JPH01503390A - （ｎ‐アルファ‐アシル，８‐グリシン，デス‐１９‐ロイシン）‐カルシトニン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的活性を有するカルシトニ／、生物学的に活性なカルシトニン に転換できるペプチドさらにこのようなカルシトニン類似体を製造する方法に関 する。

〔従来の技術〕

すべての周知の天然カルシトニンペプチドは、３２個のアミノ酸のアミノ酸配列 を含む。天然のカルシトニンは、サケ、ウナギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネズミ及 びヒトのカルシトニンを含む。サケカルシトニンは、例えば下記の式 ％式％： ４４０１．５９３及び４５２＆１３２号において、前記のサケカルシトニンを含 むカルシトニンの改善された合成が開示されている。

〔発明の概要〕

本発明者は、周知のカルシトニンと同一のタイプの生物活性を有する３１個のア ミノ酸を肩する上記の天然由来のカルシトニンペプチドの合成カルシトニン類似 体を見い出した。構造上の顕著な差は、本発明の新しいペプチドにおいて１９位 のロイシンがな（、バリン−８がグリシンにより１を換されそしてＮ−アルファ がアシル化されている。これは、ペプチドの合成修飾に関する命名法であるＩＵ ＰＡＣ−ＩＵＰ法を用いて〔Ｎ−アル７アーアシル、８−グリシン、デス−１９ −ロイシン〕カルシトニンと命名される〔「バイオケミ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）Ｊ Ｊ（１９８４）２１９，３４５〜３７７〕。

新しいペプチドは、周知のカルシトニンと比べたときより高い効力及び性質を有 する。本発明は、〔Ｎ−アルファープロピオニル、８−グリシン、デス−１９− ロイシン〕カルシトニンよりなる修飾カルシトニンに関する。

本発明は、又カルシトニンを形成するのに通常必要なアミノ酸を順次加えること により修飾カルシトニンを製造する方法に関し、それは８位のバリンをグリシン に置換しセしてＮ−アルファをアセチル化して〔Ｎ−アルファーフロピオニル、 ８−グリシン、デス−１９−ロイシ／〕カルシトニ／を形成することよりなる。

周知のサケカルシトニンと同一のタイプの活性を有する不発明の新しい〔Ｎ−ア ルファープロピオニル、８−クリシン、デス−１９−ロイシン〕サクカルシトニ ンの式は次のように記載される。

本発明の新しい〔Ｎ−アルファープロピオニル、８−グリシン、デス−１９−ロ イシン〕ウナギカルシトニンの式は、次のように記載される。

Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＭＨｚ 本発明の新しい〔Ｎ−アルファープロピオニル、８−クリシン、デス−１９−ロ イシン〕ニワトリカルシトニンの式は、次のように記載される。

上述の式から分るように、３１＠のアミノ酸が含まれ、そしてこの式において位 置は認められたやり方でナンバーをつけられ、鎖の一端のＣｙｓに関する１位で 始まりそして鎖の他端の３１位のＰｒｏで終る。記載を明確にするために、この 同じ数え方が、合成のサイクルに関して従われる。アミノ酸の組立てがサイクル ３１で始まり、それはスレオニンのカップリングなどを含む。

一般に、本発明者は合成の固相法を用いそしてベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨ Ａ樹脂）と呼ばれる樹脂で開始する。この樹脂は、スチレ／及びジビニルベンゼ ンの共重合により製造される橋かけ結合ポリスチレンビーズ樹脂から誘導される 。このタイプの樹脂は周知でありそしてその製造はさらにピエタ（Ｐｉｅｔｔａ 　）ら〔ピエタ。

ｐ、　ｓ、及びマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ　）、　Ｇ、　Ｒ，［ケム。

コミ：ｓ−二、　（Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）　Ｊ　６５０．　（１９７ ０）　）及びオーロウスキ（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ　）　ｂ　（ｒ　Ｊ、オーガ、ケ ム、　（Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ−）Ｊ　４１．３７０１　（１９７６））により示さ れている。橋かげ結合ポリスチレンＢＨＡ樹脂は化学品製造業者から入手できる 。本発明者は、Ｂ１’ｌＡ樹脂を示すために名称 （■は樹脂のポリスチレン部分である）を用いる。

樹脂ペプチド合成 この合成において、全ペプチド配列が樹脂上に形成されるまで、一つずつ不溶性 樹脂に加えられる。アミノ酸の官能基は、ブロッキング基により保護される。ア ミノ酸のアル７アーアミノ基は第三級ブチルオキシカルボニル基又はその同等物 により保護される。このアルファー第三級ブチルオキシカルボニル基を本発明者 はＢＯＣと呼フ。セリン及ヒスレオニンのヒドロキシル基は、ベンジル又はベン ジル誘導基例えば４−メトキシベンジル、４−メチルベンジル、Ｒ４−ジメチル ベンジル、４−クロロベンジル、２６−ジクロロベンジル、４−ニトロベンジル 、ベンズヒドリル又はその同等物により保護される。本発明者は、べ／ジル又は ベンジル誘導基を示すために用語ＢＺを用いる。

チロシンのヒドロキシル基は、保護されないか、Ｂｚ基として前述したベンジル 又はベンジル誘導基により保護されるか、又はベンジルオキシカルボニル又はベ ンジルオキシカルボニル誘導基例えば２−クロロベンジルオキシカルボニル又は ２−ブロモベンジルオキシカルボニル基又はその同等物により保護される。本発 明者は用語Ｗを用いて非保睦基、Ｂｚ基、ベンジルオキシカルボニル基又はベン ジルオキシカルボニル誘導基の何れかを示す。

