CS260663B1 - Analytický prostředek ke stanovení diagnosticky významných součástí tělních kapalin - Google Patents

Abstract

Analytický prostředek ke stanovení součástí tělních kapalin, zejména krve, sestává z nasákavého nosiče, obsahujícího všechna činidla potřebná k provedení analýzy, je opatřen semipermeabilní membránou vytvořenou ze směsi bydrofilního, ve, vodě rozpustného hydroxyalkyléteru celulózy a hydrofobní, ve vodě nerozpustné, polymerní látky ze skupiny éteru nebo esterů nebo ačetalů golyvinylalkoholu. Tentoanalytický prostředek umožňuje rychlé a účinné stanovení jednotlivých součástí krevního séra bez nutnosti pracného a zdlouhavého oddělování séra od krevních elementů.

Description

Předmětem vynálezu je analytický prostředek ke stanovení diagnosticky významných součástí tělních kapalin, zejména krve, sestávající z nasákavého nosiče, obsahujícího všechna činidla potřebná k provedení analysy a opatřený semipexmeabilní membránou k oddělení krevních elementů, vytvořená ze směsi hydrofilního, ve vodě rozpustného hydroxy alky léteru celulosy a hydrofobní, ve vodě nerozpustné polymerní látky ze skupiny éteru nebo esteru celulosy a/nebo esteru nebo acetatů polyvinylalkoholu· Tento analytický prostředek umožňuje rychlé a účinné stanovení stanovení jednotlivých součástí krevního séra bez nutnosti pracného a zdlouhavého oddělování séra od krevních elementů·

K vyšetřování tělních kapalin, jako krve, moče nebo liquoru, se po desetiletí používají složité laboratorní metody, založené na přídavku přesného množství vzorku vyšetřoyané kapaliny k roztoku činidel s následným spektrofotometrickým vyhodnocením proběhlé - většinou barevné - reakce· Při vyšetřování krve je pak tento již sám o sobě zdlouhavý proces ještě dále komplikován o nutnost oddělení krevních elementů od séra buů odstředěním, nebo tak zvaným odbílkováním· Tyto metody jsou tudíž proveditelné pouze v dokonale vybavené klinickobiochemické laboratoři·

260 663

K odstranění tohoto nedostatku byly v poslední době vyvinuty specielní reagenční proužky, u nichž všechna' činidla potřebná k průběhu vlastní specifické analytické reakce jsou obsažena v pevném stavu ve vhodném nasákavém nosiči, jako na příklad filtračním papíru, rouna ze syntetických vláken nebo i porézního polymeraího filmu· S použitím těchto proužků se celý postup vyšetření zjednodušil na nanesení vyšetřované kapaliny na proužek nebo namočení proužku do vyšetřované kapaliny a visuelní nebo reflektometrické vyhodnocení proběhlé specifické barevné reakce· Obecné použití však našly tyto proužky prozatím pouze při vyšetřování moče $ jejich širšímu rozšíření pro vyšetřování krve brání stále mimo jiné okolnost, že lze pomocí nich vyšetřovat pouze sérum,takže vlastnímu vyšetření musí předcházet opět oddělení krevních elementů odstředěním· Tyto proužky mohou být tudíž použity opět jen v laboratoři a nikoliv i na příklad přímo u lůžka pacienta nebo dokonce pacientem samotným·

Byly ovšem vyvinuty i proužky, dovolující přímé vyšetření plné krve* U těchto proužků je nasákavý nosič s činidly ©vrstven semipermeabilní membránou, která po nanesení kapky krve zadrží na svém povrchu krevní elementy a propustí k činidlům, obsaženým v nasákavém nosiči pouze sérum případně plazmu· Krevní elementy zadržené na takto upraveném povrchu proužku se odstraní opláchnutím nebo setřením a po určité době se provede visuální nebo reflektometrické vyhodnocení zbarvení indikační plošky proužku, jehož Intensita je úměrná obsahu stanovované součásti krevního séra·

