CS259288B1 - Method of baker's yeast complex fractionation - Google Patents

Description

250203

Vynález sa týká sposobu komplexně] frak-cionácie pekařského droždia.

Biůmasa kvasiniek, teda aj pekařskéhodroždia, je zdrojom mnoha cenných látok,ktoré holi doteraz izolované vačšinou jed-notlivo, pričom po ich izolácii bola zostá-vajúca časť obsahu kvasničných buniek ne-využitá.

Bielkoviny sa získavajú z kvasiniek naj-častejšie alkalickou extrakciou, resp. růz-nými modifikáciami tejto metody po dezin-tegrácii buniek (Gooney, C. L., Rha, C., Tan-nenbaum, S. R., Adv. Food, Res. 26, 1—52,1980 j. Hlavnou překážkou použitia takých-to mikrobiálnych bielkovín v 1'udskej výži-vě je vysoký obsah nukleových kyselin. E-xistuje niekoíko sposobov, ktoré umožňuji!znížiť obsah nukleových kyselin v biomasekvasiniek a tým aj v izolovanom bielkovino-vom produkte. Medzi najznámejšie patří zní-ženie obsahu nukleových kyselin v kvasin-kách iniciované vhodným zložením kultivač-ného média (Rut, M., Štros, F., Hladeček, P.,Kvasný průmysl '24, 58—66; Čs. vynález č.188 575), pflsobenie chemických činidel naintaktné buňky (Damodaran, S., Kinsella, J.E., Biotechnol. Bioeng. 25, 761—770, 1983;Patenty USA č. 3 615 654 a č. 3 775 393), po-užiti e tepelného šoku (Deimann, W.,. Fabri-ni H. D., J. Exptl. Med., 23, 883—897, 1979;Patent USA č. 2 081 172), enzymatické štie-penie nukleových kyselin nukleázami endo-génneho i exogénneho původu (Rottová, D.,Fencl, Z., Průmysl potravin, 30, 531—3. 1979;Patent USA č. 3 867 255).

Ergosterol i celkové steroly sa najčastej-šie izolujú metodou, ktorá před extrakcioudo organického rozpúšfadla zahrňuje krokzmydelnenia. Nezmydelnitelhý podiel stero-lov sa získá extrakciou nepolárným rozpúš-ťadlom, najčastejšie sa používá hexán, ace-ton, připadne extrakčný benzén (Čs. vyná-lez č. 189 440).

Invertáza je jedným z priemyselne naj-používanejších enzýmov. Tradičnou metodouna uvolhenie kvasničnej invertázy z buňkyje auíolýza indukovaná zvýšenou teplotou,alebo chemickým spósobom. Na izoláciu savyužívá predovšetkým precipitácia organic-kými rozpúšťadlami, najčastejšie etanolom,polyetylénglykolom, dietyléterom (Neumann,P., Lampen, J. O., Biochemistry 6, 468—75,1967; Bacon, S., Methods Enzymol. 1, 251až 262, 1955; čs. vynález č. 101971).

Polysacharidy kvasničných buňkovýchstien sa najčastejšie izolujú parciálnou al-kalickou hydrolýzou, napr. glukany a ma-nany (Manners, D. J., Masson, A. J., Patter-son, J. C., J. Gen. Microbiol. 80, 411—417,1974), alebo sa buňková stená kvasiniek en-zymaticky naruší trypsínom, nerozpustnépolysacharidy sa zbavia rozpuštěných gly-cidov a produktov odbúrania bielkovín vypie-raním (Pillemer, L., Blum, L., Lepow, I. H.,Wurz, L·., Told, E. W., J. Exptl. Med. 103, 1až 13, 1956). Týmto postupom je možnézáskavať z kvasiniek zymozán (zmes gluka- nov a mananov), čo je preparát s imuno-chemickými vlastnosťami. Postup přípravychrání čs AO 185 063).

