CZ107095A3

CZ107095A3 - Compounds inhibiting fernesylproteintransferase and precursors thereof, pharmaceutical composition containing thereof and the use of such compounds for preparing pharmaceutical preparations

Info

Publication number: CZ107095A3
Application number: CZ951070A
Authority: CZ
Inventors: S Jane Desolms; Samuel L Graham
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1992-10-29
Filing date: 1993-10-27
Publication date: 1996-10-16
Also published as: AU683627B2; SK53995A3; JPH08502971A; HUT72188A; FI952010A; US5326773A; FI952010A0; NO951647L; CA2147286A1; NZ257766A; WO1994010137A1; HU9501240D0; PL308553A1; KR950704247A; EP0668856A1; NO951647D0; AU5453994A; EP0668856A4

Description

Sloučeniny, inhibující farnesylproteintransferázu a jejích prekursor/, farmaceutický prostředek s jejich obsahem, a použití těchto látek pro výrobu farmaceutických prostředků

Oblast technikv

Vynález se zabývá látkami, schopnými inhibovat enzym famesylproteiníransferázu a famesyfaci onkogenní bílkoviny Ras. Dále zahrnuje chemoterapeutika prostředky, obsahující sloučeniny podle vynálezu a. způsob inhibice uvedeného enzymu a řamesyiace onkogenního proteinu Ras.

Dosavadní stav technikv

Aktivování genu Ras 'oyfo prokázáno u mnoha typů lidské rakoviny, včetně kolorektálnino karcinomu (nádoru tlustého střeva), exokrinniho pankreatickáho karcinomu a myeloídních leukémií. Sioícgické a biochemická studie působení Ras naznačují, že Ras funguje stejné jako G-reguíační bílkovina, neboť se musí nacházet v plasmatické membráně a musí. se vázat s GTP pro možnou transformaci buněk (Gibos, J, a spoluautoři, Microbiol. Rev, 53, 171-236, 1339). Formy Ras v rakovinných buňkách vykazují mutace, které tuto bílkovinu odlišují od Ras v normálních buňkách.

Na lokalisaci Ras v membráně se podílejí nejméně 3 posttransíační modifikace a ke všem 3 modifikacím dochází na C-konci Ras. C-konec bílkoviny Ras obsahuje část sekvence, zakončenou CAAX* nebo úsekem ’Cys-Aaa^:-Aaa--Xaa (Aaa je alifatická aminokyselina, Xaa je jakákoli aminokyselina) (Wiilumsen se spoluautor/, Nátuře 310, 533-536, 1984). K dalším bílkovinám, obsahujícím tento úsek. patří bílkoviny vázající GTP, podobné Ras, jako jsou Rho, spojovací faktor/ hub, lamely jádra a podjednotka gama transducinu.

-2 K farnesylaci Ras pomocí fosfátu isoprenoidfarnesylu (FPP) dochází v podmínkách in vivo na cysteinu za vzniku thioetherová vazby (Hancock se spoluautory, Cell 57, 1167, 1989; Casey se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci.USA 86, 8323, 1989). Kromě toho jsou Ha-Ras a N-Ras palmitoylovány cestou vytvoření thioesteru na cysteinovém zbytku, ležícím blízko C-koncového cysteinu, který je příjemcem farnesylu (Gutierrez se spoluautory, EMBO J. 8, 1093-1098, 1989; Hancock se spoluautory, Cell 57, 1167-1177, 1989). Ki-Ras cystein, který je příjemcem palmitátu, neobsahuje. Poslední 3 aminokyseliny na C-konci Ras jsou odstraňovány proteolyticky a na novén C-konci dochází k esterifikací methylem (Hancock se^poiuautory, viz výše). Spojovací faktor hub a savčí jaderné lamely , procházejí stejnými modifikačními kroky (Anderegg se spoluautory, J. Biol. Chem:

263, 18236, 1988; Farnsworth se spoluautory, J. Biol. Chem. 264, 20422, 1989).

Inhibice famesylace Ras v podmínkách in vivo byla prokázána v případě lovastatínu (Měrek and Co., Rahway, NJ) a compactinu (Hancock se spoluautory, viz výše; Casey se spoluautory, viz výše; Schafer se spoluautory, Science 245, 379, fl

1989). Tato léčiva inhibují HMG-CoA;reduktázu, enzym, limitující rychlost tvorby polyisoprenoidů a prekursoru farnesylpyrofosfátu. Bylo prokázáno, že farnesylproteintransferáza, využívající jako prekursor farnesylpyrofosfát, je enzymem, odpovídajícím za farnesylaci Ras. (Reiss se spoluautory, Cell 62, 81-88, * ’

1990; Schaber se spoluautory, J.Biol. Chem. 265, 14701-14704, 1990; Schafer se spoluautory, Science 249, 1133-1139, 1990; Manne se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 7541-7545,1990).

Inhibice famesylproteintransferázy a tím i famesylace bílkoviny Ras blokuje schopnost Ras transformovat normální buňky na rakovinné buňky. Sloučeniny podle vynálezu inhibují farnesylaci Ras a tím vytvářejí rozpustnou bílkovinu Ras, která, jak bylo potvrzeno měřením infračerveného spektra, muže působit jako převládající negativní inhibitor funkce Ras. Zatímco se v rakovinných buňkách může rozpustná

-3 bílkovina Ras stát převládajícím negativním inhibitorem, v normálních buňkách by jako inhibitor nepůsobila.

- Forma Ras, která se vyskytuje v cytosolu (neobsahující úsek Cys-Aaa’-Aaa²-Xa a membránové domény) a je aktivovaná (o snížené aktivitě GTPázy, zůstávající navázané na GTP), působí jako převládající negativní inhibitor fungování bílkoviny Ras, membránově vázané (Gibbs se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 6630-6634, 1989). Cytosoiická forma Ras s normální GTPázovou aktivitou Ínhibičně nepůsobí. Gibbs se spoluautory, viz výše, prokázal tento účinek na zárodečných, vaječných buňkách rodu Xenopus a na savčích buňkách.

Podání sloučenin' podle vynálezu, k blokování farnesylace. nejen snižuje množství Ras v membráně, ale vytváří také cytosolickou zásobu, (pool) Ras. V nádorových buňkách s aktivovanou Ras působí cytosolová zásoba jako další antagonista funkce, membránově vázané Ras. V normálních buňkách, majících normální Ras, cytosoiická zásoba Ras tímto způsobem'jako antagonista,nepůsobí.. Pokud nedojde k celkové inhibici farnesylace, jsou další farnesylované bílkoviny schopny pokračovat ve svých funkcích.

* ' . í . - . ·

Aktivita famesylproteintransferázy - může být úpravou dávky podané sloučeniny snížena ’ nebo zcela, inhibována. Snížení, enzymové aktivity famesylproteintransferázy úpravou dávky podané sloučeniny, muže být vhodná k vyloučení možných nežádoucích vedlejších účinků, vznikajících interferencí s jinými metabolickými procesy, které využívají tento enzym.

Tyto sloučeniny a jejich analogy jsou inhibitory famesylproteintransferázy.

Farnesylproteintransferáza využívá farnesylpyrofosfát ke kovalentnímu modifikování thiolové skupiny cysteinu v oddílu CAAX bílkoviny Ras farnesylovou skupinou.

Inhibice biosynthesy famesylpyrofosfátu inhibováním HMG-CoA:reduktázy blokuje lokalisaci Ras v membráně in vivo a inhibuje funkcí Ras. Inhibice famesylprotein-4transferázy je oproti všeobecnému inhibitoru biosynthesy isoprenu specifičtější a je doprovázena horečnatými vedlejšími účinky.

Dříve bylo prokázáno, že tetrapeptidy se sekvencí CAAX, obsahující cystein jako konečný zbytek N-konce, inhibují famesylací Ras (Schaber se spoluautory, viz výše; Reiss se spoluautory, viz výše; Reiss se spoluautory, PNAS 88, 732-736,

1991). Takové inhibitory mohou působit inhibičně v době, kdy slouží jako druhé substráty famesyltransferázového enzymu bílkoviny Ras, anebo mohou být čistě kompetitivními inhibitory (US patent 5 141 851, University of Texas).

