CS272758B2 - Method of peptide production - Google Patents
Method of peptide production Download PDFInfo
- Publication number
- CS272758B2 CS272758B2 CS20084A CS20084A CS272758B2 CS 272758 B2 CS272758 B2 CS 272758B2 CS 20084 A CS20084 A CS 20084A CS 20084 A CS20084 A CS 20084A CS 272758 B2 CS272758 B2 CS 272758B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- arg
- gln
- leu
- ala
- ser
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 15
- -1 Leu Chemical compound 0.000 claims abstract description 37
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 23
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical group C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims abstract description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 64
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 61
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 61
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 24
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 21
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 15
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 9
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 5
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DBTDEFJAFBUGPP-UHFFFAOYSA-N Methanethial Chemical compound S=C DBTDEFJAFBUGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CNC=N1 Chemical group [N].C1=CNC=N1 GELXFVQAWNTGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 28
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 7
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 abstract 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 abstract 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 31
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 22
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 21
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 17
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 10
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical group C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000825738 Rattus norvegicus Somatoliberin Proteins 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- ORNDKVCWLUZAQL-FOWIMTFFSA-N rgrf 43 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CN=CN1 ORNDKVCWLUZAQL-FOWIMTFFSA-N 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 3
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000252073 Anguilliformes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- NXJOFTRBTBDSHB-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-1,4-diazepane-1-carbothioyl)sulfanyl 4-methyl-1,4-diazepane-1-carbodithioate Chemical compound C1CN(C)CCCN1C(=S)SSC(=S)N1CCN(C)CCC1 NXJOFTRBTBDSHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 229940122439 Hydroxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;phosphoric acid Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC UBLQIESZTDNNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 108010036509 somatotropin releasing factor 40 Proteins 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
(57) Řešení se týká způsobu výroby syntetických peptidických analogů, uvolňujících růstový hormon a hypofysy a podobných útvarů, například tkáňových kultur hypofysárních buněk, obecného vzorce I, kde R^ znamená Tyr, Met, D-Tyr, Phe, Leu, D-His, nebo His, R„ znamená Ser nebo Asn, R,„ znamená Tyr, Phe nebo D-Tyr, R., znamená^rg nebo Lys, R., znamená Ile nebo Val, R.g znamená Gly nebo D-Alá, R.„ znamená Tyr nebo Ser, R,, znamená His nebo Gin, R,c znamená Glu nebo Asp, R,_ znamená D-Met, Met, Nle, Yle, Leu nebo Val, Z znamená Y, R-. -Arg-Y, R-r-Arg-Gln-Gln-Gly-Y, nebo R~g-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R,.-Asn-Gln-Glu-R~g-R,g-R,0-Arg-Phe-Asn,-Y, za předpokladu, še^bud R,
2’ 1 n --1— n
RSer nebo R,, 3e An9 nebo R,, je Ile nebo R.g je Tyr nebo R_. je His nebo R-5 je Glu nebo R-g je Asn, R_g znamená Ser nebo Asn, R,4 znamená Arg nebo Ser, Rgg znamená GlnJnebo Arg, R,„ znamená Arg nebo Gly, R._ znamená Ser nebo Ala, R.. znamená Val nebo des-R4- a Y znamená skupinu -NH, nebo -OH, nebo netoxických solí svrchu uvedených sloučenin.
272 758 (11) (13) B2 (51) Inť. Cl.5
C 07 K 7/20
H-R1-AlH-A»p-AlB-Ile-Phe-Thr-Rj)-Spr-n1(rAre-nij-n^j-Lfiii-^g-Oln-LGii-D^g-yOB-Arg-Lys-LeH-Leu-R24.H25-ne-E27Z.
Vynález se týká způsobu výroby peptidú, které mají vliv na funkci hypofýzy u lidí i u jiných živočichů., zejména savců. Vynález se týká zejména způsobu výroby peptidů, které vyvolávají uvolňování růstového hormonu z hypofýzy.
Fyziologové již dlouho věděli, že hypothalamus řídí vyměšovací funkci adenchypofýzy tak, že produkuje určité polypeptidy, které vyvolávají sekreci některého hormonu hypofýzy. Byl také zjištěn inhibiční faktor, který způsobuje inhibici sekrece růstového hormonu (GH) a je nazýván somatostatin.
V poslední době byl z nádoru slinivky břišní u člověka izolován odpovídající faktor, který naopak uvolňuje růstový hormon z hypofýzy. Tento faktor je podobný hypothalamickému faktoru, byl čištěn, byla stanovena jeho struktura a byl také vyroben a zkoušen. Tento peptid má následující sledí
Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.
Uvedený peptid pravděpodobně existuje v amidované formě, která se označuje hpGRF (faktor, uvolňující růstový hormon,· izolovaný z nádoru slinivky břišní-u člověka).
Nyní byl z extraktů krysího hypothalamu izolován polypeptid, který byl čištěn, byl. stanoven jeho sled a peptid byl také vyroben a zkoušen. Tento peptid uvolňuje růstový hormon z hypofyzálních buněk, pěstovaných ve tkáňové kultuře. Tento peptid se přirozeně vyskytuje, obsahuje 43 zbytků aminokyselin a má následující sled:
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-ieu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH.
Tento peptid bude dále označován jako rhGRF (faktor z krysího hypothalamu, uvolňující růstový hormon).
Nyní byly vyrobeny některé analogy hpGRF a při zkouškách se prokázalo, že některé z nich jsou ještě účinnější a řada z nich má kratší řetězec. Některé z těchto analogů vznikají substitucí řetězce rhGRF, kdežto některé z nich vznikají složitějšími substitucemi. Je tedy možno získat farmaceutické prostředky, které obsahují svrchu uvedené analogy nebo jejich netoxické soli, dispergované v pevném nebo kapalném nosiči, přijatelném z farmaceutického hlediska. Takto získané farmaceutické prostředky je možno užít v klinickém lékařství, a to jak v lidském, tak ve veterinárním lékařství k léčebným a také k diagnostickým účelům. Tyto prostředky je možno užít k podpoře růstu nejrůznějších teplokrevných živočichů včetně drůbeže a'v zemědělství i k podpoře růstu studenokrevných zvířat, například ryb, úhořů a podobně.
Nomenklatura, která bude dále užívána při definici jednotlivých peptidů, je užita v souladu s publikací Schroder a lubke “The Peptides, Academie Press (1965), kde je v souladu s běžnou praxí N-terminální aminoskupina zařazována nalevo a C-termiňální karboxylová skupina zařazována napravo.
Za přírodní aminokyselinu se považuje běžně přírodrě se vyskytující aminokyselina, a to Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe,
Tyr, Pro,·Trp a His tak, jak se vyskytují v bílkovinách.
V případě, že zbytek aminokyseliny se vyskytuje v isomerních formách, je vždy míněna L-forma aminokyseliny, není-li výslovně uvedeno jinak. Pro účely přihlášky se rhGRF považuje za analog hpGRF.
