Patents

Search tools Text Classification Chemistry Measure Numbers Full documents Title Abstract Claims All Any Exact Not Add AND condition These CPCs and their children These exact CPCs Add AND condition
Exact Exact Batch Similar Substructure Substructure (SMARTS) Full documents Claims only Add AND condition
Add AND condition
Application Numbers Publication Numbers Either Add AND condition

Způsob výroby peptidů kontinuální průtokovou metodou v pevné fázi

Abstract

Řeší se způsob výroby peptidů metodou v pevné fázi v kolonovém uspořádání, jehož podstata spočívá v tom, že polymerni nosič, na kterém postupná výstavba peptidického řetězce probíhá, se umístí do kolony, a ta se promývá veškerými roztoky a rozpouštědly použitými při syntéze tím způsobem, že se mění po jednotlivých cyklech směr promývání. Toto uspořádání znemožňuje ucpávání frity drobnými částmi pryskyřice, neboř změna směru promývání zamezuje usazování drobných částic pryskyřice, které by mohlo snižovat průtok, a zrychluje a zjednodušuje celou syntézu peptidů.

Landscapes

Show more

CS255089B1

Czechoslovakia

Other languages
English
Inventor
Viktor Krchnak
Milan Krojidlo
Ludek Lepsa

Worldwide applications
1986 CS

Application CS864961A events

Description

Vynález se týká způsobu výroby peptidů kontinuální průtokovou metodou v pevné fázi.
Syntéza peptidů metodou v pevné fázi doznala v posledních letech neobvyklého rozšíření a v dnešní době se peptidy připravují prakticky výlučně touto metodou. V jejím dnes již klasickém uspořádání se provádějí veškeré reakce na polymerním nosiči, který je umístěn v reakční nádobě a všechny roztoky a rozpouštědla se dávkují do této nádoby, promíchají s polymerní pryskyřicí a po zvoleném čase se roztok nebo rozpouštědlo odstraní např. odsátím.
Modifikovaný postup, který spočíval v umístění polymerního nosiče do kolony a promývání kolony s nosičem všemi zvolenými roztoky a rozpouštědly, narážel na problém postupného ucpávání spodní frity kolony drbonými částečkami pryskyřice, což vedlo ke snižování průtoku kolonou a k nutnosti zvyšovat neúměrně tlak na kolonu, aby se dosáhlo únosného průtoku. Takovéto syntetizátory vyžadovaly speciální konstrukce, které připomínaly zařízení pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii. Někteří autoři se snažili tento nedostatek odstranit přípravou speciálních polymerních nosičů, které vykazovaly po stránce fyzikálních vlastností zvýšenou odolnost proti drolení.
Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby peptidů kontinuální průtokovou metodou v pevné fázi, podle vynálezu jehož podstata spočívá v tom že se postupná výstavba peptidického řetězce provádí na polymerním nosiči umístěném v koloně a směr průtoku mobilní fáze se vždy mění po připojení další aminokyseliny.
Způsob podle vynálezu popisuje postup, který nevyžaduje ani speciálních polymerních nosičů ani zvláštního zařízení, které by vyvolávalo vysoké tlaky na kolonu. Do normální skleněné kolony se umístí tolik’polystyrénové pryskyřice sířované divinylbenzenem (nejběžněji používaný polymerní nosič pro syntézu peptidů v pevné fázi), aby objem nabobtnalé pryskyřice vyplnil celý objem kolony. Veškeré reakce a promývání, které -syntéza peptidů v pevné fázi zahrnuje, se provádějí tím způsobem, že po jednotlivých cyklech se mění směr promývání kolony s polymerním nosičem. Při tomto uspořádání nedochází k postupnému zanášení frity drobnými kousky pryskyřice, neboř tyto jsou umášeny proudem kapaliny střídavě nahoru nebo dolů.
Při vlastním provádění syntézy podle vynálezu se autorům vynálezu osvědčil postup, při kterém jsou zásobní nádoby, které obsahují roztoky a rozpouštědla použité při syntéze, natlakovány na mírný přetlak (20 až 30 kPa) např. dusíkem, a spojovací hadičkou z inertního materiálu, např. teflonu, je tímto přetlakem kolona s polymerním nosičem promývána. Průtok se tak řídí přetlakem plynu. Oba konce kolony jsou napojeny na čtyřcestný ventil, jehož třetí vývod je spojen přes šesticestný ventil se zásobními nádobami a čtvrtý vývod je umístěn do odpadu. Přepínáním čtyřcestného ventilu po jednotlivých cyklech se dosáhne změny směru průtoku kolonou.
