CZ200092A3

CZ200092A3 - Nitrogen oxide intended for inhibition of rhinovirus infection

Info

Publication number: CZ200092A3
Application number: CZ200092A
Authority: CZ
Inventors: Scherer P Sanders; David Proud
Original assignee: Univ Johns Hopkins Med
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2001-05-16
Also published as: KR20010021749A; WO1999002148A1; ID23780A; HUP0002859A2; TR200000157T2; EP1011657A1; BR9811473A; AU8399098A; US6277891B1; CA2303430A1; JP2001509481A; NO20000151D0; NO20000151L; CN1277552A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti virologie. Zejména se týká oblasti lidských rhinovirů.

Dosavadní stav techniky

Rhinovirové infekce jsou hlavní příčinou obecného nachlazení (18), nejčastěji se vyskytující respirační nemoci u lidí. Nejnovější poznatky implikují rhinovirové infekce jako důležitý spouštěcí faktor při vyvolání astmatu (21, 22, 37), chronické bronchitidy (35), sinusitidy (19, 50) a tánět středního ucha (3). Přes vysoké náklady zdravotnické péče spojené s rhino virovými infekcemi, základní proces, kterým virová infekce vede k symptomatologii je málo pochopena.

Epitheální buňky jsou primárním místem rhino virových infekcí (6, 51). Na rozdíl od jiných respiračními viry, jako je chřipka, nezdá se, že by cytotoxické poškození infikovaných epitheálních buněk hrálo roli v patogenesi rhinovirových infekcí, poněvadž se cytotoxicita nepozoruje ani v infikovaných lidských epiteliálních buněčných kulturách (49, ani v nosním slizu infikovaných jedinců (53, 54). Na základě toho se pozornost soustředila na představu, že symptomy mohou vznikat z akce protizánětlivých mediátorů, které se generují jako důsledek rhinovirové infekce. Tuto hypotézu podpořily dvě větve důkazů: 1) Studie jedinců s experimentálně zavedenými nebo přirozeně získanými nachlazeními demonstrovaly zvýšené úrovně řady mediátorů, včetně kininů (36, 41), IL-1 (40) a IL-6 (55) v nosních sekretech během symptomatických rhinovirových infekcí a 2) ukázalo se, že infekce čištěných lidských respiračních epiteliálních buněčných populací rhinovirů indukuje produkci protizánětlivých cytokinů, včetně IL-8, IL/6 a GM-CSF (49, 55), což by mohlo přispívat k patogenesi nemoci. Dosud jsou však specifické biochemické události působící při produkci každého z těchto cytokinů pochopeny neúplně a úloha specifických cytokinů a jiných mediátorů při patogenesi nachlazení se musí určit.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je zabezpečit způsob pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí.

Jiným cílem vynálezu je zajistit způsob snížení replikace rhinovirů.

Ještě dalším cílem je zajistit způsob snížení produkce cytokinů způsobené rhino viry.

φ · · ♦ φ φ φ φ φ φ φ ·· φ · · · · • φ φ φ φ · · · · • φ φ φ φ · · · φ φ φ · φ ········ ···· ···· ·· ·* ·* ··

Ještě dalším cílem vynálezu je zajistit způsob pro screening sloučenin pro identifikaci kandidátních terapeutických nebo profylakčních činidel pro rhinovirovou infekcí.

Tyto a jiné cíle vynálezu se dosahují zajištěním způsobu pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí, který zahrnuje podávání sloučeniny osobě infikované rhinovirem. Sloučenina uvolňuje oxid dusnatý (NO). Podávané množství je dostatečné k zmírnění jednoho nebo více symptomů spojených s infekcí.

Podle ještě jiného hlediska vynálezu je zajištěn způsob snížení replikace rhinovirů stykem lidských epiteliálních buněk, které jsou infikovány rhinovirem, se sloučeninou. Sloučenina uvolňuje NO. Podává se dostatečné množství, aby se inhibovala replikace rhinovirů.

Podle ještě jiného hlediska vynálezu je zajištěn způsob snížení produkce cytokinů způsobené rhinoviry. Způsob zahrnuje podávání sloučeniny osobě infikované rhinovirem. Sloučenina uvolňuje NO. Podávané množství sloučeniny je dostatečné, aby se inhibovalo produkci cytokinů způsobenou rhinovirem.

Jiné provedení vynálezu je způsob pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí. Způsob zahrnuje podávání účinného množství sloučeniny osobě infikované rhinovirem. Sloučenina indukuje syntasu oxidu dusnatého (NOS) v lidských epiteliálních respiračních buňkách, čímž se zmírňují symptomy infekce.

Ještě další provedení vynálezu je zajištěno způsobem pro snížení replikace rhinovirů. Způsob zahrnuje styk lidských epiteliálních respiračních buněk, které jsou infikované, se sloučeninou. Sloučenina indukuje NOS v lidských epiteliálních respiračních buňkách. Sloučenina se podává v množství dostatečném, aby se inhibovalo replikace rhinovirů.

Také jiným hlediskem vynálezu je způsob snížení produkce cytokinů způsobené rhinovirem. Způsob zahrnuje styk lidských epiteliálních buněk, které jsou infikovány rhinovirem, se sloučeninou, která indukuje NOS v lidských epiteliálních respiračních buňkách. Podává se množství, které je účinné, aby inhibovalo produkci cytokinů způsobenou rhinoviry.

Ještě dalším provedením vynálezu je způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro terapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry. Způsob zahrnuje krok infikování lidských epiteliálních respiračních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství alespoň jednoho protizánětlivého nebo eosinofil-aktivního cytokinů produkovaného v respiračních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství ·· · · ·· produkovaného cytokinu, je kandidátní látkou pro therapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.

Jiným hlediskem vynálezu je další způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro therapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry. Způsob zahrnuje krok infikování lidských epiteliálních respiračních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství rhinovirového genomu replikovaného v respiračních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství replikovaného rhinovirového genomu, je kandidátní látkou pro therapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.

Podle dalšího hlediska vynálezu je zabezpečena farmaceutické kompozice pro léčení rhinovirových infekcí. Kompozice obsahuje kapalnou formulaci obsahující sloučeninu, která uvolňuje NO. Kapalnou formulací jsou nosní kapky.

Další provedení vynálezu je nosní sprejová nebo kapací láhev pro podávání farmaceutické kompozice k lidskému nosu. Láhev obsahuje kapalnou formulaci, která uvolňuje NO. Ještě jiným hlediskem vynálezu je inhalátor nebo zamlžovaě pro dodávání antirhinovirové kompozice do lidského respiračního traktu. Zařízení obsahuje kapalnou formulaci, která uvolňuje NO.

Vynález tak zajišťuje obor kompozicemi, zařízeními a způsoby pro léčení rhinovirových infekcí a také způsoby identifikace dalších kandidátních terapeutických nebo profylakčních činidel.

Zjisto se, že lidské rhinoviry indukují produkci protizánětlivých cytokinů z lidských respiračních epiteliálních buněk. Navíc se zjistilo, že oxid dusnatý poznatelně inhibuje replikaci rhinoviru a expresi cytokinů indukovanou viry bez ovlivnění hladin mRNA pro cytokiny. Podávání donorů NO nebo sloučenin indukujících syntházu oxidu dusnatého (NOS) se tedy může použít k dosažení profylaktických a terapeutických cílů. Protože replikace a záněty jsou ovlivněny s NO, takové ošetření vedou ke kratšímu trvání infekce a také k sníženým symptomům.

S výhodou se podávají množství donorů NO nebo sloučenin indukujících NOS, aby se dosáhla významná inhibice symptomů, syntéza protizánětlivých cytokinů, syntéza eosinofilaktivního cytokinu anebo replikace virů. Taková i je alespoň 10%, výhodně alespoň 20%, a postupně více výhodněji alespoň 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 95% nebo 99%. Symptomy, které jsou často spojeny s lidskými rhinoviry zahrnují obecné nachlazení, astma, sinusitidu, zánět

9 4 4 ♦· 4 4 · 4 ·♦ 1 »4·· · · 4 · · 4 • · 4 4 4 444

444 4 444 44

4 4444 4 · 4 »499 9444 44 44 44 <

středního ucha a bronchitidu. Kterékoliv z těchto a z jiných symptomů mohou být ulehčeny nebo inhibovány podle vynálezu.

Způsoby léčení podle vynálezu zahrnují jakýkoliv způsob, kterým aktivní sloučeniny mohou získat přístup k lidským epiteliálním respiračním buňkám. Takové způsoby zahrnují bez omezení: topická aplikace, nosní kapky, inhalace, aerosol, sprej, kloktadlo nebo promytí.

Lze použít sloučeniny, které generují NO in šitu. Takové sloučeniny zahrnují bez omezení nitro glycerin, organické dusičnany, linsidomin, molsidomin, N-acetylpenicilamin, 3morfolinosyndonimin (SIN-1), neuvolňující se deriváty aspirinu, NOC-18, nitroprusid sodný, GEA 3162, GEA 3175, GEA 5171, nicorandil, C87 3754, N-naroxen, S-nitrosogstein, Snitrosoglutathion, FR 144420 a FK409, NOR4, NOC-7, (N(O)NO)-polymery, pirsidomin, 2,2diethyl-l-nitrexylhydrazin, furoxany. Sloučeniny s výhodou zahrnují skupinu N2O2’. Sloučeninou je výhodněji 3-(2-hydroxy-2-nitroso-l-propylhydrazino)-l-propanamin (člen třídy NONOátů). Takové sloučeniny byly známy pro topickou aplikaci k srdeční tkáni v pastách a náplastích. Tyto sloučeniny se mohou aplikovat do nosu, úst, hrdla, průduškek nebo jiné části respirační soustavy. Také se může použít intravenosní podávání a také jako přímá farmakologická injekce. Vhodné dávky budou obecně asi od 0,01 mg do 10 mg na aplikaci, s výhodou 0,1 mg do 5 mg a výhodněji od 1 až 3 mg.

