého v mediu, jak NONOát degradoval. Je zajímavé, že NONOát neměnil hladiny exprese mRNA cytokinu. Jak se ukazuje na Obr. 9 hladiny mRNA pro buňky BEAS-2B infikovaných HRV-16 v přítomnosti a nepřítomnosti NONOátu nebyly významně rozdílné. Existovala tendence, že pro 3 a 7 hodin mRNA z IL-8 byla vyšší u buněk ošetřených NONOátem. V dalších kontrolních studiích samotný NONOát neměl žádný účinek na expresi mRNA pro IL-8 a IL-6, ani neaktivní NONOát neměnil expresi mRNA pro IL-8 a IL-6 indukovanou viry v buňkách BEAS-2B (údaje nejsou ukázané).
Nukleotidové sondy pro Nothem analýzu cDNA pro IL-8 s plnou délkou se získala řetězovou reakcí reversní transkriptasy (RTPCR) s použitím RNA extrahované z lidské buněčné linie BEAS-2B. cDNA s plnou délkou se klonovala do pCRII vektoru (Invitrogen Corp., San Diego, CA) mezi dvě EcoRl místa a rostla v kompetentních E. Coli XLl-Blue buňkách (Stratagene, LaJolla, CA). Pořadí sondy cDNA použitého pro Nothem analýzu bylo identické s uveřejněnou sekvencí IL-8 (31, 34) podle dideoxy sekvencování cDNA s plnou délkou pro IL-6 laskavě poskytl dr. Stevens Gillis (Immunex, Seattle, WA). cDNA s plnou délkou pro dehydrogenázu glyceraldehyd 3-fosfátu (GAPDH) se získala od Clontech (Palo Alto, CA). Vzorky pro IL-8, IL-6 a GAP se označily na vysoce specifickou aktivitu metodou náhodného priméru (15) s použitím -^2P dCTP a označovací soupravy DNA s náhodným primérem (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Nezařazené nukleotidy se oddělily za použití kolon Nuctrap Push (Stratagene).
Extrakce RNA a Nothem analýza
Celková buněčná RNA se extrahovala z buněk BEAS-2B s použitím RNAzol B (1 ml/10 cm^) v modifikaci metody Chomczynski a Saccchi (9). V krátkosti, buněčné monovrstvy se lyžovaly s RNAzol B a přenesly se do 13 ml polypropylenové zkumavky, do které se přidal chloroform (0,1 ml/1 ml RNAzol B). Po ochlazení na ledu se po 5 minutách vzorky odstředily při 7900 x g po 30 minut při 4 °C. Vodná fáze se srážela pře noc se stejným objemem ledově chladného 95% ethanolu při -20 °C. Po opakovaném odstředění se RNA peleta dvakrát promyla 75% ethanolem, sušila se a rozpustila se v 0,050 ml vody s přídavkem 0,2% diethylpyrokarbonátu. Integrita každé RNA se vyhodnotila elektroforézou alikvotního podílu (0,5 pg) na 1% agarosovém gelu s ústojem 0,5 pg ethidium bromidu/ml. RNA se skladovala při 70 °C
Pro Nothem analýzu se elektroforézovaly stejná množství (15-20 pg) RNA z každé experimentální podmínky na gelu 1% agarosa/ 2,2 mol formaldehyd v soustavě Mops ústoje. RNA se přenesla na nylonovou membránu (GeneScreen Plus, New England Nuclear Research Products, Wilmington, DE). Membrány se síťovaly expozicí ultrafialovému světlu a pak se předem hybridizovaly v 10 ml ústoje obsahujícího 4,5 ml formamidu, 2,5 ml 10X Denhartova činidla, 2 ml 20 X SSPE, 1 ml 20% SDS a 0,100 ml denaturované DNA z lososího sperma/ml v hybridizační peci po 2 hodiny při 42 °C. Ihned po předběžné hybridizaci se příslušný vzorek cDNA označený 32p přidal do předhybridizačního roztoku a se otáčela dalších 18 hodiny při 42 °C. Skvrny se promyly na konečný obsah 0,2 x SSD/0,2% SDS při 60 °C a vystavily se na film (Biomax MS, Kodak, New Heawen, CT) s použitím dvou Lightening Plus Screens při -70 °C. Filmy se rutinně vyvolávaly za různé časové úseky, aby se zajistilo, že intenzity pásů zjištěné densitometrií budou v lineární oblasti filmu. Denzitometrie se prováděla s použitím skenovacího denzitometru (dokumentační systém UVP gelu, San Gabriel, CA) a denzitometrická analýza se prováděla s použitím software NIH Image.
Příklad 7
Tento příklad ukazuje účinek NONOátu na eosinofil-aktivní cytokiny při rhinovirové infekci.
Protože zvýšená eosinofilie hraje důležitou úlohu při astmatu, zkoumali jsme účinky NONOátu na viry indukovanou produkci cytokinů, které ovlivňují funkci eosinofilů. Tyto cytokiny zahrnují stimulující faktor granulocytové makrofágové kolonie (GM-CSF) podporuje přežití a zvýrazňuje aktivaci eosinofilů a RANTES, což je silný chemotaktický faktor pro eosinofily, lymfocyty paměti T, monocyty a basofily. Obr. 10 ukazuje hladiny proteinu pro GMCSF a RANTES produkovaných epiteliálními buňkami v přítomnosti a nepřítomnosti NONOátu 24 hodiny po infekci rhinovirem (E1RV-16). Přidání NONOátu významně inhibovalo indukci viru obou cytokinů, což naznačuje, že oxid dusnatý může hrát důležitou úlohu při regulaci produkce eosinofil-aktivujících cytokinů během viry vyvolaných záchvatů astmatu.