システィンのチオール基は、ベンジル又は前述されモしてＢｚと名付けられたベ ンジル誘導係ａ基により、又はｎ−アルキルチオ基例えばメチルチオ、エチルチ オ、ｎ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ又はその同等物により保護される。本発 明者はＲ１を用いて、Ｒ１がｎ−アルキルチオのときＢｚを示しそしてＲ３がＢ Ｚのときｎ−アルキルチオを表す。一方、Ｒ１は他のシスティン基であり、そし てこの場合Ｒ：はｎｚである。アルギニンのグアニジン基は、ニトロ基、トシル 基又はその同等物により保護される。本発明者は、Ｔを用いてニトロ基又はトシ ル基の何れかを示す。リジンのイプシロン−アミノ基は、ベンジルオキシカルボ ニル基又はベンジルオキシカルボニル誘導基例えば２−クロロベンジルオキシカ ルボニル、物により保護できる。本発明者は、■を用いてベンジルオキシカルボ ニル基又はベンジルオキシカルボニル誘導基を示す。ヒスチジンのイミダゾール 窒素について用いられる保護基は、ベンジルオキシカルボニル及びベンジルオキ シカルボニル誘導基例えばリジンについて前述しＶと名付けられたものである。

グルタミン酸のガンマ−カルボン酸基は、ベンジル又はベンジル誘導基例えばセ リン及びスレオニンのヒドロキシル基の保護について記載さｎたものにより保護 される。これらの保護基は、Ｂｚにより示される。

サケカルシトニンの合成の３１サイクルのそれぞれに用いられる好ましいアミノ 酸反応剤（例示のためのみに用いる）は、下記の第１表に示される。

第１表 ３０　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン２９　ＢＯＣ−グリシン ２８　ＢＯＣ−０−ベンジル−し−セリン２７　ＢＯＣ−グリシン ２６　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン２１　ＢＯＣ−０−ブロモベンジ ルオキシカルボ１９　ＢＯＣ−Ｌ−グルタミンｐ−ニトロ７エ二又はＢＯＣ−イ プシロン−２−クロローベ１７　ＢＯＣ−Ｎ（ｉｍ）−ＣＢＺ−Ｌ−ヒスチジン １４　ＢＯＣ−Ｌ−グルタミンｐ−ニトロフェニル１１　ＢＯＣ−イブ’１０７ −ＣＢＺ−Ｌ−リジン又はＢＯＣ−イプシロン・−２−クロロ−ベンジルオキシ カルボニル−Ｌ　＋　ＩＪレジン０　ＢＯＣ−グリシン ９　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン ・　８　ＢＯＣ−グリシン ７　ＢＯＣ−８−エチルチオ−Ｌ−システィン。

ＢＯＣ−８−メチルチオ−Ｌ−システィン。

ＩＢＯＣ−８−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−ジアシル化　プロピオン敗 第１表に記載されたアミノ酸誘導体のそれぞれは、業者から入手できる。

サイクル３１ ＢＨム樹脂へのプロリンのカップリング樹脂ペプチド合成の全工程に用いられる 反応容器は、原料添加用の上部の入口及び可溶性反応混合物の除去及び濾過によ る洗滌溶媒用の下部の焼結ガラス円板を設けたガラス容器である。濾過は、真空 又は窒素の圧力の使用により行われる。容器の内容物は、容器全体を振盪するか 又は機械的攪拌器により攪拌できる。

サイクル３１において、ＢＨＡ樹脂は反応容器に入れられそして樹脂ｌｔ当り約 ３〜１２ｄｆ）溶媒の割合で溶媒例えば塩化メチレン、クロロホルム、ジメチル ホルムアミド、ベンゼン又はその同等物中に懸濁される。これに、用いるＢＨＡ 樹脂の遊離アミン当量当り約１〜６当量の量でＢＯＣ−Ｌ−プロリンを加える。

５〜１０分間の混合時間後、カップリング試薬（ＣＡ）例えばジシクロへキシル カルボジイミド（ＤＣＣ）を加えるか、又は他のジイミドカップリング剤を用い る。ジイミドカップリング剤は、用いるＢＯＣ−Ｌ−プロリンの当量当りα５〜 ２−０当量の量で用いることができる。

もしその活性エステル誘導体、そのアジド銹導体、その対称誘導体又は好適に選 ばれた混合無水物誘導体が用いられるならば、ＢＯＣ−Ｌ−プロリンはカップリ ング試薬の不存在下カップリングされる。用いることのできル活性エステル誘導 体は、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフル オロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル又はその同等物 である。活性エステルはＢＨＡ１ｓｉ脂のアミン当量当り１〜１０当量の量で用 いられる。

ＢＨＡ樹脂、溶媒、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン、カップリング試薬又はＢＯＣ−Ｌ− ブロリ／活性エステルよりなる反応混合物を、反応がニンヒドリン（Ｅ、カイザ ー（Ｋａｉｓｅｒ　）ら「アナル、バイオケム、（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、） ４３４，５９５−８（１９７０））によりテストサンプルについて示されるよう に完了するまで、機械的に攪拌又は振盪する。カップリング反応の完了後、ＢＯ Ｃ−Ｌ−プロリン樹脂は、溶媒例えば塩化メチレン、クロロホルム、メチルアル コール、ベンゼン、ジメチルホルムアミド又は酢酸により洗う。洗滌溶媒の量は 、好適には初めに用いられるＢＨＡ樹脂の１２当り５〜２０ｄの溶媒である。も し完了前にカップリング反応を停止することが望ましいならば、洗滌工程が用い られセしてＢＯＣ−Ｌ−プロリン上の残りの遊離のアミノ基は、過剰のアセチル 化試薬によるアセチル化により次の反応からブロックされる。アセチル化工程は 、０．５〜１２時間の間アセチル化試薬の溶液とともにＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹 脂を攪拌することにより行うことができる。アセチル化試薬例えば塩化メチレン 中のＮ−７セチルイミダゾール溶液又はクロロホルム中の無水酢酸及びトリエチ ルアミンの混合物が用いられる。アセチル化試薬は、原料ＢＨＡ樹脂の遊離のア ミン力価の当量当りα５〜５．０当量の量で用いられる。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂を生成するカップリング反応は、下記の式により記載 できる。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂の脱保護基 前述のようにして生成したＢ　ＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂は、溶媒例えば前述した ものにより洗滌されそして溶媒例工ば塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン又 はその同等物中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物のような剤とともにそれ を攪拌することにより脱保護基される。