Sloučeniny, které lze použít jako sloučeniny indukující NOS, zahrnují bez omezení interferon gama, TNF-alfa, IL-1 beta a bakteriální lipopolysacharid.

Zařízení pro dodávání kompozic a sloučenin do respiračního traktu mohou být jakékoliv, které se konvenčně používají v oboru pro takové účely. Zahrnují inhalátory, zamlžovače, láhve s nosními kapkami, kapací láhve. Jakákoliv formulace, která je vhodná pro dodávání do nosu, úst, hrdla, průdušek, plic, uší anebo dutin.

Popis výše obecně popisuje vynález. Úplnější pochopení lze získat odkazem na následující specifické příklady, které jsou zde poskytnuty jen pro ilustraci a jsou zamyšleny jako omezení rozsahu vynálezu.

Krátký popis obrázků

Obr. 1: Produkce cytokinů z buněk BEAS-2B 24 hodin po infekci s každým z řady kmenů lidského rhinoviru (HRV). Údaje představují průměr +/- SEM ze tří pokusů. Obr. 1A ukazuje produkci IL-8, zatím co obrázek 1B ukazuje produkci IL-6.

·· ·· · · ·· ·· • · · · · · · ···· • · ··· ···· • · · · · ······ • · · · · · ···· ···· ···· ·· ·· ·· ··

Obr. 2: Časový průběh indukce stálého stavu mRNA hladin a proteinu pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-14. Obr. 2A a 2B ukazují Nothem bloty od každého cytokinů a pro provozní gen, GAPDH. Obrázky 2C a 2D ukazují densitometrické poměry, zatímco obr. 2E a 2F ukazují hladiny proteinu produkované v každém ukázaném časovém bodě. Údaje jsou z reprezentativního pokusu (n = 3).

Obr. 3: Časový průběh indukce stálého stavu mRNA hladin a proteinu pro IL-8 (vlevo) a IL6 (vpravo) z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-16. Obrázky 3 A a 3B ukazují Nothem bloty od každého cytokinů a pro provozní gen, GAPDH. Obr. 3C a 3D ukazují hodnoty průměr +/SEM densitometrických poměrů pro 4 pokusy. Obr. 3E a 3F ukazují hodnoty průměr +/- SEM proteinu produkovaného ve 4 pokusech v každém časovém bodě. Hvězdičky označují významná zvýšení každého parametru vztaženo ke kontrole v čase nula (p < 0,05 v každém případě).

Obr. 4: Cykloheximid nemění stálý stav mRNA hladin pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) měřené 1 hodinu po infekci s HRV-16. Obr. 4A a 4B ukazují reprezentativní Nothem bloty, zatímco obr. 4C a 4D ukazují hodnoty průměr +/- SEM densitometrických poměrů pro 4 pokusy.

Obr. 5: Účinky Budenosidu (107 M) na stálý stav mRNA hladin a protein pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-16. Obr. 5A a 5B ukazují reprezentativní Nothern bloty s použitím mRNA extrahované 1 hodinu po infekci. Obr. 5C a 5D ukazují hodnoty průměr +/- SEM densitometrických poměrů pro 3 pokusy. Obr. 5E a 5F ukazují hodnoty průměr +/- SEM produkované 7 hodin po infekci ve 3 pokusech.

Obr. 6: Inhibice produkce cytokinů NONOátem z buněk BEAS-2B infikovaných s HRV-16. Obr. 6A ukazuje hodnoty průměr +/- SEM ve 4 pokusech produkce IL-8 4 hodiny a 24 hodin po infekci s HRV-168, zatímco obr. 6B ukazuje údaje pro produkci IL-6. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými v stejné době po infekci v nepřítomnosti NONOátu (p < 0,05 v každém případě).

Obr. 7: Na dávce závislá inhibice NONOátem HRV-16 titrů v supematantech BEAS-2B získaných 24 hodin po expozici virům. Údaje představují průměr +/- SEM ze 4 pokusů. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými v nepřítomnosti NONOátu (p < 0,05 v každém případě).

Obr. 8: Srovnání účinků neaktivního NONOátu a aktivního NONOátu přidaných v různých dobách během postupu infekce na produkci cytokinů indukovanou HRV-16 z buněk BEAS-2B. NONOát se použil při konečné koncentraci 1000 μΜ a hladiny proteinu 4 hodiny po infekci. Obr. 8A ukazuje hodnoty průměr +/- SEM pro IL-8 ze 3 pokusů. Obr. 8A ukazuje údaje pro IL·· ···· ·· ·· • · · · • · · · · • · · · ···♦ ···· *· ·♦ »· • · · · · • · · ♦ • · · · · · • · · · · • · ··

6. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými samotným virem (p < 0,05 v každém případě).

Obr. 9: Účinek NONOátu (500 μΜ) na stálý stav mRNA hladin a protein pro IL-8 (vlevo) a IL-6 (vpravo) v různých dobách po infekci s HRV-16. Obrázky 9A a 9B ukazují reprezentativní Nothern bloty od každého cytokinu a pro provozní gen, GAPDH. Obr. 9C a 9D ukazují hodnoty průměr +/- SEM densitometrických poměrů pro 3 pokusy. Obr. 9E a 9F ukazují hodnoty průměr +/- SEM proteinu produkovaného ve 3 pokusech v každém časovém bodě. Hvězdičky označují významnou inhibici ve srovnání s hladinami produkovanými samotným virem (p < 0,05 v každém případě).

Obr. 10: Účinek NONOátu (500 mikromolů) na produkci GM-CSF (vlevo) a RANTES (vpravo) z buněk BEAS-2B 24 hodiny po infekci s HRV-16. Údaje představují průměr +/- SEM ze 4 pokusů.

Obr. 11: HRV infekce lidských bronchiálních epiteliálních buněk indukuje expresi mRNA pro iNOS. Buňky se vystavily samotnému mediu (sloupce 2 a 4) nebo HRV-16 (sloupce 3 a 5). Celková buněčná RNA se extrahovala a podrobila se RT-PCR na iNOS při 24 hodin (sloupce 2 a 3) a při 48 hodin (sloupce 4 a 5). Pro tuto PCR se použily priméry k amplifikaci na produkt s 500 bp. Sloupec 1 obsahuje DNA sloupec k ukázání velikosti molekuly.

Příklady provedení vynálezu

Byly provedeny následující studie, aby se dále vymezila kinetika a mechanismy produkce cytokinů způsobené rhinoviry v epiteliálních buňkách a pro vyhodnocení účinků možných terapeutických zásahů na těchto cestách. Kladl se důraz na virovou produkci IL-8 a IL-6, protože tyto cytokiny jsou produkované v relativně velkých množstvích a mají biologické vlastnosti, které jsou zajímavé s ohledem na patogenesi nachlazení. IL-8 je silný chemoatraktant a aktivátor neutrofilů (5) a také má chemotaktickou aktivitu pro lymfocyty (28), dva dominantní buněčné typy v nosní mukose během rhinovirových infekcí (29, 54). IL-6 je nejen schopný stimulovat aktivaci T buněk, indukováním diferenciace B buněk a produkcí protilátek (1), ale také stimuluje mukózní IgA immuní odpovědi (42). Na základě šikých rozsahů immunomodulatomích a protizánětlivých účinků glukokortikoidů (44), včetně jejich schopnosti inhibovat produkci řady cytokinů v rozmanitých buněčných typech (45), vyzkoušeli jsme účinky silného glukokortikoidu, budesonidu na rhinovirovou infekci epiteliálních buněk. Jako nový alternativní přístup jsme také prozkoumali schopnost donoru oxidu dusnatého inhibovat replikaci virů a viry indukovanou produkci cytokinů v epiteliálních buňkách. Studie ukázaly, že vasodilatomí oxid dusnatý (NO) •4 ···· ·· ·« • · · · · · • · · · • · · · · • · · · ········ ·« ·* ·· • · · · · • · · » « • · · · · » • · · · · · ·· ·« ·· může vykonávat modulační účinky na záněty (39) a ukázalo se, že oxid dusnatý má antivirové účinky v některých zvířecích modelech (7, 12, 20, 24, 32), avšak tato vlastnost se nevyzkoušela na lidských respiračních epiteliálních buňkách. Naše studie ukazují, že budesonid mírně inhibuje tvorbu cytokinů indukovanou rhinoviry bez ovlivnění replikace virů. Naopak, NO značně inhibuje tvorbu cytokinů indukovanou rhinoviry a také replikaci virů a může hrát terapeutickou úlohu při rhinovirových infekcích.

Příklad 1

Účinky pasažování buněk

Předběžné studie naznačily výrazný účinek opakovaného pasažování buněk na produkci cytokinů z buněk BEAS-2B. Ačkoliv získané údaje byly vždy kvalitativně identické pro každé pasážování, existoval progresivní účinek pasážování buněk na absolutní hladiny produkovaných cytokinů. Například ve čtyřech pokusech, provedených s použitím identického postupu s opakovaným pasážováním buněk, produkce IL-8 se snížila z 7690 pg/ml na 3090 pg/ml. Z tohoto důvodu se každý typ pokusu provedený níže se vždy prováděl ve shodných pokusech s použitím pasážování stejných buněk.

