CS272678B1

CS272678B1 - Analog of salmon hypothalamic gnrh and method of its preparation and utilization

Info

Publication number: CS272678B1
Application number: CS90389A
Authority: CS
Inventors: Martin Rndr Csc Flegel; Jana Rndr Charvatova; Jan Ing Kouril; Jitka Ing Hamackova; Tomislav Rndr Drsc Barth
Original assignee: Flegel Martin; Jana Rndr Charvatova; Kouril Jan; Jitka Ing Hamackova; Barth Tomislav
Priority date: 1989-02-10
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1991-02-12
Also published as: CS90389A1

Description

a způsob jeho přípravy (57) Řešení se týká nového analogu lososího hypothalamického GnRH vzorce I PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-/D-Glu/NH-Ad//-Trp-Leu-Pro-GlyNHg , kde NH-Ad je adamantyl-l-amld, způsobu jeho přípravy vycházejícího ze synthesy peptidového řetězce na polymerním nosiči v pevné fázi, následném uvolnění chránících skulin, odštěpení nosiče kapalným fluorovodíkem a přečištěním produktu. Tento analog lososího spouštěcího faktoru gonadotropinu je možno použít pro indukovanou ovulaci jikernaček lína v dávce 5-25 ?ug /kg hmotnosti jikernačky při jednorázové aplikaci injekčním podáním intramuskulárne.

(11) ,
(13)	Bl
(51)	Int.	CL⁵
	C 07	K 9/00

'i .6

CS 272678 Bl

Vynález se týká analogu lososího hypothalamického GnRH, způsobu jeho přípravy a použití.

Pro indukovaný výtěr jiker z některých druhů, ryb se běžně používají kapří hypofyay nebo v poslední době také luliberin, což je spouštěcí faktor pro luteisační a folikuly stimulující hormon savšího původu (viz čs. autorské osvědčení č. 214369). S ohledem na to, že byly postupně izolovány spouštěcí faktory z různých druhů živočichů (N. Sherwood; Trends in řfeurosciences 10, 129 /1987/) a ukázalo se, že v jednotlivých vývojových řadách existují strukturně odlišné faktory (struktura lososího LH-RH je odlišná od savšího), zaměřila se pozornost na strukturní obměny rybího faktoru. V rámci studia závislosti struktura účinek se ukázalo již v řadě analogů savčího LH-RH, že změna v poloze 6/ tj. substituce glycinu různými neproteinogenními aminokyselinami konfigurace D a jejich zejména lipoflínějšími a stericky silně náročnými deriváty vede k látkám vysoce aktivním s vysokou agonistickou a tedy gonadotropní aktivitou.

Záměnou glycinu v poloze 6 pomocí adamantylamidového derivátu D-glutamové kyseliny, který byl nově připraven a využit mimo jiné také při přípravě peptidů s adjuvantními účinky (čs. autorské osvědčení č. 231221) byl získán nový analog spouštěcího faktoru pro luteisační hormon podle vynálezu působící při indukovaném výteru některých druhů ryb obecného vzorce I pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-GluÍNK-AdJ-Trp-Leu-Erq-Gly-ÍIHg (i),

kde značí líH-Ad adamantyl-l-amid. Zkratkové symboly pro aminokyseliny mají tento význam
pGlu	pyroglutamová kyselina
His	histldin
Trp	tryptofan
Ser	serin
Tyr	tyrosin
D-Glu/NH-Ad/	• adamantyl-l-amíd vázaný na karboxylovou skupinu v poloze •j*' -D-glutamové kyseliny
Leu	leucin
Pro	prolin
GlyKH₂	glycinamid

Tato nová látka - biologicky vysoce účinný dekapeptid - je synthetickým analogem přírodního, tzv. spouštěcího faktoru pro luteinisační hormon.

Způsob přípravy tohoto analogu lososího hypothalamického GnRH vzorce I spočívá v postupné výstavbě peptidového řetězce z vhodně chráněných aminokyselin na polymernim nosiči v pevné fázi, následném uvolnění chránících skupin a odštěpení řetězce od nosiče kapalným fluorovodíkem.