溶媒中のＴＦＡの量は、混合物の１０〜１００チに変化する。ＴＦＡ−溶媒混合 物の量は、初めに用いたＢＨＡ樹脂１を当り３〜２０−に変化できる。反応時間 は、灼１０分〜４時間である。脱保護基工程は、ＴＦＡ−溶媒混合物を除く濾過 により停止する。残存ＴＦＡは、溶媒例えば塩化メチレン、クロロホルム、ベン ゼン又はその同等物中の５〜３０チドリエチルアミン溶液３〜２０ｄ（ＢＨＡｍ 月旨ｌｆ当り）により洗滌することによりＢＯＣ−に−プロリン樹脂から除去で きる。他の第三級又は第二級有機アミン例えばトリメチルアミン、Ｎ−エチルピ ペリジン、ジイソプロピルアミン又はその同等物が、トリエチルアミンの代りに 用いることができる。ＢＯＣ−に−プロリン樹脂の遊離アミンのタイターは、ド ーマン（Ｄｏｒｍａｎ　）　＠定法〔ドーマン、ｒ、、ｃ、「ナト２ヘドロン・ ｖターズ（Ｔｅｔｒａｂｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　Ｊ　１９６９　＋２ ３１９〜２１〕によりめることができる。脱保機基反応は下記の式で示される。

サイクル３０ サイクル３１の結果として得られたプロリル−ＢＨＡ樹脂をカップリング溶媒に 懸濁し、ＥＯＣ−０−Ｂｚ−に−スレオニンを加えそして混合物を同様なやり方 で平衡させる。カップリング剤ＤＣＣを加え、イサチンテスト〔Ｅ、カイザー（ Ｋａｉｓｅｒ　）ら［アナル、ケム、アクタ。

（１９８０））により指示される反応の完了後、反応混合物を濾過によりＢＯＣ −０−Ｂｚ−スレオニルプロピル−ＢＨＡ樹脂から除去する。反応剤及び溶媒の 量及び反応時間は、サイクル３１に記載されたのと同一である。

ＢＯＣ基は、サイクル３１に記載された脱保護基法によりペプチド樹脂から除去 される。得られた０−Ｂｚ−スレオニル−プロピル−ＢＨ人樹脂は次にサイクル ２９に用いることができる。サイクル３０の反応は下記の式で示される。

Ｂｚ ■ 簡単のため、下記のように、この得られた樹脂ペプチドは簡略された命名法を用 いて記載される。

サイクル２９ サイクル２９において、カップリング反応セして又脱保護基反応は、サイクル３ ０と同じやり方で行われるが、ただしＢＯＣ−０−Ｂｚ　−Ｌ−スレオニンの代 りにＢＯＣは、下記の通りである。

サイクル２８において、カップリング及び脱保護基の反応は、サイクル３０にお けるのと同じやり方で行われるが、ただしアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−０−Ｂ ｚ−に−セリンの置換をする。これは以下のように示される。

サイクル２７ サイクル２７において、カップリング及び脱保護基の反応は、サイクル３０に記 載されたように行われるが、ただしＢＯＣ−グリシンなアミノ酸反応剤として置 き換える。カップリング及び脱保護基の反応は、下記の通りサイクル２に のサイクルでは、カップリング及び脱保護基の反応は、同じアミノ酸反応剤を用 いてサイクル３０のと同じであって、下記の化合物を生ずる。

サイクル２５ サイクル２５では、カップリング反応はＢＯＣ−Ｌ−アスパラギンの活性エステ ル誘導体を用いて行われる。

活性エステル法は、ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン又はＢＯＣ−Ｌ−グルタミンとＤ ＤＣカップリング剤の代りに用（〜られる。ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギンの活性エ ステル誘導体を用いる反応は、ジメチルホルムアミド、ジメチルホルムアミドと ベンゼン、塩化メチレン又はクロロホルム又はその同等物との混合物（初めに用 いたｎａＡｗＪＩｊ１２当り２〜２０Ｍｔの溶媒の量）中のＢＨＡ樹脂の遊離ア ミン当量当り２〜１０当量の量で行われる。

反応時間は１〜２７時間に及ぶ。反応混合物は、ニンヒドリンテストにより示さ れる反応の完了後、濾過によりＢＯＣペプチド樹脂から除去できる。用いられる 活性エステル誘導体は、２−ニトロフェニルニスｆｋ、４−二トロフェニルエス テル、ペンタフルオロフェニルエステル又はその同等物である。誘導体の活性エ ステル部分なＡＥとする。カップリング反応は次のように示される。

