CZ20001310A3

CZ20001310A3 - Lék pro léčbu onemocnění způsobených amyloidem

Info

Publication number: CZ20001310A3
Application number: CZ20001310A
Authority: CZ
Inventors: David Robert Howlett; Davina Elizabeth Mitchell
Original assignee: Boehringer Mannheim Pharmaceuticals Corporation - Smithkline Beckman Corporation
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2001-04-11

Abstract

Vynález popisuje použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfarreceptoru pro adrenalin pro výrobu léku pro léčbu onemocnění způsobených amyloidem, zvláště použití sloučeniny vzorce (I), kde R7 až R[3 jsou nezávisle -H nebo -OH; a A je skupina vzorce II, ve kterém Rj je vodík, nižší alkanoyl nebo aroyl, vybraný z benzoylu a naftoylu; R2 je vodík, nižší alkyl nebo aralkyl vybraný z benzylu, fenethylu a fenylpropylu; R3 je vodík nebo nižší alkyl; R4 je vodík nebo nižší alkyl nebo pokud je X kyslík, může R4 spolu s R5 tvořit - CH2-O-; X je jednoduchá vazba, -CH2, kyslík nebo síra; Arje vybrán ze souboru obsahujícího fenyl, naňyl, indanyl a tetrahydronaftyl; R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxyl, nižší alkyl, - CONH2-, nižší alkoxyskupinu, benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu, nižší alkylsulfinyl a nižší alkylsulfonyl; nebo R5 a R6 dohromady tvoří methylendioxyskupinu; ajejich farmaceuticky přijatelných solí.

Description

Lék pro léčbu onemocnění způsobených amyloidem

Oblast vynálezu

Vynález se týká použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alf a-^-receptoru pro adrenalin pro výrobu léku pro léčbu onemocnění způsobených amyloidem, zejména Alzheimerovi choroby, zvláště použití dále uvedené sloučeniny vzorce (I) a jejich farmaceuticky přijatelných solí, výhodně carvedilolu nebo hydroxylovaných derivátů carvedilolu.

Dosavadní stav techniky

Onemocnění související s amyloidem jsou charakterizována přítomností extracelulárních, ale ne krystalických, proteinových agregátů složených ze zesítěných beta-fibril/antiparalelních beta-listů vytvořených v důsledku nesprávného složení proteinů. Amyloid je obvykle patogenní. Nejčastějšími klinickými amyloidosami jsou Alzheimerova nemoc, chronické záněty, mnohotný myelom, diabetes II. typu a Creutzfeldt-Jacobova nemoc. Amyloidosy mohou způsobovat kardiální problémy při familiární amyloidové polyneuropatii ve vyšším věku a mohou také způsobit nutnost dlouhodobé dialýzy. Inhibitory amyloidosy budou výhodné pro léčbu amyloidos, protože systémová tvorba amyloidu je reversibilní a existující depozita mohou být resorbována, jakmile je rychlos ukládání amyloidu snížena nebo jakmile ukládání amyloidu ustane.

Alzheimerova nemoc (AD) je nejčastější příčinou demence ve stáří a postihuje 5-10% všech jedinců ve věku nad • * let. Charakteristickými změnami v mozku jsou senilní plaky, neurofibrilární sítě a degenerace a ztráta neuronů. Senilní plaky jsou lokalizovány extracelulárně a obsahují depozita fibrilárního beta-amyloidu, jehož nejdůležitější složkou je betaA4 peptid. Agregované formy BA4 jsou toxické pro kultivované neurony in vitro (L. Iverson et al., Biochem.