Pro synthesu peptidů podle vynálezu byla využita metoda v pevné fázi (J,J,f, Stewart, J.D, Young, Pierce Chem, Comp, 1984). Využili jsme methyl-benzhydrylaminový polyraerní nosič /substituce aminoskupinami 0,51 mmol/g. Jako dočasná chránící skupina byl použit zbytek tercbutyloxykarbonyl a dále byly použity tyto deriváty:

BOO-Trp/Por/, BOC-D-Glu/NH-Ad/, BOC-Tyr/Z/, BOC-Ser/Bzl/, BOO-His/BOC/.

CS 272678 Bl

Kondensace byly prováděny ve směsi dimethylformamidu a dichlormethanu 1 : 1,

Vo/Vo pomocí dicyklohexylkarbodiimidu a W-hydroxybenztriazolu v tzv. průtokovém uspořádání (V. Krchňák a spol.: Tetrahedron Letters 28, 4469 /1987/ . Štěpení tercbutyloxykarbonylové skupiny bylo prováděno 35% roztokem trifluoroctové kyseliny v dichlormethanu, neutralizace 3% roztokem diisopropylethylaminu v dichlormethanu. Po ukončení synthesy byl peptidový řetězec odštěpen z polymerního nosiče kapalným fluorovodíkem meto'dou Lowhing Tam, J.P, a spol,, J. Am.Chem. Soc. 105, /442/1983). Analog lososího hypothalamického GnRH byl čištěn metodou gelové chromatografie na dextranovém gelu a oak vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií.

Dále bylo nalezeno použití analogu vzorce I pro indukovanou ovulaci jikerniček lína, kdy se tento analog v dávce 5 až 25 /ug/kg hmotnosti jikernačky aplikuje jednorázovým injekčním podáním intramuskulárně.

Při zjišíováni biologické aktivity byl pozorován významně vyšší výtěžek při nižších dávkách tohoto peptidu ve srovnání s jiným analogem lososího spouštěcího faktoru gonadotropinu. Výsledky jsou ukázány v tabulce 1 a 2.

Příklad 1

Příprava a čistění peptidu;

struktura peptidu: látka I pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(WH-Ad)-Trp-Leu-Pro-Gly-KH₂ polymerní nosič: metylbenzhydrylamin.polymer substituce 0,51 mmol/g-NHg množství nosiče v reaktoru: 0,5 g

fát aminokyseliny	mol. hmotnost	navážka (g)
BOC-Gly	175,19	0,13
BOC-Pro	215,2	0,16
B0C-Leu.H₂0	249,3	0,19
BOC-Trp(Por)	333,4	0,25
BOC-D-Glu(KH-Ad)	380,5	0,28
BOC-Tyr(Z)	415.5	0,32
BOC-Ser(Bzl)	295,13	0,22
BOC-Trp(Por)	333,4	0,25
BOC-His(BOC)DCHA	536,72	0,40
pGlu	111,1	0,10

Všechny kondensace proběhly během 45 min (negativní, ninhydrinový test)

Štěpení tercbutyloxykarbonyl. skupiny bylo prováděno 30 min.

neutralisace 5 min.

Ve všech stupních bylo použito 3 ekvivalentů aktivovaných derivátů aminokyselin (0,75 mmol). Bylo použito methodiky průtok, uspořádání (citace uvedena v textu). Jako ochranné látky při štěpení peptidu z nosiče byl použit p-kresol a thiokresol v množství odpovídajícím shora uvedené publikaci. Po odsolení na sloupci dextran. gelu (eluce 50% kys. octovou) a lyofilisací bylo získáno 55 mg sur, peptidu, který byl dále čištěn na sloupci silikagelu modifikovaného oktadecylovými skupinami v soustavě - mobilní fázi

CS 272678 Bl obsahující 50 % methanolu a 50 % 0,1% trifluoroctové kyseliny ve vodě. Bylo získáno (pro provedení kontrolní kapal, chromatografie a chromatografie na tenké vrstvě silikagelu) celkem 10 mg peptidú o odpovídající aminokyselinové a elementární analyse.

Podle analytické vysokoúěinné chromatografie na koloně s obrácenou fází typu ODS v mobilním systému obsahujícím stejné složky jako při preparaci látky obsahoval analog spouštěcího faktoru 97% peptidú o aminokys. složení:

pGlu 1,0, His 1,1, Trp 1,7, Her 0,9, Tyr 1,2, Olu 1,0, Leu 1,2, Pro 1,0, Gly 1,1.

