CS254637B1 - Způsob koncentrace a purifikace viru parotitidy - Google Patents

Abstract

Způsob koncentrace a purifikace viru parotitidy z alantoidní tekutiny kuřecích embryí po úpravě pH a iontové síly pomocí polyethvlenglykolu-6 000 a přídavku iontů Ca2+. Precipitace a koncentrace tohoto viru z alantoidní tekutiny kontaminované lipidy a lipoproteiny žloutku je umožněna přídavkem dalšího podílu iontů Ca2+ při zachování ostatních parametrů. Obvyklou technikou purifikace ultracentrifugací přes vrstvu sacharózy případně na lineárním hustotním gradientu sacharózy je virus parotitidy zbaven zbývajících balastních proteinů.

Description

Vynález se týká způsobu koncentrace a purifikace viru parotitidy (PaV) precipitací z virové alantoidní tekutiny (AT) kuřecích embryi (KE).

Dosud známé způsoby koncentrace PaV i dalších virů adaptovaných na KE využívají ultracentrifugace případně ultrafiltrace. Zpracování větších objemů virové tekutiny potom předpokládá budto nákladný provoz dostupné ultracentrifugy s omezeným objemem rotoru (např.

VAC 602, rotor W 6 x 85) nebo pořízení vysokoobrátkové preparativní centrifugy typu Beckman J2-21, která umožňuje zpracovat v rotoru W 6 x 500 jednorázově až 3 litry virové tekutiny. Druhý ze způsobů koncentrace, ultrafiltrace, je závislý rovněž na technicky náročném a nákladném zařízení.

Podstatou předkládaného způsobu koncentrace PaV je jeho přímá precipitace z AT pomocí polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 6 000 (PEG-6 000) v podmínkách zvýšené iontové 2+ síly a za přítomnosti iontů vápníku Ca . Způsob koncentrace je předkládán na základě podrobného studia podmínek koncentrace PaV z AT. Precipitace PaV z AT je komplikována značnou nestandardností kvality AT. Tato variabilita je dána jednak fyziologickými dispozicemi příslušné šarže KE a jednak je dc značné míry závislá i na technice a pečlivosti odběru AT· Během této operace může totiž snadno dojít k protržení žloutku a tím ke kontaminaci AT lipidickými složkami žloutku. Míra kontaminace AT lipidy je případ od případu různá. Uvádí se však, že norma obsahu lipidů v AT 12denních KE je 200-400 mg.ml AT znečištěná žloutkem potom může mít až 2 000 mg.ml^-\

Zvýšený obsah lipidů a lipoproteinů v AT způsobuje, že produkt srážecí reakce flotuje,

2+ což znemožňuje jeho sedimentaci. Příslušným přídavkem iontů Ca při zachování ostatních parametrů je však iniciováno další srážení, dávající vznik mohutnější sraženině, která 2+ již má příznivé fyzikální vlastnosti pro sedimentaci. Přídavkem iontů Ca se tedy daří koncentrovat viriony PaV i z AT silně kontaminované žloutkovými lipidy. Volbou koncentrace 2+ iontů Ca v podmínkách různého stupně kontaminace AT lipidy lze ovlivňovat rozsah srážecí reakce PaV a tím i hodnoty specifických parametrů purifikace virionů PaV již ve fázi koncentrace.

Hlavní výhody předkládaného způsobu koncentrace a purifikace PaV spočívají v tom, že lze koncentrovat a purifikovat virus z velkého objemu virové tekutiny AT při výrazném 2+ omezení provozu ultracentrifugy a že lze stupňovaným přídavkem iontů Ca zpracovávat i alantoidní tekutinu s vysokou kontaminací žloutkovými lipidy a lipoproteiny. Navrhovaná metodika by měla být po specifickém upřesnění obecně použitelná pro koncentraci a purifikaci dalších infekčních agens (diagnostických antigenů), adaptovaných na Ke a uvolňovaných do AT. Z dalších zástupců rodu Paramyxovirus to mohou být virus parainfluenzy 1 (Sendai), virus moru drůbeže (NDV), některé další viry parainfluenzy ptáků. Zvláštní význam by měla mít tato metoda pro koncentraci viru chřipky A z AT kuřecích embryí, popřípadě i pro některé togaviry a rickettsie.

Produkt navrhovaného způsobu koncentrace a purifikace PaV se osvědčil jako diagnostický antigen pro test inhibice hemaglutinace, zvláště pak jako antigen pro nejrůznější uspořádání enzymové imunoanalýzy specifických protilátek izotypů IgG a IgM včetně přímého značení peroxidázou. Osvědčil se též při imunizacích k získání hyperimunního zvířecího séra i imunních myší k produkci monoklonálníoh protilátek.

