Vynález se týká způsobu výroby nativního hemoglobinu z lidských nebo zvířecích červených krvinek k analytickým, perfúzním nebo výhledově infúzním účelům. Oproti dosavadním postupům má navržený způsob větší rychlost a účinnost odstraňování nežádoucích příměsí v hemolyzátu erytrocytů. Ode jak o mechanické částice (erytrocytární stromata a jejich fragmenty), tak o rozpuštěné nehemové bílkoviny nebo fosfolipidy. Postup zahrnuje i možnost odstranění případné virové kontaminace pasteurizací. Příprava nativního hemoglobinu podle vynálezu je jednou z možnosti, jak využít a prakticky zhodnotit část dosud exspirujicíoh erytrocytů z krevních konzerv transfúzní služby.The invention relates to a method for producing native hemoglobin from human or animal red blood cells for analytical, perfusion or prospective infusion purposes. In contrast to the prior art, the proposed method has a greater rate and efficiency of removing unwanted impurities in the erythrocyte hemolysate. These include both mechanical particles (erythrocyte stroma and their fragments) and dissolved non-haem proteins or phospholipids. The procedure also includes the possibility of removing possible viral contamination by pasteurization. The preparation of the native hemoglobin of the present invention is one way to utilize and practically evaluate a portion of the hitherto expiring red blood cell erythrocytes from the transfusion service.
Podstata obecného řešení způsobu výroby hemoglobinu podle vynálezu spočívá ve vhodné kombinaci a sledu technických operací a o sobě známých postupů, jako je hemolýza, odstraňováni, vytřepávání organickým rozpouštědlem, filtrace, deoxygenace, pasteurizace, sterilizační filtrace, adsorpce a lyofilizace. Náš postup vychází z působení chloroformu na promytou exspirovanou erytromasu naředěnou hypoosmotickým pufrem za fysiologického pH, za třepání a intensivního míchání, v přítomnosti laurylalkoholu k potlačení pěnění. V těch to podmínkách se vyrázně urychlý hemolýza, extrakce fosfolipidů do chloroformu i vysrážení některých nehemovýoh bílkovin za tvorby v podstatě třífázového systému: chloroform (spodní fáze) - sraženina nebo emulze (střední fáze) - roztok hemoglobinu. Po nízkoobrátkové centrifugaci se odsaje hemoglobinová vrstva, zbaví se rozpuštěného chloroformu v proudu plynného dusíku. V této fázi je možno roztok zcela deoxygenovat například dithioničitanem a po naředění na 1 až 2¾ hemoglobin pasteurizovat při 60 °C po 10 h. Během postupného chla zení se zbytky laurylalkoholu odstraní adsorpci na aktivní uhlí. Po centrifugaci se provede dialýza proti vodě, popřípadě diafiltrace, upraví se koncentrace hemoglobinu, pH, a následuje sterilizační filtrace. Preparát se skladuje za chladu po případné mrazové sublimaci (lyofilizaci).The general solution of the process according to the invention consists in a suitable combination and sequence of technical operations and processes known per se, such as hemolysis, removal, organic solvent shaking, filtration, deoxygenation, pasteurization, sterilization filtration, adsorption and lyophilization. Our procedure is based on the action of chloroform on washed expired erythromase diluted in hypoosmotic buffer at physiological pH, with shaking and vigorous stirring, in the presence of lauryl alcohol to suppress foaming. Under these conditions, markedly rapid hemolysis, extraction of phospholipids into chloroform, and precipitation of some non-heme proteins to form a substantially three-phase system: chloroform (bottom phase) - precipitate or emulsion (middle phase) - hemoglobin solution. After low-speed centrifugation, the hemoglobin layer is aspirated, freed from dissolved chloroform in a stream of nitrogen gas. At this stage, the solution can be completely deoxygenated with, for example, dithionite and, after dilution to 1-2¾ hemoglobin, pasteurized at 60 ° C for 10 hours. During successive cooling, the residues of lauryl alcohol are removed by adsorption to activated carbon. After centrifugation, dialysis against water or diafiltration is performed, hemoglobin concentration, pH is adjusted, followed by sterilization filtration. The preparation is stored in the cold after possible freeze-drying.
