CS269549B1 - Spoaob zvýšenia efektivnosti přenosu DNA do bakteriálnej buňky - Google Patents

Description

CS 269 549 Bl 1

Vynález sa týká sposobu zvýšenia efektivnosti přenosu deoxyribonukleovejkyseliny (ONA) do hostiteískej buňky. Použitím látok všeobecných vzoreov

CH-l J CH3 - + N - CH3 ,X' *1 (i) CH- CH- CH- <CH2)n -

I N - CH- . 2X" (II) kde Rj uhlovodíkový refazec s počtom uhlikov 6 až 20, priamy alabo rozvětve-ný, připadne obsahujiici heteroatdm, n = 2 až 12, X “ Cl, Br, I, Přenos hybridných molekul DNK in vitro do nových hostitelských buniekje nevyhnutnou súčastou manipulácii v gónovom inžínierstve. Cielom tohoto postupuje klonovanie cudzorodej genetickej informácie v recipíentných buňkách, jej roz-množenie a selekcia s následným výberom vhodných klonov. Přenos génov do bakteriálnej buňky sa može uskutočňovaf tromi základnýmispžsobmi: transformáciou, alebo transfekciou - t, j, priamym vychytáváním vol-nej DNA recipientnými buňkami, transdukciou, pri ktorej je DNA přenesená fágomz jednej buňky do druhej a konjugáciou, pri ktorej sa přenos ONA uskutoňňuje pria-mym kontaktom medzi dvorná bakteriálnymi buňkami. Výsledkom je dědičná změna reci»·pientnej buňky.

Bakteria, ktoré je schopná přijímat exogénnu volnu DNA a inkorporovaf judo svojho genOmu sa nazýva kompetentnou, Pre niektoré baktérie (Streptococcuspneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis) je kompetencia prirodze-ným fyziologickým stavom počas rastového cyklu, zatiaf čo u mnohých baktérii (napr

Escherichia coli), kvasiniek, a taktiež u buniek živočíchov kultivovaných in vitromusi byt kompetencia umele navodená fyzikálno-chemickými postupmi.

Nevýhodou doterajšich metOd je, že pre nejčastejsie používané hostitelské buň-ky (E.coli) je potřebné relativné komplikovaným sposobom indukovat kompetenciu,pričom efektivnost transformácie (počet transformantov na vnesené množstvo DNA)je malá. Podobné, prijimanie velkých plazmidov (>30 kb ) kompetentnou buňkou jeneefektivne,

Transforraácia E.coli volnou DNA je velmi významná pre technológiu klonovaniaONA, lebo kompetentně buňky možu byt poměrně Iahko transformované roznymi malýmireplikónmi, ktoré sú používané pre konštrukciu rekombinantných molekul ONA, Naviacaj přenos klonovaných génov do geneticky nového prostredía je doležitou etapou ichanalýzy.

Zvýšeníe efektivnosti transformácie buniek exogénnou DNA je možné využítv oblasti génového inžinierstva a moderných biotechnologii, při vytváraní geno-vých bánk v mikroorganizmech. 2 CS 269 549 Bl

Podstata rieáenia podlá vynálezu spočiva v použiti povrchovo aktívnych ke-tiónových látok, ktoré po přidaní do reekčnej zmesi zvyšují efektivnost transfor-mácie až 10 krát. Výhodou riešenia podlá vynálezu je, že s nepatrnou modifikáciou zaužlva-nej metídy transformácie je nožná použitím takého istáho množstva izolovanejONA získat niekolkonásobné množstvo transformantov. Sálej uvedené příklady ilustrují, ale neobmedzují využitie spásobu podlávynálezu. Přiklad 1 50 ml exponenciálnej kultíry E.coli DHl v LB půdě sa po centrifugovaní(frekvence otáčeni 7000 min"^·, 4 °C, 10 min) resuspenduje v 5 ml chladného roz-toku CaCl2 (0,05 mol/1) a nechá sa 20 min. pri 0 °C. Po daláom centrifugovania resuspendovaní v 1 ml chladného roztoku Cacl2 (0,05 mol/1) sa suspenzia rozdě-lí do skímaviek po 200^1.