Předmětem vynálezu je způsob výroby.syntetických peptidických analogů, uvolňujících růstový hormon a hypofysy a podobných útvarů, například tkáňových kultur hypofysárních buněk, obecného vzorce 1
-4*
H-R1-Ala-Asp-Ala-Ilc-Phe-Thr-R8-Ser-R1Q-Arg-R12-Ri3-Leu-R15-Gln-Leu-R1g-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R2 4_R2 5”!le—Rgy”Z kde
Rj znamená Tyr, Met, D-Tyr, Phe, Leu, D-His, nebo His,
R8 znamená Ser nebo Asn,
R10 znamená Tyr, Phe nebo D-Tyr,
R|2 znamená Arg nebo Lys,
R|g znamená Ile nebo Val,
Rj5 znamená Gly nebo D-Ala,
R^g znamená Tyr nebo Ser,
R24 znamená His nebo Gin,
R25 znamená Glu nebo Asp,
R27 znamená D-Met, Met, Nle, Ile, Leu nebo Val, znamená Y, R28“Arg_Y, R28—Arg—Gin—Gln-Gly—Y, nebo R2g—Arg—Gln—Gln—Gly—Glu—R34“
-Asn-Gln-Glu-Rg8 —Rg g—R4 q—Arg—Phe—Asn—R4 4—Y, za předpokladu, že bud Rg znamená Ser, nebo Rg2 j® Ang nebo R|g je Ile nebo R18 je Tyr nebo R24 je His nebo R25 je Glu nebo Rgg je Asn,
R28 znamená Ser nebo Asn,
R84 znamená Arg nebo Ser,
Rg8 znamená Gin nebo Arg,
Rgg znamená Arg nebo Gly,
R4Q znamená Ser nebo Ala,
R44 znamená Val nebo des-R44 a
Y znamená skupinu -NHg nebo -OH, nebo netoxických solí svrchu uvedených sloučenin, vyznačující se tím, že se
a) vytvoří peptid s alespoň jednou ochrannou skupinou, obecného vzorce II
X1-R1 (X nebo X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X4 nebo X5)-Ser(X4)-Rlo(X2)-Arg(X6)-R12(X6 nebo X7)-R13-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-R18(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys-(X7)-Leu-Leu-R24(X nebo X5)-R25(X3)-Ile-R27-Z' kde R-£ až 27 mají svrchu uvedený význam,
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alfa-aminoskupině,.
s výhodou BOC,
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na imidazolovém dusíkovém atomu His, s výhodou Tos,
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu fenolové hydroxylové skupiny Tyr, s výhodou 2,6-dichlorbenzyl,
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na karboxylové skupině
Asp nebo Glu, s výhodou Bzl, .
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alkoholové hydroxylové skupině Thr nebo Ser, s výhodou Bzl,
X' .5 .6 .7
Z* znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu amidoskupiny postranního řetězce Asn nebo Gin, s výhodou Xan, >
znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na guanidoskupině Arg, s výhodou Tos, znamená atom vodíku nebo ochrannou.skupinu na aminoskupině postranního řetězce Lys, s výhodou 2-chlorbenzyloxykarbonyl, znamená X9 nebo R28(X4 nebo X3)-Arg(X6,-X9 nebo R28(X4 nebo X5,-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln{X5)-Gly-X9 nebo R2g(X4 nebo X5)-Arg(X6)-Gln{X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 nebo X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(x3j-R38(X5 nebo X5)-R40(X4)-Arg(X6)-Phe-Asn(X5)-R44-X9, kde R28 až R44 mají svrchu uvedený význam a X -0-CH2-nosič nebo vazbu -NH-nosič, navázáním každé aminokyseliny s alespoň alfa-aminoskupinou chráněnou odpovídajícím způsobem, v množství 1 až 2 milimoly chráněné aminokyseliny na 1 g pryskyřice jako nosiče ve vhodném rozpouštědle, potom se
b) odštěpí ochranné skupiny a peptid se oddělí od pryskyřice jako nosiče kyselinou trifluoroctovou ve vhodném rozpouštědle, s následným užitím fluorovodíku a anisolu nebo methylensulfidu nebo směsi těchto látek při nižší teplotě, s výhodou 0 až -20 C potom se výsledný produkt rozpustí ve vhodném rozpouštědle, a potom se čistí známým způsobem.
Analogy hpGRF, které obsahují některý ze svrchu uvedených substituentů pro Met v poloze 27 jsou daleko stálejší, zvláště při vystavení oxidačním podmínkám. Mimoto v případě, že substituentem je D-isomer, může být zvýšena odolnost proti působení enzymů. Přitom fragmenty jsou biologicky aktivní a některé analogy mají dokonce vyšší účinnost při zkouškách in vitro. Substituce His v poloze 1 má za následek překvapující zvýšení účinnosti. Mimoto při substituci D-isomerem aminokyseliny, například D-Tyr, se uchovává většina účinnosti a peptid je přitom odolnější proti degradaci některými enzymy.
Svrchu uvedené peptidy je možno připravit vhodným způsobem, například na pevné fázi, částečně na pevné fázi, kondenzaci fragmentů, klasickou vazbou v roztoku nebo použitím rekombinantní DNA. Například při výlučném použití pevné fáze je moznů postupovat podle publikace Solid-Phase Peptide Synthesis, Stewart a Young, Freeman a Co., San Francisko, 1969, příklady těchto postupů jsou uvedeny také v US patentovém spisu č. 4 105 603 z 8. srpna 1978 {Vale a další). Kondenzace fragmentů jako metoda pro získání peptidů je uvedena například v US patentovém spisu č. 3 972 859 z 3. srpna 1976. Další způsoby syntézy jsou uvedeny například v US patentovém spisu č. 3 842 067 z 15. října 1974 a v US patentovém spisu č. 3 862 925 z 28. ledna 1975·.
Pod syntézou při použití rekombinantní DNA se rozumí použití strukturálního genu, který je kódem pro požadovanou formu analogu hpGRF nebo jeto fragmentu. Syntetický peptid hpGRF je možno získat tak, že se transformuje mikroorganismus při použití vektoru pro expresi a při použití promotoru a operátoru současně s tímto strukturálním genem, čímž dojde k transformaci mikroorganismu a expresi peptidu hpGRF. K produkci peptidu hpGRF může dojít také u některého živočicha tak, že se použije strukturální gen a obecný postup, uvedený v US patentovém spisu č. 4 276 282 z 30. června 1981 nebo při užiti mikroinjekcí do zárodků způsobem, popsaným ve WO83/01783 z 26. května 1983 a WO82/04443 z 23. prosince 1982. Syntetický postup hpGRF je také možno provádět přímo ve zvířeti, ve kterém je požadován urychlený růst při použití způsobů,·popsaných v obou svrchu uvedených WO publikacích.
Běžným způsobem při chemické syntéze je ochrana labilních skupin v postranních řetězcích různých aminoskupin při použití vhodných ochranných skupin, které zabrání nežádoucím chemickým reakcím v těchto místech do té doby, než je ochranná skupina obsažena. Běžné je také chránění alfa-aminoskupiny na aminokyselině nebo na fragmentu v době, kdy celá molekula reaguje na karboxylové skupině s následným selektivním odstraněním ochranné skupiny na alfa-aminoskupině k umožnění další reakce v této poloze. Je také běžné vytvořit nejprve meziprodukt, který obsahuje zbytky aminokyselin v požadovaném sledu výsledného peptidového řetězce a současně nese na postranních řetězcích v příslušných polohách ochranné skupiny.
Ochranné skupiny na alfa-aminoskupině ve významu X^ jsou běžné ochranné skupiny, známé při postupné výrobě polypeptidů. Jde zejména o následující typy ochranných skupin:
1) Ochranné skupiny typu aromatického urethanu, například fluorenylmethyloxykarbonyl, (FMOC), benzyloxykarbonyl (Z), popřípadě substituovaný, například p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-nitrobenzyloxykarbony1, p-brombenzyloxykarbonyl a p-methoxybenzyloxykarbonyl,
2) ochranné skupiny typu alifatického urethanu, například terč.butyloxykarbonyl (BOC), diisopropylmethyloxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl, ethoxykarbonyl, allyloxykarbonyl a
3) ochranné skupiny typu cykloalkylurethanu, na příklad cyklopentyloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl a cyklohexyloxykarbony1.
Výhodnou ochrannou skupinou na alfa-aminoskupině je BOC.
X znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu pro dusíkový atom imidazolového kruhu His, například Tos.
.
X znamená vhodnou ochrannou skupinu pro hydroxylovou skupinu fenolového zbytku Tyr, například tetrahydropyranyl, terč. butyl, trityl, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ a 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Výhodnou ochrannou skupinou je 2,6-dichlorbenzyl.
X může také znamenat atom vodíku, coz znamená, ze na zbytku aminokyseliny v této poloze se na postranním řetězci nenachází žádná ochranná skupina.
z z
X je atom vodíku nebo vhodná ochranná skupina, tvořící ester na karboxylové skupině Asp nebo Glu, například benzyl (OBzl), 2,6-dichlorbenzyl, methyl nebo ethyl.