Srovnání účinků řady kmenů rhinovirů na produkci cytokinů z buněk BEAS-2B

Účinky na produkci cytokinů ve stejných účinných dávkách čtyř různých kmenů rhinovirů se srovnávaly v kulturách buněk BEAS-2B. Tři použité kmeny, typy 14, 16 a 39 jsou členy hlavní skupiny rhinovirů, které používají mezibuněčnou adhesní molekulu-1 (ICAM-l) jako svého receptoru, zatímco typ 1A je člen menší skupiny nezávislé na ICAM-1. Všechny tyto kmeny indukovaly produkci IL-8 a IL-6, měřenou 24 hodiny po infekci (Obr. 10). U všech kmenů virů byly generované hladiny IL-8 přibližně 10-krát vyšší než u IL-6.

Materiály

Získala se následující činidla: Dullbeccovo minimální nezbytné medium (DMEM), Eaglovo minimální nezbytné medium (EMEM), Hamovo F-12 medium, HBSS, L-glutamin, penicilin/streptomycin/fungizon, stopové prvky a kyselina retinová (Biofluids, Rockville, MD), hydrokortizon, růstový faktor epiteliálních buněk, růstový doplněk endotheliálních buněk (Collaborative Research, Bedford, MA), hovězí sérum plodu (Genini Bio Products, lne., Calabasa, CA), transferrin a insulin (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 3-(2-hydroxy-2-nitroso-lpropylhydrazino)-l-propanamin (NONOát) od Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI), RNAzoI™B (Tel-Test, lne., Friendswood, TX), agaróza (Bioproducts, Rockland, ME), Mops »4 *4 444» »444 · » · 4 4 4 4

Ο «4*4 4 4444

O 4 4··· * 4 I 4 β 4 • · · · 4 4 4 4 4 4

4444 ···« *4 44 44 44 (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) a alfa ^p.^CTP (Amersham, Arlington Heights, IL). Všechny ostatní chemikálie se získaly od Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Budesonid byl získán laskavostí dr. Per Anderssona a dr. Ralph Brattsanda (Astra Pharmaceutical Production, Lund, Sweden).

Použily se následující zásobní ústoje: 10X Mops (0,2 M Mops, 0,05 M octan sodný, 0,01 M EDTA, 50X Denhartův (1% ficoll, 1% polyvinylpyrrolidin, 1% albumin z hovězího séra) a 20X SSPE (175,3 g NaCl, 27,6 g NaH₂PO₄.H₂O, 7,4 g EDTA v 1 litru H₂O, pH 7,4).

Viry a buněčné linie

Typy lidského rhinoviru 14 (HRV-14), 16 (HRV-16), 39 (HRV-39) a 1A (HRV-1A) a buňky HeLa se získaly American Type Culture Collection (Rockville, MD). Další zásoby virů HRV-14 a HRV-16 se generovaly pasážováním v HeLa nebo WI-38 buňkách, jak se popisovalo výše (49). Nebylo možné generovat ekvivalentní zásoby těchto dvou virových kmenů s použitím stejné hostitelské buněčné linie, protože tyto dva kmeny vykazovaly vyznačené výhody v termínech schopnosti infikovat a replikovat v těchto buněčných liniích. Tato proměnná citlivost hostitelských buněk k různým kmenům rhinoviru se doložila dříve (11). HRV-16 se čistil pro některé pokusy, aby se odstranily ribosomy a rozpustné faktory pocházející z WI-38 centrifugací v sacharose podle publikovaných metod (16). Inaktivace HRV-16 se provedla expozicí UV na 30 minut, jak se popisovalo dříve (49). Pro pokusy užívající HRV-39 a 1A se použily přímo zásoby virů, jak se získaly od dodavatele. Dodaná zásoba HRV-16 se připravila v WI-38 buňkách, zatímco dodaná zásoba HRV-1A se generovala v HELa buňkách. Buněčná linie BEAS-2B (43) byla získána laskavostí dr. Curtis Harrise (National Cancer Institute, Bethesda, MD).

Kultura epiteliálních buněk

Primární lidské tracheální epiteliální buňky se získaly štěpením lidské tkáně proteázou, jak se popisovalo dříve (10). Jak primární buňky, tak BEAS-2B buňky rostly v kultivačním mediu složeném z Hamova F-12 výživného media s penicilinem (100 U/ml), streptomycinem (100 U/ml), fungizonem (250 ng/ml), L-glutaminem (2 mM), fosfoethanolamin/ethanolaminem (0,5 mM), transferrinem (0,010 mg/ml), doplňkem endotheliálních buněk (0,00375 mg/ml), epidermálním růstovým faktorem (12,5 ng/ml), insulinem (0,005 mg/ml), hydrokortizonem (10'? M), toxinem cholery 10 ng/ml), 3,3',5-triodothyroninem (3 x 109 Μχ kyselinou retinovou (0,1 ng/ml) a stopovými prvky. Toto medium se následovně uvádí jako F12/10X. Buňky se inkubovaly při 37 °C v 95% vzduchu a 5% CO₂. Pro tyto pokusy se buňky mezi pasážováním 35

• · ·· ·· ···· • · · · · · · η ··«·· y ······ • · · · · · ···· ···· «· a 50 daly na desky s 6 jamkami nebo na75 cm^ misky (Costar, Cambridge, MA) při hustotě 2,5 10⁴ buněk/cmÁ

Virová infekce buněk BEAS-2B

Monovrstvy buněk BEAS-2B (70-80% souvislý nárůst) se třikrát promyly s HBSS. Rhinoviry (kmeny 14, 16, 39 a 1A) se přidaly k buňkám při koncentraci 10⁴ TCID5Q jednotek/ml HBSS. To odpovídí infekční dávce 0,01 TCID50 jednotek/buňka BEAS-2B, ačkoliv není jasné, co toto představuje ve vztahu k multiplicitě infekce (MOI - infekční jednotky na buňku) pro buňky BEAS-2B, poněvadž schopnost rhinoviru infikovat různé hostitelské buňky je dost proměnná (viz výše). Buňky se inkubovaly při 34 °C 1 hodinu, třikrát se promyly s F12/10X a pak se přidalo čerstvé F12/10X mediu k buňkám. Z buněk se supematanty odstranily v různých dobách po infekci a skladovaly se při -80 °C pro pozdější analýzu produkce proteinu cytokinu a obsah viru. V některých pokusech se extrahovala z buněk celková buněčná RNA v různých dobách po infekci a skladovala se při -80 °C pro pozdější analýzu.

Kvantifikace IL-8 a IL-6

Hladiny cytokinů v supematantech buněk se stanovily s použitím specifických ELIS A testů. Měření IL-8 se prováděly s použitím dříve popsané ELISA, citlivé na 30 pg/ml cytokinu (49), zatímco hladiny IL-6 se testovaly s použitím komerční soupravy citlivé na 15 pg IL-6/ml (Biosource International, Camarillo, CA). Ani kultivační medium, ani vehikly pro léky použité v našich pokusech nepůsobily žádné nespecifické rušivé účinky v obou testech.

Statistická analýza

Údaje se vyjadřují jako průměr +/- SEM. Srovnání kinetiky exprese RNA, vylučování proteinu a titry viru se prováděly s použitím jednocestné ANOVA. Účinky cykloheximidu a glukokortikoidu na expresi RNA se srovnávaly za použití Studentova t-testu pro párové vzorky. Srovnání účinků NONOátu na tvorbu cytokinu, titry viru a na expresi RNA se prováděly s dvojcestnou ANOVA s jedním opakovaným měřením, s výjimkou pokusů srovnávajících aktivní a neaktivní NONOát, které se analyzovaly jednocestnou ANOVA. Když se získaly významné variační poměry, prováděly se párová srovnání průměrů s použitím Testu nejméně významné diference s mnohonásobným rozsahem (47). Diference se považovaly za významné pro hodnoty p < 0,05.

ΦΦΦΦ • · · * • · φ · • · ♦ φ · • · · · 9 • · · Φ

Příklad 2

Kinetiky exprese RNA a vylučování proteinu

Obr. 2 ukazuje, že mRNA pro IL-8 a IL-6 byly významně zvýšené během 1 hodiny po infekci HRV-14. K maximální expresi došlo při hodině 3, avšak mRNA hladiny byly ještě vyšší než neinfikované kontroly 24 hodin po infekci. Indukce mRNA byla následovaná významnými zvýšeními IL-8 a IL-6 proteinů v supematantech. Ke zvýšené produkci cytokinu došlo 3 hodiny po infekci a dosáhlo maximální koncentrace při 24 hodinách. Je zajímavé, že časový průběh produkce IL-8 a IL-6 po infekci HRV-16 byl rychlejší, než se pozorovalo u HRV-14 (Obr. 3). K maximální expresi mRNA došlo během 1 hodiny po infekci a k maximální produkci proteinu došlo během 7 hodin. Ve shodě s údaji ukázanými výše (Obr. 1), velikost tvorby cytokinu byla asi 4-krát větší po infekci HRV-14 (Obr. 3 proti Obr. 2). Poněvadž HRV-16 umožňoval rychlejší a robustnější produkci cytokinů a je kmenem, který se bude používat v pozdějších studiích in vivo, následující experimenty s mechanismem generace cytokinu indukovaná virem se prováděly za použití HRV-16. Aby se potvrdila specifita účinků HRV-16, provedly se tři uspořádané pokusy srovnávající generaci IL-8 aktivními a UV desaktivovánými preparacemi viru. Aktivní virus generoval 3307 +/- 1156 pg/ml IL-8, zatímco UV desaktivovaný virus produkoval jen 520 +/- 90 pg/ml (kontrolní neinfikované buňky produkovaly 345 +/- 110 pg/ml). Specifita se dále potvrdila demonstrováním, že podobná množství IL-8 se generovala v uspořádaných pokusech, kdy se buňky infikovaly naší standardní preparací viru nebo stejnou infekční dávkou stejného zásobního HRV-16 čištěného hustotní centrifugací v sacharose (2080 +/- 340 pg/ml a 1750 +/500 pg/ml, n = 3). Časový průběh virové indukce IL-8 a IL-6 byl také totožný se standardními a čištěnými preparacemi HRV-16 (není ukázáno).