Ku vzorke v skímavke sa přidá 20/<l zásobného roztoku detergentu N.N*-bís(oktyldimetyl )-l ,6-hexándiam<5niumdibromidu (výsledná koncentrácia 20/xg/ml),a po 10 min, 4 °C sa přidá roztok DNA (plazmid pATl53) tak, aby v skímavkebol 1/zg DNA. Zmes sa inkubuje pri 0 °C 30 min, potom sa zahřeje na 42 °C na 2 min,přidá sa 0,75 ml LB pddy a po 30 min pri 37 °C sa vysieva po 10//1 suspenzie naPetriho misky obsahujíce živný agar s ampicilinom, Vyrastají len buňky, do kto-rých sa dostal plazmid pATl53, Ku kontrolným vzorkám nebol detergent přidaný.Výsledky vid. tab, 1. přiklad 2

Vzorka bola spracovaná ako v přiklade 1, miesto N,N*- bis(oktyldimetyl)-1,6-hexándiamdniumdibromidu bolo přidané také isté množstvo N,N'-bis(pentadecyl-dimetyl)-l,5-hexándiamíniumdibromidu (2^ég/ml). Výsledky vid, tab, 1, Přiklad 3

Vzorka bola spracovaná ako v příklade 1, miesto plazmidu pATl53 bolk E.coli BHlOl přidaný plazmid pBR322 a oktyldimetylamániumjodid (0,1 mg/ml).

Vid. tab. 1. Přiklad 4

Vzorka bcla spracovaná ako v přiklade 1, ale k buňkám E.coli DM83 miestoN,N*-bis (oktyldimetyl)-l,6-hexándiam<5niumdibromidu, bol přidaný N,fl - bis (te- CS 269 549 81 3 · tradecyldiaetyl)-l,6-hexándiamdniumdibromid (20^9/flil), amiesto vysoko-vyčištěnaj ONA (pATl53) bole přidaná ONA získaná rýchlometddou (pUC9). Množ-stvo buniek obsahujúcich plazmid bolo určená výsevom na MacConkey agar, naktoron tvoria červená koldnie. Výsledky vid. tab..1. TABUCKA 1 Látka Počet transformantov (koncentrácia, na Petriho roiske rag/ml) s látkou kontrola W»BtBB3XBBSBBSRSBXaaZBRSSa3DSBBS8S3S*S83MBXSSSaCB3

Baktérie

DNA SZ83BSBS= E.coli DHl pATl53 C8 (0,02) 123 28 E.coli OHI PAT153 C15 (0,02) 55 28 E.coli 3M83 PUC9 CB (0.02) 22 2 E.coli □M83 pUC9 Cl4 (0,02) 12 2 E.coli HBlOl pBR322 CVXII (0,1) 10 5 E.coli BH101 pBR322 C8 (0,0005) 14 5 S.typhimurium PBR322 C14 (0,125) 93 0 r Cg - N,N'-bis(oktyldimetyl )-l ,6-hexándiam<5niumdibromid C^4 - N,N*-bis(tetradecyldimetyl)-l,6-hexóndiamóniumdibromidcis - n.n' -bis(pentadecyldimetyl)-l,6-hexándiamóniumdibromid^νΐΙΙ “ oktyldimetylamóniumjodid

Claims (1)

1. 4 CS 269 549 Bl PREOMET VYNALEZU Sp^eob zvýáenie efektivnosti přenosu ONA do bekteriálnej buňky* vyzna-čený tým, že eko účinné zložke spdeobujúca zvýáenie efektivnosti.přenosu DNAse využívají látky všeobecných vzorcov CH_ CH3 J N - CH-í 3 .X CH„ CH- CH„ i i * } - (CH2)n - * N CH3 . 2K (I) (II) kde R^ je uhlovodíkový re fez s počtom uhlikov 6 až. 20, priamy alebo rozvětve-ný, n má hodnotu 2 až 12, X znamená Cl, Br, I, ktoré sa přidávají k reakčnejzmesi pri navedeni stavu kompetencie u buniek v množstva 0,0001 až 0,5 mg/ml.