X znamená vhodnou ochrannou skupinu pro hydroxylovou skupinu Thr nebo Ser, například acetyl, benzoyl, terč.butyl, trityl, tetrahydropyranyl, Bzl, 2,6-dichlorbenzyl a CBZ. Výhodnou ochrannou skupinou je Bzl. X^ může také znamenat atom vodíku, což znamená, že se na hydroxylové skupině nenachází žádná ochranná skupina.
.
X znamená atom vodíku nebo vhodnou ochrannou skupinu na postranním řetězci na amidoskupině Asn ne jo Gln.S výhodou jde o santhyl (Xan).
X® znamená vhodnou ochrannou skupinu pro guanidinovou skupinu Arg, například nitroskupinu, Tos, CBZ, adamantyloxykarbonyl a BOC, nebo jde o atom vodíku.
X znamená atom vodíku nebo vhodnou ochrannou skupinu pro aminoskupinu Lys na postranním řetězci. Vhodnými ochrannými skupinami v této poloze jsou 2-chlorbenzyloxykarbonyl (2-C1-Z), Tos, terc.-amyloxykarbonyl a BOC.
X znamená atom vodíku nebo vhodnou ochrannou skupinu postranního řetězce tak, jak byly svrchu uvedeny.
Met může být obvykle chráněn kyslíkem, s výhodou však není chráněn.
Volba ochranné skupiny pro aminoskupinu postranního řetězce není kritická až na to, že obvykle se volí taková skupina, k jejímuž odštěpení nedochází v průběhu syntézy a odstraňování ochranné skupiny na alfa-aminoskupLně. V případě některých aminokyselin, například His, není nutno navázat ochrannou skupinu po ukončeném postupu a mimoto mohou ochranné skupiny pro jednotlivé aminoskupiny být stejné.
X® znamená vhodnou ochrannou skupinu pro C-terminální karboxylovou skupinu, může 3 jít například o skupinu X, tvořící ester nebo jde o pevnou vazbu tak, jak se „„ , g užívá při syntéze na pevné fázi pro vazbu na podložku, nebo bezi o des-X , a v tomto případě obsahuje zbytek na C-terminálním zakončení karboxylovou skupinu ve významu X. V případě, že se jako podložka užije pryskyřice, může jít o některou z běžně užívaných pryskyřic, například o -O-CH2-pryskyřici,-NH-benz hydrylaminovou pryskyřici (BHA) nebo -WH-paramethylbenzhydrylaminovou pryskyři ci (MBHA). V případě, že je požadován nesubstituovaný amid, je výhodnější použití pryskyřice BHA nebo MBHA, protože v tomto případě se po odštěpení přímo získá amid. V případě, že je požadován N-methylamid, může být získán z N-methyl-BHA-pryskyřice. V případě, že by byly požadovány substituované amidy nebo jiné skupiny na C-terminálním zakončení než volná kyselina, může být výhodnější získat peptid klasickými způsoby tak, jak jsou uvedeny ve svrchu zmíněné publikaci Houben-Weylově.
Ve vzorci meziproduktu znamená alespoň jedna skupina X ochrannou skupinu nebo zahrnuje X i podložku typu pryskyřice. Předmětem vynálezu je způsob výroby svrchu uvedeneho peptidu tak, že se ‘a) vytvoří peptid s alespoň jednou ochrannou skupinou obecného vzorce II:
X1-R1(X nebo X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X4 nebo X5)-Ser (X4)-Tyr (X2)-Arg(X6)-R12(X6 nebo X7)-R13-Leu-Gly-GlnfX5)-Leu-Rlg(X2)-Ala-Arg(X6)-lys(X7)-Leu-Leu-R24(X nebo X5)-R2 (X3j-lle-R27-R2S(X4 nebo X5)-Arg(xe)-Gln(X5)-Gln(X5,-Gly-G1u(X3)-R34(X4 nebo X°) -Asn(X5) -Gln(X3) -GlufX3) -R3g {X5 nebo X8)-R3g(X6)-R40(X4)-Arg(X6)-R42-R43(X5 nebo X6)-R44(X8)-X9 kde
X, X , X , X , X
X7 a X8 znamenají atom vodíku nebo ochrannou skupinu nebo vazbu, kterou je výchozí látka vázána na pryskyřici jako na pevnou podložku nebo znamená ochrannou skupinu, skupinu, kterou je výchozí látka vázána na pryskyřici nebo skupi9 nu des-X , v tomto případe zbytek na C-terminálnírn zakončení obsahuje karboxylovou skupinu ve významu X,
b) odštěpí se ochranná skupina nebo ochranné skupiny nebo se zruší vazba peptidu obecného vzorce II, která peptid váže na pryskyřici jako na pevnou podložku a
c) popřípadě se výsledný peptid převede na netoxickou sůl.
Při volbě ochranných skupin pro postranní řetězec při syntéze peptidů je nutno zachovat následující pravidla:
a) ochranná skupina si musí zachovat své vlastnosti a nesmí být odštěpena při vazbě,
b) ochranná skupina má být stálá při použití příslušných reakčních činidel a s výjimkou Xan musí být stálá za reakčních podmínek při odstraňování ochranné skupiny na alfa-aminoskupinu v každém stupni syntézy a
c) ochrannou skupinu na postranním řetězci musí být možno odstranit po dovršení reakce získáním požadovaného sledu aminokyselin za reakčních podmínek, které neporuší peptidový řetězec.
V případě, že peptidy nejsou získávány při použití rekombinantní DNA, připravují se s výhodou při použití pevné fáze tak, jak bylo popsáno v publikaci Merrifield, J. Am.
Chem. Soc., 85, str. 2149 (1963), přestože je možné užít i jiné způsoby chemické výroby, tak, jak byly shora uvedeny. Při použití pevné fáze se syntéza zahajuje od C-terminálního zakončení peptidu tak, že se chráněná alfa-aminokyselina naváže na vhodnou pryskyřici. Výchozí materiál tohoto typu je možno získat tak, že se naváže aminokyselina, a to obvykle esterovou vazbou na chlormethylovanou nebo hydroxymethylovanou pryskyřici nebo se naváže amidovou vazbou na pryskyřici BHA nebo MBHA. V případě, že má výsledný polypeptid obsahovat methyl, ethyl nebo propylamid, je výhodné užít chlormethylované nebo hydroxymethylovanou pryskyřici a štěpení se potom provádí při použití příslušného aminu, například ethylaminu.
V případě, že má být připraven například peptid se 40 zbytky aminokyselin, naváže se na chlormethylovanou pryskyřici Ala, chráněný BOC způsobem popsaným v publikaci Monahan a Gilon, Biopolymer 12, str. 2513-19, 1973. Po navázání BOC-Ala na pryskyřici jako na podložku se odstraní ochranná skupina na alfa-aminoskupině na příklad použitím kyseliny trifluorocotové (TFA) v methylenchloridu, samotnou kyselinou trifluoroctovou nebo kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu. Odstranění ochranných skupin je možno provádět při teplotě 0 ’C až teplotě místnosti. Je možno také užít jiných činidel a podmínek pro odstranění specifických ochranných skupin na alfa-aminoskupině tak, jak byly popsány v publikaci Schroder a Lubke, The Peptides, 1, str. 72 až 75 (Academie Press 1965).
Po odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupině Phe se zbývající chráněné alfaaminosl upiny a postranní řetězce postupně naváží v požadovaném sledu tak, aby se získal svrchu uvedený meziprodukt, nebo je možno také některé aminoskupiny předem navzájem vázat před piidáním k pevné fázi. Volba příslušného činidla spadá do kompetence odborníka.
Zvláště vhodným činidlem pro toto použiti je N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCCI).
