CS254637B1

CS254637B1 - Process for the concentration and purification of virus parotitide

Info

Publication number: CS254637B1
Application number: CS864507A
Authority: CS
Inventors: Libor Grubhoffer
Original assignee: Libor Grubhoffer
Priority date: 1986-06-18
Filing date: 1986-06-18
Publication date: 1988-01-15
Also published as: CS450786A1

Abstract

Způsob koncentrace a purifikace viru parotitidy z alantoidní tekutiny kuřecích embryí po úpravě pH a iontové síly pomocí polyethvlenglykolu-6 000 a přídavku iontů Ca2+. Precipitace a koncentrace tohoto viru z alantoidní tekutiny kontaminované lipidy a lipoproteiny žloutku je umožněna přídavkem dalšího podílu iontů Ca2+ při zachování ostatních parametrů. Obvyklou technikou purifikace ultracentrifugací přes vrstvu sacharózy případně na lineárním hustotním gradientu sacharózy je virus parotitidy zbaven zbývajících balastních proteinů.Method of concentration and purification virus parotitis from allantoic fluid chick embryos after pH and ion treatment force with polyethlene glycol-6,000 and adding Ca 2+ ions. Precipitation and the concentration of this virus from allantoic lipids contaminated with lipids and lipoproteins yolk is allowed by addition additional Ca 2+ ions while retaining other parameters. The usual technique purification by ultracentrifugation through the layer sucrose optionally on a linear density sucrose gradient is parotitis virus deprived of remaining ballast proteins.

Description

Vynález se týká způsobu koncentrace a purifikace viru parotitidy (PaV) precipitací z virové alantoidní tekutiny (AT) kuřecích embryi (KE).The invention relates to a method of concentrating and purifying the parotitis virus (PaV) by precipitation from a chicken embryo virus (AT) virus allantoic fluid (AT).

Dosud známé způsoby koncentrace PaV i dalších virů adaptovaných na KE využívají ultracentrifugace případně ultrafiltrace. Zpracování větších objemů virové tekutiny potom předpokládá budto nákladný provoz dostupné ultracentrifugy s omezeným objemem rotoru (např.Previously known methods of concentration of PaV and other viruses adapted to KE utilize ultracentrifugation or ultrafiltration. The processing of larger volumes of viral fluid then implies expensive operation of the available limited ultracentrifuge (e.g.

VAC 602, rotor W 6 x 85) nebo pořízení vysokoobrátkové preparativní centrifugy typu Beckman J2-21, která umožňuje zpracovat v rotoru W 6 x 500 jednorázově až 3 litry virové tekutiny. Druhý ze způsobů koncentrace, ultrafiltrace, je závislý rovněž na technicky náročném a nákladném zařízení.VAC 602, rotor W 6 x 85) or acquisition of a high-speed preparative centrifuge of the Beckman J2-21 type, which allows to process up to 3 liters of viral fluid in the W 6 x 500 rotor. The second method of concentration, ultrafiltration, is also dependent on a technically demanding and expensive device.

Podstatou předkládaného způsobu koncentrace PaV je jeho přímá precipitace z AT pomocí polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 6 000 (PEG-6 000) v podmínkách zvýšené iontové 2+ síly a za přítomnosti iontů vápníku Ca . Způsob koncentrace je předkládán na základě podrobného studia podmínek koncentrace PaV z AT. Precipitace PaV z AT je komplikována značnou nestandardností kvality AT. Tato variabilita je dána jednak fyziologickými dispozicemi příslušné šarže KE a jednak je dc značné míry závislá i na technice a pečlivosti odběru AT· Během této operace může totiž snadno dojít k protržení žloutku a tím ke kontaminaci AT lipidickými složkami žloutku. Míra kontaminace AT lipidy je případ od případu různá. Uvádí se však, že norma obsahu lipidů v AT 12denních KE je 200-400 mg.ml AT znečištěná žloutkem potom může mít až 2 000 mg.ml^-\The essence of the present PaV concentration method is its direct precipitation from AT with polyethylene glycol of molecular weight 6,000 (PEG-6,000) under conditions of increased ionic 2+ strength and in the presence of Ca ions. The concentration method is presented on the basis of a detailed study of the PaV concentration conditions from AT. The precipitation of PaV from AT is complicated by the considerable abnormality of AT quality. This variability is due both to the physiological disposition of the respective batch of KE and also to a large extent to the technique and diligence of the AT collection. The level of AT lipid contamination varies from case to case. However, it is reported that the standard of lipid content in AT 12-day KE is 200-400 mg.ml AT contaminated with yolk may then have up to 2000 mg.ml ^-

