CS262555B1 - Způsob izolace imunoglobulinu afinitní chromatografii - Google Patents

Abstract

Řešeni se týká způsobu Izolace plazmatického lmunoglobulinu afinitní chromatografií na substituovaných porézních sférických celulózách s imobilizovaným ligandem histidinu, lysinu, reaktivní Sluti 13 (C.I. 18 990) nebo 2-(4-aminofenyl)sulfonylethylskupinami a produkty jejich diazotace a samovolné přeměny. Princip postupu, který je založen na nespecifické imunoafinitě vyznačených funkčních skupin k lmunoglobulinu, je založen na jeho sorpci, oddělení nezachycených bílkovin a následné desorpci koncentrovaným roztokem solí, s výhodou 3,5M chloridu hořečnatého nebo vápenatého. Pro zvýšení účinku se doporučuje přidáni 1,4-dioxanu, případně stabilizující složky, jako je octan sodný, glukóza nebo maltóza. Získaný eluát se zbaví nadbytečného množství solí dialýzou nebo diafiltrací. Uvedeným způsobem je možné připravit plně nativní elektroforeticky čistou imunoglobulinovou frakci třídy igG.

Description

Vynález se týká izolace imunoglobulinu třídy IgG metodou afinitnl chromatografie z roztoků obsahujících uvedenou imunoglobulinovou frakci ve směsi bílkovin, jako je krevní plazma, sérum nebo roztoky vzniklé jejich frakcionací.

Způsobů, vhodných pro izolaci imunoglobulinové frakce z krevní plazmy nebo séra, je známa celá řada. Tyto postupy jsou podrobně popsány v přehledných monografiích (Η. E. Schultze, J. F. Heretnans: Molecular biology of human proteins, Elsevier, Amsterodam 1966), (F. W. Putnám: The plasma proteins, vol III, Acad Press, New York (1977), (P. Allen, E. A. Hill,

A. M. Stokes: Plasma proteins, Blackwell Sci. Publ., Oxford 1977).. Pro izolaci imunoglobulinu z lidské krevní plazmy ve výrobním měřítku je nejčastěji využívána metoda etanolové frakcionace za chladu (Cohn a spolupracovníci: J. Amer. Chem. Soc 72, 465 (1950)). Všechny tyto postupy, které lze označit za klasické, mají poměrně nízký rozdělovači účinek a proto je třeba způsoby dělení vhodně kombinovat nebo opakovat, aby bylo dosaženo požadované čistoty konečného produktu. Jako vysoce účinná a výhodná z hlediska selektivity z pohledu zachování terciární struktury izolovaných bílkovin a jednoduchosti provedeni se osvědčuje metoda afinitní chromatografie. Metoda je založena na principu interakce vazebného ligandu imobilizovaného na pevném nosiči s příslušným místem na molekule izolovaného proteinu. Postup se například velmi osvědčuje při izolaci enzymů. O této poměrně nové metodě pojednává řada obsáhlých publikací (Ch. R. Lowe, P. D. G. Dean: Affinity Chromátography, ed. J. Wiley Ltd. London 1974) , (J. Turková: Affinity Chromátography, Elsevier Sci. Publ. Co. Amsterodam 1978), (S. P. Colovick, N. O. Kaplan, W. B. Jakoby: Methods in enzymology-Affinity Chromatography vol. 104,

Part. C, Acad. Press INC 1984). Specifitou uvedené metody je skutečnost, že každý příklad dělení vyžaduje vlastní specifickou volbu optimálních podmínek počínaje výběrem vhodného nosiče a příslušného vazebného ligandu a konče podmínkami sorpce a desorpce dělené látky. Zvláštní skupinou vazebných ligandů jsou imobilizovaná barviva (P. D. G. Dean. F. Qadri: Affinity Chromatography on imobilized dyes, Solid Phase Biochemistry, ed. W. H. Scouten,

J. Wiley 1983). Typickým příkladem jejich využití je izolace sérového albuminu na sorbentu s imobilizovanou reaktivní modří (Procion Blue H-B) (J. Saint-Blacard, J. M. Kirzin, P. Riberan, F. Petit: Affinity Chromatography and Related Techniques, ed. Elsevier 1985 str. 305), (K. Pommerening, D. Jobsky, M. Beneš, J. Stamberg: AO č. 237 620) , (M. Pokorný, M. Beneš,