Společným nedostatkem všech těchto proužků pro vyšetřování krve jsou však opět nevyhovující vlastnosti dosud používaných semipermeabilní ch membrán· Tyto membrány, vytvořené nanesením ve vodě nerozpustných a silně hydrofohních esterů nebo eterů celulosy, jako na příklad ethyleelulosy, nitrocelulosy nebo acetátu celulosy, nebo pouze hydrofobizaví povrchu nosiče pomocí tuků, olejů, parafínu, silikonu nebo vosků brání dík svým silně hydrofobním vlastnostem rychlému a stejnoměrnému p-r»nrHkmití séra do nasákavého nosiče, oož má za ná260 063

- 3 sledek nejen poměrně dlouhou dobu celého stanovení, ale zejména nehomogenitu, vzniklého vybarvení plošky proužku vedoucí ke značné nepřesnosti výsledků, pohybuj ící se až v rozmezí + 40% relate Jisté zlepšení v tomto směru přenesl sice vynález který popisuje použití semipermeabil ní membrány složené z relativně hydrofilního methylpolymetakrylátu a hydrofobního polyvinylformalu, avšak ani toto řešení všechny uvedené nedostatky neodstranuje·

Nyní bylo zjištěno, že ke zcela dokonalému oddělení krevních elementů od séra a jeho rychlému a naprosto stejnoměrnému proniknutí k reakčnímu systému v nasákavém nosiči umožňuje semipermeabilní membrána, vytvořená ze směsi hydrofilních a hydrofobních látek, při čemž však hydrofilní složka musí být navíc i rozpustná ve vodě. Předmětem vynálezu je tedy analytický prostředek ke stanovení diagnosticky významných součástí tělních kapalin, zejména krve, sestávající z nasákavého nosiče obsahujícího všechna činidla potřebná k provedení analysy, vyznačený tím, že je opatřen semipermeabilní membránou vytvořenou ze směsi hydrofilního, ve vodě rozpustného hydroxyalkyléteru celulosy, jako na příklad hydroxymetyl-, hydroxypropyl- nebo metylhydroxypropylcelulosy, a hydrofobní, ve vodě nerozpustné polymerní látky ze skupiny éterů nebo esterů celulosy, jako na příklad metyl-, ethyl- nebo nitrocelulosy, a/nebo esterů nebo acetalů polyvinylalkoholu, jako na příklad polyvinylacetátu, polyvinylpropionátu, polyvinylformalu nebo polyvinylbutyralu Semipermeabilní membrána o tomto složení vyniká proti všem dosud známým řešením výbornými filtračními vlastnostmi, oož se projevuje nejen neobyčejně rychlým a naprosto stejnoměrným proniknutím séra do. nosiče, ale i snadností, s jakou je možné krevní elementy s jejího povrohu odstranit opláchnutím nebo prostě jen setřením. Vedle toho však tato membrána nemusí být nanášena pouze na povrch nosiče, ale nosič jí může být prosycen v celé své hmotě; dík tomu je nosič chráněn proti proniknutí krevních elementů i na plochách, vzniklých rozříznutím větší plochy nosiče, takže i na těchto plochách proniká do nosiče pouze sérum, případně plasma, čímž nemůže dojít k nerovnoměrnosti vzniklého vybarvení na okrajích indikační plošky, které je typické pro všechny dosud známé prostředky a které je také v literatuře obecně popisová- 4 260 663 no jako nežádoucí tzv. okrajový efekt (”edge effect’’)· Semipermeabilní membrána tvořící integrální součást prostředku dle tohoto vynálezu a sestávající ze směsi hydrofilních ve vodě rozpustných derivátů celulosy a hydrofobních, ve vodě nerozpustných polymerních látek, má yšak vedle těchto výborných filtračních vlastností i řadu dalších předností proti dosud užívaným membránám, vytvořeným výlučně ze složek nerozpustných ve vodě. Je to v prvé řadě její výrazný stabilizačítííúčinek na reakční systém prostředku· Mechanismus tohoto účinku není zcela jasný, skutečností však zůstává, že tato membrána nejen značně prodlužuje stabilitu prostředku během jeho skladování za normálních podmínek, tj· v hermeticky uzavřeném obalu se sušidlem, ale snižuje značně jeho citlivost vůči rozkladnému působení vzdušné vlhkosti, který se u dosavad nich prostředků projevuje na příklad při nedokonalém uzavření obalu nebo při jeho opětovném otevírání při provádění analys·