J. , 311: 1-16 (1995)) a tvorba a agregace BA4 v mozku je zásadním časným mediátorem AD.

Překvapivě bylo zjištěno, že carvedilol a příbuzné sloučeniny dále uvedeného obecného vzorce I jsou použitelné pro léčbu amyloidos. Konkrétně jsou tyto sloučeniny použitelné pro inhibici tvorby neurotoxických BA4 oligomerních agregátů a proto mohou být použity pro léčbu Alzheimerovi nemoci.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa-^-receptoru pro adrenalin pro výrobu léku pro léčbu onemocnění způsobených amyloidem.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je použití výše uvedeného duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa₁-receptoru pro adrenalin podle nároku 1, který má obecný vzorec I:

• · » ·

kde

R₇ až R₁₃ jsou nezávisle -H nebo -OH; a

A je skupina vzorce II:

ve kterém

Ry je vodík, nižší alkanoyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aroyl vybraný z benzoylu a naftoylu;

R₂ je vodík, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aralkyl vybraný z benzylu, fenethylu a fenylpropylu;

R₃ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku;

R₄ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, nebo pokud je X kyslík, může R₄ spolu s R₅ tvořit -CH₂-O-;

• · · · · ·

X je jednoduchá vazba, -CH₂, kyslík nebo síra;

Ar je vybrán ze souboru obsahujícího fenyl, naftyl, indanyl a tetrahydronaftyl;

^r5 ^{a R}6 Í^sou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxyl, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, -CONH₂~, nižší alkoxyskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, nižší alkylsulfinyl obsahující až 6 atomů uhlíku a nižší alkylsulfonyl obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo

R₅ a Rg dohromady tvoří methylendioxyskupinu;

a jeho farmaceuticky přijatelných solí.

Předmětem tohoto vynálezu je také použití výše uvedeného duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfaj^-receptoru pro adrenalin, který má obecný vzorec III:

kde • · « · · · je vodík, nižší alkanoyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aroyl vybraný z benzoylu a naftoylu;

Rj je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku;

R₄ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, nebo pokud je X kyslík, může R₄ spolu s R₅ tvořit

-CH₂-O-;

X je jednoduchá vazba, -CH₂, kyslík nebo síra;

R₅ a Rg jsou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxyl, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, -CONH₂-, nižší alkoxyskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, nižší alkylsulfinyl obsahující až 6 atomů uhlíku a nižší alkylsulfonyl obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo

R₅ a Rg dohromady tvoří methylendioxyskupinu;

a jeho farmaceuticky přijatelných solí.

Dále se uvádějí podrobnější údaje o tomto vynálezu

v širších souvislostech.

Předkládaný vynález poskytuje nové použití sloučenin, které jsou duálními neselektivními antagonisty betaa alfa^-receptorů pro adrenalin, přesněji karbazolyl-4-oxypropanolaminových sloučenin obecného vzorce I, výhodně carvedilolu, pro inhibici tvorby neurotoxických BA4 oligomerních agregátů u savců, zejména u lidí. Konkrétně vynález lze aplikovat pro léčbu Alzheimerovi nemoci.

Způsob léčby Alzheimerovi nemoci zahrnuje postupné nebo současné podání sloučenin vzorce I a činidla zlepšujícího kognitivní funkce, jako je například Memric,.

Použití sloučenin, které jsou duálními neselektivními antagonisty beta- a alfa-^-receptorů pro adrenalin, přesněji karbazolyl-4-oxypropanolaminových sloučenin vzorce I, výhodně carvedilolu, v léčbě amyloidových onemocnění vede k inhibici tvorby neurotoxických BA4 oligomerních agregátů. Aplikace vynálezu vede k inhibici tvorby neurotoxických BA4 oligomerních agregátů, zejména při léčbě Alzheimerovi nemoci.

Při výhodném provedení je inhibice tvorby neurotoxických BA4 oligomerních agregátů založena na použití sloučenin vzorce IV, které jsou lépe známé pod názvem carvedilol neboli l-(karbazol-4-yloxy-3-[[2-(o-methoxyfenoxy)ethyl]amino]-2-propanol:

Tato sloučenina je použitelná pro léčbu Alzheimerovi nemoci.

Protože jsou sloučeniny vzorce I inhibitory amyloidosy, jsou tyto sloučeniny použitelné nejen pro léčbu Alzheimerovi nemoci, ale jsou použitelné také pro léčbu chronických zánětů, mnohočetného myelomu, diabetů typu II a Cretzfeldtovi-Jacobovi nemoci. Dále, sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu kardiálních obtíží u stařecké familiární amyloidové polyneuropatie a mohou také zabránit potřebě dlouhodobé dialýzy.