ＢＯＣ基を除く脱保護基反応は、サイクル３１におけるようにして行われる。

サイクル２４−２１ サイクル２４〜２１のそれぞれにおいて、カップリング及び脱保護基の反応は、 サイクル２４ではＢＯＣ−０シン、サイクル２０ではＢＯＣ−０−Ｂｚ　−Ｌ− スレオニンを用いて、サイクル３０と同じ方法及び反応剤の割合を用いて行うこ とができる。サイクル２０の完了からＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ −Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−サイクル２０ サイクル２０において、カップリング及び脱保餓基の反応は、アミノ酸誘導体と してＢＯＣ−０−Ｂｚ−Ｌ−スレオニンを用いてサイクル２５と同じ方法及び反 応剤の割合を用いて行われ、次の化合物を得る。

Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｚ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ− Ｇｌｙ−サイクル１９において、反応はアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−Ｌ−グル タミン活性エステルを用いてサイクル２５におけるのと同じく行われる。サイク ル１９から得られる化合物は次の通りである。

サイクルＩＢにおいて、アミノ酸誘導体としてＢＯＣ−イプシロン−ｖ−に−リ ジンを用いる。他の点では、−サイクル１８の方法はサイクル３０におけるのと 同様に行われて次の化合物をもたらす。

Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ− Ｇｌｙ−サイクル１７〜１５ サイクル１７〜１５はサイクル３０におけるのと同様に行われるが、ただしサイ クル１７ではＢ　ＯＣ−Ｎ　−（ｉｍ）−Ｖ−Ｌ−ヒスチジン、サイクル１５で は反応剤としてＢＯＣ−Ｌ−グルタミン活性エステル（Ｂｚはそれがセリン及び スレオニンについて示したのと同じ基を示す）を用い、サイクル１５から下記の 化合物をもたサイクル１４〜８ ルタミンーＡＩを用いてサイクル１９と同様に行われる。

サイクル１３〜８は、サイクル３０におけるのと同様にす／、サイクル１２では ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン、サイクル１１ではＢＯＣ−イブシロ７−Ｖ−Ｌ−リジン 、サイクルｌＯではＢＯＣ−グリシ／、サイクル９ではＢＯＣ−Ｈ−ロイシンそ してサイクル８ではＢＯＣ−Ｌ−バリンを用い以下の化合物を得る。

Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ −Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ −Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−サイクル７はサイクル３０と同様に行われるが、ただしアミ ノ酸誘導体としてＢＯＣ−３−エチルチオ−Ｌ−システイン又はその同等物を用 いる。サイクルマにより生ずる化合物は以下の式により示される。

Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ− Ｔｈｒ−（式中Ｒ１はアルキルチオ又はＢｚ基である）。

サイクル６〜２ サイクル６〜２はサイクル３０と同様に行われるが、ただしＢＯＣ−０−Ｈｚ− Ｌ−スレオニンがサイクル６においてアミノ酸誘導体として用いられ、ＢＯＣ− ０−Ｌ−セリンがサイクル５及びサイクル２においてアミノ酸誘導体として用い られ、モしてＢＯＣ−Ｌ−ロイシンがアミノ酸誘導体としてサイクル４において 用いられる。

サイクル３はＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン活性エステルを用いてサイクル２５と同 様に行われる。サイクル２による化合物は次の通りである。

このサイクルは、Ｂ　ＯＣ−Ｓ　−Ｒ１−Ｌ−システィ肩導体を用いてサイクル ７と同様に行われる。システィンについて選択されたＲ１基は、サイクル７で用 いられたのと同一であるか又は異る。例えばもしサイクル７について選択された 誘導体がＢＯＣ−８−エチルチオ−Ｌ−システィンであるならば、サイクルｌに おける誘導体は−システインがサイクル７について選ばれるならば、こも又サイ ク、１％／１に用いられる。サイクル１から得られる化合物は次の式で示される 。

Ｃｙｓ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ− Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−６ｅｒ− Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−（式中Ｒ１は５−ｎ−アルキル、Ｃｙｓ又はＢｚでありＲ冨は ５−ｎ−アルキル又はＢｚであり：Ｒ雪がＢｚのときＲ１は５−ｎ−アルキル又 はＣｙｓでありＲ２が５−ｎ−アルキルのときＲ１はＢｚである）。

アセチル化サイクル ＢＯＣ基は、前述の脱保護基法によりペプチド樹脂から除去できる。得られたｄ ｅ−ＢＯＣの１〜３２のＢＨＡ樹脂ペプチドは次にプロピオン酸とカップリング できる。

このアシル化サイクルはサイクル１と同様に行われるが、ただしプロピオン酸が ＢＯＣ−Ｌ−アラニンの代りに用いられる。アシル化サイクルにより生ずる化合 物は以下の式により示される。

アセチル化サイクルは樹脂ペプチドの完了を示す。樹脂ペプチドは反応容器から 除去され真空乾燥される。樹脂ペプチドの重量は、合成に初め用いたＢＨＡ樹脂 の重量の２０〜１５倍であると予想される。

樹脂ペプチド開裂 ペプチドは、液体弗化水素（ＨＦ）による処理により、アシル化サイクルにより 生じた樹脂ペプチドから開裂する。ＨＦ開裂反応は、−２０〜＋１５′ｃでα５ 〜２０時間液体ＨＦ（樹脂ペプチド樹脂当り２〜２０１ｄ）により、樹脂ペプチ ド及びアニソール（樹脂ペプチド１を当りα５〜５ａＪの混合物を処理すること により行５ことができる。反応時間後、過剰のＨＦは蒸発により除去されそして ペプチド及び樹脂ビーズの得られた混合物は、有機溶媒例えば酢酸エチル、ジエ チルエーテル、ベンゼンなどにより抽出されてアニソール及び残存ＨＦを除く。