Vedle toho má však membrána i značný positivní vliv na jakost vybarvení indikační plošky analytického prostředku po proběhlé reakci se stanovovanou součástí tělní kapaliny·

Tento vliv se projevuje ve vzniku čistějšího a brilantnějšího zbarvení, což umožňuje jednoznačnější a přesnější kvantitativní vyhodnocení výsledku vyšetření jak při objektivním reflekto metrickém stanovení, tak ale zejména při visuelním srovnávání zbarvení prostředku s barevnou, zkusmo zhotovenou srovnávací stupnicí* , Analytický prostředek dle tohoto vynálezu může být použit pro vyšetření a stanovení všech klinicky důležitých součástí krve, jako na příklad stanovení glukosy, močoviny, kys.močové nebo bilirubinu. Dík svému obecně stabilizačnímu účinku na reakční systémy analytických prostředků z oboru dg.proužků však může být membrána dle vynálezu s výhodou použita i na prostředcích pro vyšetření takových tělních kapalin, jako jsou moč nebo liquor, u nichž není nutné odstraňovat pomocí membrány rušivé složky, jako jsou krevní elementy při vyšetření plné krve.U všech těchto prostředků je reakční systém, tj. soubor činidel a chemikálií, potřebných k vlastnímu analytickému stanovení příslušné diagnosticky významné součásti tělní kapaliny

- 5 260 663 o sobě známý a již dlouhou dobu pro tento účel obecně používán· Nej významnější a svým složením a vlastnostmi zcela nový prvek analytického prostředku dle vynálezu tvoří tudíž semipermeabilní membrána, určená k oddělení krevních elementů, popřípadě ke stabilizaci reakčního systému analytického prostředku* Žádoucí vlastnosti této semlpermeabilní membrány jsou pak dány jak jejím základním složením definovaným výše, tak 1 vzájemným poměrem jednotlivých jejích složek a způsobem nanesení na nasákavý nosič*

Jak vyplývá z výše uvedeného popisu semlpermeabilní membrá ny₉ jsou její výborné funkční a stabilizační vlastnosti dány kombinací hydroflíního, ve vodě rozpustného derivátu celulosy s hydrofobní, ve vodě nerozpustnou polymerní látkou^říp* směsí dvou nebo více těchto látek, ze skupiny esterů nebo éterů celulosy a/nebo esterů nebo aoetalů polyvinylalkoholu*Při tom hmotový poměr hydrofilní, ve vodě rozpustné a hydrofobní, ve vodě nerozpustné složky membrány se dle žádaných vlastností může měnit v poměrně širokých mezích od 5:1 po 1:5· Obecně se však nej lepších vlastností membrány s ohledem na její filtrační i stabilizační* schopnosti dosáhne při poměru obou složek okolo 1:1 až 1:1,5* Dále je výhodné, 1 když nikoliv bezpodmínečně nutné, aby hydrofobní, ve vodě nerozpustná složka sestávala ze dvou rozdílných látek, tj* vhodného éteru nebo esteru celulosy a esteru nebo acetalu polyvinylalkoholu* Hmotový poměr těchto dvou hydrofobních, ve vodě nerozpustilých složek může opět ležet v poměrně Širokých mezích od 10:1 do 1:10, výhodné je však volit poměr 1:1,5* Sumárně lze tudíž ve většině případů považovat za nej výhodnější semlpermeabilní membránu, vytvořenou z 2 hmotových dílů hydrofilní, ve vodě rozpustné modifikované celulosy, 1 hmotového dílu hydrof obního ve vodě nerozpustného éteru nebo esteru celulosy a 1,5 hmotového dílu esteru nebo acetalu polyvinylalkoholu*