Příklad 2

Indukce ovulace jikernaček lína

Vylovené ryby rybničního chovu VÚRH-Vodňany byly roztříděny, zváženy, označeny a rozmístěny dle jednotlivých experimentálních podmínek (různé dávky látky I) do laminátových nádrží o objemu vody 70 1 s přítokem recirkulované vody. Teplota vody byla do začátku injikace zvýšena na 22 - 24 °C, látka I byla rozpuštěna ve fyziologickém roztoku a naředěna tak, aby všem jikernačkám byl injikován roztok o objemu 1 ml/kg hmotnosti ryby. Rozmezí dávek se pohybovalo od 0,2 yug až 125 /Ug na kg hmotnosti ryby. Kontrolní skupina jikernaček nebyla injikována. Srovnávací pokus byl proveden s jiným, dříve popsaným derivátem lososího GnRH - D-Tle GnRH - Kouřil J, a spol. Živočišná výroba 10,901 (1987).

Několik hodin před předpokládaným termínem ovulace bylo započato a kontrolou jikernaček, která probíhala v 1 až 2 hodinových intervalech. Při zjištění ovulace byly jíkernačky uměle vytřeny, byla zjištěna hmotnost vytřených jiker (s přesností na 1 kg) a odebrán vzorek jiker pro stanovená průměrné hmotnosti jikry. Na základě zjištěných údajů byla vypočtena relativní hmotnost vytřených jiker a relativní plodnost pro podání látky I a látky II (viz tabulka 1 a 2).

látka II pGlu-His-Trp-Ser-iyr-D-Tle-Trp-Leu-Pro-GlyNHg , kde D-Tle

D - terciální leucin &

Tracovni plodnost jikernaček lína po aplikaoi látky

CS 272678 Bl +» I ra ω

£ O * Xí «3	γΗ	1 1 1 OJ ι	VO	1 1 VO 1 i
o p ro «Ρ φ P	ια		OJ		xt	xt			1 1
O. >P r*	+ 1		+ 1		+ 1	+ 1			1
+>						o			1
Μ b>co	VO		b		OJ		VD	1
Ελ' > O	co		rP		co	OJ		b	1
S> Φ rP O>O N O (0 © P rH b Ρ 1 ρ. φ bo	ΟΙ		OJ		Ol	rP			1 1 1 1 1 1
44 44									1
Ή ·Η »									1
Ρ’πο,ρ «Ρ > Ο W	xt		xt		CO	co		LA	1 1
•Η Φ Ρ	σ\		b		OJ	xt		»P	1
Ρ >03 44 9Í > r-Ι CO α> φ ο « ν κ			rP		OJ		1		1 I 1 1 1 1 I
43	ΙΑ		rH		řP	LA			1 1
ο	OJ		LA		VO	fO			1
*>>	*·		»		·>				1
ρ ω	<		r-t		r—1	co			1
φ				1			1		1
Ρΐ&>Ρ	+ 1		+ 1		+ 1	+ 1			1
03 Ρ +1 0 b	CO		la		co	CO		b	1 1
Ρ Ρ >	b		r—1		vO	LA		O	1
ρ ο> ΙΚ	··		»		*	»		-	1	ISL
044 «	rP		rM	1	OJ	b		XÍ*	I
£3 Ή Λ ·ΓΊ>	ιΡ		rP		»P				1 1 i
*Η 44									1
Ρ 044 >'>J Ο •Η β Φ	Ο		iP	1	Xt	tP		rP	1 1 1
Ρ ©>ϋ)	b		CO		íP	o		co	1
©>ρ >ιχ	*		«		»	»		*	1
rP	xt		CO	1	O	fO		O	1	TSL
Φ > Φ Ρ4 > Ν				1	řP				1 1 1 1
13¾	ο		O	1	O	O		o	1 1 1	o
rj-		ω		co	xt		OJ	< f
Ο Ρ b									1 1 1
Φ 03 >Ρ Ρ	OJ		Xt		xt	OJ		íP	1 1	o
Ρ 44									1
b									l
>									1
44									1
Φ									1
>ϋ									i
Ρ Ρ 44 Ρ ο ©'b 44 Ρ •η © ·Γ·3Ϊ> >>									1 1 1 1 I
ο m	la		LA		LA	LA		LA		LA
Ρ 44 Ρ « ·Η 44 >0 Ό									1
© Ρ
Ρη·Η									1
44
Φ 60						LA		CA
Ρ>ϋ*-	ρ-	I	LA		ca	OJ		»P		LA
03 ©	έα		VD		xt	rP		rP		b
ο ρ Ρ Ρ Ρ Φ	+ 1		+ 1		+1	+ \|		+ 1		+ 1
044	xt		CO		co	CA		xt		OJ
S-HIH	Ο-		CA		<O	CA		(P		LA
ϊ3 ^,r“3	νο		V©		b	VO		b		b
Η
h0								OJ
ro h44								r
44 44 b	ια		LA		IA	rP		O		ISL
> Ρ U)	OJ		OJ
'©'© ρ Ω rP ''χ	rP	1 1					1 1 1
b		1 1
Ρ		1
Ο ·Η rM ρ. 01 ρ	<Ρ	I I 1	OJ	1	co	xJ*	1 1 1	LA		vo

