CZ20001399A3 - Prostředky a způsoby pro systémové podání orálních vakcín a terapeutických činidel - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká prostředků a způsobů pro orální podání antigenů a terapeutických činidel za použití modifikovaného botulotoxinu, který si uchovává schopnost pronikat přes stěnu střeva do systémové cirkulace, aleje změněn tak, že je netoxický

Description

Prostředky a způsoby pro systémové podání orálních vakcín a terapeutických činidel

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředků a způsobů pro systémové podání orálních vakcín a terapeutických činidel za použití modifikovaného botulotoxinu, kde uvedený toxin si uchovává schopnost pronikat přes stěnu střeva, ale je změněn tak, že je netoxický.

Dosavadní stav techniky

Neurotoxiny Clostridií jsou nejúčinnějšími známými proteinovými toxiny. Neurotoxin produkovaný v Clostridium tetani (tetanický toxin) se dostává do člověka v důsledku otevřených ran. Nicméně, otrava tetanem není v současnosti alespoň v průmyslových zemích hlavním zdravotnickým problémem díky dostupnosti a rozšíření bezpečné, účinné a levné vakciny. Tato vakcína jev podstatě formalinem inaktivovaný supernatant kultury C. tetani kultivované ve fermentorech.

Botulotoxin (BoNT), který je produkován organismem Clostridium botulinum, Clostridium butyricum a Clostridium baratii, je etiologickým agens onemocnění zvaného botulismus (Simson, L. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1986, 26: 427-453). Lidé jsou obvykle vystaveni tomuto neurotoxinu při otravě z potravy, ačkoliv existují také vzácné případy botulismu z ran. Proti otravě botulinem byla vyvinuta podobná vakcína jako je vakcína proti tetanu. Nicméně, protože existuje sedm různých serotypů botulotoxinu, může být kompletní ochrana tímto inaktivovaným toxinem dosažena pouze výrobou sedmi různých vakcín a jejich smísením pro podání. V současnosti je • · v botulotoxinové vakcíně přítomno pouze pět ze sedmi serotypů. Dále, některé ze serotypů jsou složeny z kmenů, které neprodukují vysoké hladiny toxinu v kultuře. Proto je kultivace, přečištění a inaktivace toxinů pro vakcinaci časově náročná a nákladná a obsahuje značné riziko spojené s manipulací s plně aktivním toxinem (Clavton et al.,

Infection and Immunity 1995, 63(7): 2738-2742. V této době je tato vakcína dostupná pouze v Center of Disease Control pro pokusné účely.

Obvykle vzniká botulismus v důsledku požití potravy, která obsahuje toxin, nebo v důsledku požití potravy obsahující organismy, které mohou vyrábět toxin ve střevu. Bez ohledu na původ je botulotoxin syntetizován jako relativně netoxický jednořetězcový polypeptid s molekulovou hmotností přibližně 150 kDa. Pro to, aby se stal plně toxickým, musí být posttranslačně zpracován a při tomto zpracování je molekula štěpena proteasou, za zisku dvouřetězcové struktury, ve které je těžký řetězec (přibližně 100000 daltonů) navázán disulfidovou vazbou na lehký řetězec (přibližně 50000 daltonů). Dvouřetězcová molekula je holotoxin, který je odpovědný za biologickou aktivitu. BoNT přechází se střeva do systémové cirkulace (lymfy a krve), kde je distribuován k cholinergním nervovým zakončením, které jsou cílovým místem účinku toxinu. Toxin vstupuje do těchto nervů, kde působí jako endoproteasa dependentní na zinku a štěpí polypeptidy, které jsou nutné pro exocytosu (Montecucco, C., and Schiavo, G.,

Mol. Microbiol. 1994, 13: 1-8). Štěpení těchto polypeptidů vede k blokádě uvolňování neurotransmiteru a k paralýze.

Předpokládá se, že těžké řetězce toxinu jsou zásadní pro vazbu a přechod toxinu z vnějšku do vnitřku cholinergních nervových zakončení, zatímco lehké řetězce mají aktivitu • · · · • · endoproteasy závislé na zinku, která je odpovědná za účinky toxinu na zakončeních cholinergních nervů (Neimann et al., Behring. Inst. Mitt., 1991, 89: 153-162). V souladu s tím byly popsány vakciny proti botulismu obsahující netoxický 50 kDa karboxyterminální fragment Clostridium botulinum. LaPenotiere et al., Toxicon 1995, 33(10): 1383-6 a Clayton et al., Infection and Immunity 1995, 63(7): 2738-2742. Dále, bylo naznačeno, že tento vysoce selektivní neurotoxin a tetanický toxin mohou být přeměněny na netoxické terapeutické prostředky, které mohou být použity pro přenos léků, hormonů, enzymů nebo protivirových činidel do centrálního nervového systému.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je modifikovaný botulotoxin, který si zachovává svou schopnost průniku ze střeva do systémové cirkulace, ale který je netoxický. Modifikovaný botulotoxin může být použit jako orální vakcína pro antigenní peptidy včetně botulotoxinu a pro orální podání jiných terapeutických činidel do systémové cirkulace.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je diagram znázorňující přirozený botulotoxin. Tento obrázek ilustruje lehký řetězec s motivem pro vazbu zinku navázaný disulfidovou vazbou na těžký řetězec přirozeného toxinu.

Obr. 2 je diagram ilustrující příklad modifikovaného botulotoxinu podle předkládaného vynálezu. Tento obrázek ilustruje lehký řetězec s modifikovaným motivem pro vazbu zinku navázaný na intaktní těžký řetězec botulotoxinu.

• · ··· · ··· · · · · · · · ···· · · · · · · · · · • ···· ······ • ··· ·····

Jednou z hlavních výzev moderní medicíny je vývoj léků, které mohou být podávány orální cestou. Ukázalo se, že vývoj orálních peptidových vakcín, které vyvolávají systémovou imunitu, je zejména obtížný. Mezi obtíže spojené s vývojem orálních peptidových vakcín patří: degradace působením nízkého pH a proteolytických enzymů v lidském střevu; antigenní doména agens způsobujícího onemocnění je příliš velká proto, aby byla umožněna významná nespecifická difuse ze střeva do systémové cirkulace; a neschopnost navrhnout peptidové vakciny, které by se vázaly na receptory ve střevu a které by byly aktivně transportovány do systémové cirkulace. I přes tyto obtíže existuje významná snaha o vývoj orálních vakcín. Například, nedávno byl navržen koncept využívající geneticky upravených potravin, jako jsou například brambory a banány, jako vektorů pro vakcinaci ve velkém rozsahu. Nicméně, genetické zapracování antigenního peptidu do potravy, které je potom snědena, neřeší tyto obtíže. Proto existuje potřeba vehikul pro přepravu léků, které budou spolehlivě a reprodukovatelně přenášet antigenní peptidy nebo jiná terapeutická činidla ze střeva do systémové cirkulace.

Předkládaný vynález poskytuje modifikovaný botulotoxin, který může být použit jako orální přenosový prostředek pro antigenní peptidy, včetně, ale bez omezení, botulotoxinu a jiných terapeutických činidel do systémové cirkulace. Nyní bylo zjištěno, že botulotoxin se přenáší do systémové cirkulace vazbou na serospecifické receptory na slizniční straně polarizovaných střevních buněk rostoucích v monovrstvě. Navázaný toxin je aktivně transportován buňkami a je přenesen intaktní a nemodifikovaný na serosní stranu monovrstvy. Předpokládalo se, že pomocné proteiny, jako je hemaglutinin,

I · · · · • · • · ·· který je složkou nekovalentního komplexu proteinů včetně botulotoxinu uvolňovaného Clostridium, mohou zprostředkovat vazbu a transport toxinu přes střevní stěnu. Nicméně, pokusy provedené s rekombinantní formou holotoxinu nyní prokázaly, že botulotoxin sám o sobě obsahuje vazebnou doménu, která rozpoznává receptory na povrchu střevních buněk. Dále bylo nyní prokázáno, že může být provedena modifikace lehkého řetězce toxinu, díky které se tento řetězec stává netoxickým bez toho, že by byla změněna schopnost proteinu pronikat stěnou střeva do systémové cirkulace. Proto v předkládaném vynález znamená termín modifikovaný botulotoxin botulotoxin, který si uchovává schopnost průniku ze střeva do systémové cirkulace, ale který je netoxický. Mezi alterace, které způsobují ztrátu toxicity botulotoxinu, patří mutace aminokyselinové sekvence lehkého řetězce a delece lehkého řetězce nebo jeho částí. Ve výhodném provedení jsou mutace provedeny v motivu pro vazbu zinku nebo v motivu pro vazbu substrátu lehkého řetězce. V předkládaném vynálezu znamená termín netoxický to, že vystavení zakončení cholinergních nervů působení modifikovaného botulotoxinu nevede k blokádě uvolňování neurotransmiteru v nervových zakončeních a k paralýze. Vliv alterací způsobujících ztrátu toxicity botulotoxinu na schopnost toxinu prostupovat ze střeva do systémové cirkulace může být stanoven podle zde uvedených skutečností tak, že odborník v oboru může identifikovat modifikované botulotoxiny podle předkládaného vynálezu. Tato definice modifikovaných botulotoxinů zahrnuje botulotoxiny, které dále obsahují vybraný antigen pro protein jiný než botulotoxin nebo jiné terapeutické činidlo.