Zvýšený obsah lipidů a lipoproteinů v AT způsobuje, že produkt srážecí reakce flotuje,Increased lipid and lipoprotein content in AT causes the clotting product to float,

2+ což znemožňuje jeho sedimentaci. Příslušným přídavkem iontů Ca při zachování ostatních parametrů je však iniciováno další srážení, dávající vznik mohutnější sraženině, která 2+ již má příznivé fyzikální vlastnosti pro sedimentaci. Přídavkem iontů Ca se tedy daří koncentrovat viriony PaV i z AT silně kontaminované žloutkovými lipidy. Volbou koncentrace 2+ iontů Ca v podmínkách různého stupně kontaminace AT lipidy lze ovlivňovat rozsah srážecí reakce PaV a tím i hodnoty specifických parametrů purifikace virionů PaV již ve fázi koncentrace.2+ which prevents its sedimentation. However, due to the corresponding addition of Ca ions while maintaining the other parameters, further precipitation is initiated, giving rise to a larger precipitate, which 2+ already has favorable physical properties for sedimentation. Thus, the addition of Ca ions manages to concentrate both PaV and AT virions strongly contaminated with yolk lipids. By selecting the concentration of 2+ Ca ions in conditions of different degree of AT lipid contamination, it is possible to influence the extent of the PaV precipitation reaction and thus the values of specific parameters of purification of the PaV virions already in the concentration phase.

Hlavní výhody předkládaného způsobu koncentrace a purifikace PaV spočívají v tom, že lze koncentrovat a purifikovat virus z velkého objemu virové tekutiny AT při výrazném 2+ omezení provozu ultracentrifugy a že lze stupňovaným přídavkem iontů Ca zpracovávat i alantoidní tekutinu s vysokou kontaminací žloutkovými lipidy a lipoproteiny. Navrhovaná metodika by měla být po specifickém upřesnění obecně použitelná pro koncentraci a purifikaci dalších infekčních agens (diagnostických antigenů), adaptovaných na Ke a uvolňovaných do AT. Z dalších zástupců rodu Paramyxovirus to mohou být virus parainfluenzy 1 (Sendai), virus moru drůbeže (NDV), některé další viry parainfluenzy ptáků. Zvláštní význam by měla mít tato metoda pro koncentraci viru chřipky A z AT kuřecích embryí, popřípadě i pro některé togaviry a rickettsie.The main advantages of the present method of concentration and purification of PaV are that the virus can be concentrated and purified from a large volume of AT virus fluid while significantly reducing ultracentrifuge operation, and that allantoid fluid with high egg yolk lipid and lipoprotein contamination can be processed by stepwise addition of Ca ions. The proposed methodology should, after specific clarification, be generally applicable to the concentration and purification of other infectious agents (diagnostic antigens) adapted to Ke and released into AT. Other representatives of the genus Paramyxovirus may include parainfluenza virus 1 (Sendai), avian influenza virus (NDV), and some other parainfluenza viruses. This method should be of particular importance for the concentration of influenza A virus from AT chicken embryos and possibly for certain togaviruses and rickettsia.

Produkt navrhovaného způsobu koncentrace a purifikace PaV se osvědčil jako diagnostický antigen pro test inhibice hemaglutinace, zvláště pak jako antigen pro nejrůznější uspořádání enzymové imunoanalýzy specifických protilátek izotypů IgG a IgM včetně přímého značení peroxidázou. Osvědčil se též při imunizacích k získání hyperimunního zvířecího séra i imunních myší k produkci monoklonálníoh protilátek.The product of the proposed method of concentration and purification of PaV has proven to be a diagnostic antigen for the hemagglutination inhibition assay, particularly as an antigen for a variety of enzyme immunoassays for specific IgG and IgM isotype antibodies, including direct peroxidase labeling. It has also proven successful in immunizations to obtain both hyperimmune animal serum and immune mice to produce monoclonal antibodies.