Příklad 3

Titry viru po infekci s HRV-16

Odebíraly se supematanty v různých dobách po infekci a testovaly se na titry viru v testech cytotoxicity v buňkách WI-38 na HRV-16. Virus se detekoval v kultivačním mediu počínaje asi 7 hodin po infekci a postupně se zvyšoval mezi 7 hodinami a 24 hodinami po infekci (Tabulka 1). Supematanty odebrané během druhé 24 hodinové periody po infekci obsahovaly hladiny viru podobné těm, které se pozorovaly po 24 hodinách (viz Tabulku 2 níže). Tento vzor titrů viru je téměř shodný s dříve pozorovaným u HRV-14 (49).

• · • · • · · · * « · · 1 ♦ · · · · I • · · · <

• · · · · ·

Tabulka 1

Obsah viru v kalových vodách z buněk BEAS-2B v různých dobách po infekci lidským rhinovirem-16.

Doba po infekci Titr viru (hodin) (log TCIDgn jednotek)

Přiklad 4

ND

1.25 +/- 0,25

2.25 +/- 0,25 2,4+/-0,13

Údaje představují průměr +/- SEM ze 4 pokusů.

Tabulka 2

Účinky NONOátu na titry viru se snižují s časem.

Titr viru (log TCID50 jednotek)*

Ošetření

HRV-16

HRV-16 + 0,300 mmol NONOátu HRV-16 + 1,000 mmol NONOátu

0-24 hodin 2,8+/-0,1 2,5 +/- 0,3 0,5 +/- 0,5+

24-48 hodin 2,9 +/- 0,1 2,8 +/- 0,1 2,4 +/- 0,2 * Údaje představují průměr +/- SEM ze 3 pokusů. ⁺ p < 0,05 proti samotnému HRV-16.

Účinky cykloheximidu na IL-8 a IL-6 expresi mRNA

Hladiny pro IL-8 a IL-6 z buněk infikovaných HRV-16 ošetřených cykloheximidem (0,010 mg/ml) nebyly rozdílné od infikovaných kontrolních buněk (Obr. 4). Provedla se srovnání 1 hodinu po infekci virem, době vrcholné exprese mRNA v kinetických studiích popsaných výše.

Účinek cykloheximidu na IL-8 a IL-6 expresi mRNA indukovanou HRV-16

Buňky BEAS-2B se ošetřovaly cykloheximidem (0,010 mg/ml) nebo kontrolním mediem po 1 hodinu před infekci virem. Lék byl také přítomný během a po injekci s HRV-16.

• β · · • · · · 0 0 « 9 · 0 φ • · ··· · 0 « « * · ® ♦ · ····«· • · · · 0 · 0 0 0 0 ···· 0000 00 00 «·

Při 1 hodině po infekci se RNA sklidila pro Nothem analýzu. Použila se tato koncentrace cykloheximidu, protože se dříve ukázalo, že inhibuje expresi indukovanou TNFa a IFNg u RANTES mRNA v této buněčné linii (48).

Příklad 5

Účinek předběžného ošetření glykokortikoidem na produkci cytokinů a na titry viru

Buňky se ošetřovaly Budenosidem (1()-7 M) _nebo kontrolním mediem po 24 hodin před infekci virem. Srovnání exprese mRNA a produkce proteinu se provedly v časech maximální odpovědi, jak se stanovila v kinetických pokusech popsaných výše, 1 hodina pro mRNA a 7 hodin pro produkci proteinu cytokinů. Exprese mRNA IL-8 a IL-6 v buňkách BEAS-2B infikovaných budenosidem se významně nezměnila (Obr. 5). V každém pokuse však produkce proteinů IL-8 a IL-6 z buněk BEAS-2B ošetřovaných budenosidem byla nižší než z kontrolních infikovaných buněk (p < 0,05 pro párová srovnání normalizovaných dat). Titry viru (2,2 +/- 0,6 log TCID5Q jednotek) se vystavením budenosidu nezměnily.

Účinek budenosidu na produkci cytokinů a na replikaci viru

Budenosid se připravil jako 10^ M zásobní roztok. Protože buňky BEAS-2B se obvykle udržovaly v růstovém mediu obsahujícím nízké hladiny hydrokortizonu, buňky se pro tyto pokusy daly do media bez hydrokortizonu na 24 hodin před ošetřením glukokortikoidem. Buňky se pak ošetřily Budenosidem (107 M) nebo vhodně zředěným kontrolním vehiklem po 24 hodin před infekci virem. Budenosid se po infekci opět zařadil do media. Koncentrace použitého budenosidu se vybrala, protože se dříve ukázalo, že maximálně inhibuje TNFa indukovanou RANTES produkci z buněk BEAS-2B (48). Supematanty z buněk s budenosidem a bez něj se odstranily v různých dobách po infekci a skladovaly se při -70 °C pro stanovení IL-8 a IL-6 proteinu a obsahu viru. V některých pokusech se použila Nothem analýza, aby se srovnala RNA extrahovaná 1 hodinu po infekci z buněk ošetřených Budenosidem s RNA extrahovanou z kontrolních infikovaných buněk.

Příklad 6

Účinek donoru oxidu dusnatého na produkci cytokinů a na titry viru

Sebraly se supematanty z buněk BEAS-2B 4 a 24 hodin po infekci s HRV-16, inkubovaných v nepřítomnosti nebo v přítomnosti NONOátu a testovaly se na titry viru a hladiny cytokinů. NONOát významně inhiboval produkci IL-8 a IL-6 způsobem závislým na » · · · · · · · · · · • · · * « · · · ·

-- · ·♦·· ···«·· · · ········ ···· ···· ·· ·· · ·· dávce (Obr. 6). Produkce IL-6 byla významně inhibovaná dávkami NONOátu tak nízkými, jak je 0,1 mM. Hladiny vytvořených cytokinů byly více inhibovány při 4 hodinách než při 24 hodinách, asi v důsledku mizících hladin NO při 24 hodinách. Titry viru byly také významně inhibované NONOátem (Obr. 7). Obsah viru v supernatantech sebraných při 24 hodinách byl téměř úplně eliminován 1 mM NONOátu. Supematanty z druhé kolekce při 24 hodinách však obsahovaly podobné množství viru, ať byly buňky ošetřeny NONOátem či nikoliv (Tabulka 2).

V souběžných studiích se hodnotily účinky NONOátu na životnost epitheální buňky při jakékoliv dávce a času. Existovalo malé, ale významné snížení počtu buněk jen s 1 mM NONOátu při 24 hodinách (1,7 +/- 0,4 x 1(Ú buněk na jamku bez NONOátu proti 1,2 +/- 0,4 x 1CÚ buněk na jamku s NONOátem, n - 3, p < 0,05). Žádné takové účinky se nepozorovaly při nižších dávkách NONOátu. Účinky NONOátu se také potvrdily při použití čištěného HRV-16 (není ukázáno).

Inhibiění účinky NONOátu se neomezovaly na HRV-16 infekci. Cytokiny produkované z buněk BEAS-2B infikovaných jiným hlavním kmenem HRV-14 nebo menším kmenem HRV1A byly také významně inhibované NONOátem. V přítomnosti 0,5 mM NONOátu virem indukovaná produkce IL-8 v buňkách BEAS-2B byla inhibována z asi 60 % při 4 hodinách (350 +/- 51 až 117 +/- pg/ml pro HRV-14 a 1857 +/- 58 až 670 +/- 64 pg/ml pro HRV-1A, n = 3, p < 0,05). Mimoto NONOát inhiboval titry viru v supernatantech sebraných při 24 hodinách z buněk BEAS-2B po infekci s HRV-14 (údaje nejsou ukázané). Schopnost NONOátu inhibovat produkci cytokinů indukovanou rhinovirem se také pozorovala v primárních lidských buňkách.

V jednom pokusu 1 mM NONOátu redukovalo virově indukované hladiny IL-8, měřené 4 hodiny po infekci, z 1400 pg/ml na 366 pg/ml, zatímco ve druhém pokusu IL-8 byl redukován z hladin 3420 pg/ml v buňkách infikovaných virem na 1980 pg/ml s 0,5 mM a 1 mM NONOátu.

Aby se dále prozkoumaly účinky NONOátu, provedly se další pokusy, při kterých se NONOát přidával jen během nebo po infekci virem. Obr. 8 ukazuje, že NONOát přítomný jen během expozice viru, nebo jen po infekci virem, inhiboval produkci IL-8 a IL-6 z 50-60 %. Úplná inhibice produkce proteinu se pozorovala, pokud NONOát byl přítomný jak během, tak po expozici viru.

Aby se zjistilo, zda pozorovaná inhibice byla specificky způsobena oxidem dusnatým, provedly se pokusy s aktivním NONOátem a s NONOátem, který už uvolnil všechen dostupný NO. Obr. 8 ukazuje, že neaktivní sloučenina neinhibovala produkci IL-8.