Například byly připraveny prostředky obsahující botulotoxin, ve kterém je vazebný motiv pro zinek lehkého řetězce holotoxinu inaktivován. Modifikovaný toxin je •· 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 · · · · 9 9 9 9 · • · · · · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99 netoxický, protože holotoxin si neuchovává schopnost způsobovat neuromuskulárni blokádu, ale modifikace lehkého řetězce neovlivňuje nežádoucím způsobem schopnost zbylé molekuly toxinu přecházet z lumen střeva do systémové cirkulace. V tomto výhodném provedení byly modifikovány alespoň tři aminokyseliny obsažené ve vazebném motivu pro zinek lehkého řetězce. Přesněji, aminokyseliny His (v pozici 229), Glu (v pozici 230) a His (v pozici 233) přirozené sekvence byly substitované aminokyselinami Gly, Thr a Asn, v příslušném pořadí, za zisku SEQ ID NO: 1. Sekvence nukleové kyseliny kódující tento modifikovaný botulotoxin je označena jako SEQ ID NO: 2. Tyto aminokyselinové substituce eliminují schopnost vazby holotoxinu na katalyzující zinek nebo jiné dvojmocné kationty.

Byly také provedeny pokusy demonstrující, že botulotoxin bez vazebného zářezu nebo jednořetězcový botulotoxin se také váže a je transportován přes střevní stěnu. V souladu s tím modifikované botulotoxiny podle předkládaného vynálezu také zahrnují prostředky, ve kterých bylo vazebné místo eliminováno.

Biologická aktivita modifikovaného botulotoxinu podle předkládaného vynálezu byla stanovena za použití testů toxicity in vivo, aktivity in vitro na myším preparátu frenického nervu-hemidiaphragmy a za použití hodnocení enzymatické aktivity v surových synaptosomových preparátech. Pro tyto pokusy byl modifikovaný botulotoxin, zde označovaný jako modifikovaný rekombinantní nebo modifikovaný rBoNT/C, připraven z botulotoxinu serotypu C za použití místně cílené mutagenese pro inaktivaci vazebného motivu pro zinek lehkého řetězce holotoxinu, který je zásadní pro endoproteasovou aktivitu. Nicméně, mohou být použity jiné metody peptidové ·· 4444 • ·

444

4

4444 444 44 4 4 444 44444 444 444 44 444 44 44 syntézy, včetně - ale bez omezení - biochemických technik, jako je enzymatické štěpení peptidu a vazba získaných fragmentů, kde tyto metody jsou odborníkům dobře známé. Dále, vzhledem ke strukturálním a funkčním podobnostem serotypů botulotoxinu může odborník v oboru snadno připravit modifikované botulotoxiny ze serotypů jiných než je serotyp C. Například, všechny serotypy botulotoxinů jsou syntetizovány jako relativně inaktivní prekursory s molekulovými hmotnostmi přibližně 150000 daltonů. V každém případě musí být prekursor štěpen proteasou pro vznik dvouřetězcové molekuly mající těžký řetězec (100000 kDa) navázaný disulfidovou vazbou na lehký řetězec (50000 kDa). Každý serotyp botulotoxinu působí přednostně na zakončeních cholinergních nervů, kde blokuje uvolňování neurotransmiteru a těžký řetězec působí především jako doména pro zacílení toxinu na zakončení cholinergních nervů a lehký řetězec působí především v nervových zakončeních, kde blokuje uvolňování neurotransmiteru. Je to lehký řetězec každého serotypů, který působí jako metaloendoproteasa dependentní na zinku, která štěpí jeden nebo více členů rodiny polypeptidů, které jsou zásadní pro uvolňování neurotransmiteru. V každém serotypů existuje vazebný motiv pro zinek, His-Glu-X-X-His (SEQ ID NO: 3) , který je zásadní pro enzymatickou aktivitu. Modifikace vazebného motivu vždy způsobuje ztrátu enzymatické aktivity. Dále, pořadí sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí pro část každého serotypů obsahující region vazebného motivu pro zinek vykazuje vysoký stupeň identity sekvence v regionech sousedících s a obsahujících vazebný motiv pro zinek. Proto jsou příklady s botulotoxinem serotypů C representativní pro celou třídu.

Testování toxicity modifikovaného rBoNT/C holotoxinu in vivo ukázalo, že modifikovaný botulotoxin s mutacemi ve φφ φφφφ φ·· φφφ φφφφ φφφφ φ φφφφ φ φφ φ φ φφφφ φφφ φφφ φ φφφ φφφφφ vazebném motivu pro zinek nevyvolává žádnou akutní toxicitu u myší během 16 týdenního sledování po podání, ani při vysokých dávkách (10 gg/zvíře, i.p.) Žádná zřetelná neurotoxicita ani jiné běžné nežádoucí účinky nebyly pozorovány u žádného ze zvířat. Naopak, myši, kterým bylo injekčně podáno 100 ng přirozeného BoNT/C i.p. uhynuly během 2-2,5 hodin po injekci.

In vitro toxicita modifikovaného BoNT/C holotoxinu byla také srovnávána s toxicitou přirozeného BoNT/C na preparátem myšího frenického nervu-poloviny bránice. Bylo zjištěno, že přidání modifikovaného botulotoxinu do preparátu myšího frenického nervu-poloviny bránice neprodukuje neuromuskulární blokádu (1 x ΙΟ^-10 Μ; n - 4) . Naopak, přidání přirozeného BoNT/C (1 x 10 Μ; n = 8) vždy vyvolalo paralýzu nervového přenosu (průměr ± SEM = 152 ± 17 min.).

Schopnost tohoto modifikovaného botulotoxinu vyvolat imunitní odpověď byla také testována po orálním /p.o.) podání a po podkožním (s.c.) injekčním podání. Jak bylo stanoveno imunopřenosem, jak p.o., tak s.c. podání modifikovaného BoNT/C holotoxinu vyvolalo systémovou produkci protilátek. Je proto zřejmé, že modifikovaný botulotoxin podle předkládaného vynálezu si uchovává schopnost přenosu ze střeva a je aktivně transportován ze střeva. Dále toto zjištění dokazuje, že s.c. podání nehomogenního přípravku modifikovaného botulotoxinu, který obsahuje malé množství nepříbuzných proteinů, může vyvolat imunitní odpověď proti nepříbuzným proteinům, zatímco p.o. podání vyvolává vznik protilátek pouze proti modifikovanému botulotoxinu.

Protektivní účinek protilátek vyvolaných p.o. a s.c. podáním modifikovaného botulotoxinu byl potom demonstrován jak v sérových neutralizačních testech, tak v testech toxicity in ♦ · toto·· • to to ··· • ·· to · · · · ·· · •to ··· ·· ·· vivo. Bez ohledu na způsob podání inaktivovalo sérum od zvířat imunizovaných modifikovaným botulotoxinem vysoké dávky (Ή0000 LD50) přirozeného BoNT/C. Podobně, v testech toxicity in vivo vyvolala imunizace modifikovaným botulotoxinem jak p.o., tak s.c., výrazné snížení účinnosti následné injekce přirozeného toxinu. Zvířata, kterým byl podán modifikovaný botulotoxin orálně, měla detekovatelné protilátky v séru po dobu alespoň tří měsíců. Dále, zvířata, kterým byl podán modifikovaný botulotoxin p.o. nebo s.c., byla chráněna proti expozici přirozenému BoNT/C po dobu tří měsíců po třetí imunizaci.