Způsob podle vynálezu byl s úspěchem ověřen v praxi. Došlo ke zjednodušení syntézy peptidů, k úspoře surovin a ke zrychlení celé přípravy žádaných peptidů.
Následující příklady provedení způsob podle vynálezu dokumentují, ale nikterak neomezují
Příklad 1
Do skleněné kolony (2x9 cm) se umístí 5g chlormetylované polystyrénové pryskyřice sítované 1% divinylbenzenu a esterifikované Boc-Gly (obsah Gly 0,5 mmol/pryskyřice).
Syntéza peptidů zahrnuje 8 cyklů, sestávajících z následujících kroků: (1) TFA:DCM (1:), 30 min., (2) DCM, do neutrální reakce, (3) TEA:DCM (1:9), 3 min., (4) DCM, do neutrální reakce, (5) předem připravené HOBt estery (5 mmol) v 30 ml DCMíDMF (4:1), (6) DCM, 5 min. Pokud je test na volné aminoskupiny pozitivní, opakovat kroky č. 5 a 6. Každý krok představuj promývání kolony s polymerním nosičem uvedenými roztoky a rozpouštědly přetlakem 20 kPa, aplikovaným do zásobní nádoby s kapalinou.
V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Thr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl·), Boc-Thr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Pro,
Boc-Phe. Po syntéze bylo získáno 7,1 g peptidyl-pryskiřice. Peptidyl-pryskyřice (1 g) byla suspendována ve směsi TFMSA (1,5 ml), TFA (5 ml), tioanisol (2 ml) a míchána 1 h při lab. teplotě. Produkt byl srážen 100 ml absolutního éteru a extrahován do 20% kyseliny octové.
Po lyofilizaci byl přečištěn na koloně (1x100 cm) obsahující polyakrylamidový gel, mobilní fáze 1 M kyselina octová. Frakce obsahující jednotky produkt byly spojeny a lyofilizovány. Přečištěný produkt měl vyhovující aminokyselinovou analýzu a choval se jako jednotná látka při chromatografii na tenké vrstvě v soustavě 1-butanol : pyridin : kyseina octová : voda (30:20:6:12) a při papírové elektrofreze v pufru pH 2,5.
Výtěžek: 157 mg Phe-Pro-Gly-Ser-Ser-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly.
Příklad 2
Do skleněné kolony (2x9 cm) bylo umístěno 5 g benzhydrylaminové pryskyřice (polystyreno/é) sířované 1% divinylbenzenu (obsah aminoskupin 0,6 mmol/g pryskyřice). Syntéza zahrnovala 3 cykly, které sestávaly ze stejných kroků jako v příkladu 1, s výjimkou prvého cyklu, který zařínal krokem č. 3. V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující aminokyseliny: Boc-Gly, Boc-Leu a Boc-Pro. Po syntéze bylo získáno 5,9 g peptidyl-pryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice /5,9 g/ odštěpen v 60 ml kapalného HF, extrahován do 20% kyseliny octové a lyofilizován. Surový produkt měl vyhovující aminokyselinovou analýzu a na analytické HPLC vykazoval 5 % nečistot /na základě integrace plochy píků při 210 nm/.
Výtěžek: 720 mg Pro-Leu-Gly-Nř^
Poznámka:
Peptidy získané v uvedených příkladech provedení byly syntetizovány způsobem podle vynálezu a to tak, že po každém syntetickém cyklu /tedy vždy po připojení další chráněné aminokyseliny/ byl změněn směr průtoku mobilní fáze a tím nedošlo k zanešení frity úlomky pryskyřice a reakční komponenty se velmi šetrně a přitom dokonale promíchaly. Syntéza peptidů probíhala kontinuelně.
Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:
Boc t-butyloxykarbonyl
TFA kyselina trifluoroctová
DCM dichlormetan
TEA trietylamin
HOBt N-hydroxymenztriazol
DMF dimetylformamid
Bzl benzyl
TFMSA kyselina trifluormetansulfonová
HF fluorovodík
HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Gly glycin
Thr treonin
Ser serin
Pro prolin
Phe fenylalanin
Leu leucin

Claims (1)
Hide Dependent

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Způsob výroby peptidů kontinuální průtokovou metodou v pevné fázi vyznačující se tím, že se postupná výstavba peptidického řetězce provádí na polymerním nosiči umístěném v koloně a směr průtoku mobilní fáze se vždy mění po připojení další aminokyseliny.