• · 9 9 9 9 • 9

Účinek NONOátu na produkci cytokinu a na replikaci viru

NONOát se připravil v alkalickém roztoku ( 0,01 M NaOH) jako 100 mM zásobní roztok, který se před použitím udržoval při 4 °C. Pro každý pokus se připravily nové zásobní roztoky NONOátu a použily se během 1 hodiny po přípravě. Definovaný poločas uvolňování NO z NONOátu je 76 minut při pH 7,4 a 22 °C Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Za alkalických podmínek NONOát neuvolňuje oxid dusnatý. Alikvotní podíly alkalického zásobního roztoku se přidávaly přímo ke kultivačnímu mediu BEAS-2B (pH 7,4) v rozsahu konečných koncentrací od 0,1 mM do 1 mM. Ve většině pokusů byl NONOát přítomný jak během expozice viru, tak po expozici viru. V některých pokusech se NONOát přidal jen během expozice viru nebo pouze po expozici viru. Supematanty buněk BEAS-2B inkubovaných s NONOátem a bez něj se odstranily v různých dobách po infekci virem a skladovaly se při -70 °C pro pozdější stanovení IL-8 a IL-6 proteinu a obsahu viru. V některých případech RNA extrahovaná v různých dobách po infekci z buněk ošetřených NONOátem a z kontrolních infikovaných buněk se vyhodnocovala Nothem analýzou. Jako kontrola pro nespecifické účinky sloučeniny NONOátu se provedly pokusy, ve kterých se buňky ošetřily neaktivním roztokem NONOátu. Inaktivace se dosáhla umístěním 1 mM roztoku NONOátu v mediu při pH 7,4 při teplotě místnosti na 24 hodin, aby se umožnilo NONOátu uvolnit všechen dostupný NO před jeho přidáním k buněčným kulturám.

Kinetika a mechanismy produkce IL-8 a IL-6 inhibované NONOátem

Aby se prozkoumal časový průběh inhibice NONOátem, studovaly se buňky BEAS-2B v přítomnosti a nepřítomnosti 0,5 mM NONOátu v různých dobách po infekci HRV-16. Inhibiční účinek NONOátu byl nejvýraznější v nejčasnějších časových bodech s 60-70 % snížením hladin proteinu při 1 hodině, 50% při 3 hodinách a 30-40 při 7 hodinách (Obr. 9). Tyto výsledky pravděpodobně odrážení klesající koncentraci oxidu dusnatého v mediu, jak NONOát degradoval. Je zajímavé, že NONOát neměnil hladiny exprese mRNA cytokinu. Jak se ukazuje na Obr. 9 hladiny mRNA pro buňky BEAS-2B infikovaných HRV-16 v přítomnosti a nepřítomnosti NONOátu nebyly významně rozdílné. Existovala tendence, že pro 3 a 7 hodin mRNA z IL-8 byla vyšší u buněk ošetřených NONOátem. V dalších kontrolních studiích samotný NONOát neměl žádný účinek na expresi mRNA pro IL-8 a IL-6, ani neaktivní NONOát neměnil expresi mRNA pro IL-8 a IL-6 indukovanou viry v buňkách BEAS-2B (údaje nejsou ukázané).

Nukleotidové sondy pro Nothem analýzu cDNA pro IL-8 s plnou délkou se získala řetězovou reakcí reversní transkriptasy (RTPCR) s použitím RNA extrahované z lidské buněčné linie BEAS-2B. cDNA s plnou délkou se klonovala do pCRII vektoru (Invitrogen Corp., San Diego, CA) mezi dvě EcoRl místa a rostla v kompetentních E. Coli XLl-Blue buňkách (Stratagene, LaJolla, CA). Pořadí sondy cDNA použitého pro Nothem analýzu bylo identické s uveřejněnou sekvencí IL-8 (31, 34) podle dideoxy sekvencování cDNA s plnou délkou pro IL-6 laskavě poskytl dr. Stevens Gillis (Immunex, Seattle, WA). cDNA s plnou délkou pro dehydrogenázu glyceraldehyd 3-fosfátu (GAPDH) se získala od Clontech (Palo Alto, CA). Vzorky pro IL-8, IL-6 a GAP se označily na vysoce specifickou aktivitu metodou náhodného priméru (15) s použitím -^²P dCTP a označovací soupravy DNA s náhodným primérem (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN). Nezařazené nukleotidy se oddělily za použití kolon Nuctrap Push (Stratagene).

Extrakce RNA a Nothem analýza

Celková buněčná RNA se extrahovala z buněk BEAS-2B s použitím RNAzol B (1 ml/10 cm^) v modifikaci metody Chomczynski a Saccchi (9). V krátkosti, buněčné monovrstvy se lyžovaly s RNAzol B a přenesly se do 13 ml polypropylenové zkumavky, do které se přidal chloroform (0,1 ml/1 ml RNAzol B). Po ochlazení na ledu se po 5 minutách vzorky odstředily při 7900 x g po 30 minut při 4 °C. Vodná fáze se srážela pře noc se stejným objemem ledově chladného 95% ethanolu při -20 °C. Po opakovaném odstředění se RNA peleta dvakrát promyla 75% ethanolem, sušila se a rozpustila se v 0,050 ml vody s přídavkem 0,2% diethylpyrokarbonátu. Integrita každé RNA se vyhodnotila elektroforézou alikvotního podílu (0,5 pg) na 1% agarosovém gelu s ústojem 0,5 pg ethidium bromidu/ml. RNA se skladovala při 70 °C

Pro Nothem analýzu se elektroforézovaly stejná množství (15-20 pg) RNA z každé experimentální podmínky na gelu 1% agarosa/ 2,2 mol formaldehyd v soustavě Mops ústoje. RNA se přenesla na nylonovou membránu (GeneScreen Plus, New England Nuclear Research Products, Wilmington, DE). Membrány se síťovaly expozicí ultrafialovému světlu a pak se předem hybridizovaly v 10 ml ústoje obsahujícího 4,5 ml formamidu, 2,5 ml 10X Denhartova činidla, 2 ml 20 X SSPE, 1 ml 20% SDS a 0,100 ml denaturované DNA z lososího sperma/ml v hybridizační peci po 2 hodiny při 42 °C. Ihned po předběžné hybridizaci se příslušný vzorek cDNA označený 32p přidal do předhybridizačního roztoku a se otáčela dalších 18 hodiny při 42 °C. Skvrny se promyly na konečný obsah 0,2 x SSD/0,2% SDS při 60 °C a vystavily se na film (Biomax MS, Kodak, New Heawen, CT) s použitím dvou Lightening Plus Screens při -70 °C. Filmy se rutinně vyvolávaly za různé časové úseky, aby se zajistilo, že intenzity pásů zjištěné densitometrií budou v lineární oblasti filmu. Denzitometrie se prováděla s použitím skenovacího denzitometru (dokumentační systém UVP gelu, San Gabriel, CA) a denzitometrická analýza se prováděla s použitím software NIH Image.

Příklad 7

Tento příklad ukazuje účinek NONOátu na eosinofil-aktivní cytokiny při rhinovirové infekci.

Protože zvýšená eosinofilie hraje důležitou úlohu při astmatu, zkoumali jsme účinky NONOátu na viry indukovanou produkci cytokinů, které ovlivňují funkci eosinofilů. Tyto cytokiny zahrnují stimulující faktor granulocytové makrofágové kolonie (GM-CSF) podporuje přežití a zvýrazňuje aktivaci eosinofilů a RANTES, což je silný chemotaktický faktor pro eosinofily, lymfocyty paměti T, monocyty a basofily. Obr. 10 ukazuje hladiny proteinu pro GMCSF a RANTES produkovaných epiteliálními buňkami v přítomnosti a nepřítomnosti NONOátu 24 hodiny po infekci rhinovirem (E1RV-16). Přidání NONOátu významně inhibovalo indukci viru obou cytokinů, což naznačuje, že oxid dusnatý může hrát důležitou úlohu při regulaci produkce eosinofil-aktivujících cytokinů během viry vyvolaných záchvatů astmatu.

Předpokládali jsme, že oxid dusnatý je důležitou částí hostitelské antivirové odpovědi na rhino viry. V nejnovějších studiích jsme zkoumali, zda infekce epitheálních buněk rhino virem mění expresi genu pro indukovatelnou syntházu oxidu dusnatého (iNOS), enzym, který produkuje oxid dusnatý. S použitím RT-PCR jsme vyhodnotili expresi genu pro iNOS v RNA izolované z neinfikovaných a infikovaných s HRV-16 primárních lidských bronchiálních epiteliálních buněk při 24 a 48 hodinách. Jak se ukazuje na Obr. 11, infekce viry indukuje expresi mRNA pro iNOS jak při 24 tak při 48 hodinách po infekci viry. Tyto údaje podporují koncept, že exprese genu pro iNOS se indukuje jako částí hostitelské odpovědi na infekci viry.

Dříve jsme ukázali, že HRV-14 indukuje produkci IL-8 a IL-6 z buněk BEAS-2B (49) a nyní se ukazuje, že jiná hlavní skupina kmenů (HRV-16 a HRV-39) a typ 1A menší skupiny také sdílí tuto schopnost, což naznačuje, že k indukci protizánětlivých cytokinů může docházet u mnoha, pokud ne u všech rhino virů. Už bylo ukázáno, že produkce cytokinů s HRV-14 se může blokovat jak protilátkami na ICAM-1 a UV inaktivací viru (49). Naše probíhající studie nejen ukázaly, že se účinky HRV-16 mohou anulovat UV inaktivací, ale také, že čištěné preparace HRV-16 indukovaly produkci cytokinu. Vzaty vcelku tyto údaje naznačují, že indukce cytokinu je specificky působena virem a nikoliv nějakým znečištěním roztoků zásoby viru. Mimoto • · · · » · . »' ♦ . .· · · «·..

.· * · · · ··· «« .

• * · · · · ····

............ .. ,.

obecná přirozenost této odpovědi naznačuje, že indukce produkce cytokinu z epitheálních buněk může hrát důležitou úlohu v patogenesi horních respiračních virových infekcí u lidí, koncept, který dále podporuje fakt, že jiné viry, jako chřipka a respirační syncytiální virus (RSV) také indukují produkci epitheálního cytokinu před tím, než způsobí otevřenou cytotoxicitu (2, 8, 33, 38).