Výsledky těchto pokusů tedy ukazují, že podle návodu, který je zde uveden, může být připraven modifikovaný botulotoxin, který je netoxický, ale který si uchovává svou schopnost přenosu ze střeva do systémové cirkulace a vyvolávat tvorbu protektivních protilátek. Dále, prostředky obsahující modifikovaný botulotoxin podle předkládaného vynálezu jsou jasně účinné jako orální vakciny proti botulismu u zvířat.

Kromě toho, vzhledem k tomu, že si modifikovaný botulotoxin podle předkládaného vynálezu uchovává svou schopnost přenosu ze střeva v intaktní formě do systémové cirkulace, může být tento modifikovaný botulotoxin použit jako přenosový prostředek pro orální podání antigenů nebo proteinů jiných než je botulotoxin a terapeutických činidel do systémové cirkulace. Existuje mnoho způsobů, kterými může být modifikovaný botulotoxin použit jako nosič pro orální vakciny. Například, protože inaktivace vazebného motivu pro zinek v lehkém řetězci neovlivňuje nežádoucím způsobem schopnost přenosu ze střeva, může být vazebný motiv pro zinek přirozeného toxinu nahrazen vybraným antigenem pro jiný protein, tj. protein jiný než botulotoxin, za zisku orální vakciny proti tomuto jinému proteinu. Alternativně, dobře ·· φφφφ ·· ···· φφ φφ φφφ φφφ · · · φ φφφφ · φφφφ · φφ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ _1Λ φ φφφφφφφφ

1ν φφφφ φφφ φφ φφφ φφ φφ známé techniky proteinové chemie a molekulární biologie mohou být použity pro navázání vybraného antigenu nebo jeho části na modifikovaný botulotoxin. Vzniklý modifikovaný botulotoxin je nejen netoxický, ale také si uchovává svou schopnost přenosu ze střeva do systémové cirkulace, takže vybraný antigen může po orálním podání vstupovat do systémové cirkulace a vyvolat imunitní odpověď proti proteinu. Příklady vakcín, které mohou být podány orálně s modifikovaným botulotoxinem zahrnují, ale nejsou omezeny na, vakciny pro Bacille Calmett-Guerin, choleře, záškrtu, hepatitidě B, spalničkám, meningitidě, příušnicím, černému kašli, moru, obrně, vzteklině, zarděnkám, tetanu, tyfu a žluté zimnici. Orální vakcína může být podána samostatně nebo v kombinaci, jako je například DTP (difteria, tetanus, pertussis). Schopnost dopravy orální vakciny je zejména významná pro oblasti, ve kterých není zdravotnický personál snadno dostupný. Kromě toho, orální vakcína podle předkládaného vynálezu představuje významnou ekonomickou výhodu a také snižuje potřebu odborného personálu, protože eliminuje náklady spojené s injekčními stříkačkami použitými pro injekce a/nebo pro odstraňování použitých injekčních stříkaček.

Prostředky orálních vakcín podle předkládaného vynálezu výhodně obsahují modifikovaný botulotoxin ve farmakologicky přijatelném nosiči, jako je sterilní fyziologický salinický roztok, sterilní salinický roztok s 0,1% želatinou nebo sterilní salinický roztok s 1,0 mg/ml hovězího sérového albuminu. Alternativně může být modifikovaný botulotoxin podle předkládaného vynálezu geneticky zapracován do rostlin tak, že potravina produkovaná rostlinou, jako například brambor nebo banán, může sloužit jako vektor pro vakcinaci velkého rozsahu. Způsoby pro genetické zpracování rostlin tak, aby exprimovaly • φ ·»·« • φ • φφφ • φ » φ · · • φ · · • · φφ φ • φ φ · · φφφ φ · · · · · ···· ♦·· φφ φφφ cizorodý peptid, jsou dobře známé v oboru, jak je uvedeno například v PCT/US96/09558, podané 6.6.1996.

Modifikované botulotoxiny podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné při konstrukci chimérických orálních terapeutických činidel. V tomto provedení může být terapeutické činidlo navázáno na modifikovaný botulotoxin, za zisku dvou velkých skupin orálně podávaných molekul: (1) nových léčiv s biologicky stabilními vazbami; a (2) konjugátů proléčiv majících biologicky nebo chemicky nestabilní vazby, které disociují z nosiče po dosažení krevního oběhu. Příklady chimérických terapeutických technik jsou popsány obecně v Lautenslager, G.T. and Simpson, L.L., Chimeric Molecules Constructed with Endogenous Substances Advances in Molecular and Cell Biology, svazek 9, str. 233-262, JAI Press, lne., (1994). Například, na modifikovaný botulotoxin může být navázán terapeutický peptid, čímž vznikne činidlo, které má charakteristiky substituentu a zároveň může být podáno orálně. Jedním příkladem může být příprava orálních trombolytických činidel. Fúsní protein vytvořený kombinováním P-selektinu a tkáňového plasminogenového aktivátoru (TPA) je slibným chimérickým proteinem, který má trombolytickou aktivitu a působí cíleně na tromby. Tento chimérický protein musí být dopraven do krevního řečiště. Nicméně, za použití molekulární biologie nebo proteinové chemie může být tato chimérická molekula prvního řádu navázána na modifikovaný botulotoxin podle předkládaného vynálezu, za vzniku chimérické molekuly vyššího řádu, která má dále tu výhodu, že může být dopravena do systémové cirkulace orálním podáním. Jiným příkladem je vývoj nových orálních protinádorových léků. Byly popsány různé protinádorové léky, které využívají cytotoxických vlastností jedné molekuly, která je fúzovaná na část jiné molekuly, kterou je specificky působící toxin. Nedávno popsaný příklad • * 9 » · 9 • φ • 9 9« »· »»11 ·· ·· • · · · · 9 · • » ··· · 9 9 « • 9 · · · ** 9 9 9 9 • · * · · · · e ·

999 999 99 999 99 99 využívá amino-koncové části pseudomonádového exotoxinu (PE) fúzované na epidermální růstový faktor (EGF), za vzniku chimérické molekuly EGF-PE, která může být použita jako cytotoxické činidlo proti nádorovým buňkám nesoucím receptor pro EGF. Vazba této chimérické molekuly na modifikovaný botulotoxin podle předkládaného vynálezu vytvoří chimérickou molekulu vyššího řádu, která může být podána orálně.

Obecné zásady pro použití modifikovaného botulotoxinu jako nosiče pro vakcíny nebo jiná terapeutická činidla jsou stejné pro člověka jako pro jiná zvířata, s jednou výjimkou. Všechny serotypy botulotoxinu nejsou pravděpodobně stejně účinné jako nosiče pro léky pro všechny druhy živočichů. Klinické důkazy naznačují, že lidé jsou zejména sensitivní na účinek serotypů A, B a E. Toto může souviset s účinností, se kterou jsou tyto tři serotypy absorbovány z gastrointestinálního systému. Proto jsou serotypy A, B a E výhodnými nosiči terapeutických činidel u člověka.

Naopak, většina ostatních živočichů je nejvíce sensitivní na serotyp C. To ukazuje, že pro veterinární medicínu bude výhodným nosičem pro terapeutická činidla pro zvířata jiná než je člověk serotyp C. Příklady zvířecích vakcín, které mohou být podány orálně s modifikovaným botulotoxinem, zahrnují, ale nejsou omezeny na, vakcíny proti adenoviru typu 2, Bordetella bronchiseptica, botulismu, caliciviru, Chlamydia psittaci, onemocněním způsobeným Clostridii, například Clostridium perfringens typu C, coronavirům, psince, koňské encephalomyelitidě, Escherichia coli, kočičí infekční encephalomyelitidě, kočičí infekční peritonitidě, kočičí panleukopenii, viru kočičí leukemie, hepatitidě, leptospirose, viru parainfluenzy, parvovirům, vzteklině, viru rhinotracheitidy a tetanu.