Aktivační činidla, užívaná při výrobě peptidů v pevné fázi, jsou známa. Příkladem vhodných aktivačních činidel mohou být karbodiimidy, například N,Ν'-diisopropylkarbodiimid, dále N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid. Další aktivační činidla a jejich použití při vazbě peptidů jsou popsána ve shora uvedené publikaci Schrodera a Lubkeho ve
3. kapitole a publikaci Kapoor, J. Phar. Sci, 59, str. 1 až 27 (1970).
Každá chráněná aminokyselina nebo sled aminokyselin se přivádí do reaktoru s pevnou fází v přibližně čtyřnásobném nebo větším přebytku, vazbu je možné provádět v prostředí dimethylformamidu a methylenchloridu v poměru 1 : 1 nebo v samotném dimethylformamidu nebo v samotném methylenchloridu. V případě, že dojde k nedokonalé vazbě, je nutno postup opakovat před odštěpením ochranné skupiny na alfa-aminoskupinu před vazbou další aminokyseliny. Úspěch vazby v každém stupni výroby peptidu je nutno sledovat ninhydrinovou reakcí tak, jak je popsána v publikaci E. Kaiser a další, Anal. Biochem. 34, 595 (1970).
Vazné reakce je možno provádět automaticky, například na automatickém syntetizátoru Beckman 990 při použití příslušného programu tak, jak je to popsáno v publikaci Rivier a další Biopolymers, 1978, 17, strany 1927 až 1938.
Po získání požadovaného sledu aminokyselin je možno oddělit meziprodukt od podložky, kterou je pryskyřice působením reakčního činidla, například působením kapalného fluorovodíku, který nejen odštěpí peptid od pryskyřice, ale také odštěpí všechny zbývající ochran2345678 9 né skupiny na postranním řetězci, a to X, X , X , X , X , X , X a X , vazbu X , která váže peptid k podložce a ochrannou skupinu X1 na alfa-aminoskupině, čímž se získá výsledný peptid ve formě volné kyseliny. V případě, že se ve sledu vyskytuje Met, odstraní se s výhodou nejprve ochranná skupina BOC při použití směsi kyseliny trifluoroctové a ethandithiolu před odštěpením peptidu z pryskyřice působením fluorovodíku, aby nedošlo k ne7 bezpečí potenciální S-alkylace. Při použití fluorovodíku k odštěpení má reakční směs obsahovat anisol a methylethylsulfid k vazbě vedlejších produktů.
V případě, že se syntetické peptidy připravují při použití rekombinantní DNA, obsahuje N-terminální zakončení celého peptidu obvykle ještě navíc zbytek Met, tento zbytek se však již nemá dále vyskytovat ve výsledném peptidu. Je také zapotřebí, aby všechny zbytky, použité v peptidu, byly přírodně se vyskytující L—isomery aminokyselin, nebo Gly. Výsledkem je produkce výhodného peptidu jako meziproduktu, tento peptid je možno vyjádřit ohecným vzorcem
H-Met-^-Ala-Asp-Ala-1le-Phe-Thr-Eg-Ser-Try-Arg-R.^ 2~R13-Leu-Gly-Gln-teu-R1θ-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-R27-R2g-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R3g-R3g-R4o-Arg-R42kde znamená Tyr, Leu nebo His,
| R8 | znamená | Ser | nebol Asn, | |
| R12 | znamená | Arg | nebo | Lys, |
| R13 | znamená | Ile | nebo | Val, |
| R18 | znamená | Tyr | nebo | Ser, |
| R24 | znamená | His | nebo | Gin, |
| R25 | znamená | Glu | nebo | Asp, |
| R27 | znamená | Ala, | r Hle | , Ile, Leu nebo Val, |
| R28 | znamená | Asn | nebo | Ser, |
| R34 | znamená | Arg | nebo | Ser, |
| **38 | znamená | Gin | nebo | Arg, |
| R39 | znamená | Arg | nebo | Gly, |
| R40 | znamená | Ser | nebo | Ala, |
| R42 | znamená | Phe | nebo | Ala, |
| R43 | znamená | Asn | něho | Arg, |
| R44 | znamená | přírodní | aminokyselinu nebo des-R |
kde Y znamená karboxylovou skupinu C-terminálního zakončení a běží bud o skupinu -COOH, nebo -CONH^.
Jakmile dojde k expresi tohoto peptidu geneticky modifikovaným mikroorganismem a meziprodukt je izolován a čištěn známým způsobem, působí se na tento meziprodukt bromkyanem k odštěpení zbytku Met na N-terminálním zakončení, čímž se získá biologicky aktivní peptid. Přestože ze svrchu uvedeného vzorce je zřejmé, že peptid má délku až do polohy 43 něho do polohy 44, je možno dosáhnout vysoké biologické účinností již tehdy, když peptid zasahuje pouze do zbytku 27 a 29 a tyto kratší fragmenty jsou pro celou řadu účelů stejně účinné a stejně použitelné jako celý peptid a spadají do skupiny výhodných meziproduktů, které je možno získat rekombinantní technologii při použití DNA.
V následujících příkladech jsow uvedeny výhodné způsoby syntézy analogů hpGRF technikou s pevnou fázi. Je samozřejmé, že odpovídající kratší fragmenty peptidu je možno získat stejným způsobem tak, že se vynechá příslušné množství aminokyselin od C-terminálního zakončení.’
Přikladl
Syntéza /Ile27/-hpGRF(l-40)-NH2 vzorce H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru Beckman 990 při použití hydrochloridu pryskyřice MBHA, kterou je možno získat od Bachem, lne., a která má míru substituce přibližně 0,1 až 0,5 mmol/g pryskyřice. Vazba BOC-Ala na tuto pryskyřici se provádí tak, jak bude dále uvedeno ve schématech A a B, výsledky substituce jsou přibližně 0,35 mmol. Ala na gram pryskyřice. Všechna rozpouštědla, která se při tomto postupu užívají, se pečlivě zbaví plynů průchodem inertního plynu, např. helia nebo dusíku, aby bylo možno zajistit úplnou nepřítomnost kyslíku, která by mohla být příčinou nežádoucí oxidace siry ve zbytku Met.
Po zbavení ochranných skupin a neutralizací se postupně buduje na pryskyřici peptidový řetězec. Odstranění ochranných skupin, neutralizace a přidání každé další aminokyseliny se provádí v podstatě v souladu s postupem, který je podrobně uveden v US patentovém spisu č. 4 292 313 (Vale a další).
Odstranění ochranných skupin se s výhodou uvádí v souladu s následujícím schématem A:
Schéma A reakčni činidlo doba míšení v min.
1. 60 % TFA/2 % ethandithiol 10
2. 60 i TFA/2 % ethandithiol 15
3. IPA/ 1 % ethandithiol 0,5
4. EtjF (10 %) v CH2C12 0,5
5. MeOI 0,5
6. Et3ř. (10 %) v CH2C12 0,5
7. MeOII (dvakrát) 0,5
8. CH2C12 (dvakrát) 0,5
Vazba jednotlivých aminokyselin se provádí podle následujícího schématu B:
Schéma B reakčni činidlo doba míšení v min.