Předpokládali jsme, že oxid dusnatý je důležitou částí hostitelské antivirové odpovědi na rhino viry. V nejnovějších studiích jsme zkoumali, zda infekce epitheálních buněk rhino virem mění expresi genu pro indukovatelnou syntházu oxidu dusnatého (iNOS), enzym, který produkuje oxid dusnatý. S použitím RT-PCR jsme vyhodnotili expresi genu pro iNOS v RNA izolované z neinfikovaných a infikovaných s HRV-16 primárních lidských bronchiálních epiteliálních buněk při 24 a 48 hodinách. Jak se ukazuje na Obr. 11, infekce viry indukuje expresi mRNA pro iNOS jak při 24 tak při 48 hodinách po infekci viry. Tyto údaje podporují koncept, že exprese genu pro iNOS se indukuje jako částí hostitelské odpovědi na infekci viry.
Dříve jsme ukázali, že HRV-14 indukuje produkci IL-8 a IL-6 z buněk BEAS-2B (49) a nyní se ukazuje, že jiná hlavní skupina kmenů (HRV-16 a HRV-39) a typ 1A menší skupiny také sdílí tuto schopnost, což naznačuje, že k indukci protizánětlivých cytokinů může docházet u mnoha, pokud ne u všech rhino virů. Už bylo ukázáno, že produkce cytokinů s HRV-14 se může blokovat jak protilátkami na ICAM-1 a UV inaktivací viru (49). Naše probíhající studie nejen ukázaly, že se účinky HRV-16 mohou anulovat UV inaktivací, ale také, že čištěné preparace HRV-16 indukovaly produkci cytokinu. Vzaty vcelku tyto údaje naznačují, že indukce cytokinu je specificky působena virem a nikoliv nějakým znečištěním roztoků zásoby viru. Mimoto • · · · » · . »' ♦ . .· · · «·..
.· * · · · ··· «« .
• * · · · · ····
............ .. ,.
obecná přirozenost této odpovědi naznačuje, že indukce produkce cytokinu z epitheálních buněk může hrát důležitou úlohu v patogenesi horních respiračních virových infekcí u lidí, koncept, který dále podporuje fakt, že jiné viry, jako chřipka a respirační syncytiální virus (RSV) také indukují produkci epitheálního cytokinu před tím, než způsobí otevřenou cytotoxicitu (2, 8, 33, 38).
Význam rozdílů hladin produkce cytokinu každým kmenem je obtížné interpretovat, poněvadž titry kmenů virů byly určeny v řadě rozdílných buněčných liniích a nemusí být srovnatelné. Je však jasné, že kinetika exprese mRNA cytokinu a vylučování proteinu se mezi kmeny rhinoviru měnila. Infekce s HRV-14 vedla k akumulaci mRNA závislé na době pro IL-8 a IL-6 s pozorovanými maximálními hladinami 3 hodiny po infekci a zůstaly zůstávaly zvýšené při 24 hodinách po infekci. Konzistentně s naší dřívější zprávou (49) se produkce proteinu pro každý cytokin zvýšila při 24 hodinách po infekci, ale produkce během druhé 24 hodinové periody nebyla odlišná od kontrolních neinfikovaných buněk (není ukázané). Tento časový průběh produkce proteinu byl podobný pozorovanému s tímto kmenem viru v A549 typu II epiteliálních buněk (55), ačkoliv časový průběh akumulace mRNA se poněkud liší, asi odráží rozdíly těchto dvou buněčných populací. Je zajímavé, že časový průběh exprese mRNA a produkce cytokinů byl rychlejší a velikost odpovědi byla větší u buněk infikovaných HRV-16 než HRV-14. Nejenom že, se maximální hladiny mRNA a proteinu dosáhly mnohem rychleji, ale byly více přechodné, protože byly podstatně úplné během 4 hodin. Jako u HRV-14 produkce cytokinu během druhé 24 hodinové periody po infekci s HRV-16 nebyla odlišná od kontrolních neinfikovaných buněk (není ukázané). Důvody rozdílů počátečních rychlostí produkce IL-8 a IL6 s HRV-16 a HRV-14 jsou neznámé, ale mohou mít vztah k rozdílu v poznávání, příjmu nebo zbavení obalu dvou kmenů viru v buňkách BEAS-2B. Přes rozdílné rychlosti produkce cytokinu, nepozoroval se žádný rozdíl v rychlostech replikace viru mezi oběma kmeny. V každém případě byl virus zjištěný v supernatantech z buněk BEAS-2B 7 hodin po infekci a dosáhl maximální hladiny při 24 hodinách. Druhá 24 hodinový sběr dal titry podobné prvému vzorku při 24 hodinách, což naznačuje, že proliferace a uvolňování viru do kultivačního media probíhaly stálou rychlostí. Přechodná indukce IL-8 a IL-6 oběma kmeny viru v uspořádání kontinuální replikace viru naznačuje, že nějaká časná událost při virové infekci a nikoliv samotná replikace viru stimuluje produkci protizánětlivých cytokinů. Tato rychlá produkce cytokinů podněcuje spekulaci, že tato relativně časná událost při patogenesi nachlazení může být důležitá pro zahájení rychlé filtrace zánětlivých buněk.
Aby se dále osvětlily biochemické mechanismy generace cytokinů indukované viry, prozkoumali jsme účinky vybraných léků na expresi mRNA indukovanou virem a na protein pro *· ···· cytokiny. Inhibitor syntézy proteinů, cykloheximid, neměnil hladiny mRNA pro IL-8, což naznačuje, že de novo syntéza proteinů nebyla nutná pro expresi mRNA indukované rhinovirem. To souhlasí s nejnovějšími pozorováními v A549 buňkách, což naznačuje, že indukce IL-6 s HRV-14 probíhá cestou kB-závislou na jaderném faktoru, která není ovlivněna cykloheximidem (55).