«« ···· • A • ··· «« 9999 99 99

9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 999 99 999 99 99

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Restrikční endonukleasy a enzymy pro modifkaci DNA byly zakoupeny od New England Biolabs (Beverly, MA). Expresní vektor pQE-30 a nikl-kyselina nitriltrioctová (Ni-NTA) Agarosa byly zakoupeny od QIAGEN (Chatsworth, CA). Monoklonální protilátky (mAb) specifické pro 6xHis afinitní koncovku byly zakoupeny od QIAGEN. Anti-syntaxinové mAb (S-0664; anti-HPC-1) byly zakoupeny od Sigma (St. Louis, MO) a koňské anti-BoNT/C protilátky byly získány od Centers for Disease Control (CDC, Atlanta, GA) . Plasmidy pCL8 a pCH3 nesoucí EcoRI fragmenty BoNT/C DNA byly popsány dříve, v Kimura et al., BBRC 1990,

171: 1304-1311.

Příklad 1: Konstrukce expresních vektorů pro syntézu rBoNT/C holotoxinu

Schematické znázornění přirozeného holotoxinu je uvedeno na obr. 1. Schematické znázornění modifikovaného holotoxinu, rBoNT/C, je uvedeno na obr. 2. Sekvence nukleové kyseliny a proteinová sekvence pro modifikovaný botulotoxin, rBoNT/C, jsou uvedeny v SEQ ID NO: 2 a v SEQ ID NO: 1, v příslušném pořadí.

Techniky pro izolaci DNA fragmentů, pro opravu přesahujících konců pomocí Klenow fragmentu DNA polymerasy I a ligaci za použití T4 ligasy jsou odborníkům v oboru známé a jsou popsány, například, v Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Vydání, Cold Spring Harbor • ·

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Všechny kroky klonování a exprese byly provedeny v E. coli kmene M-15 (QIAGEN) obsahujícím pREP4 represorový plasmid.

Gen bodující rekombinantní modifikovaný botulotoxin byl sestaven ze tří separátních fragmentů toxinu (fragmenty I, II a III) vytvořených za použití PCR a po jeho ligaci do vektoru pQE-30 se získal plasmid pQE-TCl. Nejprve byl DNA fragment bodující amino-terminální část BoNT/C (fragmenty I a II) amplifikován z plasmidu pCL8 ve dvou postupných krocích za zisku pBot C2. DNA fragment I (nt 4-689) byl amplifikován za použití následujícího páru oligonukleotidových primerů:

(vedoucí) 5'-CCCAATAACAATTAACAACTTTAAT-3' (SEQIDNO: 4) Κρη I (reverzní) 5'-TTTGGTACCCATTAAAATTAGTATTGGATCCAT-3' (SEQ ID NO: 5)

Jeden cytosin byl přidán na 5'-konec vedoucího primeru pro rekonstrukci BamHI restrikčního místa, stejně jako ke klonu rBoNT/C DNA v rámečku s pQE-30 iniciací translace methioninem.

KpnI restrikční místo bylo vloženo do reverzního primeru pro vytvoření aminokyselinových mutací His -Gly a Glu -Thr na 3'-konci fragmentu I. Amplifikovaný fragment I byl zpracován T4 polymerasou, byl tráven KpnI a byl insertován mezi Klenow fragmentem doplněná BamHI a KpnI místa expresního vektoru pQE-30, čímž vznikl plasmid pBot Cl. DNA fragment II (nt 689-1633) byl potom amplifikován za použití oligonukleotidových primerů:

KpnI (vedoucí) 5'-TTTGGTACCCTTAATAATGCAATGCATAATTTATATGGA-3' (SEQ ID NO: 6) φ ·

Φ·ΦΦ · ·· * • φ φ φ φ φ φ

EcoRI (reverzní) 5'-GAATTC7VAATAATCAACATTTTGAG-3' (SEQ ID NO: 7)

Do vedoucího primeru byly vloženy nukleotidové změny pro vytvoření KpnI místa a pro generování aminokyselinových mutací His²²⁹-Gly, Glu²³⁰-Thr a His²³³-Asn na 5'-konci fragmentu II. Reverzní primer byl komplementární k BoNT/C sekvenci a obsahoval vnitřní EcoRI místo v nukleotidové pozici 1633. Amplifikovaný fragment II byl zpracován T4 polymerasou, byl tráven KpnI a byl insertován mezi Klenow fragmentem doplněná Sall místa pBot Cl. Vzniklý plasmid pBot C2 obsahoval 5'koncový fragment BoNT/C (nt 4-1633) v rámci s Atg kodonem a 6xHis afinitní sekvencí pQE-30.

DNA fragment III (nt 1633-3873) bodující karboly-terminální doménu BoNT/C byl amplifikován z plasmidu pCH3 za použití oligonukleotidových primerů:

EcoRI (vedoucí) 5'-TTTGAATTCTTATTATTACCTAGAATC-3' (SEQ ID NO: 8)

Sací

Reverzní 5'-TTTGAGCTCTTATTCACTTACAGGTACAAAAC-3' (SEQ ID NO: 9)

Vedoucí primer byl komplementární k BoNT/C sekvenci a obsahoval vnitřní EcoRI místo v nukleotidové pozici 1632.

V reverzním primeru bylo Sací restrikční místo vloženo bezprostředně po stop kodonu ve směru sekvence. Amplifikovaný fragment II byl tráven EcoRI a Sací a byl klonován separátně do EcoRI a Sací tráveného plasmidu pQE-30 za vzniku plasmidu pBot C3. Nakonec byla DNA kódující úplný modifikovaný botulotoxin rekonstruována vložením EcoRI-EcoRI fragmentu (nt -88 až +1632) z plasmidu pBot C2 do EcoRI tráveného, telecí střevní alkalickou fosfatasou defosforylovaného plasmidu pBot • ·· ·

C3, za vzniku plasmidu pQE-TCl. Všechny PCR fragmenty byly znovu analyzovány DNA sekvenováním.

Oligonukletidový primer byl navržen tak, aby vkládal KpnI restrikční místo do segmentu DNA kódující vazebný motiv pro zinek. Vytvoření KpnI restrikčního místa v tomto segmentu umožnilo mutaci tří aminokyselin (His -Gly, Glu -Thr a His -Asn), které jsou zásadní pro vazbu zinku a umožnilo rekonstrukci DNA kódující modifikovaný botulotoxin bez předchozího klonování DNA přirozeného BoNT/C. Rekombinantní modifikovaný botulotoxin, syntetizovaný z plasmidu pQE-TCl, obsahoval jedenáct dalších aminokyselin, Arg-Gly-Ser-His-HisHis-His-His-His-Gly-Ser (SEQ ID NO: 10) na amino-konci.

Příklad 2: Optimalizace exprese neurotoxinu

PCR byla použita pro modifikaci sekvence pQE-30 vektoru, která je před strukturálním genem kódujícím modifikovaný rBoNT/C. Nový vedoucí primer,

5'-CGGTACCATGCCAATAACAAT TAACAACTTT-3' (SEQ ID NO: 11), obsahující deset dalších nukleotidů na 5'-konci, a nový reverzní primer,

BglII

5'-AGCTATAGATCTATAATAATCCAA-3' (SEQ ID NO: 12), pokrývající BglII restrikční místo v pozici 892 sekvence BoNT/C (Kimura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990, 171: 1304-1311), byly použity pro reamplifikaci DNA fragmentu kódujícího aminokoncovou část rBoNT/C. Amplifikovaný fragment byl zpracován T4 polymerasou, byl tráven BglII a byl insertován mezi Klenow • · • · 4 · 4 4 · · · • 4·· 4 4444 4 44 ·

444 4 444 44 4

fragmentem doplněná BamHI a BglII místa pQE-TCl za vzniku pQETC2.

Příklad 3: Exprese a přečištění modifikovaného rBoNT/C Holotoxinu

Kultury byly kultivovány v Lennox L bujónu při 37 °C, za třepání, do Αεοο 0,6-0,8. Isopropyl-P-thiogalaktopyranosid byl přidán do konečné koncentrace 1,0 mM a inkubace pokračovala po dobu dalších 5 hodin. Bakterie z 1 litru indukované kultury byly sklízeny centrifugací při 4 °C a byly resuspendovány ve 20 ml 50 mM pufru tvořeného fosforečnanem sodným, pH 7,4 s 300 mM NaCl. Buněčná suspenze byla lyžována na ledu sonikací, dvěma 1 minutovými pulsy při 75% síle, za použití Model 60 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific, Malvern, PA). Lyzáty byly centrifugovány při 20000 x g po dobu 30 minut při 4 °C. Pročištěné supernatanty byly smíseny s 1 ml balené Ni-NTA pryskyřice, provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při 4 °C na centrifuze a nakonec se tento materiál vnesl do 25 ml kolony. Kolona se promyla 30 objemy promývacího pufru (50 mM fosforečnan sodný, pH 6,0, 300 mM NaCl, 25 mM imidazol). Navázané proteiny se eluovaly elučním pufrem (50 mM fosforečnan sodný, pH 4,5, 300 mM NaCl). Přečištěné proteiny se analyzovaly na dodecylsíran sodný - polyakrylamidových gelech (SDS-PAGE).