| 9. | DCCI | - |
| 10. | Boc-aminokyselina | 50 až 9.0 |
| 11. | MeOH (dvakrát) | 0,5 |
| 12. | CH2C1 (dvakrát) | 0,5 |
| 13. | Ac20 (3M) v CH2C12 | 15,0 |
| 14.. | ch2ci2 | 0,5 |
| 15. | MeOH | 0,5 |
| 16. | CH2C12 (dvakrát) | 0,5 |
| Postupuje se tak, že se užije 1 až 2 mmol aminokyseliny, | chráněné BOC v methylen- |
chloridu na 1 g pryskyřice a mimoto 1 ekvivalent l,0M DCCI v methylenchloridu na 2 hodiny. Jakmile dojde k vazbě BOC-Arg (TOS), přidá se směs 50 % dimethylformamidu v methylenchloridu. Bzl ve formě etheru se užije jako ochranná skupina na hydroxylové skupině Ser a Thr v postranním řetězci. K aktivaci karboxylového zakončení Asn nebo Gin se užije p-nitrofenylester (ONp) a například BOC-Asn(ONp) se potom váže přes noc při použití jednoho ekvivalentu HOBt v 50 % dimethylformamidu v methylenchloridu, v tomto případě se nepřidává DCC. Amidoskupina Asn nebo Gin se chrání Xan v případě, že se užije DCC místo aktivního esteru. 2-chlorbenzyloxykarbonyl (2C1-Z) se užije jako ochranná skupina pro postranní řetězec Lys. Tos se užije jako ochranná skupina guanidinové skupiny Arg a Glu nebo Asp karboxylová skupina se chrání ve formě Bzl-esteru(OBzl). Hydroxylová skupina fenolového kruhu Tyr se chrání 2,6-dichlorbenzylovou skupinou (DCB). Na konci této syntézy se získá následující sloučenina:
X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Αχη (X5)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-GJη(X5)-Asp(X3)-Ile-IleSer (X4) -Arg(X6) -Gln(X5) -Gln(X5) -Gly-Glu(X3) -Ser (X4) -Asn(X5)-Gln(X5) -Glu(X3) -Arg(X5) Gly-Ala-X8 kde
X7 znamená BOC,
X znamená DCB,
O
X znamená zbytek benzylesteru,
X4 znamená Bzl, c
X znamená Xan,
X8 znamená Tos,
X znamená 2C1-Z a «*
X znamená -NH-pryskyřice jako podložka.
Xan je možno částečně nebo úplně odstranit působením kyseliny trifluoroctové, která se užívá k odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupinu.
Jakmile se naváže na pryskyřici poslední zbytek Tyr, odstraní se BOC působením 60 % kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu. Aby bylo možno odštěpit výsledný produkt od pryskyřice a zbavit jej ochranných skupin, působí se směsí 1,5 ml anisolu, 0,5 ml methyl ethylsulfidu a 15 ml fluorovodíku na 1 g směsi peptidú a pryskyřice 1/2 hodiny při teplo· tě -20 *C a 1/2 hodiny při teplotě 0·*C. Po odstranění fluorovodíku ve vysokém vakuu se zbytek pryskyřice s peptidem postupně střídavě promývá bezvodým diethyletherem a chloroformem a peptid se potom extrahuje vodným roztokem kyseliny octové o koncentraci 2 N, zbaveným plynů a oddělí se od pryskyřice filtrací. ' .
Odštěpený peptid, zbavený ochranných skupin, se potom rozpustí v až 5 % kyselině octové a čistí se, například filtrací přes jemný gel Šephadex G-50.
Peptid se potom dále čistí preparativní nebo semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií způsobem podle publikace Rivier a další, Peptides: Structure and Biological Function (1979), .strany 125 až 128 a Marki a další, J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981). Postupuje se tak, že se sloupec pro vysokotlakou kapalinovou chrbmatografii (Waters Associates, prep LC-500) naplní oktadecyl-oxidu křemičitého o průměru zrn 15 až 20 um a pórů 3.10 cm. Potom Se vytvoří gradient methylkyanidu v triethylamoniumfosfátu pomocí nízkotlakého zařízení Eldex, jak je popsáno v publikaci Rivier, J., J. Lig. Chromatography, 1, 343 - 367 (1978). Chromatografické frakce se pečlivě sledují vysokotlakou kapalinovou chromatografií a pouze frakce s dostatečnou čistotou se spojí. Čištěné frakce se potom zbaví solí, jednotlivě se dále sledují ke stanovení čistoty, používá se gradientu CH^CN v 0,1 & kyselině trifluoroctové. Přední část každé frakce se potom lyofilizuje, čímž se získá požadovaný peptid s čistotou vyšší než 98 %.
Postup se opakuje při použití chlormethylované pryskyřice, čímž se získá tentýž peptid ve formě volné kyseliny při použití postupu, který'je obecně popsán v publikaci Rivier J., J. Araer, Chem. Soc. 96, 2986-2992 (1974).
rS
Příklad 2
28
Syn :éza val , D-Ala -hpGRF(1-40)-NH2 se vzorcem
H-Tyr-Al i-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-D-Ala~Arg-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v přikladu 1. Podle chromatografie na tenké vrstvě a podle výsledků vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 3
Syntéza analogu hpGRF D-Tyr^ -hpGRF(1-32)-NH2 o vzorci
H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidu Beckman 990 na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Peptid je podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a podle výsledku vysokotlaké kapalinové chromatografie v podstatě čistý. Optická rotace se měří na fotoelektrickém polarimetru a její hodnota je alfa = -61,4 ° + 1 (C - 1, % kyselina octová, neopraveno).
Syntéza se opakuje p i použiti chlormethylované pryskyřice za získání téhož peptidu ve formě volné k/seliny, jak bylo uvedeno svrchu.
Příklad 4
Syntéza zkráceného analogu hpGRF typu Nle -hpGRF (1-32)-NH2 vzorce
H-Tyr-Ala~Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a při použití pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kanalinové chromatografie je tento analog v podstatě čistý. Optická rotace se měří na fotoerektrickém polarimetru, výsledek je alfa ÍP = -57,8 ° + 1 (C = 1, 1 % u 27 kyselina octová, neopraveno). Tentýž obecný postup je možno užít pro výrobu Nle -hpGRF (1-44)-NH2.
Příklad 5
Syntéza Nle^ -hpGRF(1-27)-NH2 vzorce
H-Tyr-Ala-Asp-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-NHj se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 6
Syntéza Ile^ -hpGRF(1-32)-OH vzorce
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-A:;p-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 na chlormethylované pryskyřici způsobem, uvedeným na konci příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid. Optická rotace, měřená na fotoelektrickém polarimetru je alfa θ =-61,7 + 1 (C = 1,1 % kyselina octová, neopraveno).
V případě, že se celá syntéza opakuje při použití pryskyřice MBHA, získá se tentýž peptid v amidované formě.
Příklad 7
Syntéza D-Met27 -hpGRF(l-32)-NHg Vzorce
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gl^-N^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid. Optická rotace, měřená na fotoelektrickém polarimetru, je alfa22 = -54,5' +1 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno) . ’
Příklad 8
Syntéza His3- -hpGRI'(l-32)-NH2 vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se získá postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid. Optická rotace, měřená na fotoelektrickém polarimetru, je alfa Q =-58,7’+l (C = 1, 1% kyselina octová, neopraveno).
Syntéza se opakuje při použití Phe jako posledního zbytku, čímž se získá Phe3- 22
-hpGRF(I-32)-NH2· Optická rotace, měřená na fotoelektrickém polarimetru, je alfa θ = = -58,2’ +1 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno).
Příklad 9 i n
Syntéza Phe -hpGRP(l-32)-NH2 vzorce
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Phe-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid. Optická rotace, měřená fotoelektrickým polarimetrem, je alfa = -59,5 +1 (C = 1, 1% kyselina octová, neopraveno) .
Příklad 10
Syntéza Val27 -hpGRF(l-32)-OH o vzorci
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Val-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a chlormethylované pryskyřice způsobem, popsaným na konci příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie je výsledný peptid Čistý. Optická rotace, meřená fotoelektrickým polarimetrem, je alfa Q = -62,4’ + 1(C = 1,1% kyselina octová, neopraveno).
Příklad 11
Syntéza His1, Nle27 -hpGRF(1-32)-NH2 vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Ptie-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a. pryskyřice M.BHA způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid. Optická rotace·, měřená fotoelektrickym polarimetrem je alfa = -59,3 +1 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno) .
Příklad 12
Syntéza rhGRF-(l-43)-OH vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys~
-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použiti syntetizátoru peptidů Beckman 990 a chlormethylované pryskyřice se substitucí přibližně 0,1 až 0,5 mmol/g pryskyřice způsobem, popsaným v příkladu 6. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid. Optická rotace, měřená fotoele.ktrickým polarimetrem, je alfa = 50,8 +1 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno).