Nevýhodu týchto postupov je neefektívnevyužitle východiskové] suroviny. Túto ne-výhodu odstraňuje sposob pódia vynálezu,kterého podstata spočívá v tom, že superna-tant kvasničného autolyzátu sa vyzráža eta-nolom pri teplote 2 až 5 JC v objemovornpomere 0,9 až 2 : 1, zostatok sa po odstrá-není etanolu vysuší, zo sedimentu autoly-zátu sa vyextrahuje lipidická frakcia 20-ná-sobným nadbytkom extrakčnej zroesi etanol--hexán v objemovorn pomere 1 : 2, ktorá saďalej frakcionuje 5-násobným nadbytkomacetonu, pričom acetonový extrakt sa pozmydelnení 15 %-ným roztokem hydroxidudraselného počas 1 h pri 80 :C, ďalej extra-huje hexánom, zahustí a po přidaní acetonuna výslední! koncentráciu 33 % hmot. v he-xane krystalizuje pri teplote —5 C, pričomdelipidizovaný zvyšok, ktorý zostal po ex-tra kcii lipidov zo sedimentu autolyzátu sapo zriedení vodou na 8 až 10 %-nú suspen-ziu vysuší. Kvasničný autolyzát sa rozdělína supernatant hlavně bielkoviny a sedimentzahrňujúci neropustné polysacharidy, frak-em lipidov, zvyšky bielkovín a nukleovýchkyselin, ktoré v priebehu autolýzy zostaliviazané na buňkové steny. Supernatant safínalizuje sušením v rozprašovače] sušiarníako bielkovinový koncentrát s vysokým ob-sahom surověj bielkoviny alebo táto frakciaslúži na iprecipitaáciu preparátu invertázyorganickým rozpúšťadlom, popřípadě k zís-kanému supernatantu najskór za zníženejteploty přidáme vhodný objemový poměr or-ganického rozpúšťadla, vzniknutý precipitátinvertázy oddělíme centrifugáciou a fungátvysušíme ako proteinový koncentrát. Kom-pletná sedimentná frakcia sa po vhodnomriedení vodou vysuší v rozprašovacej sušiar-ni ako biosorbent pre vinárstvo alebo sa zosedimentu kvantitativné extrahuje lipidickáfrakcia zmesou organických rozpúšťadiel.Odseparovaním nerozpustného pedielu poextrakcii sa získajú delipidizované buňko-vé steny, vhodné pre izoláciu imunoaktív-nych glukanov. Z lipidického extraktu saodpaří rozpúšťadlo, odparek sa premývanadbytkom acetonu, pričom do roztoku pře-jdu najma nepoláme lipidy. Po extrakcii zo-stane v acetone nerozpustná frakcia polár-ných lipidov, ktorá je vhodná ako emulgá-tor, například pre přípravu instantnéhodroždia. Koncentrát sterolov možno získatn-hexánovou extrakciou nezmydelnitefnéhopodielu z celkového lipidického extraktu se-dimentnej frakcie. Je vhodný pre výrobu vi-tamínu Dz. Výhodou komplexnej frakclonácie podl'avynáleu je teda selektívne využitie pekár-skeho droždia. Ďalšou výhodou uvedenéhosposobu je, že celý proces je bezodpadovoutechnológiou, ktorá je nenáročná na mate-riálové a technické zabezpečenie. Princip komplexnosti vedie k určitým kompromisomv postupoch v porovnaní so sólo izolácioujednotlivých zložiek, no napriek tomu výtaž-ky a kvalita jednotlivých produktov sú do-statečné uspokojivé. Sposob komplexnejfrakcionácie podlá vynálezu možno cielenemodifikoval pódia toho, ktoré produkty sto-ja v centre zaujmu, najma změnou iniciač-ných faktorov autolýzy, ovplyvňovaním jejpriebehu, respektive změnami procesu izolá-cic a finaližácie produktov. Z jednej vsádzky pekárskeho droždiamožno získat bielkovinový koncentrát preludskú výživu obsahujúci 40—80 % proteí-nov, hrubý preparát invertázy s aktivitou6—23 ukat/g .sušiny vhodný pre cukrovinár-ske aplikácie, ergosterol s 80 %-nou čistotupre farmaceutická výrobu vitaminu Da, frak-cia obsahuje 30 % fosfolipidov, vvužitstnáako emulgátor na přípravu instantného droz-da, a produkt obsahujúci 70 % polysacha-ridov, z ktorého možno· získat imunoaktívineglukany, manany pre chemické aplikácie,resp. hydrolyzát pri biotechnologické živnémédia. Příklad 1