Příklad 4: Imunopřenosová analýza

Schopnost E. coli řídit expresi rekombinantního modifikovaného botulotoxinu z plasmidu pQE-TCl byla testována imunopřenosovou analýzou buněčného extraktu. Proteiny pro analýzu westernovým přenosem byly separovány na 10% polyakrylamidových gelech způsobem podle Laemmli, U.K., Nátuře • · ·«· · · · · ♦ · · • ··· · · ·♦· · · · · • ···· ······ ίο · ··· ·····

1θ ···· ··· ·· ··· ·· ··

1970, 22: 680-685, byly přeneseny na nitrocelulosu a byly zpracovány pro detekci imunoreaktivních proteinů obsahujících 6xHis afinitní koncovku. Inkubace s primárními protilátkami byly provedeny během 1 hodiny při 37 °C s ředěním 1:2000 mAb proti 6xHis koncovce, nebo s protilátkami proti BoNT/C. Membrány byly vyvíjeny za použití zesílené chemiluminiscence podle návodu výrobce (ECL; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Syntéza rekombinantních proteinů byla indukována IPTG a alikvoty solubilizovaných buněk byly zpracovány na SDS-PAGE.

Analýza westernovým přenosem s protilátkami proti 6xHis koncovce nebo proti BoNT/C ukázaly extrémně nízkou úroveň exprese. Proto byl konstruován nový plasmid, který neobsahoval řetězec čtyř cytosinů, které vznikají v důsledku klonování DNA pro neurotoxin do BamHI místa pQE-30 vektoru a tento plasmid byl označen pQE-TC2. Analýza westernovým přenosem s protilátkou proti 6xHis koncovce ukázala, že pQE-TC2 je účinější v řízení syntézy modifikovaného rBoNT/C holotoxinu. Kromě toho, 1-2 mg modifikovaného rBoNT/C holotoxinu mohly být přečištěny z 1 1 Lennox bujónu.

Modifikovaný rBoNT/C holotoxin byl syntetizován v solubilní formě, bez viditelné degradace, ale oproti Clostridium botulinum neumožnila E. coli účinnou konformaci modifikovaného rBoNT/C holotoxinu. Coomasie barvením nebo westernovým přenosem byla detekována pouze stopová množství L řetězce v modifikovaném rBoNT/C holotoxinu. Nicméně, modifikovaný rBoNT/C holotoxin byl účinně konformován imobilizovaným TPCKtrypsinem (Pierce, Rockford, IL) a takto byly získány těžké a lehké řetězce správné molekulové hmotnosti. Modifikovaný rBoNT/C holotoxin syntetizovaný z pQE-TC2 obsahoval čtrnáct dalších aminokyselin (Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-GlySer-Gly-Thr (SEQ ID NO: 13)) na amino-konci. 6xHis sekvence uvnitř těchto čtrnácti aminokyselin byla použita pro přečištění a následnou detekci syntetizovaného proteinu. Rekombinantní protein připravený tímto způsobem byl přečištěn afinitní chromatografií na Ni-NTA pryskyřici za použití 6xHis afinitní koncovky. Specificky navázaný protein byl eluován nízkým pH (eluční pufr pH 4,5) a byl analyzován na SDS-PAGE. Analýza proteinu eluovaného z afinitní pryskyřice ukázala, že toxin může být přečištěn do homogenity 80% - 90%. Přečištěný modifikovaný rekombinantní BoNT/C nebo modifikovaný rBoNT/C byly použity pro všechny uvedené testy.

Příklad 5: Biotesty rekombinantních proteinů

Jak bude popsáno v následujících příkladech, přečištěné rekombinantní proteiny byly testovány na biologickou aktivitu za použití testu toxicity in vivo, testu aktivity in vitro na preparátech myšího frenického nervu-poloviny bránice a v testu na enzymatickou aktivitu na preparátech surových synaptosomů.

A. Testování toxicity in vivo

Byla testována toxicita modifikovaného rBoNT/C holotoxinu. Modifikovaný rBoNT/C holotoxin přečištěný eluci z histidinafinitní pryskyřice byl ředěn v PBS obsahujícím 1 mg/ml BSA a byl podán intraperitoneálně (i.p.) myším. rBoNT/C holotoxin byl podán ve 100 μΐ alikvotě PBS-BSA v koncentraci 10 μg na zvíře mající průměrnou hmotnost 25 g. Zvířata byla sledována po dobu celkem 16 týdnů pro vyloučení jakékoliv nespecifické toxicity.

B. Testování toxicity in vitro φφ φφφφ ·· φφφφ φφ ·· • ΦΦ ··· φ φφφ • ΦΦΦ · φφφφ · ·· · • ···· φφφφφφ _ΑΛ · φφφφφφφφ φφφφ φφφ φφφφ· φφ φφ

Toxicity byla biologicky testována na preparátech myšího frenického nervu-poloviny bránice za použití způsobu popsaného v Simpson et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990 254: 98-103. Tkáně byly excidovány a byly suspendovány ve fyziologickém pufru, který byl provzdušňován 95% O₂, 5% CO2 a jehož teplota byla udržována na 35 °C. fyziologický roztok měl následující složení (milimolární): NaCl, 137; Kel, 5; CaCl2, 1,8; MgSCú, 1,0; NaHCCb, 24; NaH2PC>4, 1,0; D-glukosa, 11; a želatina,

0,01%. Frenické nervy byly stimulovány kontinuálně (1,0 Hz; 0,1-0,3 ms pulsy) a byly zaznamenávány svalové záškuby.

Toxinem indukovaná paralýza byla zaznamenána jako 50% redukce svalových záškubů v reakci na neurogenní stimulaci.

C. Štěpení substrátu

Synaptosomy (1 mg/ml) byly připraveny způsobem podle Rosahl et al., Cell 1993, 75: 661-670. Synaptosomy byly inkubována za přítomnosti modifikovaného rBoNT/C holotoxinu (100 nM) po dobu 90 minut při 37 °C v Tris-pufrovaném salinickém roztoku (TBS) nebo v TBS obsahujícím 10 mM dithiothreitol. V paralelních pokusech byly synaptosomální membrány inkubovány za přítomnosti nebo za absence přirozeného BoNT/C. Proteiny byly separovány na 15% SDS-PAGE, byly přeneseny na nitrocelulosu a byly zpracovány pro detekci imunoreaktivních proteinů mAb proti syntaxinu.

Příklad 6: Sérová protilátková odpověď u myší imunizovaných modifikovaným rBoNT/C holotoxinem

Swiss-Webster myší samice o hmotnosti přibližně 25 g (Ace Animals, Boyertown, PA) byly imunizovány v paralelních pokusech s.c. nebo p.o. buď rBoNT/C holotoxinem nebo TBS, pro

A A AAA· ·· ··· · · · ··

9 9 9 · 9 · · · ·

A AAAA A AA «

A AAAA AAA AAA

A AAA AAAAA

AAAA AAA AA AAA AA AA hodnocení schopnosti tohoto peptidu vyvolat sérovou imunitní odpověď.

A. Imunizace a odběr vzorků

Při s.c. injekci dostalo každé zvíře 2 pg proteinu v 0,1 ml elučního pufru. Při orálním podání bylo každému zvířeti podáno 4 μς proteinu v 0,2 ml elučního pufru za použití intragastrické sondy. Myši byly imunizovány v den 0 a dosycovací imunizace byly provedeny ve dny 14, 28 a 42. Vzorky séra od identicky imunizovaných myší byly odebírány a shromažďovány ve dny 21, a 49 po imunizaci. Pro odběr séra byla myším odebrána krev za anestesie isofluranem z retroorbitálního plexu za použití heparinizovaných kapilár.