Význam rozdílů hladin produkce cytokinu každým kmenem je obtížné interpretovat, poněvadž titry kmenů virů byly určeny v řadě rozdílných buněčných liniích a nemusí být srovnatelné. Je však jasné, že kinetika exprese mRNA cytokinu a vylučování proteinu se mezi kmeny rhinoviru měnila. Infekce s HRV-14 vedla k akumulaci mRNA závislé na době pro IL-8 a IL-6 s pozorovanými maximálními hladinami 3 hodiny po infekci a zůstaly zůstávaly zvýšené při 24 hodinách po infekci. Konzistentně s naší dřívější zprávou (49) se produkce proteinu pro každý cytokin zvýšila při 24 hodinách po infekci, ale produkce během druhé 24 hodinové periody nebyla odlišná od kontrolních neinfikovaných buněk (není ukázané). Tento časový průběh produkce proteinu byl podobný pozorovanému s tímto kmenem viru v A549 typu II epiteliálních buněk (55), ačkoliv časový průběh akumulace mRNA se poněkud liší, asi odráží rozdíly těchto dvou buněčných populací. Je zajímavé, že časový průběh exprese mRNA a produkce cytokinů byl rychlejší a velikost odpovědi byla větší u buněk infikovaných HRV-16 než HRV-14. Nejenom že, se maximální hladiny mRNA a proteinu dosáhly mnohem rychleji, ale byly více přechodné, protože byly podstatně úplné během 4 hodin. Jako u HRV-14 produkce cytokinu během druhé 24 hodinové periody po infekci s HRV-16 nebyla odlišná od kontrolních neinfikovaných buněk (není ukázané). Důvody rozdílů počátečních rychlostí produkce IL-8 a IL6 s HRV-16 a HRV-14 jsou neznámé, ale mohou mít vztah k rozdílu v poznávání, příjmu nebo zbavení obalu dvou kmenů viru v buňkách BEAS-2B. Přes rozdílné rychlosti produkce cytokinu, nepozoroval se žádný rozdíl v rychlostech replikace viru mezi oběma kmeny. V každém případě byl virus zjištěný v supernatantech z buněk BEAS-2B 7 hodin po infekci a dosáhl maximální hladiny při 24 hodinách. Druhá 24 hodinový sběr dal titry podobné prvému vzorku při 24 hodinách, což naznačuje, že proliferace a uvolňování viru do kultivačního media probíhaly stálou rychlostí. Přechodná indukce IL-8 a IL-6 oběma kmeny viru v uspořádání kontinuální replikace viru naznačuje, že nějaká časná událost při virové infekci a nikoliv samotná replikace viru stimuluje produkci protizánětlivých cytokinů. Tato rychlá produkce cytokinů podněcuje spekulaci, že tato relativně časná událost při patogenesi nachlazení může být důležitá pro zahájení rychlé filtrace zánětlivých buněk.

Aby se dále osvětlily biochemické mechanismy generace cytokinů indukované viry, prozkoumali jsme účinky vybraných léků na expresi mRNA indukovanou virem a na protein pro *· ···· cytokiny. Inhibitor syntézy proteinů, cykloheximid, neměnil hladiny mRNA pro IL-8, což naznačuje, že de novo syntéza proteinů nebyla nutná pro expresi mRNA indukované rhinovirem. To souhlasí s nejnovějšími pozorováními v A549 buňkách, což naznačuje, že indukce IL-6 s HRV-14 probíhá cestou kB-závislou na jaderném faktoru, která není ovlivněna cykloheximidem (55).

Bylo ukázáno (46,52), že glukokortikosteroidy inhibují produkci řady cytokinů u pacientů s alergickými zánětlivými nemocemi, a také v kultivačních soustavách buněk (45, 48). Vyhodnotili jsme jako první účinky glukokortikoidu na replikaci viru a na expresi mRNA a na produkci proteinu indukovanou IL-8 a IL-6 v epiteliálních buňkách infikovaných rhinovirem. Budenosid neměl žádný účinek na expresi mRNA pro žádný cytokin, ale působil mírnou inhibici hladin vylučovaného proteinu. Tato redukce vylučování proteinu při absenci změn hladin mRNA by mohla odrážet schopnost glukokortikoidů měnit posttranskripční jevy účastnící se produkce nebo sekrece proteinu cytokinů. Dříve se uvádělo, že glukokortikoidy mírně inhibují mRNA IL-8 a produkci proteinu z kultivovaných epiteliálních buněk vystavených cytokinům (27, 30), ale uvádělo se, že dexamethason inhibuje mRNA IL-6 indukovanou TNF_a a produkci proteinu z buněk BEAS-2B (30).

Nedostatek účinku budenosidu titry virů a mírná inhibice sekrece IL-8 a IL-6 však odpvídají studiím in vivo experimentálních infekcí rhinovirem, ve kterých glukokortikoidy měly malý nebo žádný účinek na oddělování viru a symptomy (14,17).

Nyní je jasné, že NO může působit široký rozsah akcí tím, že slouží jako vazodilatátor, neurotransmiter, antimikrohiální a imunitní regulátor (39). V nedávných letech se ukázalo, že NO má antivirové vlastnosti v myších buněčných liniích a v myším modelu in vivo. Replikace řady virů, včetně viru vaccinia (20), herpes simplex-1 (12, 24), viru vesicular stomatidis (7), viru Coxsackie (32) a polioviru (26) se inhibovala indukcí syntházy NO, enzymu, který generuje NO, nebo přidáním donoru NO, N-nitroso-l-acetylpenicilaminu. Za předpokladu, že hladiny NO jsou zvýšeny ve vydechovaném vzduchu lidí s infekcemi horního respiračního traktu (25), zkoumalo se, zda by NO mohl inhibovat replikaci rhinovirů a tyto studie se rozšířily, aby se vyhodnotily účinky NO na produkci IL-8 a IL-6 indukovanou rhinovirem. Ačkoliv se ukázalo, že normální lidské respirační epitheliální buňky exprimují jak konstitutivní, tak indukovatelné formy synthasy NO (24), exprese těchto enzymů je výrazně snížená v buněčné linii BEAS-2B (údaje nejsou ukázané). Z tohoto důvodu, aby se zajistila kontrolovaná úroveň expozice NO, použili jsme NONOát, donor, který uvolňuje NO s definovaným poločasem. Naše údaje ukazují za prvé, že NO může inhibovat jak replikaci rhinovirů, tak produkci IL-8 a IL-6 indukovanou rhinovirem v lidských epiteliálních buňkách. Tyto účinky byly závislé na dávce a došlo k nim v nepřítomnosti jakýchkoliv účinků na životnost epiteliálních buněk. Inhibice produkce cytokinů byla zřetelnější při 4 hodinách po infekci než při 24 hodinách po infekci, odlučování viru z epitheálních buněk se také upravilo na normální hladiny během druhé 24 hodinové periody odběru. Tyto údaje se shodují se schopností NONOátu působit inhibici, pouze když je schopný uvolňovat významná množství NO, a ukazují, že jak replikace viru, tak produkce cytokinů znovu začíná, když sloučenina degraduje. Dalším dokladem pro klíčovou úlohu uvolňování NO podávají naše data, že inaktivovaný NONOát neměl žádné účinky na titr viru a produkci cytokinů.

Schopnost NONOátu působit částečnou inhibici produkce cytokinů i když je přítomný pouze po infekční periodě naznačuje, že NONOát neinhibuje přímým zabíjením viru, nebo inhibováním vstupu viru do buněk BEAS-2B. To je také podporováno schopností titrů viru se vzpamatovat po degradaci NONOátu. Spíše se zdá, že NO inhibuje jeden nebo více časných událostí v procesu virové infekce. Selhání NONOátu při inhibici exprese mRNA cytokinů v jakémkoliv prozkoumaném čase naznačuje, že NO může působit post-transkripčním mechanismem, ale jsou nutné další studie, aby se to potvrdilo. Existují však precedenty schopnosti NO inhibovat syntézu proteinu v jiných typech buněk (13, 23).

V souhrnu jsme ukázali, že mnoho kmenů rhinovirů indukuje produkci protizánětlivých cytokinů z lidských respiračních epitheálních buněk, ale že existuje proměnlivost hladin a kinetiky produkce cytokinů různými kmeny. Ačkoliv glukokortikoidy mírně inhibují sekreci cytokinů indukovanou infekcí rhinovirem, nemění expresi mRNA cytokinů nebo replikaci virů. Na rozdíl od toho, NO výrazně inhibuje replikaci rhinovirů a expresi cytokinů indukovanou virově, bez ovlivnění hladin mRNA pro tyto cytokiny. Ačkoliv jsou nutné další studie, aby se osvětlil mechanismus, kterým NO inhibuje replikaci virů a produkci cytokinů, naše údaje naznačují, že topická aplikace donorů NO může zajistit nový terapeutický přístup k léčení nachlazení způsobených rhino virem a jejich komplikací.

·· ···· ·· ·· • · · · • · • · • · ···· ···· • · · · • · · · · • · · · • · · ·

Odkazy na literaturu

1. Akiro, S., T. Birano, T. Taga, and T. Kishimoto.1990. Biology of multifunctional cytokines: IL 6 and related molecules (IL 1 and INF). FASEB J. 4:2860-2867.

2. Arnold, R, B. Humbert, H. Werchau, H. Gallati, and W. K“nig.l994. Interleukin-8, interleukin-6, and soluble tumour necrosis factor receptor type I release from a human pulmonary epithelial cell line (A549) exposed to respirátory syncytial virus. Immunology. 82:126-133.