Sloučeniny vzorce I, jejichž příkladem je carvedilol, jsou nová léčiva s mnohotným mechanismem účinku, která jsou použitelná v léčbě mírné až střední hypertense. Je známo, že carvedilol je jak kompetitivní neselektivní antagonista beta-receptoru pro adrenalin a vasodilatans, tak také - při vyšších koncentracích - antagonista vápníkového kanálu. Vasodilatační účinek carvedilolu vzniká primárně v důsledku blokády alfa^-receptorů pro adrenalin, zatímco blok beta-receptorů pro adrenalin brání reflexní tachykardii, když je tento lék použit pro léčbu hypertense. Tyto mnohotné účinky carvedilolu jsou odpovědná za antihypertensní účinnost léku u zvířat a hlavně u lidí. (Viz Willette, R.N. , Sauermelch, C.F. & Ruffolo, R.R. Jr. (1990), Eur. J. Pharmacol. 176: 237-240; Nichols, A.J., Gellai, M., Ruffolo, R.R. Jr., (1991), Fundam: Clin. pharmacol. 5. 25-38; Ruffolo, R.R. Jr., Gellai, M., Hieble, J.P., Willette, R.N., Nichols, A.J. (1990) Eur. J. Clin. Pharmacol. 38: S82-S88; Ruffolo, R.R. , Jr., Boyle, D.A., Venuti, R.P., Lukas, M.A. , (1991), Drugs of Today, 27: 465-492; a Yue, T.-L., Cheng, H., Lysko, • · · · to · to · « · to · to·

- 7a P.G. , McKenna, P.J., Feuerstein, R., Gu, J., Lysko, K.A. , Davis, L.L. Feuerstein, G. (1992), J. Pharmacol. Exp. Ther., 263: 92-98.

Antihypertensní účinek carvedilolu je způsoben primárně snížením celkové periferní vaskulární resistence bez toho, že by bylo způsobena současná změna srdeční frekvence, která je obvykle spojena s působením jiných antihypertensních činidel. Viz Willette, R.N., výše; Nichols, A.J. , výše; Ruffolo, R.R. Jr., Gellai, M. , Hieble, J.P., Willette, R.N., Nichols, A.J. (1990) Eur. J. Clin. Pharmacol. 38: S82-S88. Carvedilol značně redukuje velikost infarktu v krysích, psích a prasečích modelech akutního infarktu myokardu, Ruffolo R.R. Jr. et al., Drugs of Today, výše, pravděpodobně v důsledku svého antioxidačního účinku, kterým zmírňuje peroxidaci lipidů iniciovanou volnými kyslíkovými radikály. Yue, T.-L. et al., výše.

Podle předkládaného vynález se mohou použít sloučeniny, které jsou duálními neselektivními antagonisty beta-receptoru pro adrenalin a alfa-^-receptoru pro arenalin, konkrétně sloučeniny vzorce I, výhodně carvedilol, pro léčbu amyloidos. Tyto sloučeniny inhibují tvorbu neurotoxických BA4 oligomerních agregátů a proto jsou uvedené sloučeniny použitelné pro léčbu Alzheimerovi nemoci.

Je známo, že některé sloučeniny vzorce I jsou metabolity carvedilolu. Některé výhodné sloučeniny podle předkládaného vynálezu, t.j. sloučeniny vzorce I, kde A je skupina vzorce II, kde R-j_ je -H, R₂ je -H, R₃ je -H, R₄ je ·· ····

99 99

- 7b -Η, X je O, Ar je fenyl, R₅ je ortho-OH a Rg je -H, a jeden z Ry, Rg nebo R-^θ je -OH, jsou metabolity carvedilolu.

Sloučeniny vzorce I mohou být připraveny způsobem popsaným v US patentu č. 4 503 067. Celý obsah uvedeného patentu je zde zahrnut jako odkaz.