ペプチドは、水性酢酸中への抽出により樹脂ビーズから分離される。この工程で ペプチドは環状ではなく、分子中の１及び７位のシスティン間にジスルフィド結 合のない非環状生成物である。

ＨＦ処理はペプチドからすべてのブロッキング基を除くが、ただし１位又は７位 の何れかのシスティン残基のチオール基のＳ−アルキルチオブロッキング基は存 在スる。５−ｎ−フルキルチオ−Ｌ−７ステイン残基はＨＦ開裂工程に対して安 定であり、そして開裂工程及び抽出工程を通してそのままで残る。５−Ｂｚ−Ｌ −システィン残基はＨＦにより開裂して遊離のチオール基を有するシスティン残 基を生ずる。ブロッキング基の両方のタイプが、１位及び７位で互に組合って本 発明の合成中に用いられる。

それ故、ＨＦ開裂後得られるペプチドは、樹脂ペプチド合成中に用いられるシス ティン誘導体のチオール基について選択されたブロッキング基に依存して、一つ 又は四つのタイプである。

もＬＢＯＣ−３−Ｂｚ　−Ｌ−システィン誘導体が樹脂ペプチド合成のサイクル １で用いられそしてＢＯＣ−５−ｎ−アルキルチオ−Ｌ−システィンがサイクル ７で用いられるならば、Ｉ（Ｆ開裂後に生ずるペプチドはタイプＩのものであっ て、１位に遊離のチオール基を有しそして７位のシスティ／残基に５−ｎ−フル キルチオ基を有する。本発明者は、これを式 ％式％ にょう示されるタイプ■ペプチドと呼ぶ。

逆に、もしＢＯＣ−８−ｎ−アルキルチオ−Ｌ−システィン誘導体がサイクルｌ で用いられそしてＢＯＣ−８−Ｂｚ　−Ｌ−システィンがサイクル７で用いられ るならば、＠裂により生ずるペプチドはタイプ■のものでありＣＨ３−ＣＨｌ　 −Ｃ−Ｃｙｓ−８ｅ　ｒ　−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−８ｅ　ｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌ 　ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈ ｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔ ｈｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｎｉ２ により示される。

１位の保護基５−ｎ−アルキルの代りに１不発明者はＳ−システイニル基（この 位の７ステインとともにシスチン基を形成する）を用いそしてこれを行うとき７ 位のシスティンを採掘するためにＢＺ基を用いる。もしビスーＢＯＣ−Ｌ−シス チンかサイクルｌで反応剤として用いられそしてＢＯＣ−８−Ｂｚ　−Ｌ−シス ティンがサイクル７で反応剤として用いられるならば、開裂から生ずるペプチド はタイプ■のものでありそして下記の式％式％ Ｇｌｙ−Ｔｂｒ−Ｐｒｏ−ＭＨｚ により示される。

もしＢＯＣ−８−Ｂｚ−Ｌ−システィンが１及び７位の両方で反応剤として用い られるならば、開裂により生ずるペプチドはタイプ■のものでありそして式％式 ％ にょう示される。

タイプＩ、Ｉｆ及び■のペプチドの環状ジスルフィドペプチドへの転換は、蒸留 水により、ＨＦ開裂からの粗ペプチドの酢酸水浴液を希釈して、開裂した樹脂ペ プチド１２当り５０〜２００ｄの最終容積とすることにより行われる。この溶液 のｐＨは、水酸化アンモニウム溶液の添加により５〜１０に調節され、そして混 合物は約２〜４８時間不活性気体例えば窒素の流れの下密封した容器中で攪拌さ れる。流出する気体の流れがもはやｎ−フルキルメルカプタンを含まないとき反 応を停止する。反応混合物のｐＨは、氷酢酸の添加により約３．５〜５．５に低 下させられる。

タイプ■ペプチドの環状ジスルフィドペプチドへの転換は、当業者に周知のやり 方で行われ、ペプチドは酸化されて環構造を形成して１及び７位にシスティンを 含む。

中間体ペプチドがタイプＩ、Ｉｆ、　Ｉ［［又は■の何れであっても、すべての 周知のカルシトニンに相当するアミノ酸鎖を有するペプチドが合成される。本発 明で合成されるこのようなペプチドは、精製されそして周知のカルシトニンと同 じタイプの生物学活性を有することが分った。

合成されたすべてのカルシトニンは、８−グリシン、デス−１９−ロイシン−カ ルシトニンと呼ばれる。これは、命名のＩＵＰＡＣ−ＩＵＰ法による。

１ｍ（Ｎ−アルファープロピオニル−８−グリシン、デス−１９−ロイシン〕サ クカルシトニン 上述の合成からのｐＨ５，０の粗ペプチド溶液をイオン交換法を用いて濃縮する 。濃縮物は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ法及び分配クロマトグラ フィの組合せにより精製される。最終の精製した生成物は、毛状の白色固体とし て凍結乾燥により溶液から得られる。

生成物は所望のペプチドに関する正確なアミノ分析を与える。

〔実施例〕

以下はペプチドの製造の特別な例である。

実施例１ 樹脂の活性化 ０、６１　ｍｅφのアミンタイターのＢＨＡ樹脂（５ｔ）をアリシナ州タクソン （Ｔｕｃｓｏｎ　）のベガ・バイオケミカルズ（Ｖｅｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ　）により市販されているペプチドシンセサイザーの反応容器に入れた。

樹脂を、各処理後ＦＡして２５ｍの下記の溶媒により処理した。

塩化メチレン、２分間 クロロホルム、それぞれ２分間、２回 りロロホルム中１０％トリエチルアミン、それぞれ５分間、２回 クロロホルム、２分間 塩化メチレン、それぞれ２分間、３回 カップリング：ＢＨＡ樹脂、２５ゴの塩化メチレン及び１３１Ｆ（０，００６１ モル）のＢＯＣ−Ｌ−プロリンを１０分間攪拌した。ａｌ−のジシクロへキシル カルボジイミド（溶液１ｍ当り１ミリ当量のＤＣＣ）の塩化メチレン溶液を反応 器に加え混合物を６時間攪拌した。反応混合物を濾過により反応器から除きモし てＢＯＣ−プロピルＢＨＡ樹脂に下記の連続した２分間、２５−の洗滌を行い、 それぞれ濾過により洗滌液を除いた。

塩化メチレン、２回 メチルアルコール、２回 塩化メチレン、３回 アセチル化：樹脂を次に２時間Ｌ５ｄのトリエチルアミン（ＴＥＡ）、１ｍの無 水酢酸及び２５−のクロロホルムの混合物とともに攪拌した。反応混合物を濾過 により除きそして樹脂に下記の２分間、２５ｄの洗滌を行った。

クロロホルム、２回 メチルアルコール、２回 塩化メチレン、３回 口酢＆（ＴＦＡ）及び１５ｍの塩化メチレンの混合物とともに５分間攪拌した。

この混合物を濾過により除き樹脂を３０分間１５ｍのＴＦＡ及び１５ｍｇの塩化 メチレンの第二の混合物とともに攪拌した。反応混合物を濾過により除去しそし て樹脂に次の２５−の洗滌を行った。

塩化メチレン、２回、それぞれ２分間 メチルアルコール、２回、それぞれ２分間クロロホルム、２回、それぞれ２分間 クロロホルム中１０％ＴＥＡ、２回、それぞれ１０分間クロロホルム、２回、そ れぞれ２分間 塩化メチレン、２回、それぞれ２分間 に一プロリンＢＨ人樹脂を滴定してアミン又はプロリンタイターをめた。この値 は、樹脂１ｆ当りα５５ミリ当量のアミン又はプロリンであった。

サイクル３０ ジン及び１６４Ｆ（α００５３モル）のＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン を１０分間攪拌した。次にジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣの１ミリ当 量）の塩化メチレン溶液５．５ａｔを反応器に加え混合物を２時間攪拌した。反 応混合物を反応器から除き樹脂に下記の連続した２分間、２ｄの洗滌を行い、そ れぞれ濾過により洗液を除いた。

塩化メチレン、２回 メチルアルコール、２回 塩化メチレン、３回 イサチンテ゛ストは陰性 脱保護塞化：サイクル３１に記載された脱保護塞化をこのサイクルについて繰返 した。

これらのサイクルで用いられたカップリング及び脱保護塞化は、サイクル３１に おけるのと同じであったが、ただし下記のアミノ酸誘導体をスレオニン誘導体の 代りに用いた。

サイクル２９：α９３ｔ（α００５３モル）のＢＯＣ−グリシン サイクル２ｇ：１５５Ｆ（０，００５３モル）のＢＯＣ−Ｏ−ベンジル−し−セ リン サイクル２７：用いた反応剤はサイクル３０と同一サイクル２６：用いた反応剤 はサイクル３１と同一サイクル２５ ２５ｄずつのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）により２回洗った。樹脂を次に３ ５ｄのＤＭＦ’中の１８２１（αＯＯＳモル）のＢＯＣ−！、−アスパラギンｐ −ニトロフェニルエステルの溶液とともに２４時間攪拌した。

反応混合物を濾過し、樹脂ペプチドに下記の溶媒の２＠の連続した２５ｄずつの ２分間の洗滌を行った。ＤＭＦ。

塩化メチレン、メタノール、塩化メチレン。それぞれの個々の溶媒を濾過により 除いた。ニンヒドリンテストは陰性であった。

した。

サイクル２４ カップリング及び脱保膿基化は、同じ反応剤及び量を用いサイクル３０と同一で あった。

サイクル２３ チドなりＭＦの２回の続けた２５ｄずつで洗った。樹脂ペプチドを次に１０分間 ３．４２１（０，００８モル）のＢＯＣ−Ｎ−オメガ−トシル−に−アルギニン 及び２５ｄのＤＭＦの混合物とともに攪拌した。次に塩化メチレン中のＤＣＣ（ α００８モルのＤＣＣ′￥Ｃ相当）８Ｍｔを加えそして混合物を６時間攪拌した 。反応混合物を濾過により除いた。樹脂ペプチドに、下記の溶媒の２回の連続し た２５ｄずつの２分間の洗滌を行った。ＤＭＦ、塩化メチレン、メチルアルコー ル、塩化メチレン。ニンヒドリンテストは陰性であった。

脱保護塞化：サイクル３１で用いた脱保護塞化を繰返した。

１０分間１７２Ｆ（０００８モル）のＢＯＣ−Ｌ−プロリン及び２５Ｍｔの塩化 メチレンとともに攪拌した。塩化メチレン中のＤＣＣ（α００８モルのＤＣＣに 相当）８ｄを加えそして混合物を６時間攪拌した。反応混合物を濾過により除き そして樹脂ペプチドに、下記の溶媒の２回の連続した２５ｊＩＩＩ！ずつの２分 間の洗滌を行った。塩化メチレン、メチルアルコール、塩化メチレン。それぞれ の個々の洗液を濾過により除いた。ニンヒドリンテストは陰性であった。

した。

サイクル２１及び２０ このサイクルで用いたカップリング及び脱保履基の方法は、サイクル２２と同じ であったが、ただしカップリング反応において下記のアミノ酸誘導体をＢＯＣ− Ｌ−プロリンの代りに用いた。

サイクル２１：４．０７ｆ（αＯＯＳモル）のＢＯＣ−０−２−ブロモベンジル オキシカルボニル−し−チロシン ティク＃２０　：　Ｚ４７　ｔ　（Ｑ、００８モ＃）ノＢＯＣ−０−ベンジル− し一スレオニン サイクル１９ この方法はサイクル２５と同じであるが、ただし凹４ｒ　（ｏ、　ｏ　ｏ　ｓモ ル）のＢＯＣ−Ｌ−グルタミンｐ−ニトロフェニルエステルをアスパラギン誘導 体の代りに用いる。

サイクル１８〜１５ 方法はサイクル３０で用いたのと同じであるが、ただし下記のアミノ酸誤導体を スレオニン誘導体の代りに用いた。

ティク＃１８　：　２−２０ｆ　（αＯＯ５３ｒ＝ル）ノＢＯＣ−イプシロン− ２−クロロベンジルオキシ−Ｌ−リジン ティクに１７：２−０６ｆ（α００５３−ｖ−＋）のＢＯＣ−Ｎ（ｉｍ）−カル ボベンジルオキシ−Ｌ−ヒスチジン サイクル１６　：　１．３２Ｆ（０，００５３モＪ％／）のＢＯＣ−に−ロイシ ン サイクル１５：　Ｌ７９ｒ（０，００５：３モル）のＢＯＣ−サイクル１９と同 一。

サイクル１３ 用いた方法は、サイクル２２で用いたのと同一であったが、ただしカップリング 反応においてＺ３６Ｆ（α００８モル）のＢＱＣ−Ｑ−べｙジル−Ｌ　−＋　” 　７をプロリン誘導体の代りに用いた。

サイクル１２〜９ 用いた方法は、サイクル３ｏで用いたのと同じであったが、ただしカップリング 反応において下記のアミノ酸誌導体をスレオニン誘導体の代りに用いた。

サイクル１２：サイクル１９で用いたのと同じ反応剤。

サイクル１１：反応剤はサイクル１８におけるのと同一であった。

サイクルｌＯ：サイクル２９で用いたのと同一の反応剤。

サイクル９：サイクル１９で用いたのと同一の反応剤。

及び２５−の塩化メチレンとともに攪拌した３次に塩化メチレン中ＤＣＣ（０， ００８モルのＤＣＣに相当）８−を加えそして混合物を１６時間攪拌した。反応 混合物を濾過により除いた。樹脂に、下記の溶媒の２回の連続した２５１ｄずつ の２分間の洗滌を行った。塩化メチレン、メチルアルコール、塩化メチレン。そ れぞれの個々の洗液は、濾過により除去された。

方法はサイクル３０で用いたのと同一であったが、ただしカップリング反応にお いて１５Ｆ（０，００５３モル）のＢＯＣ−８−エチルチオ−し−シスナインを スレオニン誘導体の代りに用いた。

用いた反応剤及び方法はサイクル３ｏと同一であった。

サイクル５ 用いた反応剤及び方法はサイクル２８と同一であった。

用いた反応剤及び方法はサイクル１６と同一であった。

用いた反応剤及び方法はサイクル２５と同一であった。

用いた反応剤及び方法はサイクル２８と同じであった。

用いた反応剤及び方法はサイクル３０と同一であったがただし１８１　？　（０ ，００５３モル）のＢＯＣ−８−ｐ−メトキシベンジル−に一システィンをスレ オニン誘導体の代りに用いた。

化法をこのサイクルについて繰返した。

ジン及びα７４Ｆ（α０１モル）のプロピオン酸を１０分間攪拌した。ジシクロ へキシルカルボジイミド（１−当り１ｍｅｑ１７）ＤＣＣ）の塩化メチレン溶液 １１−を反応物に加えそして混合物を２時間攪拌した。反応混合物を反応器から 除きそして樹脂をサイクル３１に記載したように洗った。樹脂ペプチドを最後に ２回の連続した２５ｄずつのｎ−ヘキサンにより洗った。ペプチド材料を反応器 から除きそして２４時間０．１　ｕＨｙで４０Ｃで真空オーブン中で乾燥した。

弗化水素による開裂 乾燥した樹脂ペプチド（２２）及び２−のアニソールをテフロン反応容器に入れ た。テフロン被覆磁気攪拌器を備えた容器をドライアイス・アセトン浴中に置き そして１５−の弗化水素ガスを容器に注入した。この混合物を１時間水浴中で０ ℃で攪拌した。弗化水素を減圧下蒸発により除いた。残液を６回の２５−ずつの 酢酸エチルにより処理した。ペプチドを、１２０−のα１モル酢酸水溶液により 樹脂ビーズから抽出した。

ペプチドの環化 弗化水素開裂により得られた酢酸・水抽出物を８０ｍの蒸留水の添加により２０ ０ｍに希釈した。溶液のｐＨを濃水酸化アンモニウムの添加により７．５に調節 した。

溶液を２４時間窒素の流れの下閉じた容器中で攪拌した。

このとき、外に出る窒素流中にエチルメルカプタンは検出できなかった。窒素流 のエチルメルカプタン含量は、エルマン（Ｅｌ　１ｍａｎ　）の試薬〔エルマン 、Ｇ、Ｌ、［アル流れを通すことにより測定できた。反応混合物のｐＨは氷酢酸 の添加により５．ＯＫ調節された。

粗〔Ｎ−アルファープロピオニルｅ　”Ｙ”ｐ　デス−Ｌｅｕ”　）　−Ｓ　Ｃ Ｔの精製 ｐＨ５，０の上述の合成からの溶液２００ｄを、５Ｐ−２５イオン交換カラムを 用いて濃縮した。α７モルの塩化ナトリウム溶液によりカラムから除いた２５ｍ の濃縮物を脱塩し、そしてセファデックスＧ−２５（７アイン）ゲル濾過カラム を通しそしてα０３モルの酢酸水溶液により溶離することにより精製した。この カラムからの〔Ｎ−アルファープロピオニル＃　Ｇｌ）”ｅデス−Ｌｅｕ”　） −８ＣＴ画分を氷酢酸の添加によりｐＨ５，０に調節した。

この溶液をＳＰ−セファデックスＣ−２５イオン交換カラムを用いてａ縮した。

α７モルの塩化ナトリウム溶液にようカラムから除いた３０ａｄの濃縮物をセフ ァデックスＧ−２５（ファイン）ゲル濾過カラムにより脱塩した。

ペプチド画分を集め凍結乾燥した。生成物を、さらにセファデックスＧ−２５（ ファイン）カラム並に溶媒系〔ｎ−ブタノール、エタノール、α２Ｎ酢酸アンモ ニウム（０，０４％酢酸含有）（４−１−５））を用いる分配クロマトグラフィ により精製した。生成物を０．３３のＲｆ値でカラムから溶離した。生成物を含 む画分を合わせそして蒸発によりｎ−ブタノールを除いた。生成物を凍結乾燥に より回収した。固体を次にα２Ｍ酢酸溶液によりセファデックスＧ−２５（７ア イン）カラムでゲル濾過した。Ｎ製したペプチド画分を集めそして凍結乾燥した 。

生成物は毛状の白色固体として得られた。生成物のアミノ酸分析は下記の比を有 した（カッコ内は理論値を示す）。Ａｓｐ　ｚｏ　（２）　、　Ｔｈｒ　５．２ 　（５）、　Ｓｅｒ　１ｇ　（４）。

Ｇｌｕ１８（３）、ＰｒｏＺＯ（２）、　Ｇｌｙ４．０（４）、　Ｌｅｕ４０（ ４）。

Ｈｉｓα９２（１）、ＬｙｓＺ９（２）、Ａｒｇα９４（１）、ＣｙｓＬ　９１ 　（２）　、Ｔｙｒ　Ｏ，９１（１）。

（Ｎ−アルファープロピオニル、８−グリシン、デス−１９−ロイシン〕サケカ ルシトニンの生物学的活性は、変化する投与量の〔Ｎ−アルファープロピオニル ＊　Ｇ’Ｙ”ｐデス−Ｌｅｕ”　）　−Ｓ　ＣＴ及び合成サケカルシトニン標品 による投与後の血清カルシウム濃度の低下を比較することによりめられた。ラッ トを７頭の動物の４群に分け、それぞれの群に標準又はテスト溶液の投与をアト ランダムに行った。低投与量及び高投与量は、投与・反応曲線の直線部分から選 ばれた。サケカルシトニン標品について、値はα７及びＺ１ｎｌＦペプチド／１ ００ｆＢＷであった。ペプチドは皮下注射（α２−／１０１００ｒｎにより与え られ、血液は血清カルシウム測定のため１時間後に抜き取られた。血清は採取の ２時間以内に処理・分析された。結果は採取の２時間以内に分析された。結果は ２×２パラレル・ライン・アッセイ〔ガダム（Ｇａｄｄｕｍ　）　Ｊ、　Ｈ，ｒ Ｊ、　７アーム・ファーマコロ。

（Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、）Ｊ　６．　３４５　（１９５３）　）に より分析した。用いた標準カルシトニンは、独立して測定されて、４０００　Ｉ Ｕ／ｗｉより多く含んだ。（Ｎ−アルファープロピオニルｐ　Ｇ’Ｙ”ｍ　デス −Ｌｅｕ”　）　−８ＣＴはａ　７００　ＩＵ／ｗｉとアッセイされた。

本発明の成る態様のみが詳しく記載されたが、多くの他の特定の態様が行われそ して多く変化がなされ、それらすべては本発明の趣旨並に請求の範囲の範囲内に あることは、当業者に明らかであろう。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）〔Ｎ−アルフア−プロピオニル，８−グリシン，デス−１９−ロイシン〕 カルシトニンよりなる修飾カルシトニン。
2. （２）該カルシトニンがサケカルシトニン置換欠失類似体ウナギカルシトニン置 換欠失類似体又はニワトリカルシトニン置換欠失類似体である請求項１記載のカ ルシトニン。
3. （３）構造 【配列があります】 （サケ）、 【配列があります】 （ウナギ）又は 【配列があります】 （ニワトリ） を有する請求項１記載のカルシトニン。
4. （４）カルシトニンが構造 【配列があります】 （サケ）、 【配列があります】 （ウナギ）又は、 【配列があります】 （ニワトリ） （式中Ｒ１はＳ−ｎ−アルキル、Ｃｙｓ又はＨであり、Ｒ２はＳ−ｎ−アルキル 又はＨであり、Ｒ２がＨのときＲ１はＳ−ｎ−アルキル、Ｃｙｓ又はＨでありそ してＲ１がＨのときＲ２はＳ−ｎ−アルキル又はＨである）を有する請求項１記 載の方法。
5. （５）請求項１〜４の何れか一つの項により形成される化合物を含むカルシウム 調節組成物。
6. （６）有効量の請求項１〜４の何れか一つの項により形成される化合物の投与よ りなる血液カルシウムレベルを調節する方法。