3. Arola, Μ., T. Ziegler, H. Puhakka, O. P. Lehtonen, and O. Ruuskanen.

1990. Rhinovirus in otitis media with efiusion. Ann. Otol. Rhinol. & Laryngol. 99:451-453.

4. Asano, K., C. Β. E. Chee, B. Gaston, C. M. Lilly, C. Gerard, J. M.

Dražen, and J. S. Stamler.1994. Constitutive and inducible nitric oxide synthase gene expression, regulation, and activity in human lung epithelial cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 91:10089-10093.

5. Baggiolini, M., A. Walz, and S. L. Kunkel.1989. Neutrophil-activating peptide-l/interleukin 8, a novel cytokine that activates neutrophils. J. Clin. Invest. 84:1045-1049.

6. Bardin, P. G., S. L. Johnston, G. Sanderson, S. Robinson, M. A. Pickett,

D. J. Fraenkel, and S. T. Holgate.1994. Detection of rhino virus infection of the nasal mucosa by oligonucleotide in šitu hybridization. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.l0:207-213.

7. Bi, Z., and C. S. Reiss.1995. Inhibition of vesicular stomatitis virus infection by nitric oxide. J. Virol. 69:2208-2213.

8. Choi, A. Μ. K., and D. B. Jacoby.1992. Influenza virus A infection induces interleukin-8 gene expression in human airway epithelial cells. FEBS Lett. 309:327-329.

9. Chomczynski, P., and N. Sacchi.1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159.

>

• ···

9 ··« »·

9 • · • 9

9

99

9 9 9

99

10. Churchill, L., F. H. Chilton, J. H. Resau, R Bascom, W. C. Hubbard, and

D. Proud. 1989. Cyclooxygenase metabolism of endogenous arachidonic acid by cultured human tracheal epithelial cells. Am. Rev. Respir. Dis. 140:449-459.

11. Couch, R B.1996. Rhinoviruses, pp. 713-734. In B. N. Fields and D. M.

Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields Virology, 3rd. edition. Lippincott-Raven, Philadelphia.

12. Croen, K. D. 1993. Evidence for an antiviral effect of nitric oxide. Inhibition of herpes simplex virus type 1 replication. J. Clin. Invest. 91:2446-2452.

13. Curran, R D., F. K. Ferrari, P. g, Kispert, J. Stadler, D. J. Stuehr, R L. Simmons, and T. RBilliar.1991. Nitric oxide and nitric oxide-generating compounds inhibit hepatocyte protein synthesis. FASEB J. 5:2085-2092.

14. Farr, B. M., J. M. Gwaltney, Jr., J. O. Hendley, F. G. Hayden, R M.

Nacterio, T. McBride, W. J. Doyle, J. V. Sorrentino, D. K. Riker, and D.

Proud. 1990. A randomized controlled trial of glucocorticoid prophylaxis against experimental rhinovirus infection. J. Infect. Dis. 162:1173-1177.

15. Feinberg, A. P., and B. Vogelstein.1983. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specifíc activity. Anal, Biochem.l32:6-13.

16. Gem, J. E., R Vrtis, E. A. B. Kelly, E. C. Dick, and W. W, Busse.1996.

Rhino virus produces nonspecific activation of lymphocytes through a monocyte-dependent mechanism. J. Immunol.l57:1605-1612.

17. Gustafson, L. M., D. Proud, J O. Hendley, F. G. Hayden, and J. M.

Gwaltney, Jr.1996. Oral prednisone therapy in experimental rhino virus infections. J. Allergy Clin. Immunol. 97:1009-1014.

18. Gwaltney, J M., J. O. Hendley, G. Simon, and W. S. Jordán. 1966.

Rhinovirus infections in an industrial population. I. The occurrence of illness.

N. Engl. J. Med. 275:1261-1268.

19. Gwaltney, J. M., Jr., C. D. Philips, R D. Miller, and D. K. Riker. 1994. Computed tomographic study of the common cold. N. Engl. J. Med. 330:25-30.

φφ «φφφ ·· *« • » · » « · • · · · • · * · · • · * ·« ·····»«· «φ ·· • » » · · • · > · » · φ > * · • « # · « «· φφ

20. Harris, Ν., R Μ. L. Buller, and G. Karupiah.1995. Gamma interferon-induced, nitric oxide-mediated inhibition of vaccinia virus replication. J. Virol. 69:910-915.

21. Johnston, S. L., P. K. Pattemore, G. Sanderson, S. Smith, M. J.

Campbell, L. K. Josephs, A. Cunningham, B. S. Robinson, S. H. Myint,

Μ. E. Ward, D. A. J. Tyrrell, and S. T. Holgate.l996. The relatioship between upper respirátory infections and hospital admissions for asthma: a time-trend analysis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:654-660.

22. Johnston, S. L., P. K. Pattemore, G. Sanderson, S. Smith, F. Lampě, L.

Josephs, P. Sympington, S. O'Toole, S. H. Myint, D. A. Tyrrell, and S. Τ. Holgate.l 995. Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children. Br. Med. J. 310:1225-1228.

23. Karupiah, G., and N. Harris. 1995. Inhibition of viral replication by nitric oxide and its reversal by ferrous sulfáte and tricarboxylic acid cycle metabolites.

J. Exp. Med.l81:2171-2179.

24. Karupiah, G., Q: w. Xie, R M. L. Bulter, C. Nathan, C. Duarte, and J. D. MacMicking.1994. Inhibition of viral replication by interferon-g-induced nitric oxide synthase. Science. 261:1445-1448.

25. Kharitonov, S. A., D. Yates, and P. J. Bames.1995. Increased nitric oxide in exhaled air of normál human subjects with upper respirátory tract infections. Eur. Respir. J. 8:295-297.

26. Komatsu, T., Z. Bi, and C. S. Reiss. 1996. Interferon-g induced type I nitric oxide synthase activity inhibits viral replication in neurons. J. Neuroimmunol. 68:101-108.

27. Kwon, O. J., B. T. Au, P. D. Collins, J. N. Baraniuk, I. M. Adcoctc, K. F.

Chung, and P. J. Bames.1994. Inhibition of interleukin-8 by dexamethasone in human cultured airway epithelial cells. Immunology. 81:389-394

28. Larsen, C. G., A. O. Anderson, E. Appella, J. J. Oppenheim, and K. Matsushima.1989. The neutrophil activating protein (NAP-1) is also chemotactic for T lymphocytes. Science. 243:1464-1466.

I φ ΦΦΦΦ

29. Levandowski, R A., C. W. Weaver, and G. G. Jackson.1988. Nasal secretion leukocyte populations determined by Ilow cytometry during acute rhinovirus infection. J. Med. Virol. 25:423-432.

30. Levine, S. J., P. Lariv,e, C. Logun, C. W. Angus, and J. H. Shelhamer.

1993. Corticosteroids differentially regulate secretion of IL-6, IL-8, and G-CSF by a human epithelial cell line. Am. J. Physiol. 265:L360-L368.

31. Lindley, I., H. Aschauer, J. M. Seifert, C. Lam, W. Brunowsky, E.

Kownatski, M. Thelen, P. Peveri, B. Dewald, V. von Tschamer, A. Walz, and M. Baggiolini. 1988. Synthesis and expression in escherichia coli of the gene encoding monocyte-derived neutrophil-activating factor: biological equivalence between natural and recombinant neutrophil-activating factor.

Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 85:9199-9203.

32. Lowenstein, C. J., S. L. Hill, A. Lafond-Walker, J. Wu, G. Allen, M. Landavere, N. R Rose, and A. Herskowite.1996. Nitric oxide inhibits viral replication in murine myocarditis. J. Clin. Invest. 97:1837-1843.

33. Matsukura, S., F. Kokubo, H. Noda, H. Tokunaga, and M. Adachi. 1996. Expression of IL-6, IL-8, and RAN'TES on human bronchial epithelial cells, NCI-H292, induced by influenza virus A. J. Allergy Clin. Immunol. 98:1080-1087.

34. Matsushima, K., K. Morishita, T. Yoshimura, S. Lávu, Y. Kobayashi, W.

Lew, E. Appella, H. F. Kung, E. J. Leonard, and J. J. Oppenheim.1988. Molecular cloning of a human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (NmNCF) and the induction of lVmNCF by interleukin 1 and tumor necrosis factor. J. Exp. Med.l67:1883-1893.

McHardy, V. U., J. M. Ingtis, M. A. Calder, J. W. Crofton, I. Gregg, D.

A. Ryland, P. Taylor, M. Chadwick, D. Coombs, and R W. Riddell.1980.

A study of infective and other factors in exacerbations of chronic bronchitis. Br. J. Dis. Chest. 74:228-238.

35.

• · • · ·» • · « · • · · ·

«) · · · · • · · · • · · ·

36. Naclerio, R M., D. Proud, L. M. Lichtenstein, A. Kagey-Sobotka, J. O. Hendley, J. Sorrentino, and J. M. Gwaltney.1988. Kinins are generated during experimental rhinovirus colds. J. Infect. Dis.l57:133-142.

37. Nicholson, K. G., J. Kent, and D. C. Ireland. 1993. Respirátory viruses and exacerbations of asthma in adults. Br. Med. J. 307:982-986.

38. Noah, T. L., and S. Becker.1993. Respirátory syncytial virus-induced cytokine production by a human bronchial epithelial cell line. Am. J. Physiol. 265:L472-L478.

39. Nussler, A. K., and T. R Biltiar.1993. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase. J. Leukocyte Biol. 54:171-178.

40. Proud, D., J. M. Gwaltney, Jr., J. O. Hendtey, C. A. Dinaretlo, S. Gillis, and R P. Schteimer. 1994. Increased levels of interleukin-1 are detected in nasal secretions of volunteers during experimental rhinovirus colds. J. Infect. Dis.l69:1007-1013.