Příklad 1Example 1

Kuřecí embrya (KE) jsou ve stáří 8 dní infikovány virem parotitidy (PaV), laboratorním kmenem Enders. Očkovací dávka PaV je 10⁴'² infekčních jednotek v 0,1 ml média na jedno KE. Infikovaná KE jsou dále 4 dny inkubována při teplotě 35,5 °C, přičemž pátý den je inkubace ukončena přenesením KE do +4 °C a důkladným vychlazením přes noc. Následující den je proveden odběr alantoidní tekutiny tradiční technikou. Získaná alantoidní tekutina (AT) je kombinovanou klarifikací (filtrace, nízkoobrátková centrifugace) zbavena tkáňových a buněčných zbytků.Chicken embryos (KE) are infected with parotitis virus (PaV), an enders laboratory strain, at 8 days of age. The vaccine dose of PaV is 10 ⁴ ^-2 infectious units in 0.1 ml medium per KE. The infected KEs are further incubated at 35.5 ° C for 4 days, on which day the incubation is terminated by transferring the KE to +4 ° C and cooling thoroughly overnight. The next day, the allantoic fluid is collected using a traditional technique. The obtained allantoic fluid (AT) is free of tissue and cell debris by combined clarification (filtration, low-turn centrifugation).

Následuje úprava pH na hodnotu 7,0 až 7,5 a zvýšení iontové síly přídavkem 0,2 M krystalického NaCl. Po úplném rozpuštění NaCl je za stálého míchání při teplotě laboratoře přidán ze zásobního roztoku k upravené AT polyethylenglykol-6 000 (PEG-6 Ó00) do konečné koncentraceThe pH is then adjusted to 7.0 to 7.5 and the ionic strength is increased by the addition of 0.2 M crystalline NaCl. After complete dissolution of the NaCl, it is added from the stock solution to treated AT polyethylene glycol-6,000 (PEG-6,000) to the final concentration while stirring at room temperature.

5,0 až 5,5 % (w.v ³). Po krátkém intenzivním míchání je objem doplněn přídavkem roztoku 2+5.0 to 5.5% (wv ³ ). After briefly vigorous stirring, the volume is supplemented by the addition of 2+ solution

CaCl^ do konečného obsahu iontů Ca 3 mM. Vlastní srážecí reakce poté probíhá přes noc při teplotě +4 °C. Jemná sraženina PaV je centrifugována a sediment resuspendován do 1/50 až 1/100 původního objemu v tlumivém roztoku TNE (lOmM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 MM EDTA, pH 7,2). Preparát má v uvedeném rozsahu stupně koncentrace příznivé mechanické vlastnosti, je dostatečně homogenní a hodnoty koncentrace proteinů nepřesahují 4,0 mg.ml^-1 při vysokém titru hemaglutinační aktivity (8 192 až 16 384). Již na této úrovni preparačního postupu dosahuje koncentrovaný preparát PaV stupně purifikace hemaglutinační aktivity hodnoty 50.CaCl 2 to a final Ca ion content of 3 mM. The actual precipitation reaction is then carried out overnight at + 4 ° C. The fine precipitate of PaV is centrifuged and the sediment resuspended to 1/50 to 1/100 of the original volume in TNE buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 MM EDTA, pH 7.2). The preparation has favorable mechanical properties in the stated concentration range, is sufficiently homogeneous and the protein concentration values do not exceed 4.0 mg.ml ^-1 at a high titer of haemagglutination activity (8,192 to 16,384). Already at this stage of the preparation process, the concentrated preparation of PaV achieves a degree of purification of hemagglutination activity of 50.