B. Testy na produkci sérových protilátek

Séra od imunizovaných a od kontrolních myší byla testována na protilátky za použití imunopřenosové analýzy pro imunoreaktivitu k nekonformovanému modifikovanému botulotoxinu. Rekombinantní antigen (modifikovaný botulotoxin; 0,1 μς/dráhu) byl separován SDS-PAGE a byl přenesen na nitrocelulosové membrány. Membrány byly blokovány 5% odtučněným práškovým mlékem v TBS, byly nastříhány na proužky a byly zpracovány pro detekci imunoreaktivních proteinů za použití různých sérových vzorků. Primární inkubace byly provedeny přes noc (18 hodin) při teplotě okolí se sérem v ředění 1:1000. Sekundární křenovou peroxidasou značený antimyší IgG byl použit v ředění 1:10000 a inkubace byla 1 hodina při teplotě okolí. Po důkladné promytí byly membrány vyvíjeny za použití ECL (Amersham).

Příklad 7: Neutralizační aktivita séra od imunizovaných myší

4 4 44 · 99 444 · • 4 4 4 4 4

444 · 4444

4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

Byly provedeny pokusy pro hodnocení schopnosti různých vzorků séra neutralizovat přirozený BoNT/C. Byly testovány tři různé zdroje séra: (1) non-imuní sérum; (2) sérum od zvířat, kterým byl podán modifikovaný rBoNT/C holotoxin p.o.; a (3) sérum od zvířat, kterým byl podán modifikovaný rBoNT/C holotoxin s.c.. Přirozený BoNT/C (10 μΐ, 100 ng) byl inkubován s 10 μΐ pre-imunního nebo imunního séra při 37 °C po dobu 1 hodiny nebo byl inkubován s PBS-BSA. Potom byla inkubační směs ředěna 80 μΐ PBS obsahujícím 1 mg/ml BSA a tato směs byla injikována i.p. Myši byly sledovány po dobu 48 hodin pro hodnoceni jakékoliv residuálni toxicity různých směsi.

Přiklad 8: Chráněni myší před působením přirozeného BoNT/C

Tři měsíce po podání třetí dosycovací dávky byly myši imunizované rBoNT/C vystaveny i.p. dávce 100 ng přirozeného BoNT/C na zvíře. Přežívání těchto zvířat bylo sledováno po dobu 5 dnů.

Každý patent, patentová přihláška a publikace je zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byl vynález popsán ve svých výhodných provedeních, existují jiná provedení a variace předkládaného vynálezu, která spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Připojené patentové nároky zahrnují všechna taková provedení a ekvivaletní variace.

• 9 »·· ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Simpson, Laňce

Kiyatkin, Nikita Maksymowych, Andrew (ii) Název vynálezu: Prostředky a způsoby pro systémové podán orálních vakcín a terapeutických činidel (iii) Počet sekvencí: 13 (iv) Počítačová čtecí forma:

(D) Software: Patentln Ver. 2.0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1291 aminokyselin (ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: modifikovaný botulotoxin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Aan Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn

1

5

10

15

Lys

Asn

Ile

Leu

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

Asn

Thr

Leu

Ala

Asn

Glu

20

25

30

Pro

Glu

Lys

Ala

Phe

Arg

Ile

Thr

Gly

Asn

Ile

Trp

Val

Ile

Pro

Asp

35

40

45

Arg

Phe

Ser

Arg

Asn

Ser

Asn

Pro

Asn

Leu

Asn

Lys

Pro

Pro

Arg

Val

50

55

60

Thr

Ser

Pro

Lys

Ser

Gly

Tyr

Tyr

Asp

Pro

Asn

Tyr

Leu

Ser

Thr

Asp

65

70

75

60

φφφφ φφ φφφφ ·* ·» , * * ·»· .··· • ··· · ·***. ϊ ίΐ ! * ·»·· ♦ · · · · · . · · » ♦···· *··· ··· ·· ··· ·· ··

Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg 85 90 95

Ile

Asn

Ser

Arg

Glu

Ile

Gly

Glu

Glu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Leu Ser

Thr

100

105

110

Asp

Ile

Pro

Phe

Pro

Gly

Asn

Asn

Asn

Thr

Pro

Ile

Asn

Thr Phe

Asp

115

120

125

Phe

Asp

Val

Asp

Phe

Asn

Ser

Val

Asp

Val

Lys

Thr

Arg

Gin Gly

Asn

130

135

140

Asn

Trp

Val

Lys

Thr

Gly

Ser

Ile

Asn

Pro

Ser

Val

Ile

Ile Thr

Gly

145

150

155

160

Pro

Arg

Glu

Asn

Ile

Ile

Asp

Pro

Glu

Thr

Ser

Thr

Phe

Lys Leu

Thr

165

170

175

Asn

Asn

Thr

Phe

Ala

Ala

Gin

Glu

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Ser Ile

Ile

180

185

190

Ser

Ile

Ser

Pro

Arg

Phe

Met

Leu

Thr

Tyr

Ser

Asn

Ala

Thr Asn

Asp

195

200

205

Val

Gly

Glu

Gly

Arg

Phe

Ser

Lys

Ser

Glu

Phe

Cys

Met

Asp Pro

Ile

210

215

220

Leu

Ile

Leu

Met

Gly

Thr

Leu

Asn

Asn

Ala

Met

His

Asn

Leu Tyr

Gly

225

230

235

240

Ile

Ala

Ile

Pro

Asn

Asp

Gin

Thr

Ile

Ser

Ser

Val

Thr

Ser Asn

Ile

245

250

255

Phe

Tyr

Ser

Gin

Tyr

Asn

Val

Lys

Leu

Glu

Tyr

Ala

Glu

Ile Tyr

Ala

260

265

270

Phe

Gly

Gly

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Ile

Pro

Lys

Ser

Ala

Arg Lys

Tyr

275

280

285

Phe

Glu

Glu

Lys

Ala

Leu

Asp

Tyr

Tyr

Arg

Ser

Ile

Ala

Lys Arg

Leu

290

295

300

Asn

Ser

Ile

Thr

Thr

Ala

Asn

Pro

Ser

Ser

Phe

Asn

Lys

Tyr Ile

Gly

305

310

315

320

Glu

Tyr

Lys

Gin

Lys

Leu

Ile

Arg

Lys

Tyr

Arg

Phe

Val

Val Glu

Ser

325

330

335

Ser

Gly

Glu

Val

Thr

Val

Asn

Arg

Asn

Lys

Phe

Val

Glu

Leu Tyr

Asn

340

345

350

*♦ ·· • to ♦ toto ♦ ·* · • · « to · • to ·· to · · • ♦·· · · J J to»to ·· *

.......· ·..*···’