CS 272678 Bl

P	r
03		to
O	λ	X
P	o	•
	'ib	•P
O	P	03
r-í	O	P
P	>p	AJ

-p

		r-í		tí-
o		4		OJ
r-í				CA
+1	1	+1		+1
OJ		vn		xj-
co			Γ	co
r-í		r-í	1	CM

OJ

TSL p 03 > o >>o r-í

Q OJ N
O P
QX P		r-í
p o		í
PAÍ		to
•rl		a:
'rí *ra	»
P	P	•P
>	o	OT
•H	43	P
-P	30)	AJ
ca	>
I“í		CA
03	03	O
tt	N	rí

OJ

OJ r-í *4 OJ i—I •Sl

Pracovní plodnost jikernaček lína po aplikaci látky II

1 Λ t O 1 'bi 1	VO	I kO 1	co t r- \| fA 1
-RtR C		o		CM	r-l	o
0] tt) O Dl		+1		+1	+i	CA r~l
a. k-p _L, -P o J..+I		CA	I	*4·	4-
ox > ε·κ ιχ		Xj-		CA	fA
Λ-ratq		r4			t—1

•Η p 03 p enm cí>A >1X r-í«P « íb<D « > N

O

Ρ ib

03 >fc P

-PAÍ A* řb o> >

ÍO <0

ΡΛ P o 03'^a Aí P •H Oj O> 5b

-pjo to oj cd 'o p ρ P ta +> o O Aí 4-1 S *H S-r^K to

O >»Af

AíAi\ >-P hfl 'qpctf p ftr-í \ ib

P

O-rT ι—t O* tn p

ΜΛ5

TSL

« CA 1	CA l	kO »	b-
tA 1	CO 1	ΓΑ 1	rH
r		> 1	*
CA l	Ě> t	tA 1	CA

Ονο vn

19.

ia ia ίcm r~í ia kO kO

IA

	CA	*4·		O	kO		LA
<A	O	CA		kO	kO		LA
\O	r-i	CM			r-l		r-í
+1	+ 1	+1		+ 1	+ 1		+ 1
CM	c-	O	f	CO	CA	1	co
O\	rí	IA		o	M*		r-í
0-	CO	t-		CD	ř-		t-

O

OJ t—t

O

O r-í

CM

O ia

O cv

IA tA

1SL

VO jo ta ?

CÍ3 272670 131

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

1, Analog lososího hypothalamického GnRH vzoroe I pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-/D-Glu/NH-Ad//-Trp~Leu-Pro-Gl,yNH2 , krte NH—Ad je ndamantyl-l-nmid.

?. Zpňnob péíprnvy nnnlo/ru vzorce T. vyznačený tím, že ne pontupnn vyntnví z, vhodné chráněných aminokyselin peptidový řetězec na polymerním nosiči v pevné fázi, načež se chrániči okupiny uvolní, řetězec ee odštěpí od nosiče kapalným fluorovodíkem o výsledný produkt se přečistí kombinací gelové a vysoce účinné kapalinové chromato-