Bylo ukázáno (46,52), že glukokortikosteroidy inhibují produkci řady cytokinů u pacientů s alergickými zánětlivými nemocemi, a také v kultivačních soustavách buněk (45, 48). Vyhodnotili jsme jako první účinky glukokortikoidu na replikaci viru a na expresi mRNA a na produkci proteinu indukovanou IL-8 a IL-6 v epiteliálních buňkách infikovaných rhinovirem. Budenosid neměl žádný účinek na expresi mRNA pro žádný cytokin, ale působil mírnou inhibici hladin vylučovaného proteinu. Tato redukce vylučování proteinu při absenci změn hladin mRNA by mohla odrážet schopnost glukokortikoidů měnit posttranskripční jevy účastnící se produkce nebo sekrece proteinu cytokinů. Dříve se uvádělo, že glukokortikoidy mírně inhibují mRNA IL-8 a produkci proteinu z kultivovaných epiteliálních buněk vystavených cytokinům (27, 30), ale uvádělo se, že dexamethason inhibuje mRNA IL-6 indukovanou TNFa a produkci proteinu z buněk BEAS-2B (30).
Nedostatek účinku budenosidu titry virů a mírná inhibice sekrece IL-8 a IL-6 však odpvídají studiím in vivo experimentálních infekcí rhinovirem, ve kterých glukokortikoidy měly malý nebo žádný účinek na oddělování viru a symptomy (14,17).
Nyní je jasné, že NO může působit široký rozsah akcí tím, že slouží jako vazodilatátor, neurotransmiter, antimikrohiální a imunitní regulátor (39). V nedávných letech se ukázalo, že NO má antivirové vlastnosti v myších buněčných liniích a v myším modelu in vivo. Replikace řady virů, včetně viru vaccinia (20), herpes simplex-1 (12, 24), viru vesicular stomatidis (7), viru Coxsackie (32) a polioviru (26) se inhibovala indukcí syntházy NO, enzymu, který generuje NO, nebo přidáním donoru NO, N-nitroso-l-acetylpenicilaminu. Za předpokladu, že hladiny NO jsou zvýšeny ve vydechovaném vzduchu lidí s infekcemi horního respiračního traktu (25), zkoumalo se, zda by NO mohl inhibovat replikaci rhinovirů a tyto studie se rozšířily, aby se vyhodnotily účinky NO na produkci IL-8 a IL-6 indukovanou rhinovirem. Ačkoliv se ukázalo, že normální lidské respirační epitheliální buňky exprimují jak konstitutivní, tak indukovatelné formy synthasy NO (24), exprese těchto enzymů je výrazně snížená v buněčné linii BEAS-2B (údaje nejsou ukázané). Z tohoto důvodu, aby se zajistila kontrolovaná úroveň expozice NO, použili jsme NONOát, donor, který uvolňuje NO s definovaným poločasem. Naše údaje ukazují za prvé, že NO může inhibovat jak replikaci rhinovirů, tak produkci IL-8 a IL-6 indukovanou rhinovirem v lidských epiteliálních buňkách. Tyto účinky byly závislé na dávce a došlo k nim v nepřítomnosti jakýchkoliv účinků na životnost epiteliálních buněk. Inhibice produkce cytokinů byla zřetelnější při 4 hodinách po infekci než při 24 hodinách po infekci, odlučování viru z epitheálních buněk se také upravilo na normální hladiny během druhé 24 hodinové periody odběru. Tyto údaje se shodují se schopností NONOátu působit inhibici, pouze když je schopný uvolňovat významná množství NO, a ukazují, že jak replikace viru, tak produkce cytokinů znovu začíná, když sloučenina degraduje. Dalším dokladem pro klíčovou úlohu uvolňování NO podávají naše data, že inaktivovaný NONOát neměl žádné účinky na titr viru a produkci cytokinů.
Schopnost NONOátu působit částečnou inhibici produkce cytokinů i když je přítomný pouze po infekční periodě naznačuje, že NONOát neinhibuje přímým zabíjením viru, nebo inhibováním vstupu viru do buněk BEAS-2B. To je také podporováno schopností titrů viru se vzpamatovat po degradaci NONOátu. Spíše se zdá, že NO inhibuje jeden nebo více časných událostí v procesu virové infekce. Selhání NONOátu při inhibici exprese mRNA cytokinů v jakémkoliv prozkoumaném čase naznačuje, že NO může působit post-transkripčním mechanismem, ale jsou nutné další studie, aby se to potvrdilo. Existují však precedenty schopnosti NO inhibovat syntézu proteinu v jiných typech buněk (13, 23).
V souhrnu jsme ukázali, že mnoho kmenů rhinovirů indukuje produkci protizánětlivých cytokinů z lidských respiračních epitheálních buněk, ale že existuje proměnlivost hladin a kinetiky produkce cytokinů různými kmeny. Ačkoliv glukokortikoidy mírně inhibují sekreci cytokinů indukovanou infekcí rhinovirem, nemění expresi mRNA cytokinů nebo replikaci virů. Na rozdíl od toho, NO výrazně inhibuje replikaci rhinovirů a expresi cytokinů indukovanou virově, bez ovlivnění hladin mRNA pro tyto cytokiny. Ačkoliv jsou nutné další studie, aby se osvětlil mechanismus, kterým NO inhibuje replikaci virů a produkci cytokinů, naše údaje naznačují, že topická aplikace donorů NO může zajistit nový terapeutický přístup k léčení nachlazení způsobených rhino virem a jejich komplikací.