Jak bylo uvedeno výše, jsou vlastnosti membrány dány - vedle již uvedeného poměru jejich jednotlivých složek - i způsobem nanesení ňa nasákavý noqič* Zásadně je možné membránu nanést na nosič z vhodného nevodného těkavého rozpouštědla, jako metanolu, etanolu, propanolu, dichlormetanu, chlorofomrau, triohlorétanu, benzenu nebo toluenu* Jako nejvýhodnější se však

260 663 ukázalo nanášení membrány ze směsi nevodných rozpouštědel, sestávající z nižšího alifatického alkoholu, jako metanolu a/nebo etanolu, nižšího halogenovaného alkanu jako dichlormetanu, chloroformu nebo trichloratanu a benzenu nebo toluenu.

Poměr jednotlivých složek těchto rozpouštědel v uvedené směsi není kritický a může být víceméně libovolně měněn.

Obvykle se membrána nanáší na nosič jako poslední impregnace, tj. po nanešení všech činidel a látek, potřebných pro průběh vlastní analytické reakce. Je však možné - a v některých případech djvýhodné - některé z těchto analytických činidel přidat do roztoku pro vytvoření membrány. Tyto možnosti spolu s obecným způsobem přípravy prostředku dle vynálezu osvětlují blíže některé typické příklady uvedené níže.

Proužky pro stanovení glukosy v krvi

1)
Impregnační roztok 1
Etanol	24,0 ml
Aceton	42,0 ml
Metanol	16,0 ml
voda dest*	16,0 ml
3,315,5-Tetramethylbenzidin	0,72 g
Dioktylsulfo jantaran sodný	o,ia g
Polyvinylpyrrolidon K 90	1 ,20 g
Impregnační roztok II
Glukosooxidasa, 28 U/mg	0,24 g
Peroxidasa, 100 U/mg	0,10 g
Citrátový tlumič, pH«5,3	20 ,0 ml
Polyvinylpyrrolidon K 90	t»0 g
laurylsulfát sodný	0,04 g
Želatina, 1,5%-ní vodný roztok	20,0 ml
Voda dest.	26,0 ml
Metanol	12,0 ml

Impregnační roztok III

Hydroxypropylce lulosa,

5,3%-ní roztok ve směsi triehloretan-^netanol 2:1 Nitrocelulosa, 6,8%-ní roztok v toluenu Polyvinylacetát, 2,9%-ní roztok v etanolu

260 663

43,0 ml 28,0 ml 28,0 ml

Jednotlivé impregnační roztoky se připraví rozpuštěním, případ ně smícháním jednotlivých složek v uvedeném pořadí a nanesou tak, aby papír byl impregnačním roztokem právě nasycen·

Po každé impregnaci se papír důkladně vysuší proudem horkého vzduchu· Usušený, krémově bílý papír se poté rozřeže na čtvečky 6x6 mm a nalepí se - na příklad pomocí oboustranné samolepí cí pásky - na konec bílého plastikového proužku o rozměrech 6x80 mm· Jestliže se na takto připravenou indikační plošku nanese kapka kapilární krve, je možné po 3θ β s povrchu proužku krevní elementy odstranit na příklad opláchnutím vodou nebo otřetím navlhčenou buničitou vatou, a vyhodnotit Čistě modré zbarvení plošky, jehož intenzita je úměrná obsahu glukosy ve vyšetřované krvi, na příklad visuelně porovnáním se zkusmo zhotovenou barevnou srovnávací stupnicí. Tyto proužky indikují koncentraci glukosy v krvi v rozmezí od 1 do 8 mmol/1 a jsou tudíž vhodné pro stanovení silnějších hypoglykémií přes normální hodnoty až do slabě zvýšených hyperglykemií.