Dezintegrácia 2 550 ml 10 %-nej suspen-zie kvasničných buniek pekárskeho droždiasa iniciuje prídavkom 425 ml čerstvéhokvasničného autolyzátu, 26 g NaCl a 128 getanolu. Autolýza prebieha za stálého mieša-nia pri 50 °C a ukončí sa po 5 hodinách.Autolyzát, ktorý obsahuje 153 g surověj biel-koviny, sa okamžité vysuší, alebo scentrifu-guje, čím sa získá 2 400 ml supernatantu,pričom do supernatantu sa uvoTní 38 % pro-teínov z celkového obsahu proteínov v kvas-ničných buňkách. V sedimente sa oproti ín-taktným buňkách zachová nezmenená hla-dina lipidov a polysacharidov. la) Supernatant sa vysuší v rozprašova-če] sušiarni, čím sa získá produkt konzisten-cie, bieložltej farby, s koncentráciou proteí-nov 67 % hmot., alebo lb) K supernatantu sa přidá 0,9 naž 2-ná-sobný objem 96 % etanolu, pričom etanoli supernatant sú ochladené na teploau 4 CC.Získá sa tak 4,5 g precipitátu s aktivitouinvertázy 9 ukat na gram sušiny. Preparátinvertázy je vhodný na použitie v potravi-nárstve, alebo lcj postup rovnaký ako v příklade lb, a-však po oddělení precipitátu invertázy cen-trifugáciou sa fugát vysuší v rozprašovače]sušiarni na proteinový koncentrát. ld) Sediment sa riedi vodou a vysuší sa vrozprašovacej sušiarni. Získaný produkt mávýhodné adsorpčné vlastnosti, porovnatel-né s komerčnými preparátmi zahraničnýchfiriem používaných ako biosorbenty vo vi-nárstve na stimuláciu kvasenia hroznovýchmušktov, alebo le) sediment sa zmydelňuje 3-násoobnýmhmotnostným množstvom etanolického roz-toku KOH (1 mol/1) 3 hodiny pod spatným chladičom. Po ukončení alkalickej hydro-lýzy a ochladení obsahu sa přidá destilovanávoda v množstvo zodpovedajúcom 1/3 cel-kového objemu hydrolyzovaného sedimentu.Zmes sa premieša a extrahuj 3-krát n-he-xánom v objemovom pomere 1 : 1. I-íexánovéextrakty sa spoja, rozpňstadlo sa odpaří asterolový koncentrát prefúka prúdom inert-néhO' plynu. Uvedeným postupom mož-no získat až 80 % celkových kvasničnýchsterolov 50 %-nej čistoty. Preparát je možnévyužit .priamo v polnohospodárstve na de-ratizačně účely, alebo po ďalšej purifikáciia konverzii na vitamín D2 vo farmácii.

If j Zo sedimentu sa extrahujú lipidy 20-ná-sobným nadbytkom extrakčnej zraesi etanol--hexán v, objemovom pomere 1 : 2. Extraktsa zahustí a k němu sa přidá. 500 ml ace-tónu. Koncentrovaný acetonový extrakt sazmydelní 200 ml 15 %-nsho metanolickéboKOH ipcčas 1 hodiny pri CO CC a nezmydel-nitefný podiel sa extrahuje bexánom. He-xánový extrakt sa odpaří na konečný ob-jem 100 ml. K tomuto objemu sa přidá ace-ton a roztok sa ochladí na —5 CG. Týmto po-stupem sa získá 3,26 g preparátu vo for-mě bieložltých ihličiek, ktorý obsahuje 1,99 gsterolov, čo představuje 69,8 % z obsahusterolov v intaktnom droždí. Získaná ste-rolová frakcia sa dá použit na přípravu vi-tamínu Dz pre farmaceutické aplikácie, ale-bo