·· ···· ·· ·· • · · · • · • · • · ···· ···· • · · · • · · · · • · · · • · · ·
Odkazy na literaturu
1. Akiro, S., T. Birano, T. Taga, and T. Kishimoto.1990. Biology of multifunctional cytokines: IL 6 and related molecules (IL 1 and INF). FASEB J. 4:2860-2867.
2. Arnold, R, B. Humbert, H. Werchau, H. Gallati, and W. K“nig.l994. Interleukin-8, interleukin-6, and soluble tumour necrosis factor receptor type I release from a human pulmonary epithelial cell line (A549) exposed to respirátory syncytial virus. Immunology. 82:126-133.
3. Arola, Μ., T. Ziegler, H. Puhakka, O. P. Lehtonen, and O. Ruuskanen.
1990. Rhinovirus in otitis media with efiusion. Ann. Otol. Rhinol. & Laryngol. 99:451-453.
4. Asano, K., C. Β. E. Chee, B. Gaston, C. M. Lilly, C. Gerard, J. M.
Dražen, and J. S. Stamler.1994. Constitutive and inducible nitric oxide synthase gene expression, regulation, and activity in human lung epithelial cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 91:10089-10093.
5. Baggiolini, M., A. Walz, and S. L. Kunkel.1989. Neutrophil-activating peptide-l/interleukin 8, a novel cytokine that activates neutrophils. J. Clin. Invest. 84:1045-1049.
6. Bardin, P. G., S. L. Johnston, G. Sanderson, S. Robinson, M. A. Pickett,
D. J. Fraenkel, and S. T. Holgate.1994. Detection of rhino virus infection of the nasal mucosa by oligonucleotide in šitu hybridization. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.l0:207-213.
7. Bi, Z., and C. S. Reiss.1995. Inhibition of vesicular stomatitis virus infection by nitric oxide. J. Virol. 69:2208-2213.
8. Choi, A. Μ. K., and D. B. Jacoby.1992. Influenza virus A infection induces interleukin-8 gene expression in human airway epithelial cells. FEBS Lett. 309:327-329.
9. Chomczynski, P., and N. Sacchi.1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159.
>
• ···
9 ··« »·
9 • · • 9
9
9
99
9 9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9
99
10. Churchill, L., F. H. Chilton, J. H. Resau, R Bascom, W. C. Hubbard, and
D. Proud. 1989. Cyclooxygenase metabolism of endogenous arachidonic acid by cultured human tracheal epithelial cells. Am. Rev. Respir. Dis. 140:449-459.
11. Couch, R B.1996. Rhinoviruses, pp. 713-734. In B. N. Fields and D. M.
Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields Virology, 3rd. edition. Lippincott-Raven, Philadelphia.
12. Croen, K. D. 1993. Evidence for an antiviral effect of nitric oxide. Inhibition of herpes simplex virus type 1 replication. J. Clin. Invest. 91:2446-2452.
13. Curran, R D., F. K. Ferrari, P. g, Kispert, J. Stadler, D. J. Stuehr, R L. Simmons, and T. RBilliar.1991. Nitric oxide and nitric oxide-generating compounds inhibit hepatocyte protein synthesis. FASEB J. 5:2085-2092.
14. Farr, B. M., J. M. Gwaltney, Jr., J. O. Hendley, F. G. Hayden, R M.
Nacterio, T. McBride, W. J. Doyle, J. V. Sorrentino, D. K. Riker, and D.
Proud. 1990. A randomized controlled trial of glucocorticoid prophylaxis against experimental rhinovirus infection. J. Infect. Dis. 162:1173-1177.
15. Feinberg, A. P., and B. Vogelstein.1983. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specifíc activity. Anal, Biochem.l32:6-13.
16. Gem, J. E., R Vrtis, E. A. B. Kelly, E. C. Dick, and W. W, Busse.1996.
Rhino virus produces nonspecific activation of lymphocytes through a monocyte-dependent mechanism. J. Immunol.l57:1605-1612.
17. Gustafson, L. M., D. Proud, J O. Hendley, F. G. Hayden, and J. M.
Gwaltney, Jr.1996. Oral prednisone therapy in experimental rhino virus infections. J. Allergy Clin. Immunol. 97:1009-1014.
18. Gwaltney, J M., J. O. Hendley, G. Simon, and W. S. Jordán. 1966.
Rhinovirus infections in an industrial population. I. The occurrence of illness.
N. Engl. J. Med. 275:1261-1268.
19. Gwaltney, J. M., Jr., C. D. Philips, R D. Miller, and D. K. Riker. 1994. Computed tomographic study of the common cold. N. Engl. J. Med. 330:25-30.
φφ «φφφ ·· *« • » · » « · • · · · • · * · · • · * ·« ·····»«· «φ ·· • » » · · • · > · » · φ > * · • « # · « «· φφ
20. Harris, Ν., R Μ. L. Buller, and G. Karupiah.1995. Gamma interferon-induced, nitric oxide-mediated inhibition of vaccinia virus replication. J. Virol. 69:910-915.
21. Johnston, S. L., P. K. Pattemore, G. Sanderson, S. Smith, M. J.
Campbell, L. K. Josephs, A. Cunningham, B. S. Robinson, S. H. Myint,
Μ. E. Ward, D. A. J. Tyrrell, and S. T. Holgate.l996. The relatioship between upper respirátory infections and hospital admissions for asthma: a time-trend analysis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:654-660.
22. Johnston, S. L., P. K. Pattemore, G. Sanderson, S. Smith, F. Lampě, L.
Josephs, P. Sympington, S. O'Toole, S. H. Myint, D. A. Tyrrell, and S. Τ. Holgate.l 995. Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children. Br. Med. J. 310:1225-1228.
23. Karupiah, G., and N. Harris. 1995. Inhibition of viral replication by nitric oxide and its reversal by ferrous sulfáte and tricarboxylic acid cycle metabolites.