Farmaceutické prostředky sloučenin vzorce I, včetně carvedilolu, mohou být podány pacientům jakýmkoliv medicínsky přijatelným způsobem, výhodně jsou podány orálně. Pro parenterální podání jsou prostředky ve formě sterilní injekční kapaliny uskladněné ve vhodném kontaineru, jako je například ampule, nebo jsou ve formě vodných nebo nevodných kapalných suspenzí. Charakter

9 9 9

9 9

99 a složení farmaceutického nosiče, ředidel a přísad bude samozřejmě záviset na vybraném způsobu podání, například na tom, je-li prostředek určen pro intravenosní nebo intramuskulární injekci.

Farmaceutické prostředky sloučenin vzorce i pro použití ve způsobu mohou být připraveny jako roztoky nebo lyofilizované prášky pro parenterální podání. Prášky mohou být rekonstituovány přidáním vhodného ředidla nebo farmaceuticky přijatelného nosiče před použitím. Kapalné prostředky jsou obvykle pufrované, izotonické vodné roztoky. Příklady vhodných ředidel zahrnují izotonický salinický roztok, standardní 5% dextrosu ve vodě nebo pufrovaný roztok octanu sodného nebo amonného. Takové prostředky jsou vhodné zejména pro parenterální podání, ale mohou být použity také pro orální podání nebo mohou být obsaženy v inhalačním přístroji s odměřitelným dávkováním nebo v nebulizátoru pro vdechování. Může být žádoucí přidání přísad jako je ethynol, polyvinylpyrrolidon, želatina, hydroxycelulosa, arabská klovatina, polyethylenglykol, mannitol, chlorid sodný nebo citrát sodný.

Alternativně mohou být takové sloučeniny připraveny ve formě kapslí, tablet nebo emulsí nebo sirupů pro orální podání. Mohou být přidány farmaceuticky přijatelné solidní nebo kapalné nosiče pro posílení nebo stabilizaci prostředku, nebo pro usnadnění přípravy prostředku. Mezi kapalné nosiče patří sirup, podzemnicový olej, olivový olej, glycerin, salinický roztok, ethanol a voda. Mezi solidní nosiče patří škrob, laktosa, dihydrat síranu vápenatého, terra alba, stearan hořečnatý nebo kyselina stearová, talek, pektin, arabská klovatina, agar nebo želatina. Nosičem může být také materiál zpomalující uvolňování, jako je glycerylmonostearat nebo glyceryldistearat, ·« ·* ·« ·· • · · • · *· • ·

9 9 999 9 9 9

9 9 ·· 99

99 • 9 9 · • ·9 9

9 9 9

9 99 samostatně nebo v kombinaci s voskem.

Množství solidní nosiče může být různé, ale výhodně je mezi 20 mg až 1 g na dávkovou jednotku. Farmaceutické prostředky jsou připraveny běžnými farmaceutickými techikami, včetně mletí, míšení, granulování a lisování pro tablety; nebo mletí, míšení a plnění pro kapsle z tuhé želatiny. Při použití kapalného nosiče je prostředek ve formě sirupu, elixíru, emulse nebo vodné nebo nevodné suspenze. Takové kapalné prostředky mohou být podány přímo p.o. nebo mohou být plněny do kapslí z měkké želatiny.

Dávkování pro člověka při léčbě onemocnění podle předkládaného vynálezu by nemělo přesáhnout dávkové rozmezí od přibližně 3,125 do přibližně 50 mg sloučeniny vzorce I, výhodně carvedilolu, výhodně dvakrát denně. Jak je odborníkům v oboru známo, pacient by měl zahájit léčbu nižší dávkou vybrané sloučeniny vzorce I, konkrétně carvedilolu, a měly by být sledovány dobře známé příznaky intolerance takových sloučenin, například pocity na omdlení. Pokud je zjištěno, že pacient toleruje takové sloučeniny, tak může být dávka pomalu zvyšována do dosažení udržovací dávky. Volba počáteční dávky nejvhodnější pro daného pacienta je provedena lékařem po zvážení známých faktorů, včetně, například, tělesné hmotnosti. V případě, že pacient toleruje dávku sloučeniny po dobu 2 týdnů je dávka na konci druhého týdne zdvojnásobena a pacient je sledován při této nové, vyšší dávce po dobu 2 týdnů a jsou monitorovány příznaky intolerance. Takto se pokračuje do dosažení udržovací dávky.