Glu

Leu

Thr

Gin

Ile

Phe

Thr

Glu

Phe

Asn

Tyr

Ala

Lys

Ile

Tyr

Asn

355

360

365

Val

Gin

Asn

Arg

Lys

Ile

Tyr

Leu

Ser

Asn

Val

Tyr

Thr

Pro

Val

Thr

370

375

380

Ala

Asn

Ile

Leu

Asp

Asp

Asn

Val

Tyr

Asp

Ile

Gin

Asn

Gly

Phe

Asn

385

390

395

400

Ile

Pro

Lys

Ser

Asn

Leu

Asn

Val

Leu

Phe

Met

Gly

Gin

Asn

Leu

Ser

405

410

415

Arg

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Lys

Val

Asn

Pro

Glu

Asn

Met

Leu

Tyr

Leu

420

425

430

Phe

Thr

Lys

Phe

Cys

His

Lys

Ala

Ile

Asp

Gly

Arg

Ser

Leu

Tyr

Asn

435

440

445

Lys

Thr

Leu

Asp

Cys

Arg

Glu

Leu

Leu

Val

Lys

Asn

Thr

Asp

Leu

Pro

450

455

4 60

Phe

Ile

Gly

Asp

Ile

Ser

Asp

Val

Lys

Thr

Asp

Ile

Phe

Leu

Arg

Lys

465

470

475

480

Asp

Ile

Asn

Glu

Glu

Thr

Glu

Val

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Asn

Val

Ser

485

490

4 95

Val

Asp

Gin

Val

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

Glu

His

Gly

Gin

Leu

500

505

510

Asp

Leu

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ile

Asp

Ser

Glu

Ser

Glu

Ile

Leu

Pro

Gly

515

520

525

Glu

Asn

Gin

Val

Phe

Tyr

Asp

Asn

Arg

Thr

Gin

Asn

Val

Asp

Tyr

Leu

530

535

540

Asn

Ser

Tyr

Tyr

Tyr

Leu

Glu

Ser

Gin

Lys

Leu

Ser

Asp

Asn

Val

Glu

545

550

555

560

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Arg

Ser

Ile

Glu

Glu

Ala

Leu

Asp

Asn

Ser

Ala

565

570

575

Lys

Val

Tyr

Thr

Tyr

Phe

Pro

Thr

Leu

Ala

Asn

Lys

Val

Asn

Ala

Gly

580

585

590

Val

Gin

Gly

Gly

Leu

Phe

Leu

Met

Trp

Ala

Asn

Asp

Val

Val

Glu

Asp

595

600

605 w* ·*»<· • 4 · · • 444 4 • ¢44 *4 ··*» • 4 • 44*

4

26

4 4444 444

•

• · ··

• OK

Phe

Thr

Thr

Asn

Ile

Leu

Arg

Lys

Asp

Thr

Leu

Asp

Lys

Ile

Ser

Asp

610

615

620

Val

Ser

Ala

Ile

Ile

Pro

Tyr

Ile

Gly

Pro

Ala

Leu

Asn

Ile

Ser

Asn

625

630

635

640

Ser

Val

Arg

Arg

Gly

Asn

Phe

Thr

Glu

Ala

Phe

Ala

Val

Thr

Gly

Val

645

650

655

Thr

Ile

Leu

Leu

Glu

Ala

Phe

Pro

Glu

Phe

Thr

Ile

Pro

Ala

Leu

Gly

660

665

670

Ala

Phe

Val

Ile

Tyr

Ser

Lys

Val

Gin

Glu

Arg

Asn

Glu

Ile

Ile

Lys

675

680

685

Thr

Ile

Asp

Asn

Cys

Leu

Glu

Gin

Arg

Ile

Lys

Arg

Trp

Lys

Asp

Ser

690

695

700

Tyr

Glu

Trp

Het

Met

Gly

Thr

Trp

Leu

Ser

Arg

Ile

Ile

Thr

Gin

Phe

705

710

715

720

Asn

Asn

Ile

Ser

Tyr

Gin

Met

Tyr

Asp

Ser

Leu

Asn

Tyr

Gin

Ala

Gly

725

730

735

Ala

Ile

Lys

Ala

Lys

Ile

Asp

Leu

Glu

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Ser

Gly

Ser

740

745

750

Asp

Lys

Glu

Asn

Ile

Lys

Ser

Gin

Val

Glu

Asn

Leu

Lys

Asn

Ser

Leu

755

760

765

Asp

Val

Lys

Ile

Ser

Glu

Ala

Met

Asn

Asn

Ile

Asn

Lys

Phe

Ile

Arg

770

775

780

Glu

Cys

Ser

Val

Thr

Tyr

Leu

Phe

Lys

Asn

Met

Leu

Pro

Lys

Val

Ile

785

790

795

800

Asp

Glu

Leu

Asn

Glu

Phe

Asp

Arg

Asn

Thr

Lys

Ala

Lys

Leu

Ile

Asn

805

810

815

Leu

Ile

Asp

Ser

His

Asn

Ile

Ile

Leu

Val

Gly

Glu

Val

Asp

Lys

Leu

820

825

830

Lys

Ala

Lys

Val

Asn

Asn

Ser

Phe

Gin

Asn

Thr

Ile

Pro

Phe

Asn

Ile

835

840

845

Phe

Ser

Tyr

Thr

Asn

Asn

Ser

Leu

Leu

Lys

Asp

Ile

Ile

Asn

Glu

Tyr

*« **

9 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 * *< 4«

850 855 860 • · · ·

Phe 865	Asn	Asn	Ile	Asn Asp Ser 870	Lys	Ile Leu Ser Leu Gin 875	Asn	Arg	Lys 880
Asn	Thr	Leu	Val	Asp Thr Ser	Gly	Tyr Asn Ala Glu Val	Ser	Glu	Glu
				885		890		895
Gly	Asp	Val	Gin	Leu Asn Pro	Ile	Phe Pro Phe Asp Phe	Lys	Leu	Gly
			900			905	910
Ser	Ser	Gly	Glu	Asp Arg Gly	Lys	Val Ile Val Thr Gin	Asn	Glu	Asn
		915			920	925
Ile	Val	Tyr	Asn	Ser Met Tyr	Glu	Ser Phe Ser Ile Ser	Phe	Trp	Ile
	930			935		940
Arg	Ile	Asn	Lys	Trp Val Ser	Asn	Leu Pro Gly Tyr Thr	Ile	Ile	Asp
945				950		955			960
Ser	Val	Lys	Asn	Asn Ser Gly	Trp	Ser Ile Gly Ile Ile	Ser	Asn	Phe
				965		970		975
Leu	Val	Phe	Thr	Leu Lys Gin	Asn	Glu Asp Ser Glu Gin	Ser	Ile	Asn
			980			985	990
Phe	Ser	Tyr	Asp	Ile Ser Asn	Asn	Ala Pro Gly Tyr Asn	Lys	Trp	Phe
		995		1000	1005
Phe	Val	Thr	Val	Thr Asn Asn	Met	Met Gly Asn Met Lys	Ile	T vr	Ile
1010			1015		1020
Asn	Gly	Lys	Leu	Ile Asp Thr	Ile	Lys Val Lys Glu Leu	Thr	Gly	Ile
1025			1030		1035		1040
Asn	Phe	Ser	Lys	Thr Ile Thr	Phe	Glu Ile Asn Lys Ile	Pro	Asp	Thr
			1045		1050	1055
Gly	Leu	Ile	Thr	Ser Asp Ser	Asp	Asn Ile Asn Met Trp	Ile	Arg	Asp
		1060		1065 1070
Phe	Tyr	Ile	Phe	Ala Lys Glu	Leu	Asp Gly Lys Asp Ile	Asn	Ile	Leu
	1075		1080	1085
Phe	Asn	Ser	Leu	Gin Tyr Thr	Asn	Val Val Lys Asp Tyr	Trp	Gly	Asn
1090			1095		1100
Asp	Leu Arg	Tyr	Asn Lys Glu Tyr	Tyr Met Val Asn Ile	Asp	Tyr	Leu
1105			1110		1115		1120

• · · ·

Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser Arg Gin Ile Val	Phe	Asn	Thr 1135	Arg
1125	1130
Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn 1140	Glu Gly Tyr Lys Ile 1145	Ile	Ile 1150	Lys	Arg
Ile Arg Gly Asn Thr Asn Asp 1155	Thr Arg Val Arg Gly 1160	Gly 1165	Asp	Ile	Leu
Tyr Phe Asp Met Thr Ile Asn 1170 1175	Asn Lys Ala Tyr Asn 1180	Leu	Phe	Met	Lys
Asn Glu Thr Met Tyr Ala Asp 1185 1190	Asn His Ser Thr Glu 1195	Asp	Ile	Tyr Ala 1200
Ile Gly Leu Arg Glu Gin Thr 1205	Lys Asp Ile Asn Asp 1210	Asn	Ile Ile 1215	Phe
Gin Ile Gin Pro Met Asn Asn 1220	Thr Tyr Tyr Tyr Ala 1225	Ser Gin 1230	Ile	Phe
Lys Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys 1235 1240 1245	Ser	Ile	Gly
Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly 1250 1255	Gly Asp Trp Tyr Arg 1260	His	Asn	Tyr	Leu
Val Pro Thr Val Lys Gin Gly 1265 1270 Ser Thr His Trp Gly Phe Val	Asn Tyr Ala Ser Leu 1275 Pro Val Ser Glu	Leu	Glu	Ser Thr 1280

1285 1290 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 3950 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: modifikovaný botulotoxin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

ggatattaga aagttaggag atgttagtat tatgccaata acaattaaca accttaatta 60 ttcagatcct gttgataata aaaatatttt atatttagat actcatttaa atacaccagc 120 !