Konečný roztok (60.až 70 g hemoglobinu/1) má jasně červenou barvu, absorpční spektrum odpovídá nativnímu oxyhemoglobinu. Obsah methemoglobinu činí obvykle 3 % (relativně k celkovému Hb).The final solution (60-70 g hemoglobin / l) has a bright red color, the absorption spectrum corresponding to native oxyhemoglobin. The methemoglobin content is usually 3% (relative to total Hb).
Předmět vynálezu je doložen v následujícím příkladu, aniž by byl tímto příkladem omezován .The invention is illustrated by the following example without being limited thereto.
Příklad objemový díl sterilní exspirované lidské erytromasy (ne starší než 42 dnů po odběru) se při 4 °C promyje centrifugačně při 1 000 g, čtyřikrát po 10 min vždy s přídavkem 3 objemových dílů 0,15M chloridu sodného. K 5 objemovým dílům promyté erytromasy se přidá 10 objemových dílů hemolyzačního roztoku o složení 0,01M fosforečnan sodný pufrující pH 7,5, dále se přidají 3 objemové díly chloroformu a 10“3 objemového dílu laurylalkoholu. Směs se intensivně protřepává a míchá 60 min při 25 °C. Potom se centrifuguje při 2 000 g po dobu 20 min. Červený supernatant se oddělí a zbaví se rozpuštěného chloroformu průchodem čistého dusíku při teplotě 25 až 30 °C během 60 až 90 min.. Roztok se upraví na koncentraci hemoglobinu 1%, fosfátového pufru 0,lM při pH 7,5, přidá se dithioničitan sodný do dosažení konoentrace 0,04M a vzorek se v mírném proudu dusíku pasteurizuje zahříváním na 60 °C po dobu 10 h. Ke každým 100 ml roztoku se přidá 0,2 ml aktivního uhlí, směs se postupně chladí za přístupu vzduchu až k 10 °C za mícháni, potom se centrifuguje a filtruje na vrstvě Seitz EK. Konečný jasně červený roztok se dialyzuje proti vodě při 4 °C, koncentrace hemoglobinu se upraví například dialitrací na 60 až 70 g/1, pH se uprav! na 6,5 až 7,4, roztok se sterilizuje filtrací přes membránové filtry a skladuje za chladu, popřípadě po lyofilizaoí s příslušným protektivem.Example volume of sterile expired human erythromase (not older than 42 days after collection) at 4 ° C is washed by centrifugation at 1000 g, four times for 10 min each with the addition of 3 volumes of 0.15 M sodium chloride. To 5 parts by volume erytromasy washed was added 10 volumes of a hemolyzing solution composed of 0.01 M sodium phosphate buffering pH 7.5, then add 3 parts by volume of chloroform and 10 "3 parts by volume of lauryl alcohol. The mixture was shaken vigorously and stirred at 25 ° C for 60 min. It is then centrifuged at 2000 g for 20 min. The red supernatant was separated and freed from dissolved chloroform by passing pure nitrogen at 25-30 ° C for 60-90 min. The solution was adjusted to a hemoglobin concentration of 1%, phosphate buffer 0.1M at pH 7.5, sodium dithionite was added. until a concentration of 0.04M is achieved and the sample is pasteurized in a gentle stream of nitrogen by heating at 60 ° C for 10 h. 0.2 ml of activated carbon is added to each 100 ml of solution, gradually cooled to 10 ° C with air. with stirring, then centrifuged and filtered on a Seitz EK layer. The final bright red solution is dialyzed against water at 4 ° C, the hemoglobin concentration is adjusted, for example, by dialitization to 60 to 70 g / l, the pH is adjusted. to 6.5 to 7.4, the solution is sterilized by filtration through membrane filters and stored refrigerated, optionally after lyophilization with an appropriate protector.