J. Exp. Med.l81:2171-2179.
24. Karupiah, G., Q: w. Xie, R M. L. Bulter, C. Nathan, C. Duarte, and J. D. MacMicking.1994. Inhibition of viral replication by interferon-g-induced nitric oxide synthase. Science. 261:1445-1448.
25. Kharitonov, S. A., D. Yates, and P. J. Bames.1995. Increased nitric oxide in exhaled air of normál human subjects with upper respirátory tract infections. Eur. Respir. J. 8:295-297.
26. Komatsu, T., Z. Bi, and C. S. Reiss. 1996. Interferon-g induced type I nitric oxide synthase activity inhibits viral replication in neurons. J. Neuroimmunol. 68:101-108.
27. Kwon, O. J., B. T. Au, P. D. Collins, J. N. Baraniuk, I. M. Adcoctc, K. F.
Chung, and P. J. Bames.1994. Inhibition of interleukin-8 by dexamethasone in human cultured airway epithelial cells. Immunology. 81:389-394
28. Larsen, C. G., A. O. Anderson, E. Appella, J. J. Oppenheim, and K. Matsushima.1989. The neutrophil activating protein (NAP-1) is also chemotactic for T lymphocytes. Science. 243:1464-1466.
I φ ΦΦΦΦ
29. Levandowski, R A., C. W. Weaver, and G. G. Jackson.1988. Nasal secretion leukocyte populations determined by Ilow cytometry during acute rhinovirus infection. J. Med. Virol. 25:423-432.
30. Levine, S. J., P. Lariv,e, C. Logun, C. W. Angus, and J. H. Shelhamer.
1993. Corticosteroids differentially regulate secretion of IL-6, IL-8, and G-CSF by a human epithelial cell line. Am. J. Physiol. 265:L360-L368.
31. Lindley, I., H. Aschauer, J. M. Seifert, C. Lam, W. Brunowsky, E.
Kownatski, M. Thelen, P. Peveri, B. Dewald, V. von Tschamer, A. Walz, and M. Baggiolini. 1988. Synthesis and expression in escherichia coli of the gene encoding monocyte-derived neutrophil-activating factor: biological equivalence between natural and recombinant neutrophil-activating factor.
Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 85:9199-9203.
32. Lowenstein, C. J., S. L. Hill, A. Lafond-Walker, J. Wu, G. Allen, M. Landavere, N. R Rose, and A. Herskowite.1996. Nitric oxide inhibits viral replication in murine myocarditis. J. Clin. Invest. 97:1837-1843.
33. Matsukura, S., F. Kokubo, H. Noda, H. Tokunaga, and M. Adachi. 1996. Expression of IL-6, IL-8, and RAN'TES on human bronchial epithelial cells, NCI-H292, induced by influenza virus A. J. Allergy Clin. Immunol. 98:1080-1087.
34. Matsushima, K., K. Morishita, T. Yoshimura, S. Lávu, Y. Kobayashi, W.
Lew, E. Appella, H. F. Kung, E. J. Leonard, and J. J. Oppenheim.1988. Molecular cloning of a human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (NmNCF) and the induction of lVmNCF by interleukin 1 and tumor necrosis factor. J. Exp. Med.l67:1883-1893.
McHardy, V. U., J. M. Ingtis, M. A. Calder, J. W. Crofton, I. Gregg, D.
A. Ryland, P. Taylor, M. Chadwick, D. Coombs, and R W. Riddell.1980.
A study of infective and other factors in exacerbations of chronic bronchitis. Br. J. Dis. Chest. 74:228-238.
35.
• · • · ·» • · « · • · · ·
«) · · · · • · · · • · · ·
36. Naclerio, R M., D. Proud, L. M. Lichtenstein, A. Kagey-Sobotka, J. O. Hendley, J. Sorrentino, and J. M. Gwaltney.1988. Kinins are generated during experimental rhinovirus colds. J. Infect. Dis.l57:133-142.
37. Nicholson, K. G., J. Kent, and D. C. Ireland. 1993. Respirátory viruses and exacerbations of asthma in adults. Br. Med. J. 307:982-986.
38. Noah, T. L., and S. Becker.1993. Respirátory syncytial virus-induced cytokine production by a human bronchial epithelial cell line. Am. J. Physiol. 265:L472-L478.
39. Nussler, A. K., and T. R Biltiar.1993. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase. J. Leukocyte Biol. 54:171-178.
40. Proud, D., J. M. Gwaltney, Jr., J. O. Hendtey, C. A. Dinaretlo, S. Gillis, and R P. Schteimer. 1994. Increased levels of interleukin-1 are detected in nasal secretions of volunteers during experimental rhinovirus colds. J. Infect. Dis.l69:1007-1013.
41. Proud, D., RM. Naclerio, J. M. Gwaltney, and J. O. Hendley.1990.
Kinins are generated in nasal secretions during natural rhinoviros colds. J. Infect. Dis. 161:120-123.
42. Ramsay, A. J., A. J. Hirsband, I. A. Ramshaw, S. Bao, K. I. Matthaei, G. Koehler, and M. Kopf.1994. The role of interleukin-6 in mucosal IgA antibody responses in vivo. Science. 264:561-563.
43. Reddel, R R, Y. Ke, Β. I. Gerwin, M. G. McMenamin, J. F. Lechner, R T. Su, D. E. Brash, J.-B. Park, J. S. Rhim, and C. C. Harris.1988.
Transformation of human bronchiat epithelial cells by infection with SV4O or adenovirus-12 SV4O hybrid virus, or transfection via strontium phosphate coprecipitation with a plasmid contair-ng SV4O early region genes. Cancer Res. 48:1904-1909.