taatgagcct gaaaaagcct ttcgcattac aggaaatata tgggtaatac ctgaragatt 180 ttcaagaaat tctaatccaa atttaaataa acctcctcga gttacaaacc ctaaaagtgg 240 ttattatgat cctaattatt tgagtactga ttctgacaaa gatacatttt taaaagaaat 300 tataaagtta tttaaaagaa ttaattctag agaaatagga gaagaattaa tatatagact 360 ttcgacagat ataccctttc ctgggaataa caatactcca attaatactt ttgattttga 420 tgtagatttt aacagtgttg atgttaaaac tagacaaggt aacaactggg ttaaaactgg 480 tagcataaat cctagtgtta taataactgg acctagagaa aacattatag atccagaaac 540 ttctacgttt aaattaacta acaatacttt tgcggcacaa gaaggatttg gtgctttatc 600 aataatttca atatcaccta gatttatgct aacatatagt aatgcaacta atgatgtagg 660 agagagtaga ttttctaagt ctgaattttg catggatcca atactaattt taatgggtac 720 ccttaataat gcaatgcata atttatatgg aatagctata ccaaatgatc aascaatttc 780 atctgtaact agtaatattt tttattctca atataatgtg aaattagagt atgcagaaat 840 atatgcattt ggaggtccaa ctatagacct tattcctaaa agtgcaagga aatattttga 900 ggaaaaggca ttggattatt atagatctat agctaaaaga cttaatagta taactactgc 960 aaatccttca agctttaata aatatatagg ggaatataaa cagaaactta ttagaaagta 1020 tagattcgta gtagaatctt caggtgaagt tacagtaaat cgtaataagt ttgttgagtt 1080 atataatgaa cttacacaaa tatttacaga atttaactac gctaaaatat ataatgtaca 1140 aaataggaaa atatatcttt caaatgtata tactccggtt acggcgaata tattagacga 1200 taatgtttat gatatacaaa atggatttaa tatacctaaa agtaatttaa atgtactatt 1260 tatgggtcaa aatttatctc gaaatccagc attaagaaaa gtcaatcctg aaaatatgct 1320 ttatttattt acaaaatttt gtcataaagc aatagatggt agatcattat acaataaaac 1380 attagattgt agagagcttt tagttaaaaa tactgactta ccctttataa gtgatattag 1440 tgatgttaaa actgatatat ttttaagaaa agatattaat gaagaaactg aagttatata 1500 ctatccggac aatgtttcag tagatcaagt tattctcagt aagaatacct cagaacatgg 1560 acaactagat ttattacacc ccagtattga cagtgagagt gaaatattac caggggagaa 1620 tcaagtcttt tatgataata gaactcaaaa tgttgattat ttgaattctt attattacct 1680 agaatctcaa aaactaagtg ataatgttga agattttact tttacgagat caattgagga 1740 ggctttggat aatagtgcaa aagtatatac ttactttcct acaccagcta ataaagtaaa 1800 tgcgggtgtt caaggtggtt tatttttaat gtgggcaaat gatgtagttg aagattttac 1860 tacaaatatt ctaagaaaag atacattaga taaaatatca gatgtatcag ctattattcc 1920 ctatatagga cccgcattaa atataagtaa ttctgtaaga agaagaaatt ttactgaagc 1980 atttgcagtt actggtgtaa ctattttatt agaagcattt cctgaattta caatacctgc 2040 acttggtgca tttgtgattt atagtaaggt tcaagaaaga aacgagatta ttaaaactat 2100 agataattgt ttagaacaaa ggattaagag atggaaagat tcatatgaat ggatgatggg 2160 aacgtggtta tccaggatta ttactcaatt taataatata agttatcaaa tgtatgattc 2220 tttaaattat caggcaggtg caatcaaagc taaaatagat ttagaatata aaaaatattc 2280 aggaagtgat aaagaaaata taaaaagtca agttgaaaat ttaaaaaata gtttagatgt 2340 aaaaatttcg gaagcaatga ataatataaa taaatttata cgagaatatt ccgtaacata 2400 tttatttaaa aatatgttac ctaaagtaat tgatgaatta aatgagtttg atcgaaatac 2460 taaagcaaaa ttaattaatc ttatagatag tcataatatt atcctagttg gtgaagtaga 2520 taaattaaaa gcaaaagtaa ataatagctt tcaaaataca atacccttta atattttttc 2580 atatactaat aattctttat taaaagatat aattaatgaa tatttcaata atattaatga 2640 ttcaaaaatt ttgagcctac aaaacagaaa aaatacttta gtggatacat caggatataa 2700 tgcagaagtg agtgaagaag gcgatgttca gcetaatcca atatttccat ttgactttaa 2760 attaggtagt tcaggggagg atagaggtaa agttatagta acccagaatg aaaatattgt 2820 atataattct atgtatgaaa gttttagcac tagtttttgg attagaataa ataaatgggt 2880 aagtaattta cctggatata ctataattga tagtgttaaa aataactcag gttggagtat 2940 aggtattatt agtaattttt tagtatttac tttaaaacaa aatgaagata gtgaacaaag 3000 tataaatttt agttatgata tatcaaataa tgctcctgga tacaataaat ggttttttgt 3060 • · • · · ·

• · aactgttact aacaatatga tgggaaatat gaagatttat ataaatggaa aattaataga 3120 tactataaaa gttaaagaac taactggaat taattttagc aaaactataa catttgaaat 3180 aaataaaatt ccagataccg gtttgattac ttcagattct gataacatca atatgtggat 3240 aagagatttt tatatatttg ctaaagaatt agatggtaaa gatattaata tattatttaa 3300 tagcttgcaa tatactaatg ttgtaaaaga ttattgggga aatgatttaa gatataataa 3360 agaatattat atggttaata tagattattt aaatagatat atgtatgcga actcacgaca 3420 aattgttttt aatacacgta gaaataataa tgacttcaat gaaggatata aaattataat 3480 aaaaagaatc agaggaaata caaatgatac tagagtacga ggaggagata ttttatattt 3540 tgatatgaca attaataaca aagcatataa tttgtttatg aagaatgaaa ctatgtatgc 3600 agataatcat agtactgaag atatatatgc tataggttta agagaacaaa caaaggatat 3660 aaatgataat attatatttc aaatacaacc aatgaataat acttattatt acgcatctca 3720 aatatttaaa tcaaatttta atggagaaaa tatttctgga atatgttcaa taggtactta 3780 tcgttttaga cttggaggtg attggtatag acacaattat ttggtgccta ctgtgaagca 3840 aggaaattat gcttcattat tagaatcaac atcaactcat tggggttttg tacctgtaag 3900 tgaataaata atgattaata atataaatta tgttaaatat tttaatatta 3950 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 5 aminokyselin (ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: modifikovaný motiv pro vazbu zinku (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

His Glu Xaa Xaa His (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA • · · · · · • · •31 · · · · · · ¹ ······· · · · · · 4 (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

cccaataaca attaacaact ttaat 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 33 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

tttggtaccc attaaaatta gtattggatc cat 33 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 39 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6: tttggtaccc ttaataatgc aatgcataat ttatatgga 3g (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence •9 9 99 9 • ·

primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

gaattcaaat aatcaacatt ttgag (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

tttgaattct tattattacc tagaatc (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 32 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

tttgagctct tattcactta caggtacaaa ac (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (ii) Typ molekuly: protein ♦ · φφφφ φφ φφφφ φφ φφ φφφ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφ · · φ φ φ φφφφ φφφ φφφ φ φ φφ φ φφφφ (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: modifikovaný botulotoxin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 15 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 31 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

cggtaccatg ccaataacaa ttaacaactt t 31 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 nukleotidů (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

agctatagat ctataataat ccaa 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin • toto to ·· to··· • * · 9··· to··· · ···· « ·· · • ··· · · · · ·· · • ··· · · · · · (ii) Typ molekuly: protein (ix) Vlastnosti:

(A) Arteficiální sekvence

Popis arteficiální sekvence: modifikovaný botulotoxin

Claims (5)

1. Patentové nároky

   1. Modifikovaný botulotoxin zahrnující botulotoxin schopný přenosu ze střeva do systémové cirkulace, který je pozměněn tak, aby byl netoxický.
2. 2. Modifikovaný botulotoxin podle nároku 1, který dále obsahuje vybraný antigen.
3. 3. Modifikovaný botulotoxin podle nároku 1, který dále obsahuje terapeutické činidlo.
4. 4. Orální vakcína proti vybranému antigenů vyznačující se tím, že obsahuje modifikovaný botulotoxin podle nároku 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.
5. 5. Způsob pro orální podání terapeutického činidla zvířeti vyznačující se tím, že obsahuje podání modifikovaného botulotoxinu podle nároku 3 uvedenému zvířeti.