Vynález dále obsahuje způsob léčby Alzheimerov# nemoci, který obsahuje postupné nebo současné podání sloučenin vzorce I a činidla zlepšujícího kognitivní funkce, jako je například • 4

• 4

4 « 4 • · • 4 • ·

Memric. Sloučenina známá jako Memric je R-(Z)-(methoxyimino)-(1-azabicyklo[2.2.2]okt-3-yl)acetonitril, monohydrochlorid. Způsob její přípravy je popsán v EP-A-0392803, WO 95/31456 a WO 93/17018.

Dávka Memric se bude lišit v závislosti na závažnosti onemocnění, hmotnosti pacienta a relativní účinnosti sloučeniny. Nicméně, obvyklá denní dávka je nižší než 0,01 mg/kg, přesněji 0,003 mg/kg a méně, například 0,0001-0,003 mg/kg, například 0,00035-0,003 mg/kg, 0,0007-0,003 mg/kg, 0,0001-0,0007 mg/kg nebo 0,00035-0,002 mg/kg. Vhodné dávkové jednotky pro dosažení takových denních dávek jsou 5, 12,5, 25, 50 nebo 75 g, podané dvakrát denně, v případě 50 g pouze jednou denně.

Je třeba si uvědomit, že skutečné výhodné dávky sloučenin, které jsou použity v prostředcích podle předkládaného vynálezu, se liší podle daného typu prostředku, způsobu podání, místa podání a stavu pacienta.

Při použití sloučenin vzorce I způsobem podle předkládaného vynálezu se neočekávají žádné nepřijatelné toxické účinky.

Následující příklady ilustrují použití sloučenin podle předkládaného vynálezu, ale nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Odborníkůnm v oboru budou jasná mnohá další provedení předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Stanovení inhibice agregace beta-amyloidového peptidu imunotestem

A* *· * · ® • · ·· • · · · » · · ítř·· ·· »« » · * * » »·· • · · * · • « ♦ · ·» *· «» *· • · « · • * · * • · » * »A ·«

Beta-amyloidový (1-40) peptid od Bachem UK se rozpustí v 0,1% kyselině octové v koncentraci 2 mg/ml a dále se ředí na koncentraci 55 /*g/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (Sigma P4417) obsahujícím 0,02% Tween 20 (PBS Tween). Testované inhibitory se rozpustí v DMSO v koncentraci 10 mg/ml a dále se ředí v PBS-Tween. Pro každý testovaný inhibitor se 45 fal peptidového roztoku (55 jug/ml) inkubuje s 5 yUl vhodně ředěného inhibitoru přes noc při 37 °C v Linbro EIA II plotnách s mělkými jamkami (ICN, EIA II Microplates, kat. č.

76-181-04). Plotny se potáhnou během všech inkubací potahem pro plotny (Dynatech Labs., kat. č. 001-010-3501).

Pro imunotest se plotny (Gibco BRL, 96-jamkové plotny s plochým dnem, katalog, č. 1-67008-A) potáhnou (přes noc při 4 °C) zachycovací protilátkou 2F12, namířenou proti beta-amyloidovému 1-16 peptidu, která je použita v ředění 1:3000 v PBS. Po potažení se roztok protilátky aspiruje a plotny se blokují inkubací po dobu 60 minut při 37 °C s 1% (obj./obj.) želatinou (Amersham RPN416), 2,5% (obj./obj.) kozím sérem (Sigma G9023) v testovacím pufru (50 mM Tris HC1, 150 mM NaCl, 0,5% hovězí gamma globuliny, 0,05% Tween 20, pH 7,4, před použitím filtrovaném přes 0,2 yum filtr). Po blokování se plotny promyjí 4 x 250 A¹ fosfátem pufrovaného salinického roztoku s Tween 20 (Sigma kat. č. P3563). Pro testování obsahu agregovaných peptidů se vzorky inkubují s testovaným inhibitorem, ředí se testovacím pufrem a 50 /»1 alikvoty obsahující ekvivalent 20 ng beta-amyloidu 1-40 se přidají do jamek 2F12 potažené plotny. Detekční protilátkou je dextran-biotin konjugovaný 2F12 fragment: tato protilátka se ředí 1:3000 v testovacím pufru. 2F12 potažená plotna obsahující beta-amyloid 1-40 a 150 /*1 detekční protilátky se inkubuje přes noc při 4 °C. Plotny se potom promyjí (4 x 250/>1) fosfátem pufrovaným salinickým roztokem s Tween 20.