Syntéza se opakuje při použití pryskyřice MBHA, čímž se získá rhGRF(1-43)-NH2 při použití počátečního postupu tak, jak je popsán v US patentovém spisu č. 4 292 313 (Vale a další) při vazbě Asn na pryskyřici MBHA. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid. Optická , „ 22 otacivost, merená fotoelektrickym polarimetrem, je alfa = -51,7 +1 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno).
Příklad 13
Syntéza rhGRF(1-4)-NH2 vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-NH2 se provádí postupem při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA postupem, který byl popsán v příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid. Otická rotace, měřená na fotoelektrickém polarimetru je alfa = -56,5’ +1 (C = 1, % kyselina octová, neopraveno).
Příklad 14 1 27
Syntéza analogu hpGRF, tj. Met , Leu -rhGRF(1-43)-OH vzorce
H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a chlormethylované pryskyřice způsobem, který je popsán v příkladu 12. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 15
Syntéza analogu hpGRF typu Nle -rhGRF-(1-32)-ΝΞ2 vzorce H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ála-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-®^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 16
Syntéza fragmentu analogu hpGRF typu D-Tyr^ -rhGRF(1-29)-NH2 vzorce
Η-Ηΐ3-ΑΐΒ-ΑΞρ-ΑΐΞ-Ι1&-Ρίιβ-ΤΐΐΓ-Ξ6Γ-ΞθΓ-Ώ-ΤγΓ-Α^-Α^-Ι1β-Ι1βη-6ΐγ-6ΐη-1βη-ΤγΓ-Α^-Α^-Ι,γ3-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-N^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem podle přikladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid.
Syntéza se opakuje při použití D-Tyr místo His na N-terminálním zakončení, čímž se lín získá D-Tyr ' -rhGRF(1-29)-NH2·
Příklad 17
Syntéza fragmentu analogu hpGRF typu rhGRF(1-29)“NH2 vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ilo-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Iieu-Tyr-Ala-Arg-Iiys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 se provádí postupem při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 3. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chrcmatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 18
Syntéza Nle^? -rhGRF(1-29)-NHj vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-ffi^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid. Optická otáčivost, měřená na fo22 toelektrickem polarimetru je alfa β = -526 +1 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno) .
Příklad 19
Syntéza analogu hpGRF typu D-His^, D-Tyr^, D-Ala^ -rhGRF(1-29)-NH^ vzorce
H-D-His~Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-D-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-ArgLys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-N^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 20
Syntéza analogu hpGRF typu Tyr1 -rhGRF(1-29)-NH2 vzorce H-Tyr-Ala-A p-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Lou-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Hi :-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.
Příklad 21 44
Syntéza rhGRF- Val -NH2 vzorce
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gl ,-Lc u-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val-NH2 se provádí při použití syntetizátoru peptidů Beckman 990 a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se získá v podstatě čistý peptid.
Syntéza Leu1, Nle27 -rhGRF(l-29)-NH2 se provádí při použití synthetizátoru peptidů způsobem podle příkladu 1. Optická otáčivost, měřená na fotoelektrickém polarimetru ·
je alfa β = -52,8 (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno).
V následující tabulce bude uvedena optická otáčivost sloučenin z některých příkladů, ve kterých není tato hodnota přímo uvedena.
Optická otáčivost alfa (C = 1, 1 % kyselina octová, neopraveno)
Sloučenina z příkladu Optická otáčivost
| 4 | -57,8 |
| 5 | -62,4’ |
| 6 | -61,7’ |
| 15 | -55,8’ |
| 16 (první látka) | -63,6’ |
| 19 | -64,5’ |
| 20 | -49,7’ |
-50,8
Syntetické peptidy, připravené způsobem podle předchozích příkladů, byly srovnávány s čištěným syntetickým hpGRF(1-40)-OH nebo čištěným syntetickým hpGRF(1-40)-Phe-Gln-NH2 in vitro, aby bylo možno stanovit účinek na uvolňování růstového hormonu. Všechny tyto syntetické analogy byly účinné při uvolňování růstového hormonu.
Pokusy in vitro byly prováděny při použití syntetického hpGRF jako standardu srovnáním s ekvimolární koncentraci různých syntetizovaných analogů. Byly použity kultury buněk krysí hypofýzy po 4 až 5 dnech po odebrání. Kultury, které byly optimální, pokud jde o sekreci růstového hormonu, byly použity pro srovnání způsobem, popsaným v publikaci Vale a další, Endocrinology, 91, 562 až 572 (1972). Inkubace byla prováděna 3 až 4 hodiny se zkoumanou látkou a potom byly zkoumány vzorky živného prostředí na obsah imunoreaktivního růstového hormonu (ir GH) radioimunologickým způsobem.
Výsledky srovnávacích pokusů při použití ekvimolárních koncentrací jsou uvedeny v následující tabulce I:
peptid
Nle27 -HpGRF(1 až 32)-NH2 .
His1 -hpGRFd až 32)-NH2 Ile27 -hpGRFd až 32)-OH D-Tyr1 -hpGRFd až 32)-NH2 D-Met27 -hpGRFd až 32)-NH2 Phe1 -hpGRFd až 32,-NH2 Phe 10 -hpGRFCl až 32)-NH2
Val27 -hpGRFd až 32)-OH His1, Nle27 -hpGRFd až 32)-NH.
Tabulka I x/ relativní účinnost in vxtro
| 3,21 | (2,02 | až | 5,43) |
| 2,15 | (1,12 | až | 4,41) |
| 0,20 | (0,11 | až | 0,35) |
| 0,74 | (0,47 | až | 1,14) |
| 0,22 | (0,13 | až | 0,36) |
| 0,13 | (0,05 | až | 0,29) |
| 0,69 | (0,26 | až | 2,63) |
| 0,31 | (0,21 | až | 0,45) |
| 3,22 | (2,12 | až | 5,33) |
x/ vzhledem k hpGRFd až 40)-Phe-Gln-NH2
Pokusy in vitro při poižití těchto syntetických peptidů ukázaly, že se EC5Q mění v rozmezí 20 až 100 pikomoLů a nejnižší zjištěná účinná koncentrace byla 3 až 8 pikomolů. Maximální účinná koncentrace pro hpGRFd až 40)-NH2 byla 1 nanomol.
Výsledky srovnávacích pokusů při použití ekvimolárníoh koncentrací různých analogů hpGRF, vyjádřených jako deriváty rhGRF jsou uvedeny v následující tabulce XX:
Tabulka II peptid srovnání v %
| hpGRFd až 40)-OH | |
| (použitý jako standard) | 100 |
| rhGRF(1 až 43)-OH | 30Q |
| rhGRF(1 až 29)-NH- | 1 100 |
| 10 z D-Tyrxu -rhGRF(1 až 29)-NH2 | 34 |
| D-Tyr1'10 -rhGRF(1 až 29)-NH2 | 600 |
| Tyr1 -rhGRF(1 až 29)-NH2 | 920 |
| Nle27 -rhGRF(1 až 32)-NH2 | 1 390 |
| Leu1,Nle27 -rhGRF(l až 29)-NH2 | 480 |
| D-His1,D-Tyr10,D-Ala15 -rhGRF- | |
| (1 až 29)-NH2 | 29 |
| 44 rhGRF- Val -NH2 | 670 |
Pokusy in vitro při použití těchto syntetických prvků ukázaly, že se EC5lJ mění v rozmezí 20 až 100 pikomolů a nejnižší účinná koncentrace je 3 až 8 pikomolů. Maximální účinná koncentrace pro rhGRF(1 až 43)-OH je 1 nanomol.