41. Proud, D., RM. Naclerio, J. M. Gwaltney, and J. O. Hendley.1990.

Kinins are generated in nasal secretions during natural rhinoviros colds. J. Infect. Dis. 161:120-123.

42. Ramsay, A. J., A. J. Hirsband, I. A. Ramshaw, S. Bao, K. I. Matthaei, G. Koehler, and M. Kopf.1994. The role of interleukin-6 in mucosal IgA antibody responses in vivo. Science. 264:561-563.

43. Reddel, R R, Y. Ke, Β. I. Gerwin, M. G. McMenamin, J. F. Lechner, R T. Su, D. E. Brash, J.-B. Park, J. S. Rhim, and C. C. Harris.1988.

Transformation of human bronchiat epithelial cells by infection with SV4O or adenovirus-12 SV4O hybrid virus, or transfection via strontium phosphate coprecipitation with a plasmid contair-ng SV4O early region genes. Cancer Res. 48:1904-1909.

44. Schleimer, R P. 1993. Glucocorticosteroids: their mechar-sm of action and use in allergic diseases, p. pp. 893-925. In E. Middleton and C. E. Reed and E.

F. Ellis and N. F. Adkinson, Jr. and J. W. Yunginger and W. W. Busse (ed.), Allergy: Principles and Practice, 4th. ed. Mosby, St. Loius.

• · · · • · · · ···· • · · · « · · · • · · · • · · · ♦ * · *

45. Schwiebert; L. A., L. A. Beck, C. Stellato, C. A. Bickel, B. S. Bochner, and R P. Schleimer. 1996. Glucocorticosteroid inhibition of cytokine production; relevance to antiallergic actions. J. Allergy Clin. Immunol. 97:143-152.

46. Sim, T. C., L. M. Reece, K. A. Hitsmeier, J. A. Grant, and R Alam.1995. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152:927-933.

47. Steel, R G. D., and J. H. Torrie. 1980. Principles and Procedures of Statistics, a Biometrical Approach, 2nd ed. McGraw-Hill, New York.

48. Stellato, C., L. A. Beck, G. A. Gorgone, D. Proud, T. J. Schall, S. J. Ono,

L. M. Lichtenstein, and R P. Schleimer. 1995. Expression of the chemokine RANZ'ES by a human bronchial epithelial cell iine. Modulation by cytokines and glucocorticoids. J. Immunol,155:410-418.

49. Subauste, M. C., D. B. Jacoby, S. M. Richards, and D. Proud. 1995.

Infection of a human respirátory epithelial cell line with rhino virus. Induction of cytokine release and modulation of susceptibility to infection by cytokine exposure. J. Clin. Invest. 96:549-557.

50. Turner, B. W., W. S. Cail, J. O. Hendley, F. G. Hayden, W. J. Doyle, J. V. Sorrentino, and J. M. Gwaltney, Jr.1992. Physiologic abnormalities ofthe paranasal sinuses during experimental rhinovirus colds. J. Allergy Clin.

Immunol. 90:474-478.

51. Turner, R B., J. O. Hendtey, and J. M. Gwaltney, Jr.1982. Shedding of infected epithelial cells in rhinovirus colds. J. Infect. Dis. 145:849-853.

52. Wang, J. H., C. J. Trigg, J. L. Devalia, S. Jordán, and R J. Davies.1994.

Effect of inhaled beclomethasone dipropionate on expression of proinflammatory cytokines and activated eosinophils in the bronchial epithelium of patients with mild asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 94:102S-1034.

53. Winther, B., S. Brofeldt, B. Christensen, and N. Mygind.1984. Light and scanning electron microscopy of nasal biopsy materiál from patients with naturally acquired common colds. Acta. Otolazyngol. (Stockh). 97:309-318.

54. Winther, Β., B. Farr, R B. Turner, J. O. gendley, J. M. Gwaltney, Jr., and N. Mygind.1984. Histopathologic examination and enumeration of polymorphonuclear leukocytes in the nasal mucosa during experimental rhinovirus colds. Acta. Otolaryngol. Suppl. (Stockh). 413:19-24.

55. Zhu, Z., W. Tang, A. Ray, Y. Wu, O. Einarsson, M. L. Landry, J. M. Gwaltney, Jr., and J. A. Elias.1996. Rhinovirus stimulation of interleukin-6 in vivo and in vitro. Evidence for nuclear factor kB-dependent transcriptional activation. J. Clin. Invest. 97:421-430.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití sloučeniny uvolňující oxid dusnatý pro výrobu léčiva pro zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí, přičemž se sloučenina uvolňující oxid dusnatý podává v účinném množství osobě infikované rhinovirem.
2. Použití podle nároku 1, kde symptom způsobený rhinovirovou infekcí je vybrán ze skupiny obsahující obecné nachlazení, astma, sinusitidu, zánět středního ucha, bronchitidu.
3. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý jej uvolňuje kontrolovaným způsobem.
4. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý jej uvolňuje při patofyziologickém pH.
5. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý obsahuje skupinu N2O2'.
6. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je 3-(2-hydroxy-2-nitroso1 -propylhy drazino)-1 -propanamin.
7. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý se podává nosními kapkami, topicky, inhalací nebo sprejem.
8. Použití sloučeniny uvolňující oxid dusnatý pro přípravu léčiva obsahující její dostatečné množství k inhibici replikace rhinoviru v rhinovirem infikovaných lidských epiteliálních buňkách.
9. Použití sloučeniny uvolňující oxid dusnatý pro výrobu léčiva obsahující její dostatečné množství k inhibici produkce cytokinů způsobené rhinovirem v rhinovirem infikovaných lidských epiteliálních buňkách.
10. Použití podle nároku 9, kde cytokin je vybrán ze skupiny obsahující protizánětlivý cytokin, interleukin-8, interleukin-6.
11. Použití podle nároku 8, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý obsahuje skupinu N2O2“.
12. Použití podle nároku 8, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je 3-(2-hydroxy-2-nitroso-1 -propylhy drazino)-1 -propanamin.
13. Použití podle nároku 9, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý obsahuje skupinu N2O2'.

• ·

9 9 9 9 ·· 9 9 • · · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 99 9 ·

9999 99 9 99 9

28 ·· .· ·· ··· ·· ···
14. Použití podle nároku 9, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je 3-(2-hydroxy-2-nitroso-1 -propylhydrazino)-1 -propanamin.
15. Použití podle nároku 1, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je S-nitroso-1-acetylpenicilamin.
16. Použití podle nároku 8, kde sloučenina uvolňující oxid dusnatý je S-nitroso-1-acetylpenicilamin.
17. Použití podle nároku 9, vyznačený tím, že sloučenina uvolňující oxid dusnatý je S-nitroso-1 -acetylpenicilamin.
18. Použití sloučeniny indukující synthasu oxidu dusnatého v lidských epiteliálních respiračních buňkách pro výrobu léčiva ke zmírnění symptomů způsobených rhinovirovou infekcí.
19. Použití sloučeniny indukující synthasu oxidu dusnatého v lidských epiteliálních respiračních buňkách pro výrobu léčiva obsahujícího její účinné množství k inhibici replikace rhinoviru.
20. Použití sloučeniny indukující synthasu oxidu dusnatého v lidských epiteliálních respiračních buňkách pro výrobu léčiva obsahujícího její účinné množství k inhibici produkce cytokinů způsobenou rhinovirem.
21. Použití podle nároku 18, kde sloučenina indukující synthasu oxidu dusnatého je vybraná ze skupiny obsahující interferon gama, lipopolysacharid.
22. Použití podle nároku 19, kde sloučenina indukující synthasu oxidu dusnatého je vybraná ze skupiny obsahující interferon gama, lipopolysacharid.
23. Použití podle nároku 20, kde sloučenina indukující synthasu oxidu dusnatého je vybraná ze skupiny obsahující interferon gama, lipopolysacharid.
24. Způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro terapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry, který zahrnuje:

infikování lidských epiteliálních respiračních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství alespoň jednoho protizánětlivého nebo eosinofil-aktivního cytokinu produkovaného v respiračních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství produkovaného cytokinů, je kandidátní látkou pro terapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačený tím, že cytokin je vybrán se skupiny obsahující protizánětlivý cytokin nebo eosinofil-aktivní cytokin.
26. Způsob podle nároku 24, vyznačený tím, že krok styku buněk se provádí před krokem infekce.
27. Způsob testování sloučenin pro identifikaci kandidátních látek pro terapeutické nebo profylaktické ošetření obecného nachlazení nebo jiné nemoci spojené s lidskými rhinoviry, který zahrnuje kroky:

infikování lidských epiteliálních respiraěních buněk lidským rhinovirem, styk buněk s testovanou sloučeninou a měření množství rhinovirového genomu replikovaného v respiraěních epiteliálních buňkách, kde testovaná sloučenina, která snižuje množství replikovaného rhinovirového genomu, je kandidátní látkou pro terapeutické nebo profylaktické ošetření infekce lidskými rhinoviry.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačený tím, že krok styku se provádí před krokem infekce.
29. Farmaceutické kompozice pro léčení rhinovirových infekcí, vyznačená tím, že obsahuje kapalnou formulaci obsahující sloučeninu uvolňující oxid dusnatý kapalnou formulací jsou nosní kapky.
30. Nosní sprejová nebo kapací láhev pro podávání farmaceutické kompozice do nosu osoby, vyznačená tím, že obsahuje kapalnou formulaci, která obsahuje sloučeninu uvolňující oxid dusnatý.
31. Inhalátor nebo zamlžovač pro dodávání antirhinovirové kompozice do lidského respiračního traktu, vyznačený tím, že obsahuje kapalnou formulaci, která obsahuje sloučeninu uvolňující oxid dusnatý.