Podle jeho dalšího využití (sérologie, imunizace, příprava subjednotek) je dále purifikován postupem obvyklým v preparativní virologii ntyxóvírů ultracentrifugací přes vrstvu sacharózy (20% w.v Stupeň purifikace hemaglutinační aktivity potom dosahuje hodnotyAccording to its further use (serology, immunization, subunit preparation), it is further purified by the procedure usual in preparative virology of ntyxoviruses by ultracentrifugation through a layer of sucrose (20% wV).

60. Nejvyššího stupně purifikace 70 až 80, vyjádřeno rovněž specifickou hemaglutinační aktivitou s kuřecími erytrocyty, lze potom dosáhnout v preparativním měřítku následnou ultracentrifugací částečně purifikovaného koncentrátu PaV na lineárním gradientu hustoty sacharózy (15 až 55% w.v . Produkty těchto purifikačních operací lze již snadno resuspendovat do .1/100 původního objemu AT, přičemž koncentrace proteinů nepřesáhne hodnotu 2,5 2,5 mg.ml ¹ při vysokém titru hemaglutinační aktivity 16 384, a lyofilizovat bez ztráty aktivity.60. The highest purification degree of 70-80, also expressed by specific hemagglutinating activity with chicken erythrocytes, can then be achieved on a preparative scale by subsequent ultracentrifugation of the partially purified PaV concentrate on a linear sucrose density gradient (15-55% wv). to .1 / aT 100 of the original volume, the concentration of proteins does not exceed a value of 2.5 2.5 mg.ml ¹ at high titer hemagglutination activity 16384, and lyophilized without loss of activity.

Příklad 2Example 2

Vizuálním hodnocením výchozí AT nemůže být vždy odhadnuto, zda AT již obsahuje kritické množství lipidů nebo zda je jejich množství v normě. Toto rozhodnutí lze učinit pouze tehdy, když evidentně došlo k proniknutí žloutku do AT. Jestliže je i v případě AT s abnormálním množstvím lipidů postupováno podle příkladu 1, potom již 2 hod od začátku precipitace lze pozorovat tvorbu flotující sraženiny, která nebude při centrifugaci sedimentovat.Visual assessment of the initial AT cannot always estimate whether the AT already contains a critical amount of lipids or whether the amount is normal. This decision can only be made if the yolk has evidently entered the AT. If, even in the case of AT with an abnormal amount of lipids, Example 1 is followed, formation of a flotating precipitate is observed already 2 hours from the beginning of the precipitation, which will not sediment during centrifugation.

Za této situace je nutné doplnit precipitující suspenzi postupně nebo jednorázově 2+ přídavkem roztoku CaC^ do konečného obsahu iontů Ca v rozmezí 7 až 20 mM. Vytváří se mohutnější sraženina, která centrifugaci sedimentuje. Získaný sediment je resuspendován v 1/10 výchozího objemu AT tlumivým roztokem TNE s přídavkem EDTA až do bosahu 5 mM a promýván obvyklým způsobem ultracentrifugací. Sediment po této ultracentrifugací je resuspendován v 1/100 původního objemu AT tlumivým roztokem TNE, přičemž získaná suspenze PáV je podle dalšího využití purifikována způsoby popsanými v příkladě 1 s obdobnými výslednými parametry.In this situation, it is necessary to replenish the precipitating suspension gradually or once with 2+ by adding CaCl 2 solution to a final Ca ion content of 7 to 20 mM. A larger precipitate is formed which sediments by centrifugation. The resulting sediment is resuspended in 1/10 of the initial volume of AT with TNE buffer plus EDTA up to 5 mM and washed in the usual manner by ultracentrifugation. The sediment after this ultracentrifugation is resuspended in 1/100 of the original volume with AT buffer TNE, and the obtained PáV suspension is further purified according to the methods described in Example 1 with similar endpoints.

Claims

Method for concentrating and purifying the parotitis virus, characterized in that the parotitis virus is concentrated from an allantoic fluid at pH 7.0 to 7.5 of chicken embryos after increasing the ionic strength by 0.15 to 0.20 Μ NaCl by precipitation with polyethylene glycol-6000 (5). 0 to 5.0% wv with an addition of 3 to 6 mM in the case of a high lipid allantoid fluid and further purified by a conventional procedure by ultracentrifugation through a layer of sucrose, optionally on a linear sucrose density gradient.