M. Holinka, K. Pommerening, S. Ulrych: Cs. AO 257 930). Jiným příkladem je užití reaktivní žlutí HAC1 imobilizované na Sepharosu k izolaci imunoglobulinu (P. G. H. Bylield: Mol. Immunol. 21(7), 647 (1984)),.(G. Birkenmeier: FEBS Letters 174(1), 162 (1984)). Jiným příkladem kovalentně vázaného afinitního ligandu jsou některé aminokyseliny. Například k izolaci plazminogénu bylo užito Arginin-Sepharosy 4B (M. Wu, G. K. Azimura, A. A. Yunis: Biochemistry 16,

908 (1977) nebo Lysin-Sepharosy 4B (D. G. Deutsch: Science 170, 1 095 (1970)). O možnostech využití sorbentu s vázaným histidinem na matrici Sepharosy nebo porézního skla bylo hovořeno na mezinárodním Symposiu o bioafinitní chromatografií v Praze (L. Amourache. S. Kanoun,

S. Krishnan, M. A. Vijayalakshni: Abstracts of 6th International Symposium on Bioaffinity Chromatography, September 1985 Praha str. 149) . Zvláštním případem jsou postupy založené na principu imunoafinitnl chromatografie. Jako příklad může sloužit izolace imunoglobulinu se specificky zvýšeným obsahem antitetanických nebo antistafylokokových protilátek. (M. Pokorný, S. Ulrych, M. Beneš, M. Kyselová, N. Odehnalová, J. fienčová: AO č. 256 654).

Pro praktické využití jakéhokoli postupu afinitní chromatografie je třeba zvolit optimální podmínky v celém procesu dělení. Je to především volba vhodného pevného nosiče, vazebného ligandu, postupu při sorpci žádané látky, eluční médium a řada dalších podmínek, které umožní získání nativního, plně účinného produktu v požadované čistotě a při dostatečné výtěžnosti. teprve při souhře všech faktorů se v plné míře uplatní přednosti postupu afinitnl chromatografie. Metody afinitnl chromatografie lze využít i při izolaci imunoglobulinu ze směsi dalších bílkovin.

Tohoto principu využívá způsob izolace Imunoglobulinu třídy IgG z krevní plazmy, séra nebo roztoků obsahujících kromě imunoglobulinové frakce směs dalších bílkovin metodou afinitní chromatografie vyznačující se tlm, že porézní sférická celulóza obsahující kovalentně imobilizovaný histidln, lysin, reaktivní žluť 13 GGL nebo 2-(4-aminofenyl)sulfonyletyl skupiny nebo produkty jejich diazotace a samovolné přeměny se uvede do styku s roztokem směsi bílkoZ vin, nejlépe za chladu +4 °C, načež se oddělí roztok obsahující nezachycený podíl bílkovin, sorbent se promyje dostatečným množstvím roztoku o nízké iontové síle, která odpovídá koncentraci 0,1 až 0,01M roztoku chloridu sodného nebo 0,05M borátového pufru pH 8,0 až 8,5 a zachycený imunoglobulin se desorbuje pomocí 3,0 až 3,5M roztoku chloridu hořečnatého nebo vápenatého, který může dále obsahovat 0,1 až 0,2M octan sodný, 1 až 5 % maltózy nebo glukózy a 1 až 5 % 1,4-dioxanu, načež se takto získaný eluát obsahující imunoglobulin zbaví solí dialýzou nebo diafiltrací.

Uvedený způsob izolace imunoglobulinu je založen na principu nespecifické imunoafinity.

Při porovnávání s ostatními frakcionačním! postupy má přednosti, kterými se vyznačuje metoda afinitní chromatografie, to jest vysoká selektivita, spolehlivost, jednoduchost v provedení, energetická nenáročnost, nízká pracnost, maximální snížení rizika při práci s infekčním materiálem a možnost automatizace celého procesu. Podmínkou vSak zůstává dodržení postupu při provedení.

Využití sférické celulózy jako nosiče k imobilizaci histidinu, lysinu, reaktivní žlutí 13 GGL a 2-(4-aminofenyl)sulfonyletyl skupiny má výhodu oproti jiným podobným sorbentům v dobrých průtokových vlastnostech, stabilitě, nepatrné změně objemu při kolísání pH a iontové síly, v neškodnosti pro případ jejích využití pro přípravu léčebných preparátů a v jejich dostupnosti. Navrženým postupem lze získat imunoglobulinovou frakci o vysoké elektroforetické čistotě, která odpovídá třídě IgG. Lidský imunoglobulin připravený tímto způsobem je plně nativní bez agregovaných podílů a projevuje nízkou antikomplementární aktivitu. Sorbent je možné opakovaně regenerovat.