Příklad 1

Kuřecí embrya (KE) jsou ve stáří 8 dní infikovány virem parotitidy (PaV), laboratorním kmenem Enders. Očkovací dávka PaV je 10⁴'² infekčních jednotek v 0,1 ml média na jedno KE. Infikovaná KE jsou dále 4 dny inkubována při teplotě 35,5 °C, přičemž pátý den je inkubace ukončena přenesením KE do +4 °C a důkladným vychlazením přes noc. Následující den je proveden odběr alantoidní tekutiny tradiční technikou. Získaná alantoidní tekutina (AT) je kombinovanou klarifikací (filtrace, nízkoobrátková centrifugace) zbavena tkáňových a buněčných zbytků.

Následuje úprava pH na hodnotu 7,0 až 7,5 a zvýšení iontové síly přídavkem 0,2 M krystalického NaCl. Po úplném rozpuštění NaCl je za stálého míchání při teplotě laboratoře přidán ze zásobního roztoku k upravené AT polyethylenglykol-6 000 (PEG-6 Ó00) do konečné koncentrace

5,0 až 5,5 % (w.v ³). Po krátkém intenzivním míchání je objem doplněn přídavkem roztoku 2+

CaCl^ do konečného obsahu iontů Ca 3 mM. Vlastní srážecí reakce poté probíhá přes noc při teplotě +4 °C. Jemná sraženina PaV je centrifugována a sediment resuspendován do 1/50 až 1/100 původního objemu v tlumivém roztoku TNE (lOmM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 MM EDTA, pH 7,2). Preparát má v uvedeném rozsahu stupně koncentrace příznivé mechanické vlastnosti, je dostatečně homogenní a hodnoty koncentrace proteinů nepřesahují 4,0 mg.ml^-1 při vysokém titru hemaglutinační aktivity (8 192 až 16 384). Již na této úrovni preparačního postupu dosahuje koncentrovaný preparát PaV stupně purifikace hemaglutinační aktivity hodnoty 50.

Podle jeho dalšího využití (sérologie, imunizace, příprava subjednotek) je dále purifikován postupem obvyklým v preparativní virologii ntyxóvírů ultracentrifugací přes vrstvu sacharózy (20% w.v Stupeň purifikace hemaglutinační aktivity potom dosahuje hodnoty

60. Nejvyššího stupně purifikace 70 až 80, vyjádřeno rovněž specifickou hemaglutinační aktivitou s kuřecími erytrocyty, lze potom dosáhnout v preparativním měřítku následnou ultracentrifugací částečně purifikovaného koncentrátu PaV na lineárním gradientu hustoty sacharózy (15 až 55% w.v . Produkty těchto purifikačních operací lze již snadno resuspendovat do .1/100 původního objemu AT, přičemž koncentrace proteinů nepřesáhne hodnotu 2,5 2,5 mg.ml ¹ při vysokém titru hemaglutinační aktivity 16 384, a lyofilizovat bez ztráty aktivity.

Příklad 2

Vizuálním hodnocením výchozí AT nemůže být vždy odhadnuto, zda AT již obsahuje kritické množství lipidů nebo zda je jejich množství v normě. Toto rozhodnutí lze učinit pouze tehdy, když evidentně došlo k proniknutí žloutku do AT. Jestliže je i v případě AT s abnormálním množstvím lipidů postupováno podle příkladu 1, potom již 2 hod od začátku precipitace lze pozorovat tvorbu flotující sraženiny, která nebude při centrifugaci sedimentovat.

Za této situace je nutné doplnit precipitující suspenzi postupně nebo jednorázově 2+ přídavkem roztoku CaC^ do konečného obsahu iontů Ca v rozmezí 7 až 20 mM. Vytváří se mohutnější sraženina, která centrifugaci sedimentuje. Získaný sediment je resuspendován v 1/10 výchozího objemu AT tlumivým roztokem TNE s přídavkem EDTA až do bosahu 5 mM a promýván obvyklým způsobem ultracentrifugací. Sediment po této ultracentrifugací je resuspendován v 1/100 původního objemu AT tlumivým roztokem TNE, přičemž získaná suspenze PáV je podle dalšího využití purifikována způsoby popsanými v příkladě 1 s obdobnými výslednými parametry.

Claims (1)

1. Způsob koncentrace a purifikace viru parotitidy, vyznačený tím, že virus parotitidy je koncentrován z alantoidní tekutiny při pH 7,0 až 7,5 kuřecích embryí po zvýšení iontové síly 0,15 až při 0,20 Μ NaCl precipitací polyetylenglykolem-6 000 (5,0 až 5,0 % w.v s přídavkem 3 až 6 mM v případech alantoidní tekutiny s vysokým obsahem lipidů a dále purifikován obvyklým postupem ultracentrifugací přes vrstvu sacharózy, případně na lineárním hustotním gradientu sacharózy.