Igj lipidická frakcia sa extrahuje zo sedi-mentu 20-násobným nadbytkom extrakčnejzmesi etanol-hexán v objemoovom pomere1 : 2. Rozpúšťadlo sa odpaří. Odparok saextrahuje 4—5-krát 5-násobrtým nadbytkomacetonu. Po extrakcii zosíáva v acetone ne-rozpustná frakcia polárných lipidov (cca 3,5 g), ktorá obsahuje 30 % fosfolipidov.Táto frakcia može byť využitá pri přípravěinstantného droždia. Acetonové extrakty saspoja, pričom postup ďalšieho spracovaniaje analogický ako v příklade le. lh) Delipidizované buňkové steny, ktorésa získajú extrakciou lipídickej frakciepodlá postupov If a lg sa odíiltrujú, zho-mogenizujú a po nariadení vodou sa vysušiav rozprašovacej sušiarni. Získá sa tak velmijemný práškovitý produkt, ktorý obsahuje68—73 % polysacharidov, vhodný pre izo-láciu čistých glukanov pre imunofarmakolo-glcké účely. Příklad 2

Postup rovnaký ako v příklade 1, auto-lýza sa ukončí po 24 hodinách. V priebehuautolýzy sa do supernatantu uvolní viac ako87 % z celkového obsahu proteínov v kvas-ničných buňkách. 2a) Postup rovnaký ako v příklade la,bielkovinový produkt obsahuje 76 % bielko-vín. 2b) Postup rovnaký ako v příklade lb, precipitátu sa však získá. 15 g, čo je vlastně

Claims (1)

1. 259288 7 preparát invertázy s aktivitou 6,8 ukat nagram sušiny. Příklad 3 Postup rovnaký ako v příklade 1, použijesa však objem 10 °/o suspenzie pekárskehodroždia — 1700 ml. Autolýza sa iniciuje prí-davkom 170 ml čerstvého kvasničného auto-lyzátu, 2 g chloridu sodného a 17 g etanolu.Autolýza priebieha pri 50 °C za stálého mie-šania a ukončí sa po 10 hodinách. Autoly- zát obsahuje 90 g surověj bielkoviny. Pocentrifugácii sa získá 1300 ml supernatantua 596 g sedimentu, pričom do supernatantusa uvolní 30 °/o z celkového obsahu proteí-nov v kvasničných buňkách. 3a j Postup rovnaký ako v příklade la,bielkovinový produkt však obsahuje 80 %surověj bielkoviny. 3 b) Postup rovnaký ako v příklade 1b,precipitáciou sa získá 1,7 g preparátu s ak-tivitou invertázy 23,5 ukat na gram sušiny. PREDMET Spósob komplexnej frakcionácie pekárske-ho droždia vyznačujúci sa tým, že super-natant kvasničného autolyzátu sa vyzrážaetanolom pri teplote 2 až 5 CC v objemovompomere 0,9 až 2 : 1, zostatok sa po odstra-nění etanolu vysuší, zo> sedimentu autolyzátusa vyextrahuje lipidická frakcia 20-násob-ným nadbytkom extrakčnej zmesi etanol-he-xán v objemovom pomere 1 : 2, ktorá sa ďa-laje frakcionuje 5-násobným nadbytkom ace- tónu, pričom acetónový extrakt sa po zmy-delnení 15 %-ným roztokom hydroxidu dra-selného počas 1 h pri 80 °C dalej extrahujehexánom, zahustí a po přidaní acetónu navýsledná, koncentráciu 33 °/o hmot. v hexá-ne kryštalizuje pri teplote —5 °C, pričomdelipidizovaný zvyšok, ktorý zostal po ex-trakcii lipidov zo sedimentu autolyzátu, sapo zriedení vodou na 8 až 10 %-nú suspen-ziu vysuší. Severografia, n. p. závod 7, Most Cena 2,40 Kčs