2) Proužky pro stanovení glukosy v krvi

Impregnační roztok I

Dihydrogenfosforečnan sodný 0;08 g

Hydrogenfosforečnan sodný (12 HgO) 1,33 g

Kyselina ethylendiaminotetraoctová,čtyřsodná sůl 2,28 g

Voda dest· 57,0 ml

Želatina, 1,5%-ní vodný roztok 38,0 ml

Glukosooxidasa, 28 U/mg 3,04 g

Peroxidasa, 100 U/mg, 1,8-ní vodný roztok 5,7 ml

- 8 Metanol 68,0 ml

Voda dest. 24,0 ml

1-(4-sulfof enyl )-3-methyl-5-pyrazo Ion 2,16 g

4-aminoantipyrin 0,63 g

Dioktylsulfojantaran sodný,

2%ní roztok v etanolu 50,0 ml Tartrazin, 1%-ní roztok vodný 4,8 ml

260 663

Impregnační roztok II

Impregnační roztok III

Methylhydroxyme thylc elulosa,

3%-ní roztok ve směsi metanol-dichlormetan 1:1 20,0 ml

Ethylcelulosa, 4%-ní roztok v toluenu 15,0 ml

Polyvinylbutýral B 20 H, 5%-ní roztok 17,5 ml v etanolu

Všechny impregnační roztoky se nanesou na papír o plošné o hmotnosti 180 g/m způsobem, popsaným v příkladu 1 , dle ktereho se také provede další zpracování naimpregnovaného papíru na proužku· Po nanesení kapky kapilární krve na jejich indikační plošku je možné po 30 s s povrchu indikační plošky krevní elementy odstranit a po dalších 30 - 60 s vyhodnotit-na příklad srovnáním se zkusmo zhotovenou barevnou srovnávací stupnicí - intensitu vzniklého, čistě červeného zbarvení, která je přímo úměrná koncentraci glukosy v krvi v rozmezí cca 4 -45 mmol/l. Proužky jsou tedy vhodné pro stanovení glukosy u jedinců s mírně sníženým obsahem glukosy v krvi až po vysoce patologické hyperglykemie, které se vyskytují např· při těžkém,· nekompensováném diabetů·

260 663

- 9 3) Proužky pro stanovení celkového bilirubinu v krvi

Impregnační roztok I

2,4 - Diohlorbenzendiazonium-	0,6 g
t etrafluoroborát
Dyphýllin	10,8 g
Kyselina metafosfořečná	3,7 g
Kyselina šlayelová	4,2 g
laurylsulfát sodný	0,3 g
Polyvinylpyrrolidon K 90,	4,7 g
Eoda dest·	100,0 ml
Impregnační roztok II
Hydroxyethylcelulosa,4 * 4%-ní	35,0 ml
roztok ve směsi etanol-chloroform 1,3»1
EtMylcelulosa, 5,7%-ní roztok roztok	35,0 ml

v benzenu

Analytický prostředek se připraví postupným nanesením o obou impregnačních roztoků na papír 180 g/m a dalším zpracováním naimpregnovaného a usušeného papíru postupem uvedeným v příkladě 1)· Získané proužky, sloužící ke stanovení bilirubinu v krvi, se použijí tak, že se na indikační plošku nanese 20^1 krve a po 30 s se s povrchu indikační plošky odstraní krevní elementy otřením navlhčenou buničitou vatou· Po dalších 9Qfse vzniklé červenoflalové zbarvení indi kační plošky vyhodnotí opět buž visuělhě porovnáním s barevnou, zkusmo zhotovenou stupnicí, nebo změřením ref lek tance pomocí vhodného reflexního fotometru· Závislost mezi naměřenými hodnotami reflexní density a koncentrací bilirubinu v krvi udává přiložený graf· č· 1·