Příklad 1

Sloupcem 12x1 cm sférické celulózy s imobilizovaným histidinem (30 <umol/g) v prostředí 0,05M borátového pufru se nechá protékat rychlostí 10 ml za hodinu 11 ml lidské krevní plazmy při teplotě 4 °C. Sloupec se promyje 30 ml 0,2m roztokem chloridu sodného rychlostí 40 ml za hodinu, čímž se oddělí nezachycený podíl bílkovin. Desorpce se provede 30 ml 3,5M roztokem chloridu hořečnatého v 0,2M octanu sodném, do něhož bylo přidáno 5 % 1,4-dioxanu a 1 % glukózy. Eluce se dokončí promytím destilovanou vodou. Regenerace sorbentu se provede promýváním 0,05M louhem sodným v IM chloridu sodném, destilovanou vodou a stabilizací v 0,05M borátovém pufru pH 8,5. Eluát obsahující imunoglobulin se dialyzuje proti 0,2% chloridu sodnému, pokud roztok obsahuje hořečnatého ionty a dále se zahustí ultrafiltraci na požadovanou koncentraci bílkoviny. Takto bylo získáno 775 g bílkoviny, která odpovídala elektroforeticky 98,8 % imunoglobulinu třídy G (IgG).

Příklad 2

K 10 ml sférické celulózy s imobilizovaným lysinovým ligandem (30 ^umol/g) se přidá 30 ml 2% roztoku bílkovin, který vznikl při rozpuětění sraženiny frakce II-III etanolového frakcionačního postupu dle Cohna. Suspenze se míchá za chladu dvě hodiny. Poté se oddělí tekutina na skleněné fritě a sorbent se promyje roztokem 0,2H octanu sodného tak, aby byla oddělena nezachycená část bílkovin. Sorbent se převede do chromatografické kolony a navázaná bílkovina se desorbuje 3,5M roztokem chloridu vápenatého. Získaný eluát se dialyzuje tak dlouho, až neobsahuje vápenaté ionty. Nakonec se roztok usuší lyofilizaci. Takto bylo získáno 45 mg bílkoviny, která odpovídala elektroforeticky 96 % IgG.

Příklad 3

Sloupcem 40x1,5 cm sférické celulózy s navázanou reaktivní žlutí 13 GGL (C. I. 18 990) se nechá zvolna protékat při 20 °C 50 ml filtrovaného séra. Sloupec se promyje. 0,05M borátovým pufrem pH 8,5. Prvý podíl bílkovny se uvolní elucí pufrovaným fyziologickým roztokem pH 7,2. Zachycený imunoglobulin se desorbuje pomocí 40% roztoku chloridu hořečnatého. Eluce se dokonči promývánlm vodou. Získaný roztok obsahující imunoglobulinovou frakci se diafiltra262555 cl zbaví nadbytečného množství solí a usuší se lyofilizacl. Takto bylo získáno 575 mg bílkoviny, která odpovídala elektroforeticky 91 % IgG.

Příklad 4

Na sloupec 7,5x1 cm celulózy s imobilizovanýml 2-(4-aminofenyl) sulfonylethyl skupinami a produkty jejich diazotace a samovolné přeměny se aplikuje 10 ml krevní plazmy. Další postup dělení je stejný, jako je uvedeno v příkladech 1, 3, 4 nebo 5. Takto bylo získáno 40 mg bílkoviny, která odpovídala elektroforeticky 95 % IgG.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob izolace imunoglobulinu třídy IgG z krevní plazmy, séra nebo z roztoků obsahujících kromě imunoglobulinové frakce směs dalších bílkovin metodou afinitní chromatografie vyznačující se tím, že porézní sférická celulóza obsahující kovalentně lmobillzovaný histidin, lysin, reaktivní žlut 13 GGL nebo 2-(4-aminofenyl)sulfonyletyl skupiny nebo produkty jejich diazotace a samovolné přeměny se uvede do styku s roztokem směsi bílkovin s výhodou při teplotě +4 °C, načež se oddělí roztok obsahující nezachycený podíl bílkovin, sorbent se promyje roztokem o nízké iontové síle, která odpovídá koncentraci 0,1 až 0,01M roztoku chloridu sodného nebo 0,05M borátového pufru pH 8,0 až 8,5 a zachycený imunoglobulin se desorbuje pomocí 3,0 až 3,5M roztoku chloridu hořečnatého nebo vápenatého, který může dále obsahovat 0,1 až 0,2M octan sodný, 1 až 5 % maltózy nebo glukózy a 1 až 5 % 1,4-dioxanu, načež se takto získaný eluát obsahující imunoglobulin zbaví solí dialýzou nebo diafiltrací.