44. Schleimer, R P. 1993. Glucocorticosteroids: their mechar-sm of action and use in allergic diseases, p. pp. 893-925. In E. Middleton and C. E. Reed and E.
F. Ellis and N. F. Adkinson, Jr. and J. W. Yunginger and W. W. Busse (ed.), Allergy: Principles and Practice, 4th. ed. Mosby, St. Loius.
• · · · • · · · ···· • · · · « · · · • · · · • · · · ♦ * · *
45. Schwiebert; L. A., L. A. Beck, C. Stellato, C. A. Bickel, B. S. Bochner, and R P. Schleimer. 1996. Glucocorticosteroid inhibition of cytokine production; relevance to antiallergic actions. J. Allergy Clin. Immunol. 97:143-152.
46. Sim, T. C., L. M. Reece, K. A. Hitsmeier, J. A. Grant, and R Alam.1995. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152:927-933.
47. Steel, R G. D., and J. H. Torrie. 1980. Principles and Procedures of Statistics, a Biometrical Approach, 2nd ed. McGraw-Hill, New York.
48. Stellato, C., L. A. Beck, G. A. Gorgone, D. Proud, T. J. Schall, S. J. Ono,
L. M. Lichtenstein, and R P. Schleimer. 1995. Expression of the chemokine RANZ'ES by a human bronchial epithelial cell iine. Modulation by cytokines and glucocorticoids. J. Immunol,155:410-418.
49. Subauste, M. C., D. B. Jacoby, S. M. Richards, and D. Proud. 1995.
Infection of a human respirátory epithelial cell line with rhino virus. Induction of cytokine release and modulation of susceptibility to infection by cytokine exposure. J. Clin. Invest. 96:549-557.
50. Turner, B. W., W. S. Cail, J. O. Hendley, F. G. Hayden, W. J. Doyle, J. V. Sorrentino, and J. M. Gwaltney, Jr.1992. Physiologic abnormalities ofthe paranasal sinuses during experimental rhinovirus colds. J. Allergy Clin.
Immunol. 90:474-478.
51. Turner, R B., J. O. Hendtey, and J. M. Gwaltney, Jr.1982. Shedding of infected epithelial cells in rhinovirus colds. J. Infect. Dis. 145:849-853.
52. Wang, J. H., C. J. Trigg, J. L. Devalia, S. Jordán, and R J. Davies.1994.
Effect of inhaled beclomethasone dipropionate on expression of proinflammatory cytokines and activated eosinophils in the bronchial epithelium of patients with mild asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 94:102S-1034.
53. Winther, B., S. Brofeldt, B. Christensen, and N. Mygind.1984. Light and scanning electron microscopy of nasal biopsy materiál from patients with naturally acquired common colds. Acta. Otolazyngol. (Stockh). 97:309-318.
54. Winther, Β., B. Farr, R B. Turner, J. O. gendley, J. M. Gwaltney, Jr., and N. Mygind.1984. Histopathologic examination and enumeration of polymorphonuclear leukocytes in the nasal mucosa during experimental rhinovirus colds. Acta. Otolaryngol. Suppl. (Stockh). 413:19-24.
55. Zhu, Z., W. Tang, A. Ray, Y. Wu, O. Einarsson, M. L. Landry, J. M. Gwaltney, Jr., and J. A. Elias.1996. Rhinovirus stimulation of interleukin-6 in vivo and in vitro. Evidence for nuclear factor kB-dependent transcriptional activation. J. Clin. Invest. 97:421-430.
Claims (31)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití sloučeniny uvolňující oxid dusnatý pro výrobu léčiva pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí, přičemž se sloučenina uvolňující oxid dusnatý podává v účinném množství osobě infikované rhinovirem.
- 2. Použití podle nároku 1, kde symptom způsobený rhinovirovou infekcí je vybrán ze skupiny obsahující obecné nachlazení, astma, sinusitidu, zánět středního ucha, bronchitidu.
- 3. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý jej uvolňuje kontrolovaným způsobem.
- 4. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý jej uvolňuje při patofyziologickém pH.
- 5. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý obsahuje skupinu N2O2'.
- 6. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je 3-(2-hydroxy-2-nitroso1 -propylhy drazino)-1 -propanamin.
- 7. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý se podává nosními kapkami, topicky, inhalací nebo sprejem.
- 8. Použití sloučeniny uvolňující oxid dusnatý pro přípravu léčiva obsahující její dostatečné množství k inhibici replikace rhinoviru v rhinovirem infikovaných lidských epiteliálních buňkách.
- 9. Použití sloučeniny uvolňující oxid dusnatý pro výrobu léčiva obsahující její dostatečné množství k inhibici produkce cytokinů způsobené rhinovirem v rhinovirem infikovaných lidských epiteliálních buňkách.
- 10. Použití podle nároku 9, kde cytokin je vybrán ze skupiny obsahující protizánětlivý cytokin, interleukin-8, interleukin-6.
- 11. Použití podle nároku 8, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý obsahuje skupinu N2O2“.
- 12. Použití podle nároku 8, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je 3-(2-hydroxy-2-nitroso-1 -propylhy drazino)-1 -propanamin.
- 13. Použití podle nároku 9, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý obsahuje skupinu N2O2'.• ·9 9 9 9 ·· 9 9 • · · ·9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 99 9 ·9999 99 9 99 928 ·· .· ·· ··· ·· ···
- 14. Použití podle nároku 9, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je 3-(2-hydroxy-2-nitroso-1 -propylhydrazino)-1 -propanamin.
- 15. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je S-nitroso-1-acetylpenicilamin.
- 16. Použití podle nároku 8, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je S-nitroso-1-acetylpenicilamin.
- 17. Použití podle nároku 9, vyznačený tím, že sloučenina uvolňující oxid dusnatý je S-nitroso-1 -acetylpenicilamin.