9 9 9

9 • 9 9 9 99

Kvantifikace tvorby komplexů peptid-protilátka se provede vazbou streptavidinu-europia. Do každé jamky se přidá 200/z-l streptavidinu-Europia (Wallac, katal. č. 1244-360) ředěného 1:500 v 0,5% BSA, 0,05% gamma-globulinu, 0,01% Tween 20, 20 M DPTA (Sigma D 6518) v Tris pufrovaném salinickém roztoku, pH 7,4. Plotny se inkubují po dobu 60 minut před promytím fosfátem pufrovaným salinickým roztokem. Nakonec se do každé jamky přidá 200/U.1 zesilovacího roztoku (Wallac, kat. č. 1244-105) a plotny se třepou po dobu 5 minut při teplotě okolí před tím, než se měří emise fluorescence v závislosti na času na Wallac 1234 Delfia přístroji pro měření fluorescence.

Beta-amyloid 1-40, který se agregoval způsobem popsaným výše, vyvolává 30- až 50-krát vyšš fluorescenci než pozadí. Tomuto zvýšení fluorescence je zabráněno tehdy, když je provedena inkubace s vhodným inhibitorem. Peptid, který nebyl preinkubován, vyvolává fluorescenci pouze 2- až 3-krát vyšší než pozadí. Proto je toto zvýšení způsobeno detekcí agregovaného peptidu.

Příklad 2: Stanovení inhibice tvorby toxických agregátů beta-amyloidového 1-40 peptidu

Beta-amyloidový (1-40) peptid od Bachem UK se rozpustí v 0,1% kyselině octové v koncentraci 2 mg/ml a dále se ředí na koncentraci 55 /A.g/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (Sigma P4417) obsahujícím 0,02% Tween 20 (PBS Tween). Testované inhibitory se rozpustí v DMSO v koncentraci 10 mg/ml a dále se ředí v PBS-Tween. Pro každý testovaný inhibitor se 45/λ.Ι peptidového roztoku (55 /-.g/ml) inkubu je s 5/J vhodně ředěného inhibitoru přes noc při 37 °C v Linbro Titertek EIA II plotnách s mělkými jamkami (ICN, EIA II Microplates, kat. č.

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid, Sigma) je metabolické barvivo vychytávané mitochondriemi živých buněk, kde je metabolizováno, za vzniku modrého formazanového krystalického materiálu. Tento materiál může být solubilizován a optická hustota vzniklého modrého roztoku je úměrná mitochondriální aktivitě (životaschopnosti) buněk.

Pro testování toxicity se IMr32 lidské neuroblastomové buňky (ECACC, Porton Down, UK) umístí v hustotě 6 x 10⁴ buněk/cm²v 96-jamkové mikrotitrační plotně (Nunc) v objemu 100 ^1 kultivačního media (DMEM:Hams F12 1:1) na jamku a provede se inkubace po dobu 2 hodin (CO₂ inkubátor, 37 °C). Inkubované roztoky beta-amyloidu 1-40 obsahující testované inhibitory se ředí v kultivačním mediu na konečnou (při kontaktu s buňkami) koncentraci beta-amyloidu 1-40 0,1 až 10 ng/ml a přidají se k IMR32 buňkám. V každém testu se použije také vehikulum.