Kromě testů in vitro pro sekreci růstového hormonu byly také prováděny pokusy in vivo tak, že syntetický peptid byl podán katetrem normálním krysím samcům. Zvířata byla předem ošetřena FLA-63, c-ož je inhibitor dopaminhydroxylázy,který potlačuje samovolnou sekreci růstového hormonu, ale nepotlačuje odpověčí. na exogenní’ GRF. Potom se odebírají tímtéž katetrem vzorky krve 5 a 20 minut po injekci. Hladina růstového hormonu v krvi se měří raCS 272758 B2 dioimunologicky. Výsledky ukazují, že syntetické analogy hpGRF jsou velmi účinné stimulátory sekrece hypofizárního růstového hormonu. Bylo prokázáno, že účinné jsou látky v rozmezí 20 nanogramů až 25 mikrogramů na 1 kg hmotnosti.
Další pokusy ukázaly, že další syntetické analogy hpGRF, získané způsobem podle svrchu uvedených příkladů, jsou také účinné. Z výsledků pokusů je možno učinit následující závěry:
1. Amidace na C-terminálním zakončení nezvyšuje účinnost peptidů typu GRF při délce řetězce větší než 39 zbytků, avšak zvyšuje účinnost peptidů kratších než 39 zbytků.
Je například možno prokázat, že
Ile -hpGRF(1 až 32)-NH2 je účinnější nez
Ile27 -hpGRF(l až 32)-OH,
127
D-Tyr , Nle -hpGRF(l az 32)je účinnější nez
D-Tyr1, Nle27 -hpGRF(1 až 32)-OH a v v. x
Ile “hpGRF(1 az 29)-NH^ je účinnější nez
Ile27 -hpGRF(1 až 29)-OH, avšak
Ile -hpGRF(l až 44)—je stejně účinný jako Ile27 -hpGRF(1 až 44)-OH.
2. V řadě amidovaných peptidů jsou analogy s 32 zbytky v podstatě stejně účinné jako od27 , „ „ „ povídající delší analogy, například Nle -hpGRF(1 az 32)-NH2 ma pnblxzne stejnou účinnost jako Nle27 -hpGRF(l až 44)-NH23. V řadě peptidů s volnou karboxylovou skupinou jsou stejně účinné odpovídající analogy, které obsahují více než 39 zbytků, například
Val27 -hpGRFd až 40)-OH a Val27 hpGRFd až 44)-OH jsou stejně účinné jako
D-Tyr1, Nle27 -hpGRFd až 40)-OH a D-Tyr , Nle27 -hpGRFd až 44)-OH.
Syntetické analogy hpGRF by měly být použitelné tehdy, když lékař má za to, že je žádoucí zvýšit produkci růstového hormonu. Stimulace sekrece růstového hormonu působením hpGRF a jeho analogů by měla být účinná u nemocných s nízkou produkcí endogenního GRF, a tím i s úplnou nebo relativní nedostatečnou sekrecí růstového hormonu. Mimo to je pravděpodobné, že zvýšená sekrece růstového hormonu by byla účinná jako pomocný prostředek k podpoře růstu u lidí i u zvířat. Mimo to by podání hpGRF mohlo příznivě ovlivnit obsah tuku v těle a změnit další metabolické, imunologické a vývojové pochody, závislé na vyměšo vání růstového hormonu. Například analogy hpGRF je možno užít k podpoře anabolických pochodů u člověka například po vzniku popálenin. Jinak by bylo možno analogy hpGRF podávat hospodářským zvířatům, například kuřatům, krocanům, vepřům, kozám, skotu a ovcím k urychlení růstu a zlepšení poměru bílkovin k tukům. Je možno je užít také pro ryby a další studenokrevné mořské živočichy, například želvy, úhoře a také obojživelníky. Při podávání lidem by měly mít analogy hpGRF čistotu alespoň 93 %, s výhodou alespoň 98 %. Tato čistota znamená, že svrchu uvedený peptid tvoří uvedené množství hmot. % všech peptidů a fragmentů peptidů v daném prostředí.
Při podávání syntetických analogů hpGRF hospodářským nebo jiným zvířatům k urychlení růstu a snížení obsahu tukové tkáně je přijatelná čistota 5 % a v některých případech i pouze 0,001 %. Při použití genetických způsobů výroby mohou mít počáteční analogy velmi nízkou čistotu.
Syntetické analogy hpGRF a jejich netoxické soli je možno podávat spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického nebo veterinárního hlediska ve formě farmaceutických prostředků nitrožilně, podkožně, nitrosvalově, perorálně nebo intravasálně. Tímto podáním je možno zvýšit uvolňování růstového hormonu. Požadovaná reakce se bude měnit v závislosti na stavu a na trvání léčby.
Svrchu uvedené peptidy je možno podávat ve formě netoxických solí, přijatelných z farmaceutického nebo veterinárního hlediska, například ve formě adičních solí s kyselinami nebo ve formě komplexu s kovem, například zinkem, železem a podobně; tyto komplexy jsou považovány pro účely vynálezu za soli. Příkladem adičních solí s kyselinami mohou být soli s kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou, jablečnou, octovou, citrónovou, benzoovou, jantarovou, maleinovou, askorbovou, vinnou a podobně.
V případě, že účinná látka má být podávána perorálně ve formě tablet, může tableta obsahovat pojivo, například tragakanc, kukuřičný škrob, kukuřičný škrob nebo želatinu, dále činidlo, které podporuje rozpad tablety, například, alginovou kyselinu a kluzné látky, například stearan hořečnatý. Při pod tvání v kapalné formě je možno užít sladidlo a/nebo chuťovou látku, při nitrožilním podáιί se obvykle užívá isotonický roztok chloridu sodného, fosfátový pvfr a podobně.
Peptidy by měly být podávány pod dozorem lékaře, farmaceutické prostředky budou obvykle obsahovat peptidy spolu s běžným nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska.
Při parenterálním podání bude celková dávka obvykle v rozmezí 20 nanogramů až 25 irikrogramů peptidu na 1 kg hmotnostiPřestože vynález byl popsán s ohledem na výhodná provedení, je však samozřejré, že je možno provést různé modifikace bez odchýlení od zásadního principu vynálezu. Může například jít o modifikace peptidového řetězce, zejména vynechání některých zbytků v blízkosti C-terminálního zakončení peptidu za vzniku fragmentů, které si zachovávají veškerou nebo podstatnou část účinnosti peptidu. Mimo to je mošno přidávat na kterémkoliv konci nebo na obou koncích ekvivalentní zbytky a/nebo je substituovat zbytky, přírodně se vyskytujícími za vzniku analogů, které mají alespoň podstatnou část účinnosti přírodního polypeptidu.