- 10 260 663

4) Proužky pro stanovení močoviny v krvi

Impregnační roztok I

Methylhydroxymethylcelulosa,

4%-ní vodný roztok 30,6 ml

Citrátový tlumič 0,3 mol, pH«5,2 20,4 ml

Cetylpyridiniumbromid 0,255 g

Glycin 0,082 g

2,3 - Dithioerythritol 0,086 g

Ureasa, 2800 U/g 0,50 g

Impregnační roztok II Methylhydroxymethylcelulosa,

3%-ní roztok ve směsi metáno1-dichlormetan 1:1 20 ml

Ethyleelulosa, 2%-ní roztok v toluenu 15 ml

Polyvinylbutýral B 20 H, 2,5%-ní roztok v etanolu 17,5 ml Bromthymolová modř 0,026 g

Impregnační roztoky se připraví postupným smí chánínij příp.

rozpuštěním jednotlivých složek ve výše uvedeném pořadí a nao nesou se na papír 180 g/m způsobem popsaným v příkladě č.1 · Impregnační roztok II se však nanese dvakrát.

Po nanesení kapky kapilární nebo venosní krve na proužek a odstranění erythrocytů 30 s po nanesení je možné visuelně poměrně přesně vyhodnotit vzniklé modré zbarvení, jehož odstín a Intensita je úměrná množství močoviny ve vyšetřované krvi v koncentračním rozmezí 1,5 - 40 mmol/1.

5) Proužky pro stanovení glukosy v moči

Impregnační roztok I

Citrátový tlumič, pHs5,23 34,0 ml

Želatina, 1,5%-ní vodný roztok 18,0 ml

Glukosooxidasa (22 U/g) 0,99 g

Peroxidasa (95 U/mg), 1,18%-ní vodný roztok 2,545 ml

- 11 260 003

Impregnační roztok II

Metanol 40,0 ml

1-fenyl-3-metyl-5-pyrazolon 2,14 g

4-aminoantipyrin 0,94 g

Voda dest· 30,0 ml

Polyvinylpyrrolidon K 90, 74,0 ml

5%-ní vodný roztok

Laury1sulfát sodný 0,6 g o-Dianisidin 0,92 g

Tartrazin, 1%-ní vodný roztok 3,6 ml

Impregnační roztok III

Složení dle příkladu 2), avšak zředěný etanolem v poměru 1:9·

Tyto proužky slouží ke stanovení glukosy v moči, kterou detekují vznikem červeného až temně hnědého zbarvení v rozmezí koncentrací 0,35 - 30 g/1· Proti proužkům stejného složení, avšak bez III. impregnace, tj. bez semipermeabilní membrány, vykazují při stejné reaktivitě vůči glukose podstatně zvýšenou stabilitu vůči vzdušné vlhkosti·

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLETU

   Analytický prostředek ke stanovení diagnostiky významných součástí tělních kapalin, zejména krve, sestávající z nasákavého nosiče, obsahujícího všechna činidla potřebná k provedení analysy, vyznačený tím, že je opatřen semipermeabilní membránou vytvořenou ze směsi hydrofilního, ve vodě rozpustného hydrozyalkyléteru celulosy, jako na příklad hydroxymethyl-, hydroxypropyl nebo methylhydroxypropylcelulosy a hydrofobní,ve vodě nerozpuBtné polymerní látky ze skupiny éterů nebo esterů celuloSy, jako na příklad methyl-,ethylnebo nitrocelulosy a/nebo esterů nebo acetalů polyvinylalkoholu, jako na příklad polyvinylacetátu, polyvinylpropionátu, polyvinylformalu nebo polyvinylbutyralu .

   Cena: 2,40 Kčs

   Vytiskly Moravské tiskařské závody, střed. 11 100, tř.Lidových milicí 3, Olomouc