Plotny se inkubují přes noc (C0₂ inkubátor, 37 °C). Do každé jamky se potom přidá 50 1 MTT roztoku (5 mg/ml v DMEM:F12/0,4% DMSO) a plotny se potom inkubují po dobu dalších 4 hodin (C0₂ inkubátor, 37 °C). Medium se potom aspiruje a formazanový materiál se rozpustí adicí 200ý*-l DMSO a 25 ýUl Sorensenova glycinového pufru (0,1 M glycin, 0,1 M NaCl, pH 10,5 s 0,1 M NaOH). Plotny se odečítají při 590 nm a inhibice toxicity se hodnotí jako rozdíl v OD pro buňky za přítomnosti a za nepřítomnosti inhibitoru.

Výsledky

1) Výsledky imunotestu • · · · • ·

Beta-amyloid 1-40 {50 g/ml) byl inkubován popsaným způsobem s carvedilolem nebo jeho analogy. Obsah agregovaného peptidu v inkubovaném materiálu byl stanoven imunotestem a inhibice byla určena jako snížení maximální pozorované fluorescence.

Carvediiol IC₅₀ 38 uM (n=6) R=4-OH; lC_so79uM(n=10) IC50 450 uM <n=3)

R=6-OH; ICso 42 uM (n=9)

2) Inhibice tvorby toxických agregátů v IMR32 buňkách

V tomto příkladu bylo 50 g/ml beta-amyloidu 1-40 inkubováno přes noc s 50 g/ml carvedilolu {nebo vehikula). Vzorek byl potom ředěn v kultivačním mediu a buňky byly vystaveny působení 0 až 10 ng/ml beta-amyloidu 1-40. Za absence carvedilolu způsobil beta-amyloid 1-40 na koncentraci závislé snížení redukce MTT při všech testovaných koncentracích peptidu.

Použití carvedilolu během agregace vedlo k významnému posunu křivky koncentrace-odpověď doprava tak, že žádné snížení redukce MTT nebylo pozorováno při koncentraci peptidu 0,1 až 1 ng/ml.

Výsledky:

Carvedilcl - 50ug/ici

—BA4+50V ί-β—BA4+C5O

0.1000.000----0.1 05 1 5 10

Konc. Peptidu (ng/ml) , o

• · • · ♦ » • · ·· ··

Předešlý popis ilustruje použití sloučenin podle předkládaného vynálezu. Vynález není nicméně omezen na popsaná provedení, ale zahrnuje všechny modifikace spadající do rozsahu připojených patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa^receptoru pro adrenalin pro výrobu léku pro léčbu onemocnění způsobených amyloidem.
2. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa-^receptoru pro adrenalin podle nároku 1, který má obecný vzorec I:

(I) kde

R₇ až R₁₃ jsou nezávisle -H nebo -OH; a

A je skupina vzorce II:

(II) ve kterém

R_x je vodík, nižší alkanoyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aroyl vybraný z benzoylu a naftoylu;

• · · · · ·

R₂ je vodík, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aralkyl vybraný z benzylu, fenethylu a fenylpropylu;

R₃ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku;

R₄ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, nebo pokud je X kyslík, může R₄ spolu s R₅ tvořit -CH₂-O-;

X je jednoduchá vazba, -CH₂, kyslík nebo síra;

Ar je vybrán ze souboru obsahujícího fenyl, naftyl, indanyl a tetrahydronaftyl;

R₅ a R₆ jsou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxyl, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, -CONH₂-, nižší alkoxyskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, nižší alkylsulfinyl obsahující až 6 atomů uhlíku a nižší alkylsulfonyl obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo

R₅ a R₆ dohromady tvoří methylendioxyskupinu;

a jeho farmaceuticky přijatelných solí.
3. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa-^-receptoru pro adrenalin podle nároku 1, který má obecný vzorec III:

·· ···* « · · · • · · · · • · · · · «· ·· ··· ·· ·· (III) kde je vodík, nižší alkanoyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aroyl vybraný z benzoylu a naftoylu;

R₂ je vodík, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aralkyl vybraný z benzylu, fenethylu a fenylpropylu;

R₃ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku;

R₄ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, nebo pokud je X kyslík, může R₄ spolu s R₅ tvořit

-CH₂-O-;

X je jednoduchá vazba, -CH₂, kyslík nebo síra;

Ar je vybrán ze souboru obsahujícího fenyl, naftyl, indanyl a tetrahydronaftyl;