Claims (7)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Způsob výroby syntetických peptidických analogů, uvolňujících růstový hormon hypofýzy a podobných útvarů, například tkáňových kultur hypofysárních buněk, obecného vzorce IH-R^-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Tiir-Rg-Ser-R^g-Arg-R^^-E^g-Leu-R^^-Gln-Leu-R^g-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R_,-R__—Ile—Ro_—Z 24 25 27 kdeR^ znamená Tyr, Met, D-Tyr, Phe, Leu, D-His, nebo His,Rg znamená Ser nebo AsnR^g znamená Tyr, Phe nebo D-Tyr,Rj2 znamená Arg nebo Lys, znamená Ile nebo Val,R^g znamená Gly nebo D-Ala, . R^g znamená Tyr nebo Ser,R24 znamená His nebo Gin,R2g znamená Glu nebo Asp,1^21 znamená D-Met, Met, Nle, Ile, Leu nebo Val,Z znamená Y, R2g-Arg-Y, R2g-Arg-Gln-Gln-Gly-7, nebo R2g-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R-^-Asn-Gln-Glu, Rgg-Rgg-R^Q-Arg-Phe-Asn-R^-Y, za předpokladu, že bud Rg znamená Ser nebo R^2 je Ang nebo R^g je Ile nebo R^g je Tyr nebo R^ je His nebo R2g je Glu nebo R2g je Asn,R2g znamená Ser nebo Asn,Rg4 znamená Arg nebo Ser,Rgg znamená Gin nebo Arg,Rgg znamená Arg nebo Gly,R4q znamená Ser nebo Ala,R44 znamená Val nebo des-R44 aY znamená skupinu -NH2 nebo -OH, nebo toxických solí svrchu uvedených sloučenin, vyznačující se tím, že sea) vytvoří peptid s alespoň jednou ochrannou skupinou, obecného vzorce IIX1-R1(X nebo X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X4 nebo X5)-Ser(X4)-R1Q(X2)-Arg(X6)-R12(X6 nebo X7)-R13-Leu-R15~Gln(X5)-Leu-Rlg·X2)-Ala-Arg(X6)-Lys-(X7)- Leu-Leu-R24(X nebo X5)-R25(X3)-Ile-R27-Z' kdeR^ až R27Z' mají shora uvedený význam, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alfa-aminoskupině, s výhodou tercbutyloxykarbonyl, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na imidazolovém dusíkovém atomu His, s výhodou Tos, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu fenolové hydroxylové skupiny Tyr, s výhodou 2,6-dichlorbenzyl, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na karboxylová skupině Asp nebo Glu, s výhodou Bzl, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alkoholové hydroxylové skupině Thr nebo Ser, s výhodou Bzl, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu amidoskupiny postranního řetězce Asn nebo Gin, s výhodou Xan, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na guanidoskupině Arg, s výhodou Tos, znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na aminoskupině postranního řetězce Lys, s výhodou 2-chlorbenzyloxykarbonyl, znamená X9 nebo R2g (X4 nebo X5)-Arg(X6)-X9 nebo R2g(X4 nebo χ5)_-Arg(X6)-Gin(X5)-Gin(X5)-Gly-X9 nebo R2g(X4 nebo X3)-Arg(X6)-Gin(X5)-Gin(X5)-Gly-Glu(X3)-R,,(X4 nebo X6)-Asn(X5)-Gin(X5)-Glu(X3)-R,o(X5 β 4 c’ R o 3 &nebo X )-R40(X )-Arg(X°)-Phe-Asn(X3)“R44X , * 9 kde R2g az R44 mají shora uvedený význam a X znamená vazbu -0-CH2-nosič nebo vazbu -NH-nosič, navázáním každé aminokyseliny s alespoň alfa-aminosknpinou chráněnou odpovídajícím způsobem, v množství 1 až 2 milimoly chráněné aminokyseliny na 1 g pryskyřice jako nosiče ve vhodném rozpouštědle, potom seb) Odštěpí ochranné skupiny a peptid se oddělí od pryskyřice jako nosiče kyselinou trifluoroctovou ve vhodném rozpouštědle, s následným užitím fluorovodíku a anisolu nebo methylensulfidu nebo směsi těchto látek při nižší teplotě, s výhodou 0 až -20 ‘c, potom se výsledný produkt rozpustí ve vhodném rozpouštědle, a potom se čistí znároýia způsobem.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se užije sloučenina obecného vzorce II,1 2 kde X znamená atom vodíku nebo Tos, X znamená tercbutyloxykarbonyl, X znamená 2,4-dichlorbenzyl, X3 znamená benzyloxy, X4 znamená benzyl, X3 znamená Xan, X3 znamená Tos,7 » 9X znamená 2-chlorbenzyloxykarbonyl a X znamená -NH-nosič.
- 3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se užije sloučenina obecného vzorce II, kde R^ znamená His a ostatní substituenty mají význam uvedený v bodu 1,
- 4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se užije sloučenina obecného vzorce II, kde Y znamená NH^ a ostatní substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
- 5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že se užije sloučenina obecného vzorce II, kde ϊ?27 znamená Nle a ostatní substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
- 6. Způsob oodle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se užije sloučenina obecného vzorce II, kde R^g znamená Tyr, R^g znamená Gly a R2g .znamená Ser a ostatní substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
- 7. Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se užije sloučenina obecného vzorce II, kde R^ znamená D-Tyr a R27 znamená Nle, Val nebo Ile, a ostatní substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/488,748 US4595676A (en) | 1983-04-26 | 1983-04-26 | Rat hypothalamic GRF |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS20084A2 CS20084A2 (en) | 1990-06-13 |
| CS272758B2 true CS272758B2 (en) | 1991-02-12 |
Family
ID=23940961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS20084A CS272758B2 (en) | 1983-04-26 | 1984-01-10 | Method of peptide production |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4595676A (cs) |
| CA (1) | CA1247601A (cs) |
| CS (1) | CS272758B2 (cs) |
| HU (1) | HU199508B (cs) |
| NZ (1) | NZ207658A (cs) |
| PH (1) | PH22236A (cs) |
| SU (1) | SU1477248A3 (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4732972A (en) * | 1983-03-07 | 1988-03-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polypeptides having growth hormone releasing activity |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US4880778A (en) * | 1986-05-12 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof |
| US5002931A (en) * | 1987-05-22 | 1991-03-26 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs VII |
| US4839344A (en) * | 1987-06-12 | 1989-06-13 | Eastman Kodak Company | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US4801456A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| USRE33699E (en) * | 1987-07-09 | 1991-09-24 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| US4880777A (en) * | 1987-09-01 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Synthetic peptides having growth hormone releasing activity |
| EP0400051B1 (en) * | 1988-01-28 | 1995-05-10 | Polygen Holding Corporation | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US5043322A (en) * | 1988-07-22 | 1991-08-27 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic GRF analogs |
| US5756458A (en) * | 1989-06-16 | 1998-05-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Stabilized potent GRF analogs |
| WO1992000095A1 (en) * | 1990-06-29 | 1992-01-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Histidine substituted growth hormone releasing factor analogs |
| DK0490249T3 (da) * | 1990-12-10 | 1995-05-29 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af GRF(1-44)-NH2 |
| WO1992018531A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5246920A (en) * | 1992-06-15 | 1993-09-21 | University Of South Florida | Treatment of hyperprolactinemia |
| US5811074A (en) * | 1992-06-29 | 1998-09-22 | University Of South Florida | Method of diagnosing pituitary dependent growth hormone deficiency |
| AU2002233082B2 (en) * | 2001-02-02 | 2005-11-10 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Long lasting growth hormone releasing factor derivatives |
| RU2005111253A (ru) * | 2002-09-18 | 2005-11-20 | Сантр Оспиталье Де Л` Юниверсите Де Монреаль (Схюм) (Ca) | Аналоги ghrh |
| WO2009009727A2 (en) * | 2007-07-12 | 2009-01-15 | Akela Pharma Srl | Ghrh analogs and therapeutic uses thereof |
-
1983
- 1983-04-26 US US06/488,748 patent/US4595676A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-01-10 CS CS20084A patent/CS272758B2/cs unknown
- 1984-01-12 HU HU8488A patent/HU199508B/hu unknown
- 1984-01-12 SU SU843692330A patent/SU1477248A3/ru active
- 1984-03-22 CA CA000450244A patent/CA1247601A/en not_active Expired
- 1984-03-27 NZ NZ207658A patent/NZ207658A/xx unknown
- 1984-04-17 PH PH30570A patent/PH22236A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU199508B (en) | 1990-02-28 |
| US4595676A (en) | 1986-06-17 |
| CA1247601A (en) | 1988-12-28 |
| CS20084A2 (en) | 1990-06-13 |
| SU1477248A3 (ru) | 1989-04-30 |
| PH22236A (en) | 1988-07-01 |
| NZ207658A (en) | 1988-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| US4563352A (en) | Human pancreatic GRF | |
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| US4529595A (en) | GRF Analogs | |
| FI87080C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av grf-analoger | |
| CS272758B2 (en) | Method of peptide production | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| US4628043A (en) | Hypothalamic GRF agonists | |
| JP2758901B2 (ja) | Ｇｒｆ類似体▲ｖｉｉ▼ | |
| FI94356B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi | |
| US4703035A (en) | Human pancreatic GRF amidated fragments | |
| EP0067608A1 (en) | CRF and analogs | |
| CS276972B6 (en) | Peptides, process of their preparation and pharmaceutical containing thereof | |
| CZ3004U1 (cs) | Peptidy a farmaceutické prostředky s jejich obsahem |