- 18. Použití sloučeniny indukující synthasu oxidu dusnatého v lidských epiteliálních respiračních buňkách pro výrobu léčiva ke zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí.
- 19. Použití sloučeniny indukující synthasu oxidu dusnatého v lidských epiteliálních respiračních buňkách pro výrobu léčiva obsahujícího její účinné množství k inhibici replikace rhinoviru.
- 20. Použití sloučeniny indukující synthasu oxidu dusnatého v lidských epiteliálních respiračních buňkách pro výrobu léčiva obsahujícího její účinné množství k inhibici produkce cytokinů způsobenou rhinovirem.
- 21. Použití podle nároku 18, kde sloučenina indukující synthasu oxidu dusnatého je vybraná ze skupiny obsahující interferon gama, lipopolysacharid.
- 22. Použití podle nároku 19, kde sloučenina indukující synthasu oxidu dusnatého je vybraná ze skupiny obsahující interferon gama, lipopolysacharid.
- 23. Použití podle nároku 20, kde sloučenina indukující synthasu oxidu dusnatého je vybraná ze skupiny obsahující interferon gama, lipopolysacharid.
- 24. Způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro terapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry, který zahrnuje:infikování lidských epiteliálních respiračních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství alespoň jednoho protizánětlivého nebo eosinofil-aktivního cytokinu produkovaného v respiračních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství produkovaného cytokinů, je kandidátní látkou pro terapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.
- 25. Způsob podle nároku 24, vyznačený tím, že cytokin je vybrán se skupiny obsahující protizánětlivý cytokin nebo eosinofil-aktivní cytokin.
- 26. Způsob podle nároku 24, vyznačený tím, že krok styku buněk se provádí před krokem infekce.
- 27. Způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro terapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry, který zahrnuje kroky:infikování lidských epiteliálních respiraěních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství rhinovirového genomu replikovaného v respiraěních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství replikovaného rhinovirového genomu, je kandidátní látkou pro terapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.
- 28. Způsob podle nároku 27, vyznačený tím, že krok styku se provádí před krokem infekce.
- 29. Farmaceutické kompozice pro léčení rhinovirových infekcí, vyznačená tím, že obsahuje kapalnou formulaci obsahující sloučeninu uvolňující oxid dusnatý kapalnou formulací jsou nosní kapky.
- 30. Nosní sprejová nebo kapací láhev pro podávání farmaceutické kompozice do nosu osoby, vyznačená tím, že obsahuje kapalnou formulaci, která obsahuje sloučeninu uvolňující oxid dusnatý.
- 31. Inhalátor nebo zamlžovač pro dodávání antirhinovirové kompozice do lidského respiračního traktu, vyznačený tím, že obsahuje kapalnou formulaci, která obsahuje sloučeninu uvolňující oxid dusnatý.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5230797P | 1997-07-11 | 1997-07-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ200092A3 true CZ200092A3 (en) | 2001-05-16 |
Family
ID=21976738
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ200092A CZ200092A3 (en) | 1997-07-11 | 1998-07-10 | Nitrogen oxide intended for inhibition of rhinovirus infection |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6277891B1 (cs) |
EP (1) | EP1011657A1 (cs) |
JP (1) | JP2001509481A (cs) |
KR (1) | KR20010021749A (cs) |
CN (1) | CN1277552A (cs) |
AU (1) | AU8399098A (cs) |
BR (1) | BR9811473A (cs) |
CA (1) | CA2303430A1 (cs) |
CZ (1) | CZ200092A3 (cs) |
HU (1) | HUP0002859A2 (cs) |
ID (1) | ID23780A (cs) |
NO (1) | NO20000151L (cs) |
TR (1) | TR200000157T2 (cs) |
WO (1) | WO1999002148A1 (cs) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR030753A1 (es) * | 2000-09-25 | 2003-09-03 | Smithkline Beecham Corp | Uso de moduladores-proteina de il-8, groalfa, grobeta, grogamma, nap-2, y ena-78, para tratar infecciones viricas |
GB0125222D0 (en) * | 2001-10-19 | 2001-12-12 | Barts & London Nhs Trust | Composition for the treatment of microbial infections |
DE10303196A1 (de) * | 2003-01-28 | 2004-08-12 | Märtz, Hans Helmut | Verwendung von Erzeugnissen, Stoffen oder Stoffgemischen, aus welchen im menschlichen oder tierischen Körper Stickoxid (Formel: NO) entsteht, zur Behandlung oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten des menschlichen oder tierischen Körpers |
SE0300971D0 (sv) * | 2003-04-03 | 2003-04-03 | Aga Ab | Nitric oxide in treatment of inflammation |
WO2005007173A1 (en) | 2003-07-09 | 2005-01-27 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health | Use of nitrite salts for the treatment of cardiovascular conditions |
US8252591B2 (en) | 2004-05-07 | 2012-08-28 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Hormone responsive tissue culture system and uses thereof |
US7362274B1 (en) * | 2004-07-09 | 2008-04-22 | Huan-Cheng Lien | Coupled feed-in butterfly shaped left/right hand circularly polarized microstrip antenna |
US8557300B2 (en) * | 2005-05-19 | 2013-10-15 | University Of Cincinnati | Methods for treating bacterial respiratory tract infections in an individual using acidified nitrite |