R₅ a R_g jsou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxy1, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, -CONH₂~, nižší alkoxyskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, • ·· ·· • · · · » · • · · · · • · · · ♦ · • · ··!· »·· ·· ·· benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, nižší alkylsulfinyl obsahující až 6 atomů uhlíku a nižší alkylsulfonyl obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo

R₅ a Rg dohromady tvoří methylendioxyskupinu;

a jeho farmaceuticky přijatelných solí.
4. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa-j^-receptoru pro adrenalin podle nároku 1, kde uvedeným antagonistou je carvedilol.
5. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa-^-receptoru pro adrenalin pro výrobu léku pro léčbu Alzheimerovi nemoci.
6. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa^^-receptoru pro adrenalin podle nároku 5, který má obecný vzorec I:

kde

R₇ až Rq_3 jsou nezávisle -H nebo -OH; a

- 20 ·« ···· • · · • to · · • to ·· • · · · • · · ·

9 9 · 9 9

9 9 9 9

9 9 99 je skupina vzorce II:

(II) ve kterém

R-L je vodík, nižší alkanoyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aroyl vybraný z benzoylu a naftoylu;

R₂ je vodík, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aralkyl vybraný z benzylu, fenethylu a fenylpropylu;

RR, je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku;

je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, nebo pokud je X kyslík, může R₄ spolu s R₅tvořit -CH₂-O-;

je jednoduchá vazba, -CH₂, kyslík nebo síra;

Ar je vybrán ze souboru obsahujícího fenyl, naftyl, indanyl a tetrahydronaftyl;

R₅ a R₆ jsou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxy1, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, -CONH₂~, nižší alkoxyskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu obsahující

9 · ·*< * » · * • · 9 · ·· ·· ·· ·· « · * · • · » * · * • ······ • · · · · ·

999 999 ·· ·· ·· až 6 atomů uhlíku, nižší alkylsulfinyl obsahující až 6 atomů uhlíku a nižší alkylsulfonyl obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo

R₅ a Rg dohromady tvoří methylendioxyskupinu;

a jeho farmaceuticky přijatelných solí.
7. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa-^-receptoru pro adrenalin podle nároku 5, který má obecný vzorec III:

(III) kde

R-j_ je vodík, nižší alkanoyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aroyl vybraný z benzoylu a naftoylu;

R₂ je vodík, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku nebo aralkyl vybraný z benzylu, fenethylu a fenylpropylu;

R₃ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku;

R₄ je vodík nebo nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, nebo pokud je X kyslík, může R₄ spolu s R₅ tvořit

-CH₂-O-;

X je jednoduchá vazba, -CH₂, kyslík nebo síra;

Ar je vybrán ze souboru obsahujícího fenyl, naftyl, indanyl a tetrahydronaftyl;

R₅ a Rg jsou nezávisle vybrány ze souboru zahrnujícího vodík, fluor, chlor, brom, hydroxyl, nižší alkyl obsahující až 6 atomů uhlíku, -CONH₂-, nižší alkoxyskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, benzyloxyskupinu, nižší alkylthioskupinu obsahující až 6 atomů uhlíku, nižší alkylsulfinyl obsahující až 6 atomů uhlíku a nižší alkylsulfonyl obsahující až 6 atomů uhlíku; nebo

R₅ a Rg dohromady tvoří methylendioxyskupinu;

a jeho farmaceuticky přijatelných solí.
8. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa^-receptoru pro adrenalin podle nároku 5, kde uvedeným antagonistou je carvedilol.
9. Použití duálního neselektivního antagonisty beta-receptoru a alfa^-receptoru pro adrenalin v kombinaci nebo ve spojení s činidlem zlepšujícím kognitivní funkce pro výrobu léku pro léčbu Alzheimerovi nemoci.
10. Použití podle nároku 9, kde duálním neselektivním antagonistou beta-receptoru a alfa^-receptoru pro adrenalin je carvedilol.

• ·
11. Použití podle nároku 9, kde činidlem zlepšujícím kognitivní funkce je Memric.