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou analogy peptidu, obsahující dvě , redukované peptidové vazby a mající obecný vzorec 0-/ΥΌΗ₂ΝΗ/Χ33¹-/νΧΗ₂ΝΗ£

Xaa²-Xaa³ kde C je cystein a Xaa¹'³ je kterákoli aminokyselina a dusík mezi Xaa¹ áó Xaa² je alkylovaný. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou stálými inhibitory farnesyltransferázy bílkoviny Ras. Přítomnost redukovaných amidových vazeb ..j uděluje těmto inhibitorům metabolickou stabilitu, takže jsou schopné inhibovat- ./¾ farnesylaci Ras in vivo. Redukce první a druhé peptidové vazby může také vést k? .. , neočekávanému zvýšení vnitřní (intrinsic) aktivity ve vztahu enzym-inhibitor;

Alkylace reaktivního dusíku mezi Xaa¹ a Xaa² poskytuje těmto analogům chemickou stabilitu a zvyšuje tak jejich aktivitu in vivo (v buněčné kultuře. Zvláště užitečné je zjištění, že laktonové nebo esterové formy těchto inhibitorů jsou prekursory (prodrugs),, které účinně dodávají aktivní hydroxykyseliny nebo kyseliny do intracelulámích prostor, kde dochází k farnesylaci bílkoviny Ras.

t

Předmětem tohoto vynálezu je tedy vyvinutí sloučenin na základě tetrapeptidů, se dvěma redukovanými amidovými vazbami, jejichž dusíkový atom mezi Xaa¹ a Xaa² je alkylovaný, a které budou inhibovat farnesylproteintransferasu a farnesylaci onkogenni bílkoviny Ras.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je vyvinutí chemoterapeutických prostředků, obsahujících sloučeniny podle tohoto vynálezu a způsoby výroby

Podstata vynálezu

t i

i ť

?

kde

R znamena

necc

R.... _t je vodík,, alkylová skupina, aralkyiová skupina, acylo-: vá skupina, aracylová skupina, aroylcvá skupina,' alkyl’ sulfenylová skupina’, aralkylsulfónyLcvá skupina nebo’ arylsulfonylová skupina, přičemž alkylové a acylové skupiny obsahují rovný nebo větvený uhlovodíkový řetězec, tvořený 1 až 6- atomy uhlíku,

R~ a R jsou vedlejší retezce přírodně se vyskytujících aminokyselin, včetně jejich oxidovaných forem, kterými mohou být methionin sulfoxid nebo methionin sulíon, nebo v jiném případě mohou být substituovanými nebo 'fc

- o az Ui n

a jej nssuostí tuovanými alifatickými, aromatickými nebo heoeroaromatickými skupinami, jako al·lylovými, cyklchsxylovými, fenyiovými, pyridylovými nebo imidazotylovými skupinami nebe nasycenými řetězci o 2 až 8 uhlíkových atomech, které mcnou být větvené nebo nevětvené, kde alifatické substituenty mohou být substituovány aromatickým, nebo heteroaromatickým kruhem.

je vedlejší řetězec přírodně, se vyskytujících aminokyselin, včetně jejich oxidovaných forem, kterými mohou být methioninsulfoxid nebo methionin suífon, nebo v jiném případe mohou být substituovanými nebo nesucstituovanými alifatickými, aromatickými nebe heteroaromatickými skupinami,, jako allylovými, cyklohexylovými, fenyiovými, pyridylovými nebo imidazolovými skupinami nebo nasycenými řetězci o 2 až 3 atomech uhlíku, které mohou být větvené nebo nevětvené, kde alifatické substituenty mohou být substitucvány aromatickým nebo heteroarematiekvm kruhem, -CrhCHhC-- nebo , ^- d i d d d je alkylová skupina, která obsahuje rovný nebo větvený uhlovodíkový řetězec z 1 až 5 uhlíkových atomů,· který může být substituován aromatickou nebo heteroaromatickcu skupinou',.

je substituovaná nebo· nesuesti-tuovaná. alifatická, aromatická nebo heteroaromatická skupina, jako nasycené řetězce 1 až 3 uhlíkových atomů, které mohou být přímé nebo větvené, a kde alifatický substituent může být substituován aromatickým nebo heteroaromatickým- kruhem, znamená 0, 1 nebo 2, ich farmaceuticky přijatelné soli a disulfidy.

Podstatu vynálezu tvoř pro inhibici farnesylace bii sloučeniny obecného vzorce I í také farmaceutický prostředek kovi.ny Ras vzhledem k tomu, že tuto farnesylaci inhibují.

Součástí podstaty vynálezu je také použití- uvedených látek pro výrobu farmaceutických prostředků pro inhibici farnesylace bílkoviny Ras a tím i pro léčení zhoubných nádo*rů.

Sloučeniny, vyjádřené, obecným vzorcem I .zahrnují jak. vlastní účinné látky, tak-některé jejich prekursory., jak bude dále podrobněji uvedeno.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu, kterým se dává přednost, jsou:

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropyfamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl'isoleucyi-homoserin,

N-[2(S)-(2(R)-amÍno-3-merkaptopropylamino)-3(S)rmethyipentyl]-N-methyl-isoleucyl-homoserinový lakton,

N-[2(S)-(2(R)-amino^3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpenty[]-N-methyl-fenylalanyl-homoserin,

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methyipentyt]-N-methyl-fenylalanyl-homoserinový lakton,

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3-methylbutyl] - N-methyt-fenylalanyfhomoserin,

-11 N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3-methylbutyl] - N-methyl-fenyfalanylhomoserinový lakton,

3(S)-(N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucylamino}-3-methyltetrahydropyran-2-on, kyselina 2(S)-{N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyi]-Nmethyl-iso-leucylamino}-2-methyl-5-hydroxypentanová, kyselina 2(S)-{N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamíno)-3(S)-methylpehtyl]-Nmethy!-iso-leucyiamino}-5-methyÍ-5-hydroxyhexanová,

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropyíamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methy(-norvalyl -homoserin,

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3{S)-methylpentyl]-N-methyl-norvaly! -homoserinový lakton,

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpenty!]-N-methy[-isoleucyí-methionin, methylester N - [2(S)-{2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyí ]- N -methyl-isoleucyl-methioninu, -- - *

N - [ 2 (S) - (2 (R) - amino-3-merkaptopropy!amino) - 3 (S) - methyípentyl]-N-methyl-fenylalanyl-methionin, methylester N -[ 2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino) - 3 (S)methylpentyl] - N-methyl-fenylalanyl-methioninu,

3(S)-{N-E2(Sj-(2(R)-a'mino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentylI-N-methyl-isoleucylamino}-6,6-dimethyltetrahydropyran-2-on,

N-[2(S)-(2(R)-amÍno-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-norvaÍyl -methionin, methylester N - [2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino) - 3(S)-methylpentyl]-N-methýl-norvalyl-methioninu,

N - [ 2(S) - (2(R) - amino-3-merkaptopropylamino) - 3(S)-methylpentyl]-N-methyl - Dnorvalyl-homoserin, nebo

N - [ 2(S) - (2(R) - amino-3-merkaptopropylamino) - 3(S)-methy1perityl]-N-methyl - Dv norvalyl-homoserinový lakton

-12a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Mezi sloučeniny podle tohoto vynálezu, kterým se dává největší přednost, patří následující páry, představující inhibitor a odpovídající esterový či iaktonový prekursor:’

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-Ň-methyI-iso1eucylhomoserin

N-[2(S)-(R)-amino-3-merkaptapropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyI-isoleucyl-homoserinový lakton

O

I

-13N-[2(S)’(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyI]-N-methy!-isoleucyl-methionin

Ν-[2(5)-(2(Κ)-3ΐηίηο-3-ηθΓΚ3ρΙορΓοργΐ3Γη!ηο)-3(5)-ηβ^νΙρβηΐνΙ]-Ν-πβίήγΙ-ί3θΙβυεγΙ-methioninový methylester

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V tomto vynálezu jsou používané aminokyseliny označovány jak pomocí třípísmenového kódu, tak i jednotlivými písmeny, jak je znázorněno dále:

Alanine	Ala	A
Arginine	Arg	R
Asparagine	Asn	K
kyselina asparagová	Asp	D
Asparagine či
kyselina asparagová	Asx	B
Cysteine	Cys	C’
Glutamine	Gin	Q
kyselina glutamová	Glu·	E
Glutamine či
kyselina glutamová	Glx	Z
Glycine.	Gly	G
Histidine	Eis	H
Isoleucine	Xle	I :
Leucine,	Leu	L
_r Lysině	Lys	K
Methionine.	Met	M
Phenylalanine	Phe	F
Proline	Pro	P
Serine	Ser	S
Threonine '	'Thr ·’···'·	τ -
Tryptophan	Trp	W
Tyrosine	Tyr	ϊ
Valine	Val	v

-15 Farmaceuticky přijatelné soie sloučenin podle vynálezu zahrnují běžné netoxické sole sloučenin podle tohoto vynálezu, vznikající například z netoxíckých anorganických nebo organických kyselin. Mezi takové běžné netoxické sole patří například sole, odvozené od anorganických kyselin, jako chlorovodíkové, bromovodíkové, sírové, sulfamové, fosforečné, dusičné a podobně; a sole připravené z organických kyselin jako kyseliny octové, propionové, jantarové, glykolové, stearové, mléčné, jablečné, vinné, citrónové, askorbové, pamoové, L * ř maleinové, hydroxymaleinové, fenyloctové, glutamové, benzoové, salicylové, J suifanilove, 2-acetoxybenzoové, fumarové, toluensulfonové, methansulfonove, » ethandisulfonové, šťavelové, isethionové, trifluoroctové a podobně.

f ·;

Farmaceuticky přijatelné sole sloučenin podle tohoto vynálezu mohou být . synthetisovány ze sloučenin podle tohoto vynálezu, které obsahují basickóu Částici, , běžnými chemickými metodami. Obecně se sole připravují reakcí volné base se stechiometrickým množstvím nebo s přebytkem anorganické nebo organické .. kyseliny, vytvářející sul, ve vhodném rozpouštědle anebo v různých kombinacích rozpouštědel.

Sloučeniny podle, vynálezu mohou být synthetisovány z aminokyselin, které * R je tvoří, běžnými metodami synthesy peptidu a dalšími metodami, popsanými níže. |

Standardní metody synthesy peptidu jsou popsány například v následujících f i^- pracích: Schroeder se spoluautory, 'The Peptides, díl I, Academie Press 1965, j nebo Bodánszky se spoluautory, Peptide Synthesis'', Interscience Pubiishers, {

1966, či McOmie (editor), Protective Groups in Organic Chemistry, Plenům Press, ~

1973, Barany se spoluatory, The peptides: Analysis, Synthesis, Biology 2, kap. 1, i

Academie Press, 1980, a Stewart se spoluautory, Solid Phase Peptide Synthesis, druhé vydání, Pierce Chemical Company, 1984, Poznatky z těchto prací jsou zde uvedeny jako odkazy.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se kromě jiných standardních postupů, jako je hydrolysa esterů, odštěpení chránících skupin atd., známých z literatury,

-16nebo uvedených v postupech pokusu, připravují využitím reakcí A až C , které jsou znázorněny na reakčním schématu. Klíčovými vazbu tvořícími reakcemi jsou:

Reakce A. Tvorba amidové vazby a odštěpení chránící skupiny za použití standardního roztoku nebo postupu, prováděných v pevné fázi.

Reakce B. Příprava redukované peptidové podjednotky redukční alkylací aminu aldehydem za použití kyanoborohydridu sodného nebo jiných redukčních činidel.

Reakce C. Alkylace redukované peptidové pdjednotky alkyl- nebo aralkylhalidem, případně také redukční alkylace redukované peptidové podjednotky pomocí aldehydu za využití kyanoborohydridu sodného nebo jiných redukčních činidel.

Tyto reakce mohou být využity vnávaznosti'po sobě k vytvoření sloučenin;,, podle vynálezu, nebo mohou být použity k synthese fragmentů, které jsou následně spojeny alkylačními reakcemi, uvedenými v reakčním schématu.

Reakční schéma.

Reakce A. Spojení zbytků k vytvoření amidové vazby

H + H₂N

EDC, HOBT či HOOBT

Et₃N, DMF

HC1 či

TFA

O

-174 . Reakční schéma B

Reakce B. Příprava redukované peptidové podiednotky redukční aikylací

O R^J

Lór

H o

H +

S^B η,νΛΤ” o

NaCNBH₃

Reakční schéma C

Reakce C. Alkylačně redukční alkylace redukované peptšdovych podjednotek

O R^A H o _O'^N^^x-^xNV^'OR⁶ R⁵X, base ^H Ř^B 2 *

R⁷CH, NaCNBH₃

kde R^A a R^B jsou R², R³ či R⁴ jak bylo definováno dříve; X je odštěpující se skupina, např. Br', J* či MsO'; a zbytek R⁷ je definován tak, že R^s vzniká v redukčním alkylačním postupu, či

-18 Sloučeniny podie vynálezu inhibují farnesylprateintransferázu a farnesylaci onkogenní bílkoviny Ras. Tyto sloučeniny jsou využitelné jako farmaceutická činidla pro savce, zvláště pak člověka a je možné jich použít u pacientů při léčbě rakoviny. Mezi typy nádorových onemocnění, které mohou být ovlivňovány sloučeninami podle tohoto vynálezu, patří, ovšem ne výhradně, karcinom tlustého střeva a konečníku, endokrinní pankreatický karcinom a myeolidní leukemie.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány savcům, především člověku, buď samotné, nebo výhodněji v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosiči či ředícími látkami, podle volby se známými adjuvantními látkami jako je kamenec, ve farmaceutických- prostředcích a : podle standardn( farmaceutické ;Λ praxe. Sloučeniny lze podávat, orálně, nebo parenteráině; včetně, intravenosního;; intramuskulámího, intraperitoneálního, subkutáního, rektálního a místního způsobu podání.

Při orálním užívání chemoterapeutické látky podle: předkládaného.vynálezu;, může být zvolená sloučenina podávána například ve formě tablet Či kapslí, nebo jako vodný roztok či suspense. V případě tablet pro orální užívání patří mezi běžně užívané nosiče laktosa a obilný (kukuřičný) škrob, a běžně se přidávají také kluzné látky jako stearát hořečnatý. Při orálním podání ve formě kapslí patří mezi vhodné ředící fátky laktosa á sušený obilný škrob. Pokud jsou k orálnímu použití vyžadovány vodné suspense,, kombinuje sé aktivní složka s emusifikačním a suspensi tvořícím činidlem. Pokud je to žádoucí, lze přidat určitá sladidla a/nebo dochucovací činidla. K intramuskulámímu, intraperitoneálnímu, subkutánímu a intrevenosnímu podání jsou obvykle připravovány sterilní roztoky aktivní složky, přičemž by mělo být pH roztoku vhodně upraveno a pufrováno. Pro intravenosní podání by měla být kontrolována celková koncentrace rozpuštěných látek, aby byly přípravky isotonické.

Předkládaný vynález rovněž obsahuje farmaceutický prostředek, užitečný při

-19léčbě rakoviny, zajišťující podání terapeuticky účinného množství sloučenin podle tohoto vynálezu, v přítomnosti farmaceuticky přijatelných nosičů nebo ředících látek, anebo bez nich. Vhodné prostředky podle tohoto vynálezu zahrnují vodné roztoky s obsahem sloučenin podle vynálezu a farmakologicky přijatelných nosičů, např. solného roztoku, při hodnotě pH například 7,4. Roztoky mohou být podávány do intramuskulárního krevního oběhu pacienta místní ínjikací bolusu.

Pokud je sloučenina podle tohoto vynálezu podávána člověku, bude dění dávka obvykle určena předepisujícím lékařem, a bude se obecně lišit v závislosti na věku, váze, a citlivosti jednotlivého pacienta, stejně jako v závislosti na závažnosti jeho příznaků.

Jako příklad podávání se vhodné množství sloučeniny aplikuje savci,, podstupujícímu léčbu rakoviny. Množství podávané látky se pohybuje od asi 0,1 mg/kg tělesné váhy do asi 20 mg/kg tělesné váhy na den a lépe mezi 0,5 mg/kg tělesné váhy a přibližně 10 mg/kg tělesné váhy na den. . . ......

_t Příklady provedení vynálezu

Uváděné příklady mají napomoci dalšímu pochopení vynálezu. Konkrétní použité látky, druhy a podmínky jsou zamýšleny jako ilustrativní a nemají , být

Κ ' I, J ·.

omezením odpovídajícího rozsahu vynálezu.

Přikladl

Příprava N - [2(S)-(2(R)-amíno-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl] -N-methyl-isoleucyl-homoserinového laktonu a N-[2(S)-(2(R)-amino-3- merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucyí-homoserinu

Krok A: aldehyd N-(t-butoxykarbonyl)-isoleucinu

-20Tato sloučenina byly synthetisována za použití postupu Goela, Krollse, Stiera a Kerstena (Organic Syntheses 67, 69, 1988) a výchozí sloučeniny N-(t-butoxykarbonyl-isoleucinu. Získaná sloučenina byla ve formě bezbarvého oleje, který byl dále použit aniž by byl čištěn. | t

}

ΐ.

Krok B: benzylester N-[(2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methylpentylj-isoleucinu j _ í

Aldehyd N-(t-butoxykarbonyl)-isoleucinu (8,0g, 0,037 molu) a ' p-toluensulfonátová súl benzylesterů isoleucinu (19,0 g, 0,048 g) byly při laboratorní ' j teplotě rozpuštěný v methanolu (MeOH, 50 ml) pod dusíkovou atmosférou a za ' míchání byly přidány gel molekulárního síta—o- velikostir 3A (15g); a i

Λ triacetoxyborohydrid,· sodný-(20,4. g; 0,096. molu). Po.,2. hodinách.:byla směs:.· zfiltrována, zahuštěna a zbytek byl rozdělen mezi octan ethylnatý (EtOAc, 100 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (100 .ml). Basická vrstva byla promyta EtOAc (2 x 50 ml); organické' roztoky.'byly spojeny, promyty. solným/Toztokemra ·vysušeny = ’ ' .

(Na₂SOJ. Filtrací a vysušením.do,sucha.bylo po chromatograf.o.vánu.(SiO₂;-hexan::.

EtOAc, 9:1) získáno 6,4 g (41%) v nadpisu uvedené sloučeniny v podobě bílé pevné j látky. \ . . j ⁱH NMR (CD₃0D) 6 7.30-7.45 (m, 5H), 5.18 (ABg, 2H), . ·· ‘ *«.· , i

3.40-3.45 (m, IH),3.12 (d, IH, J= 6 Hz), 2.70 (dd, IH, |

J= 4, 12 Hz), 2.37 (dd, IH, J= 4, 12 Hz), 2.63-2.76 (m, j

ÍH), 1.45-1.61 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.05-1.26 (m, ' j

2H ), 0.82-0.95 (m, 12H). { i· ’ ’ '4

Krok C: benzylester N-[(2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl· * ' i

-isoleucinu

Benzylester N-[(2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methylpentyl]-isoleucinu (0,8 g, 1,9 mmolu) byl rozpuštěn v acetonu (3 ml), smíchán s ^003 (0,52 g, 3,8 mmolu) a jodomethanem (1.2 ml, 19 mmolu) a míchán 18 hodin při laboratorní

-21 teplotě. K reakční směsi byi přidán 5% vodný roztok NH₄OH (10 mi), po 30 minutách míchání byla zahuštěna a'rozdělena mezi EtOAc (20 ml) a vodu (20 ml). Vodná vrstva byla promyta EtOAc (2 x 20 ml), organické roztoky byly spojeny ,‘následně promyty vodou, 10% kyselinou citrónovou, solným roztokem a vysušeny. (Na^OJ.

Filtrací a zahuštěním do sucha se získalo 0,814 g (98%) v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě žlutého oleje.

^ΧΗ NMR <CDCL₃) δ 7.32-7.41 (m, 5H), 5.11 j

5.24 (m,	2H).	3.58-	-3.72 (n,	1H),	2.8-3.0 (m, ÍE),
2.20-2.65	(m,	5E),	1.88-2.0	(m,	ÍE), 1.68-1.80 (β, 1Ξ),
1.56-1.67	(m,	1H),	1.45 <s,	9E),	1.29-1.42 (m, 2H),
1.12-1.28	(m,	ÍH).	0.98-1.09	(m,	1B), 0.80-0.95 (B,

12H).

Krok D: N-[(2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methy!pentyl]-N-methyl-isoleucin

Benzylester N - [(2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methylpentylj‘N*methyl·

-isoleucínu (0,814 g, 1,87 mmolu) byl rozpuštěn ve směsi methanol (25 ml) - EtOAc (25 ml), ponechán reagovat s 10% paládiem na uhlíku (0,1 g) a hydrogenován pod zásobníkem vodíku po dobu 4 hodin. Filtrací a zahuštěním do sucha se získalo i

0,614 g (95%) v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky, ¹H NMR | (CDC1₃) β 5.1-5.2 (m, ΙΕ ), 3.7-3.8 .(m, ÍH), 3.27-3.35 j (m. 1B), 2.8-2:92 <m, 2B), 2.55 (s, 3H), 1.80-1.93 (m. <

1E), 1.55-1.8 (m, 2H), 1.48 (s, ,9H), 1.23-1.42 (m. ÍH),

1:05-1.2 (m, ÍH), 0.82-1.03 <m, 12H).

Ϊ

Krok Ε: N - [(2S)-(t-butoxykarbonylamino) - 3(S)- methylpentyl]-N-methyl-isoleucyl- * homoserinový lakton

N-[(2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucin (1,05

Vil

-22g, 3,05 mmolu) byl za míchání při laboratorní teplotě rozpuštěn v dimethylformamidu (DMF, 10 ml) a ponechán reagovat s EDC (0,64 g, 3,35 mmolu), HOBT (0,45 g, 3,35 mmolu) a hydrochloridem homoserinového laktonu. Hodnota pH byla upravena na 6,0 pomocíEtjN (0,40 ml, 2,9 mmolu) a míchání pokračovalo po 18 hodin, Reakční směs byla zahuštěna, poté rozdělena mezi EtOAc (50 ml) a vodu (50 ml). Vodná vrstva’byla promyta EtOAc (3 x 20 ml), organické promývací roztoky byly spojeny, promyty nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ , solným roztokem a vysušeny (NajSOJ; Filtrací a vysušením do sucha bylo po chromatografování (SiO₂, hexan:EtOAc, 3:1 až 2:1 k EtOAc) získáno 0,78 g (60%) v nadpisu uvedené sloučeniny. ;

> to EtOAc). NMR (CD₃0D) δ 4.59 (t, IH, J= 10 Hz), 4.47 (td, IH, J= 2, 10 Hz), 4.28-4.39 (m, 2H),

3.56-3.64 (m, IH), 2.74 (d, IH, J= 10 Hz), 2.5-2.7 (m,

2H), 2.3-2.42,(m, 2H), 2.29 (s, 3H), 1,75-1.92 (m, 2H) _t1.4-1.6. (m, 2H). 1.46 (s,.9H), 1.07-1.20 (m, 2H), 0.88- >, 0.95 (m, 12H).

Krok F:··' N-[(2S)-amino-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-išoleucyl-homoserinový lakton ' · IV,

Plynný chlorovodík probublával do roztoku N-[(2S)-(t-butoxýkarbonyl- amino)

- 3(S )- methylpentyl]-N-méthyl-isoleucyl-homoserinového laktonu (0,21 g, 0,5 mmolu) v EtOAc (50 ml) za míchání při teplotě -20°C po dobu 30 minut. Roztok byl 0,5 h pročišťován argonem, poté byl zakoncentrován za vzniku 0,21 g (100%) v nadpisu uvedené látky ve formě bílé pevné látky. i_E ζ ) § 4 465.05 (m, 2H), 4.28-4.38 (m, IH), 3.54-3.70 (m, 2H),

3.2-3.4 (m, 2H), 2.75-2.97 (η, 3H), 2.45-2.59 (m, 2H), 2.1-2.2 (m, IH), 1.72-1.92 (m, 2H), 1.50-11.63 (m, IH), 1.18-1.4 (m, 2H), 0.98-1.12 (m, 12H).

-23Krok G: Příprava aldehydu N-(t-butoxykarbonyl)-S-trifenylmethy!cysteinu

Tato sloučenina byla synthetisována postupem podle Goela, Krollse, Stiera a Kerstena /Organic Syntheses 67, 69, 1988/ z N-(t-butoxykarbonyl)-S-tritylcysteinu. Sloučenina byla získána v podobě bílé pevné látky, která byla dále použita bez dalšího čištění. Ή NMR (CDCI3) d 9.2 (1H, s), 7.5-7.1 (18E, m), 5.1 (IE, br

d), 3.92 (IE, m), 2.85-2.5 (2B, m), 1.4 (9B, s).

d), 3.92 (1H, m), 2.85-2.5 (2H, m), 1.4 (9H, s).

Krok H:

N-[2S)-(2(R)-(t-butoxykarbony!amino)-3-trifenylmethylmerkaptopropyl amino)-3(S)-methylpentyl ]- N -methyl-isoleucyl-homoserinový iakton ►

N-[(2S)-amino-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-iso1eucyl-homoserinový laktoh (0,21 g, 0,6 mmolu) byl rozpuštěn v methanolu (3,0 ml), ponechán zreagovat š KOAc (0,1 g, 1,0 mmolu), s gelem molekulárního síta o velikosti 3A (0,5 g) a aldehydem N-(t-butoxykarbonylamino)-S-trifenýlmethylcysteinu (0,25 g, 0,6 mmolu) a následně s kyanoborohydridem sodným (1 M v THF, tetrahydrofuranu). Poté byl míchán při laboratorní tepilote 18 hodin. Reakční směs byla zfiltrována a rozdělena mezi EtOAc (20 ml) a vodný nasycený roztok NaHCO₃. Filtrací a zahuštěním do sucha se získala pevná látka, která byla chromatografována (SiO₂, CH₂CI₂: MeOH 99:1 až 97:3) se ziskem 0,12 g (33%) v nadpisu uvedené sloučeniny. ’H NMR (CD₃0D) δ 7.21-7.42 (m, 15H), 4.42-4.56 (m, 2H), 4.254.34 (m, 1H), 3.62-3.72 <m, 1H), 2.63-2.80 (m, 3E), 2.30-2.60 (m, 6H), 2.18-2,28 (m, 4H), 1.81-1.93 (m, IE), 1.54-1.78 (m, 2H), 1.45 (s, 9h>, 1.06-1.37 (m, 3E), 0.80-0.98 (m, 12E).

-24 Krok I: N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamíno-3(S)-methylpentyl ] - N -methyl· -ísoleucyl-homoserinový lakton

N-[2(S)-(2(R)-(t-butoxykarbonylamino)-3-trifenylmethyImerkaptopropyl amino)-3(S)-methylpentyl ]- N -methyl-isoleucyl-homoserinový lakton (0,12 g, 0,16 mmolu) byl rozpuštěn v (5 ml), ponechán zreagovat s CF₃CO₂H (TFA, 2,5 ml) a trietbylsilanem (0,10 ml, 0,64, mmolu) a míchán při laboratorní teplotě 0,5 ' hodiny. Roztok byl zahuštěn do sucha a rozmělněn s 0,1% TFA ve vodě. Pevný trifenylmethan byl odstraněn filtrací a filtrát byl lyofilízován se ziskem 0,07 g (59%) v nadpisu uvedené sloučeniny.

'HNMR <CD₃0D) δ 4.45-4.55 (a, 2H), 4.28-4.35 (a, 1Ξ),

3.52-3.61 (a, 1H), 3.49 (d, 1H, J= 6 Hz), 3.18-3.25 (m,

1H), 3.02-3.16 <m, 4H). 2.92 (t, 1H, 6 Hz), 2.85 (t, ,

1H, 6 Hz), 2.78 (s, 3H), 2.42-2.56 (a, 2H),

2.05-2.15 (a, 1H), 1.83-1.94 (a, 1H), 1.58-1.61 (m,

1H>, 1.40-1.52 (a, 1H), 1.22-1.4 (m, 2H), 0.93-1.06 (a,, _12H).

Analysa, spočítaná pro CjqH^N^S . 3CF₃CO₂H: C, 40,72; H, 5,77; N, 7,31. Nalezeno: C, 40,72; H, 5,99; N, 7,69. , .

Krok J: N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino-3(S)-methylpentyl ]- N -methyl-isoleucyl-homoserin

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino-3(S)-methylpentyl ] - N -methyl·

-ísoleucyl-homoserinový lakton (0,0025 g, 0,00326 mmolu) byl rozpuštěn v MeOH (0,0506 ml), poté byl přidán 1N NaOH (0,0134 ml) a následně MeOH (0,262 mí).

Konverse laktonu na hydroxykyselinu byla potvrzena analysou pomocí HPLC a/nebo spektroskopií ’H NMR.

-25Příklad 2

Příprava N-[2(S)-(2(R)-amÍno-3-merkaptopropylamino-3(S)-rriethylpentyI] -N-methylfenylalanyl-homoserinového laktonu a N-[2(S)-(2(R)-amino. - 3 - merkapto prapylamíno-3(S)-methylpenty! ]-N-methylfenylalanyl-homoserínu ;V nadpisu uvedená, sloučenina byla připravena metodou, popsanou v Příkladu 1, kdy byl benzylester isoleucinu z kroku B nahrazen methylesterem fenylalaninu. Krok D byl nahražen hydrolysou methylesteru, jak je uvedeno níže.

Krok D: N-[2S)-(t-butoxykarbonylamfno)-3(S)-methylpentyl-N-methyIfenylalanin

Methylester N-[2S)-(t-butoxykarbonylamino)-3(S)-methylpentyl-N-methyl- ·. ·,/ fenylalaninu (1,92 g, 0,0049 molu) by! rozpuštěn v MeOH (20 ml), ponechán zreagovat se 4 ekvivalenty 1N NaOH (19,56 ml, 0,0196 molu) a míchán za laboratorní teploty po 18 hodin. Reakční směs byla zahuštěna k „odstranění I íj methanolu, poté neutraiisována 1N HCI (19,56 mi, 0,0196 molu) a extrahována .

EtOAc (3 x 30 ml). Organické roztoky byly spojeny, promyty solným roztokem a vysušeny (Na₂SOJ. Filtrací a zahuštěním do sucha se získalo 1,6 g (86%) v nadpisu uvedené sloučeniny , která byla použita bez dalšího čištění.

Za použití kroků E-l z Příkladu I byla v nadpisu uvedená sloučenina získána v podobě své trifluorooctové soli ó bodu tání 74-80°C. ¹H NMR (CD₃OD) d 7,2-7,4 (m,

5H), 4,41 -4,48 (m, 1H), 4.24 (q, 1H, J=9 Hz), 4,15 (t, 1H, 11 hz), 3,97 (dd, 1H, J= 6,

Hz), 3,53 (t, 1H, J= 6 Hz), 2,95-3,4 (m, 8H), 2,82-2,92 (m, 1H), 2,81 (s, 3H),

2,12-2,3 (m, 2H), 1,82-1,95 (m, ΊΗ), 1,35-1,52 (m, 1H), 1,15-1,23 (m, 1H), 0,85-1,03 (m, 6H). Analysa, počítaná pro C₂₃H_3BN₄O₃S . 2,85 CF₃CO₂H: C, 44,44; H,

5,31; N, 7,22. Nalezeno: C, 44,36; H, 5,46; N, 7,50.

Lakton byl přeměněn na hydroxykyselinu postupem podle Příkladu 1, kroku J.

-26Příklad 3

Příprava N - [2 (S) -{2(R)-amino-3-merkaptopropylamino-3-methylbutyl]-N-methylfenylalanyl-hombsérinového laktonu a N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkapto - j propylamino-3-methylbutyl ]-N-methylfenylalanyl-homoserinu ,

L

V i

V nadpisu uvedené sloučeniny byly připraveny postupem podle Příkladů, i a i

2, přičemž byl N-t-butoxykarbonylvalinem nahražen derivát isoieucinu, použitý v | i

kroku A. Homoserinový lakton byl získán v podobě své trifiuorooctové soli o bodu i tání55-60°C.

*H NHR (CD3OD) δ

7.21-7.39 (m, 5H), 4.43 (td, 1H, J= 4, 10 Hz), 4.22 (q,lH, J« 9 Hz), 4.12 <t, 1Ξ. J= 10 Hz), 3.50-3.58 (a,

1H), 3.02-3.35 (m, 8H), 2.82-2.90 (m, 2H), 2.82 (s,

3E), 2.04-2.28 (o, 3H), 1.05 (d, 3Ξ, J= 6 Hz), 0.98 (d_t3H, J= 6 Hz).

Analysa spočítaná pro C₂₂H₃₆N₄0₃S . 3CF₃CO₂H . H₂O: C, 42,21; H, 5,19; N, 7,03. j

Nalezeno: C, 42,17; H, 5,03; N, 7,26. . | . , . ’ . |

Hydroxykyseiina byla vytvářena způsobem in šitu podle Příkladu 1, kroku J. , |

Příklad 4 i · Sr ί

í

N - [2 (S) - (2(R) - amino - 3 - merkaptopropylamino - 3(S) -methylpentyí] N ~ J

-methylnorvaiyl - homoserinový lakton a N - [2(S)-(2(R)-amino - 3 - merkapio - j propyiamino-3(S)-methylpentyl ]-N-methylnorvalyl-homoserÍn

V nadpisu uvedené sloučeniny byly připraveny postupem podle Příkladů 1 a 2, přičemž byl benzylester isoieucinu, použitý v kroku B, nahražen methylesteiw·) norvalinu. Homoserinový lakton byl získán v podobě své trifiuorooctové soli o bodu

-27tání 50-55’C.

^XH NMR (CD₃OD) δ

4.45-4.51 (m, 2H), 4.25-4.38 (m, 1H), 3.75-3.82 (m,

1H) , 3.43 (t, IE, J=6 Hz), 2.82-3.15 (d. 7H), 2.88 (s,

3H). 2.4-2.55 (m, 2H), 1.78-1.97 <m, 3H>. 1.32-1.48 (m. 3H); 1.15-1.32 (m, lH), 1.01 <q. 6H, J= 9 Hz), 1.90 <d, 3H,J= 7 Hz).

Analysa, spočítaná pro C,₉H_MN₄O₃S . 3CF₃CO₂H . 0,75 H₂O: C, 39,60; H, 5,65; N, 7,39. Nalezeno: C, 49,58; H, 5,65; N. 7,48.

Hydroxykyselina byla vytvořena způsobem in šitu podle Příkladu 1, kroku J.

Příklad 5

Methylester N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropy[amino-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucylmethioninu

V nadpisu uvedená sloučenina byla připravena postupem podle Příkladu 1, kroků A-l, přičemž byl homoserinový lakton z kroku E nahražen methy testerem methioninu. Trifluorooctová sůl byla získána po lyofilizaci.

* ^H NMR <CD₃0D) 5 4.65-4.73 (m, 1H),

3.75 (s, 3H), 3.42-3.54 (m, 2H), 2.87-3.22 <m, 7H), 2.73 (s, 3H), 2.49-2.58 <m, 2H), 2.12-2,25 (m, 1H),

2.10 (s, 3H), 1.98-2.1 (m, 2Ě), 1.8-1.92 (m, 1H), 1.62-1.77 (m, 1H), 1.21τ1.48 (m, 3H), 0.9-1.05 (m, 12H).

Analysa, spočítaná pro C₂₂H₄₆N₄O₃S₂ . 2,25 CF₃CO₂H : C, 43,28; H, 6,61; N, 7,62. Nalezeno: C, 43,23; H, 6,54; N, 7,81.

-28Příklad 6 ·

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino-3(S)-methylpentyí]-N-methylisoleucylmethionin ' j i

$

Krok' A: N-[2(S)-(2(R)-(t-butoxykarbonylamino-3-trifenylrriethy!merkapto- I propylamino-3(S)-methyipentyl]-N-methyl-isoleucylmethionin ' . |

Methylester N-[2(S)-(2(R)-(t-butoxykarbonyiamino-3-trifenylmethylmerkapto-..... í propyiamino-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucylmethíoninu (0,19 g, 0,232 mmolu, připravený jako meziprodukt v. příkladu 5). byl rozpuštěn_v. MeOH (4 ml), ponechán zreagovats 1N roztokem NaOH (0,927. mi, 0,927 mmolu).a míchán po.3,5 hodiny.pri .. laboratorní teplotě. Reakční směs byla zahuštěna, zbytek byl rozpuštěn v destilované vodě (20 ml), neutralizován 1N HCl (0,927 ml, 0,927 mmoiu) a extrahován EtOAc (3 x 20 ml). Organické podíly byly spojeny,..promyty solným roztokem a vysušeny (Na₂S0₄). Filtrací a zahuštěním do sucha se získalo^ 0,18 g (96%) v nadpisu uvedené sloučeniny, která byla dále používána bez jiného čištění. | * i i

Krok B: N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino-3(S)-methylpentyl]. -N-methyl-isoleucylmethionin * i ·?.·- . . ' .·'. '' Ά . - . ... t

N-[2(S)-(2(R)-(t-butoxykarbonylamino-3-trifenylmethylmerkapto-propylamino- f

.. ... · . . , t

-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-Ísoleucylmethionín (0,13 g, 0,223 mmoiu) byl J rozpuštěn v CH₂CI₂ (4 ml), ponechán zreagovat s CF₃CO₂H (2ml) a triethylsilanem * ( (0,143 ml, 0,893 mmolu) a míchán 1,5 hodiny při laboratorní teplotě. Reakční směs ^v byla zahuštěna, rozdělena mezi hexan (20 ml) a 0,1% TFA v H₂0 (20 ml) a vodná vrstva byla lyofilizována za vzniku surového produktu, který byl vyčištěn pomocí preparativní HPLC a opětně lyofilizován za vzniku 0,075 g (43%) v nadpisu uvedené sloučeniny v podobě trifluorooctové soli.

-29 NMR <α>₃0ϋ) δ 4.59-4.68 (i, 1H) , 3.47-3.6 (m, 2H), 3.16 (d, 1H, J= 6 Hz), 3.06 (s, 3H), 2.85-3.03 (nt, 3H), 2.77 (s, .33) i 2,5-2.7 (a, 2H), 2.17-2.29(a, 1H),

2.11 (s, 3H), 1.98-2.1 (i, 2H), 1.8-1.93 (m, 1H), 1.58-1.75 (a, 1H), 1.2-1.5 (m, 3Ξ), 0.85-1.05 (a,

12H).

Analysa, spočítaná pro C₂₁H₄₄N₄O₃S₂ . 2,75 CF₃CO₂H : C, 40,89; H, 6,05; N, 7,20. Nalezeno: C, 41,18; H, 6,21; N, 7,25.

Příklad 7

Methylester N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropy!amino-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-fenylalanyl-methioninu

V nadpisu uvedená sloučenina byla připravena postupem podle Příkladu 5, přičemž byl benzylester isoleucinu z kroku B nahrazen methyfěsterem fenylalaninu a isolován v podobě své triftuorooctové sole.

^ΧΗ NMR (CD₃0D) δ 7.26-7.37 (a, 5H), 4.49-4.55 (m, 1H), 4.16 (t, 1H, J=

Hz), 3.70 (s, 3H), 3.53 <t. 1H, J= 6 Hz), 2.9-3.3 (a, 7H), 2.89 (d, 25, 6 Hz), 2.70 (s, 3H), 2.24-2.6 (a,

2H) 2 05 (s, 3H), 1.8-2.17 (m, 3Ξ), 1.33-1.48 <m, 15),

1.18-1.3 (a, 15), 0.9-1.0 (m, 6H). MS (M+l) 513.

Příklad 8

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamÍno-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-fenylalanyl-methionín

-30V nadpisu uvedená sloučenina byla připravena cestou meziproduktu, získaného v Příkladu 7, za použití postupu podle Příkladu 6, a byla isolována v podobě své trifluorooctové sole.

NMR (CD₃0D)/8 7.,24-7.4/m, 5H), 4.4-4.5 (a, IE),

4.12 (t, IE, J= 8 Hz), 3.45-3.52 <m, IE) 2.8-3.25 (a,

7H), 2.66 (s, 3E), 2.6-2.7 (a, IH), 2.23-2.5 (m, 2E)_P2.05-2.2 2.04 (s,3H), 1.9-2.04 (a, 2E),

1.76-1 9 (a, IH),1.12-1.46 (a, 2H), 0.85-1.0 (a, 6E).

4·

Analysa, spočítaná pro C₂₄H₄₂N₄O₃S₂ . 3 CF₃CO₂H . 0,5 CH₃CN: C, 43,22; H, 5,44; N, 7,32. Nalezeno: C, 43,22; H, 5,67; N, 7,68.

Příklad 9

I

Methylester N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropyiamino-3(S)-m'ethylpentyl]“ -N-methyl-norvalyl-methioninu

V nadpisu uvedená sloučenina byla připravena postupem podle Příkladu 1 a

2, přičemž býl benzylester isoleucinu z kroku B nahrazen methylesterem norvižlínu, homoserinový lakton z kroku E byi nahrazen methylesterem methioninu a v kroku C byl použit následující náhradní postup. '

Krok C: Methylester N-[2(S)-(t-butoxykarbonylamino-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-norvalinu

Methylester N-[2(S)-(t-butoxykarbonylamino-3(S)-methylpentyl]-norvalinu (1,15 g, 3,6 mmolu) byl rozpuštěn v MeOH (15 ml), ponechán zreagovat s kyselinou octovou (0,21 ml, 3,6 mmolu), formaldehydeni (37% v H₂O) (0,61 ml, 7,2 nímoíu) a kyanoborohydridem sodným (0,34 g, 5,4 mmolu) za míchání pod argonovou atmosférou při laboratorní teplotě. Po 4 hodinách byla reakční směs zahuštěna,

-31 rozdělena mezi EtOAc (20 ml) a nasycený vodný roztok NH₄OH (20 ml), organická vrstva byia vysušena (Na^SOj a zahuštěna za vzniku 1,03 g (33%) v nadpisu uvedené sloučeniny v podobě bezbarvého oleje.

¹H NMR (CD₃0Ď) δ 3.68 <s, 33), 3.52-3.6 (a, 13), 3.27 (t, 1H, J= 8Sz), 2.66 <dd , 13,

J= 5, 12 Hz). 2.42 (dd, 1H, J«5, 12 Hz), 2.28 (s, 3Ξ), 1.57-1.69 (a, 3H), 1.44 (s, 9H), 1.2-1.5 (a, 3H),

1.0-1.2 (a, 13), 0.86-1.0 (m 9H).

Podle Příkladu 1, kroků D až I, byla isolována v nadpisu uvedená sloučenina v podobě své soli kyseliny chlorovodíkové.

NMR (CD^OD) $ 4.66-4.72 (m, 1H), 3.89-3.95 <m, 1S),

3.74 (s, 33), 3.45-3.6 (a, 13), 3.1-3.4 (a, 4H), 2.94 (s, 3H), 2.89-3.2 (a, 3H), 2.58-2.73 (a, 23), 2.12 (s,

33), 1.83-2.25 (m, 43), 1.2-1.65 (a. 53), 0.91-1.1 (a,

9H).

Analysa, spočítaná pro C^H^N^OjS^. 4,5 HCl: C, 40,11; H, 7,77; N, 8,91. Nalezeno: C, 40,03; H, 7,86; N, 8,65.

Příklad 10

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropytamino-3(S)-methy!pentyl]-N-methyl-norvalyl-methionin .....

V nadpisu uvedená sloučenina byla připravena z prekursoru z Příkladu 9 po hydrolyse a odstranění chránící skupiny postupem podle Příkladu .6 a byla isolována v podobě své trifluorooctové soli.

NMR (CD₃0D) 5 4.57-4.66 (m, 13); 3.80 (t, 13, J= 8 Hz), 3.04-3.5 <m, 7H),

2.8-2.97 (a, 43), 2.90 <s, 3H), 2.47-2.7 (m, 2H),

2.13-2.3 (a, 13), 2.09 (s, 3H), 1.8-2.0 (a, 2H),

1.34-1.6 (a, 2H), 1.2-1.32 (a, 13), 0.88-1.1 (a, 93).

-32Analysa, spočítaná pro C₂₀H₄₂N₄O₃S₂.3 CF₃CO₂H . H₂0: C, 38,51; H, 5,84; N, 6,91.

Nalezeno: C, 38,51; H, 5,71; N, 7,23.

Přikladli

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino-3(S)-methy!pentyl]-N-methyl-D-norvalyl-homoserinový lakton a N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylaniino-3(S)-methylpentyI]-N-methyl-D-norva[yl-homoserin

V nadpisu uvedené sloučeniny byly připraveny postupem podle Příkladu 1, přičemž byl isoleucylový benzylester nahrazen, methylesterem·- D-norvalinu, a ’ isolovány byly v podobě své trifluorooctové soli;

J-H NMR (CDgOD) δ 4.49 (t, IH, J= 9Hz), 4.28-4.3 (m, 1H), 3.74-3.8 (a, 1H), 3.45-3.5 (η, IH), 2.8-3.15 (a, .8H), 2.86 (s, 3Ξ), 3.55-2.63 (a, IH), 2.26-2.73 (m, IH), 1.75-1.95 (m,.

3H), 1.18-1.54 (m, 5H), 0.88-1.02, (m, 9H).

Analysa, spočítaná pro C_igH_MN₄O₃S . 3 CF₃CO₂H . 0,75 H₂O: C, 39,60; H, 5,65; N, 7,39. Nalezeno: C, 39,62; H, 6,03; N, 7,23.

Příklad 12

3(S)-{N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino) - 3 (S) - methylpentyl - N -methyl-isoleucylamino} - 6,6 - dimethyftetrahydropyran - 2-on a kyselina 3(S)-{N- [2(S)- 2(R) - amino - 3 - merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucylamino}-5-methyl-5-hydroxyhexanová

Krok A: kyselina 2-N-(t-butoxykarbonyl)amino-5^:hydroxy-5-methylhexanavá

-33t

K roztoku 5-meíhyiesíeru kyseiiny N-(t-butoxykarbonyl)g tutam ové (2,52 g, 0,0096 molu) v THF (32 ml) bylo přidáno methyllithium (1,4 M v etheru) (30,2 ml, 0,042 molu) v argonové atmosféře za míchání takovou¹ rychlostí, aby byla teplota reakce, udržována nižší než -60°C. Po tomto přídavku byla. směs 1 hodinu míchána při teplotě -70°C, pak byl přidán 10% roztok kyseliny citrónové (30 ml) a provedena extrakce pomocí EtOAc (3 x 30 ml). Vrstvy EtOAc byly spojeny, promyty solným roztokem a vysušeny (Na^OJ. Filtrací a vysušením do sucha bylo po chromatografování (SiO₂, CHCI₃:MeOH:HOAc, 90:9:1) získáno 1,20 g (48%) v nadpisu uvedené sloučeniny v podobě žlutého oleje, ze kterého stáním vznikala pevná látka.

NMR (CDC1₃) δ 55.28 (br s, 1H), 4.35-4.43 (m, 1H), *

1.75-2.0 (m, 2H), 1.58 (t, 2E, 9 Hz), 1.46 <s, 9H),

1.24 (s, 6H).

Krok B: 3(S)-(t-butoxykarbonyl)amino-6,6-dimethyltetrahydropyran-2-on

Kyselina 2-N-(t-butoxykarbonyl)amino-5-hydroxy-5-methylhexanová (1,06 g, 4,05 mmolu), dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (1,01 g, 4,86 mmolu) a 4-dimethylaminopyridin (DMAP) (0,05 g, 0,4 mmolu) byly rozpuštěny v CH₂CI₂ (40 ml) za míchání při laboratorní teplotě a pod argonovou atmosférou. Po 30 minutách byla reakční směs zfiltrována k odstranění dicyklohexylmočoviny, filtrát byl zahuštěn, poté byl rozdělen mezi . EtOAc (100 ml) a 10% roztok kyseliny citrónové (50 ml). Organická vrstva byla oddělena, promyta destilovanou vodou (3 x 50 ml), solným roztokem (1 x 5Ó ml) a vysušena síranem sodným. Filtrací a vysušením bylo po chromatografování (SiO₂, EtOAC : hexan, 1:2) získáno 0,6 g (61%) v nadpisu uvedené sloučeniny v podobě bílé pevné látky.

¹H NMR (CDCI3) δ 5.33 (br s, 1H), 4.04-4.17 (m, 1H), 2.37-2.48 (m, 1H), 1.8-2.0 <m, 3H), 1.45 (s, 9Ξ), 1.41 (s, 6H).

-34Krok C: chlorid 3(S)-amino-6,6-dimethyltetrahydropyran-2-onu

3(S)-(t-butoxykarbonyl)amino-6,6-dimethyltetrahydropyran-2-on (0,36 g, 1,48 mmolu) byl rozpuštěn v EtOAc (30 ml) a ponechán zreagovat s plynným | í

chlorovodíkem pri -50°C po 20 minut a byl míchán při -30 až -50°C po dobu 20 j ?

minut Po 10 minutovém probublávání roztoku argonem byl roztok zahuštěn za j vzniku 0,265 g (100%) v nadpisu uvedené sloučeniny ve formě bílé pevné látky. . ;

- ~ í ¹H NMR (CD₃0D) δ j

4.05-4.15 (m. 1H>, 2.2-2.32 (m, ΙΕ), 2.0-2.15 (m, 3H). I

1.48 <s, 3H), 1.43 <s, 3H).

Krok D: 3(S)-(N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methy!pentyl-N-methyl-iso-leucylamino}-3-methyltetrahydropyran-2-on

V nadpisu uvedená sloučeninabyla připravena postupem, podle Příkladu 1; . přičemž’byl nahrazen homoserínový lakton z kroku E chloridem . 3(S)-amino-6,6 = -dimethyltetrahydropyran-2-onu. V nadpisu uvedená sloučenina byla získána v J podobě své trifluorooctové soli. * ¹H NMR (CD₃0D) i δ 4.1-4.2 (m, ÍH), 3.55 (d, 2H, J=6Hz)> 3.0-3.3 (m, I

6H>; 2.90 (t,’2H, 6Hz), 2.81 (s, 3H), 2.28-2.39 <m, j

ÍH), 1.82-2.15 (m, 5H), 1.55-1.6 (m, ÍH), 1.53 (s, 3H)_t |

1.45 (s, 3H), 1.2-Ϊ.4 <m, 2H), 0.92-1.04 <m, 12 H). 4

Analysa, spočítaná pro C₂₃H_4eN₄O₃S . 3 CF₃CO₂H . 1,5 H₂O; C, 42,07; H, 6,33; N, ₍

6,77. Nalezeno; C, 42,20; H, 6,10; N, 7,16.

Hydroxykyselina byla vytvořena způsobem in sítu podle Příkladu 1, kroku 3.

Příklad 13

-353(S)-£N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucylamíno}-3-methyltetrahydropyran-2-on a kyselina 2(S)-{N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methyipentyi]-N-methyl-iso-!eucylamino)

-2-methyl -5-hydroxypentanová

Krok A: Kyselina 2-amino-2-methyl-5-hydroxypentanová .

Jemně rozmělněná racemická kyselina a-methylglutamová (5,0 g, 0,029 í ř

molu) byla suspendována v THF (30 mi), ponechána zreagovat s triethylboranem | j

(1M v THF, 32,32 ml, 0,032 molu) a zahřívána k refluxu po dobu 36 hodin. Po f chlazení na 0°C byl k roztoku po kapkách přidáván boran v THF (1M, 35,26 ml,

0,035 molu) a roztok byl po dobu 3 hodin míchán při 0°C . Reakce byla zastavena přídavkem 5% vodného roztoku HCl (30 ml), reakční směs byla míchána 30 minut, zahuštěna na rotační odparce a vzniklý zbytek byl rozpuštěn v 5% HCl (44 ml). Poté byl 45 minut zahříván k refluxu. Po ochlazení a zahuštění byl zbytek převeden do MeOH (50 ml), zahuštěn a tento postup byl 3 x opakován ke vzniku 5,69 g v nadpisu uvedené sloučeniny, která nebyla dále čištěna. . .....

X; -A' i

Krok B: kyselina 2-(t-butoxykarbonyl)amino-2-methyI-5-hydroxypentanová j

Kyselina 2-amino-2-methyl-5;hydroxypentanová (5,69 g, 0,031 molu) byla | /rozpuštěna v soustavě 1,2-dimethoxyethanu (DME) (60 ml) a vody (30 ml) za | míchání při 0°C. Hodnota pH roztoku byla upravena na 9-10 pomocí 1N NaOH, poté f í' byl po kápkách přidán di-t-butyIdikarbonát (7,45 g, 0,034 molu) v soustavě DME (60 | ml)-voda (30 ml) za stálého udržování pH směsi na hodnotě 9-10 přidáváním 1N 1 roztoku NaOH. Reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě 48 hodin s opakovaným přidáváním 1N NaOH k udržení zásaditého pH, poté byla zahuštěna a rozdělena mezi ether a vodu. Vodná vrstva byla okyselena 10% kyselinou citrónovou , a extrahována EtOAc (3 x 50 ml). Organické podíly byly spojeny, promyty solným roztokem a vysušeny síranem sodným. Filtrací a zahuštěním do sucha se získalo 3,0 g surové v nadpisu uvedené sloučeniny.

-36Krok C: 3-(t-butoxykarbonyí)amino-3-methyl-tetrahydropyran-2-on

Kyselina 2-(t-butoxykarbonyl)amino-2-methyl-5-hydroxypentanová (3,0' g, 0,012 molu) a EDC (2,56 g, 0,013 molu) byly rozpuštěny v DMF (20 ml) a míchány při laboratorní teplotě 18 hodin. Reakční směs byla zahuštěna do sucha a zbytek byl rozdělen mezi EtOAc (30 ml) a vodu (30 ml), organická vrstva byla oddělena, promyta solným roztokem a vysušena síranem sodným. Filtrací, zahuštěním a chromatografováním (SiO₂, EtOAchexan, 1:3) se získalo 0,86 g (31%) v nadpisu uvedené sloučeniny.

_ . !h NMR <CDC1₃) δ 5.1 (br s, 1H),

4.35-4.55 <m, 2Ή) _t 2.49-2.64 (m, 1H) , 1.78-2.1 (m,. 3H.), 1.45 <s, 3H), 1.41 (s, 9H).

Krok D: Chlorid 3-amino-3-methyl-tetrahydropyran-2-onu

V nadpisu uvedená, sloučenina-.byla připravena způsobem, popsaným-v.Příkladu 12, kroku C, a výsledný produkt byl použit bez dalšího čištěni.

Krok Ε:,. 3 (S) - (N - [2(S) - (2(R) - amino -3 -merkaptopropylamino) - 3(S) methylpentyl] -N-methyl-isoleucylamino}-3-methyltetrahydropyran-2-on „ . V nadpisu: uvedená sloučenina byla připravena způsobem, popsaným v Příkladu 1, přičemž byl homoserinový lakton v kroku E nahražen chloridem

3-amino-3-methyl-tetrahydropyran-2-onu. V nadpisu uvedená, sloučenina byla získána v podobě své trifluorooctové soli.

*Η NMR (CD₃0D) δ 4.42-4.55 <m, 2fi), 3.48-3.6 <m, 2H), 3.17-3.28 <m, 1H), 2.88-3.15 , .

(m, 5H), 2.79 <s. 3H), 2.3-2.45 (m, 1H), 1.97-2.18 <m,

2Ή), 1.82-11.98 (m, 3H), 1.6-1.73 (m, 1H), 1.56 (s,

3H), 1.21-1.5 <m, 4H), 0.86-1.05 (m, 12H).

Nalezeno: C, 42,79; H, 6,18; N, 7,19.

Hydroxykyselina byla vytvořena způsobem in šitu podle Příkladu 1,. kroku J.

'Příklad 14

Inhibice ras famesyltransferázy v podmínkách in vitro

Farnesylproteintransferáza (FTáza) z hovězího mozku byla chromatografována na DEAE-Sephacelu (Pharmacia, gradientova eiuce pomocí 0-0,8 M NaCI), N-oktylagarose (Sigma, gradientově eluce 0-0,6 M NaCI) a na mono Q HPLC sloupci (Pharmacia, gradientově eluce 0-0,3 M NaCI). Ras-CVLS v koncentraci 3,5 uM, 0,25 pH]FPP a uvedené sloučeniny byly inkubovány buď s částečně vyčištěným hovězím enzymovým přípravkem nebo s rekombinantním lidským enzymovým přípravkem. Údaje o FTáze, uvedené níže v Tabulce 1. odrážejí schopnost testovaných látek inhibovat farnesylaci Ras in vitro, popsanou Pomplianem a spoluautory v Biochemistry 31, 3800,1992.

Tabulka 1

Inhibice famesylace Ras sloučeninami podle tohoto vynálezu^x sloučenina

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-Ísoleucyl-homoserin • N-[2(S)-(2(R)-amíno-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-Ísoleucyl-methionin

IC₅₀ (nM) (hovězí enz.) (rekombin. lidský enzym)

-38 ^x (IC50 je taková koncentrace testované sloučeniny, která působí 50% inhibici FTázy ve stanovení při popsaných podmínkách)

Příklad .15 /

Stanovení famesylace Ras v podmínkách in vivo

V tomto stanovení bylo použito buněčné linie v-ras, schopné exprese virální Ha-ras p21. Stanovení bylo v zásadě prováděno tak, jak popsal J.E. DeClue se spoluautory v Cancer Research 51., 712-717, 1991. Buňky, vykazující 50-75% souběžný růst, byly v miských o průměru 10 cm podrobeny působení sledovaných látek (konečná koncentrace rozpouštědla, methanolu čí dimethylsulfoxidu byla 0,1%). Po 4 hodinách inkubace.při 37°C byly buňky označeny ve 3 ml média DMEM bez methioninu, doplněného 10% běžným médiem DMEM; 2% fetálním hovězím sérem a 400 uCi [“Sjmethioninu (1000 Ci/mmol). Po dalších 20 hodinách byly buňky lysovány v 1 ml lysačního pufru (1% NP40/20mM HEPES, pH. 7,5/5 mM MgCiyi mM DTT/10 ug/ml aprotinen/2 ug/ml leupeptin/2 ug/ml antípain/0,5 mM PMSF) a lysáty byly pročištěny odstředěním při 100 000 g po 45 minut. Alikvotní · Části lysátů, obsahující shodný počet impulsů, které lze vysrážet v kyselém prostředí, byly upraveny na objem 1 ml pomocí IP pufru (lysační pufr, neobsahující DTT) a imunoprecipitovány s nronoklonálními protilátkami Y13-259, specifickými vůči Ras (Furth, Μ. E. se spoluautory, J. A/irol. 43, 294-304, 1982. Po 2 hodinové inkubaci protilátek při 4°C bylo přidáno na 45 minut'200 ul 25% suspense proteinA-Sepharosy, pokryté králičím, anti-krysím imunoglobulinem IgG. Imunoprecípitáty byly čtyřnásobně promyty pufrem IP (20 nM HEPES, pH 7,5/1mM EDTA/1% Triton X-100 . 0,5 % deoxycholát/0,1% SDS/0,1 M NaCI), přivedeny k varu ve vzorkovém pufru pro elektroforézu v prostředí dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) a naneseny na 13% akryíamidové gely. Když se čelo barviva dostalo až do spodní části gelu, byl gel fixován, ponořen do přípravku Enlightening, vysušen a radiografován. Intensity proužků, odpovídajících famesylovaným a nefarnesylovaným bílkovinám Ras byly porovnány ke stanovení procenta inhibice

-39prenosu farnesyíu na bílkovinu. Údaje zástupců sledovaných látek jsou uvedeny v

Tabulce 2.

Tabulka 2 ' Inhibice famesylace Ras sloučeninami podle tohoto vynálezu u buněčné linie v-ras * sloučenina IC₅₀ (uM)

N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropylamino)-3(S)-methylpentylj-N-rnethyl-isoleucyl-homoserinový 50 ¹ lakton methylester N-[2(S)-(2(R)-amino-3-merkaptopropy!aniino)- 5

-3(S)-methylpentyl]-N-methyl-isoleucyl-methioninu

Claims

PATENTOVÉ nároky' /lOft-tyT

1.

obecného

Sloučenina, vzorce I inhibující farnesylproteintransferázu kde

R^c znamena nebo

R je vodík, alkylová skupina, aralkylová skupina, acylová·skupina, aracylová skupina, aroylová skupina, alkylsulfonylová skupina, aralkyIsulfonylová skupina nebo arylsulfonylová skupina, přičemž alkylové a ácylové skupiny obsahují rovný nebo větvený uhlovodíkový řetězec, tvořený 1 áz 6 atomy'uhlíku,

R a R jsou vedlejší řetězce přírodně se vyskytujících aminokyselin, včetně jejich.oxidovaných forem, kterými mohou být methionin sulfoxíd nebo methionin sulfon, nebo v jiném případě mohou být substituovanými nebo