GB0607402D0 (en) | 2006-04-12 | 2006-05-24 | Barts & London Nhs Trust | Therapeutic composition and use |
EP2188367A4 (en) | 2007-08-10 | 2010-10-27 | Whitehead Biomedical Inst | HORMONE REACTIVE TISSUE CULTURE SYSTEM, AND USES THEREOF |
EP2237788A4 (en) * | 2007-12-27 | 2013-06-05 | Aires Pharmaceuticals Inc | COMPOUNDS FOR OBTAINING AEROSOLIZED NITRITE AND NITRIC OXIDE AND USES THEREOF |
PL2276505T3 (pl) * | 2008-03-20 | 2014-01-31 | Karobio Ab | Sprej do nosa lub krople do nosa do leczenia przeziębienia |
EP3645010A4 (en) * | 2017-06-27 | 2021-03-24 | Ohio State Innovation Foundation | NUCLEOTIDE-BASED THERAPY FOR ASTHMA |
CN109432122A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-03-08 | 罗辉 | No或no供体在制备预防和/或治疗皮肤疾病或黏膜疾病药物中的应用及药物组合物 |
CN109846113A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-06-07 | 南京诺全生物医疗科技有限公司 | 一种可自提供一氧化氮的口鼻卫生用品 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5455279A (en) * | 1991-04-19 | 1995-10-03 | The Children's Medical Center Corporation | Regimen method of mediating neuronal damage using nitroglycerine |
-
1998
- 1998-07-10 CA CA002303430A patent/CA2303430A1/en not_active Abandoned
- 1998-07-10 CN CN98810536A patent/CN1277552A/zh active Pending
- 1998-07-10 KR KR1020007000312A patent/KR20010021749A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-07-10 CZ CZ200092A patent/CZ200092A3/cs unknown
- 1998-07-10 EP EP98934479A patent/EP1011657A1/en not_active Withdrawn
- 1998-07-10 BR BR9811473-5A patent/BR9811473A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-07-10 HU HU0002859A patent/HUP0002859A2/hu unknown
- 1998-07-10 JP JP2000501743A patent/JP2001509481A/ja active Pending
- 1998-07-10 AU AU83990/98A patent/AU8399098A/en not_active Abandoned
- 1998-07-10 WO PCT/US1998/014466 patent/WO1999002148A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-07-10 TR TR2000/00157T patent/TR200000157T2/xx unknown
- 1998-07-10 ID IDW20000272A patent/ID23780A/id unknown
- 1998-07-10 US US09/113,310 patent/US6277891B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-01-11 NO NO20000151A patent/NO20000151L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1011657A1 (en) | 2000-06-28 |
ID23780A (id) | 2000-05-11 |
AU8399098A (en) | 1999-02-08 |
KR20010021749A (ko) | 2001-03-15 |
NO20000151D0 (no) | 2000-01-11 |
JP2001509481A (ja) | 2001-07-24 |
CN1277552A (zh) | 2000-12-20 |
CA2303430A1 (en) | 1999-01-21 |
NO20000151L (no) | 2000-03-09 |
TR200000157T2 (tr) | 2001-06-21 |
HUP0002859A2 (hu) | 2001-01-29 |
WO1999002148A1 (en) | 1999-01-21 |
US6277891B1 (en) | 2001-08-21 |
BR9811473A (pt) | 2001-12-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sanders et al. | Nitric oxide inhibits rhinovirus-induced cytokine production and viral replication in a human respiratory epithelial cell line | |
CZ200092A3 (en) | Nitrogen oxide intended for inhibition of rhinovirus infection | |
US5240694A (en) | Combined antiviral and antimediator treatment of common colds | |
NADEL | Role of Mast Cell and Neutrophil Proteases in Airway Secretion1-3 | |
Kim et al. | Role of NF-κB in cytokine production induced from human airway epithelial cells by rhinovirus infection | |
CN111265500B (zh) | 一种防治covid-19的药物组合物及其制备方法 | |
US9492413B2 (en) | Use of salt of an acetylsalicylic acid for the treatment of viral infections | |
Sanders et al. | Nitric oxide inhibits rhinovirus-induced granulocyte macrophage colony-stimulating factor production in bronchial epithelial cells | |
US12011453B2 (en) | Medicament for prevention or treatment of rhinovirus infection | |
US20230021647A1 (en) | Method of treating a patient infected with a coronavirus and having a baseline level of crp below 150 mg/l | |
Bao et al. | Impact of ozone exposure on the response to glucocorticoid in a mouse model of asthma: involvements of p38 MAPK and MKP-1 | |
CN112220913A (zh) | TFF2蛋白和IFN-κ蛋白联用在治疗新型冠状病毒感染中的应用 | |
CA2793170C (en) | Aerosolized dapsone as a therapy for inflammation of the airway and abnormal mucociliary transport | |
EP4149498A1 (en) | Treatment of complications caused by infections of severe acute respiratory syndrome coronavirus | |
Sansone et al. | Theophylline inhibits the production of nitric oxide by peripheral blood mononuclear cells from patients with asthma | |
Karpel et al. | Mometasone furoate dry powder inhaler: a once-daily inhaled corticosteroid for the treatment of persistent asthma | |
MXPA00000430A (en) | Nitric oxide inhibits rhinovirus infection | |
US6030609A (en) | Method and composition for treating paramyxovirus | |
Cole | Postnatal glucocorticosteroid therapy for treatment and prevention of neonatal chronic lung disease | |
WO2021195883A1 (zh) | TFF2蛋白和IFN-κ蛋白联用在治疗新型冠状病毒感染中的应用 | |
Line | Nitric Oxide Inhibits Rhinovirus-Induced | |
US20240316082A1 (en) | Medicament for prevention or treatment of rhinovirus infection | |
US20230241177A1 (en) | Use of inhaled interferon-beta to treat virus-induced exacerbations in copd patients undergoing treatment with a systemic corticosteroid | |
Toward et al. | Airway function and reactivity, leukocyte influx and nitric oxide after inoculation with parainfluenza-3 virus: effects of dexamethasone or rolipram | |
JP2023525522A (ja) | Covid-19の治療または予防用ペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |