CS271872B1 - Method of oxyhaemoglobin's purified solution preparation - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nativního hemoglobinu z lidských nebo zvířecích červených krvinek k analytickým, perfúzním nebo výhledově infúzním účelům. Oproti dosavadním postupům má navržený způsob větší rychlost a účinnost odstraňování nežádoucích příměsí v hemolyzátu erytrocytů. Ode jak o mechanické částice (erytrocytární stromata a jejich fragmenty), tak o rozpuštěné nehemové bílkoviny nebo fosfolipidy. Postup zahrnuje i možnost odstranění případné virové kontaminace pasteurizací. Příprava nativního hemoglobinu podle vynálezu je jednou z možnosti, jak využít a prakticky zhodnotit část dosud exspirujicíoh erytrocytů z krevních konzerv transfúzní služby.

Podstata obecného řešení způsobu výroby hemoglobinu podle vynálezu spočívá ve vhodné kombinaci a sledu technických operací a o sobě známých postupů, jako je hemolýza, odstraňováni, vytřepávání organickým rozpouštědlem, filtrace, deoxygenace, pasteurizace, sterilizační filtrace, adsorpce a lyofilizace. Náš postup vychází z působení chloroformu na promytou exspirovanou erytromasu naředěnou hypoosmotickým pufrem za fysiologického pH, za třepání a intensivního míchání, v přítomnosti laurylalkoholu k potlačení pěnění. V těch to podmínkách se vyrázně urychlý hemolýza, extrakce fosfolipidů do chloroformu i vysrážení některých nehemovýoh bílkovin za tvorby v podstatě třífázového systému: chloroform (spodní fáze) - sraženina nebo emulze (střední fáze) - roztok hemoglobinu. Po nízkoobrátkové centrifugaci se odsaje hemoglobinová vrstva, zbaví se rozpuštěného chloroformu v proudu plynného dusíku. V této fázi je možno roztok zcela deoxygenovat například dithioničitanem a po naředění na 1 až 2¾ hemoglobin pasteurizovat při 60 °C po 10 h. Během postupného chla zení se zbytky laurylalkoholu odstraní adsorpci na aktivní uhlí. Po centrifugaci se provede dialýza proti vodě, popřípadě diafiltrace, upraví se koncentrace hemoglobinu, pH, a následuje sterilizační filtrace. Preparát se skladuje za chladu po případné mrazové sublimaci (lyofilizaci).

Konečný roztok (60.až 70 g hemoglobinu/1) má jasně červenou barvu, absorpční spektrum odpovídá nativnímu oxyhemoglobinu. Obsah methemoglobinu činí obvykle 3 % (relativně k celkovému Hb).

Předmět vynálezu je doložen v následujícím příkladu, aniž by byl tímto příkladem omezován .

Příklad objemový díl sterilní exspirované lidské erytromasy (ne starší než 42 dnů po odběru) se při 4 °C promyje centrifugačně při 1 000 g, čtyřikrát po 10 min vždy s přídavkem 3 objemových dílů 0,15M chloridu sodného. K 5 objemovým dílům promyté erytromasy se přidá 10 objemových dílů hemolyzačního roztoku o složení 0,01M fosforečnan sodný pufrující pH 7,5, dále se přidají 3 objemové díly chloroformu a 10“³ objemového dílu laurylalkoholu. Směs se intensivně protřepává a míchá 60 min při 25 °C. Potom se centrifuguje při 2 000 g po dobu 20 min. Červený supernatant se oddělí a zbaví se rozpuštěného chloroformu průchodem čistého dusíku při teplotě 25 až 30 °C během 60 až 90 min.. Roztok se upraví na koncentraci hemoglobinu 1%, fosfátového pufru 0,lM při pH 7,5, přidá se dithioničitan sodný do dosažení konoentrace 0,04M a vzorek se v mírném proudu dusíku pasteurizuje zahříváním na 60 °C po dobu 10 h. Ke každým 100 ml roztoku se přidá 0,2 ml aktivního uhlí, směs se postupně chladí za přístupu vzduchu až k 10 °C za mícháni, potom se centrifuguje a filtruje na vrstvě Seitz EK. Konečný jasně červený roztok se dialyzuje proti vodě při 4 °C, koncentrace hemoglobinu se upraví například dialitrací na 60 až 70 g/1, pH se uprav! na 6,5 až 7,4, roztok se sterilizuje filtrací přes membránové filtry a skladuje za chladu, popřípadě po lyofilizaoí s příslušným protektivem.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob přípravy petrifikovaného roztoku oxyhemoglobinu z exspirované lidské nebo zvířecí erytromasy za použití obecně známých materiálů a postupů 'jako je hemolýza, odstřeďování, vytřepávání, filtrace, diafiltrace, deoxygenace,pasteurizace, sterilizační filtrace a lyofilizace, přičemž konkrétní pracovní postup, vyznačující se tím, že 4 až 6 objemových dílů promyté erytromasy se hemolyzuje 8 až 12 objemovými díly 0,005 až 0,03M pufru o pH 6,6 až 7,6 v přítomnosti 3 až 6 objemových dílů chloroformu s přídavkem 10”^ až 10^-^ objemových dílů laurylalkoholu za třepání a míchání této směsi při teplotě 25 až 30 °C po dobu 30 až 90 min, potom se vzniklá suspenze centrifuguje při 2 000 až 4 000 g za teploty 5 až • 25 °C, potom se červený supernatant zbaví chloroformu odpařením, v proudu inertního plynu, potom se hemoglobin naředí na koncentraci 10 až 30 g/1 fosfátovým pufrem pH 7 až 7,8 a po redukci, respektive deoxygenaoi na deoxyhemoglobin se pasteurizuje zahříváním na 60 až 65 C po dobu 1 až 10 h, potom se přidá aktivní uhlí k odstranění laurylalkoholu a některých dalších příměsí, po ochlazení za přístupu vzduchu se směs centrifuguje, filtruje, dialyzuje proti vodě nebo 0,03 až 0,15M chloridu sodnému, koncentrace hemoglobinu se upraví na 50 až 70 g/1, pH na 6,5 až 7,5, potom se roztok sterilizuje filtrací a skladuje za chladu po případné lyofilizaci.