CS252925B1 - Způsob kultivace mikroorganismů rodu Escherichia, vykazujících L-aspartats amoniak lyasovou aktivitu - Google Patents

Abstract

Způsob kultivace mikroorganismů rodu Escherichia vykazujících L-aspartats amoniak lyasovou aktivitu, v kultivačním mediu obsahujícím kvasničný, autolyzát spočívá v tom, že kultivační medium obsahuje kvasničný autolyzát připravený bezprostředně před kultivací mikrobiálních buněk rodu Escherichia nebo stabilizovaný sterilizací při max. 120 °C po dobu max. 1 hodiny v koncentraci 0,2 až 1 % hmot. sušiny s výhodou 0,5 % hmot. sušiny ve formě supernatantu nebo filtrátu.

Description

- 1 - 252 925

Vynález se týká způsobu kultivace mikroorganismu rodu Escherichia, jež zaručuje co nejvyšší L-aspartat : amoniak lyasovouaktivitu tohoto mikroorganismu. Nakultivováné buňky je možno po-užít přímo k průmyslové biotransformaci fumaranu amonného naL-aspartan amonný nebo s výhodou k přípravě heterogenního bio-katalyzátoru pro uvedenou biotransformaci prováděnou kontinuál-ním kolonovým způsobem.

Pro ekonomickou výrobu kyseliny L-asparagové je důležitoupodmínkou použití bakteriálního kmene, obsahujícího co nejvyššíhladinu enzymu aspartasy /L-aspartat :amoniak lyasy; E.G.4.3.1.1./. Tento požadavek je možno splnit jednak použitím vhod-ného kmenového materiálu /tzv. vysokoprodukčních mutant/ a jed-nak způsobem kultivace těchto mikrobiálních buněk.

Postupné zvyšování specifické enzymové aktivity způsobenépoužitím vysokoprodukčních mutant kmene Escherichia coli s aspartasovou aktivitou a zároveň výběrem optimálních kultivačníchpodmínek demonstruje následující příklad. V roce 1974 byla spe-cifická enzymová aktivita mikrobiálních buněk používaných k prů-myslové výrobě, kyseliny L-asparagové v Japonsku okolo 0,5 ukatna gram vlhkých buněk /Chibata I., Tosa T., Sáto T.: AppliedMicrobiology 27, 878 /1974//» zatímco v roce 1979 byly používá-ny mikrobiální buňky se specifickou enzymovou aktivitou přesa-hující 28 ukat na gram vlhkých buněk /Sáto T.', Nishida Y., TosaT., Chibata I.: Biochim. Biophys. Acta 57O> 179 /1979//. Přilogickém pokračování tohoto vývoje je možno očekávat, že tytohodnoty aktivit již jsou a nadále budou překonávány. Prudký vzrůst enzymové aktivity používaných mikrobiálních buněk^ dosa-% hovaný jednak výběrem vhodného kmenového materiálu, jednak opti-malizací kultivačních podmínek, se pozitivně odráží i v nezaned- 232 925 - 2 - batelném prodloužení poločasu enzymové aktivity vytvořených he-terogenních biokatalyzátorů, v důsledku čehož jsou i značné eko-nomické úspory při kontinuální kolonové výrobě kyseliny L-aspa-ragové.

Vzhledem k tomu, že příprava heterogenních biokatalyzáto-rů vylučuje možnost použití mikrobiálních buněk kultivovanýchza přítomnosti pekařských kvasnic či jiných kvasinek, je nutnopoužívat kvasničných autolyzátů. Nevýhodou komerčně vyráběnýchkvasničných autolyzátů je kromě vyšších nákladů na kultivaci téžskutečnost, že je při jejich použití získána biomasa buněks nižší aspartasovou aktivitou ve srovnání s buňkami kultivova-nými za přítomnosti kvasničné suspense.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob kultivace mikroorganis-mu rodu Escherichia v médiu obsahujícím autolyzát připravenýautolýz.ou kvasinek při pH 5 až 7,5 a teplotě 45 až 50 °G během4fi až 72 hodin za nepřístupu vzduchu s následnou centrifugacína separátoru a stanovením sušiny v supernatantu, který spočívápodle vynálezu v tom, že se použije supernatant nebo filtráts 0,2 až 1 % hmot. sušiny připraveným bezprostředně před kulti-vací mikrobiálních buněk nebo stabilizovaným sterilizací přimax. 120 °C po dobu max. 1 hodiny. Buňky rodu Escherichia sekultivují v kultivačním mediu o složení: pepton 0,1 až 2 % hmot.,hovězí extrakt 0,25 až 3 % obj., kvasničný autolyzát připravenýpodle vynálezu 0,2 až 1 % hmot. ve formě příslušného množstvísupernatantu. před zaočkováním se k vysterilizovánému roztokupřidá 7,15 % obj. sterilního roztoku fumaranu amonného o kon-centraci 1 mol/litr a pH 7,0. Výhodou způsobu kultivace podle vynálezu je náhrada komerč-ně vyráběných kvasničných autolyzátů z hlediska kultivace kva-litnějším a přitom levnějším, snadno připravítelným autolyzátemvlastní provenience při současném snížení jeho optimální kon-centrace v kultivačním médiu z 1 % hmot. na 0,5 % hmot. Z eko-nomického hlediska je atraktivní též úspora energie, kdy je po-užíván přímo roztok autolyzátů po separaci /supernatant/ beznutnosti následného sušení či lyofilisace. Získané buňky mikro-

J 232 923 organismu rodu Escherichia připravené způsobem podle vynálezupřitom vykazují přibližně trojnásobnou aspartasovou aktivituve srovnání s buňkami připravenými dosud používanou kultivacíza přítomnosti komerčně vyráběných kvasničných autolyzátů přizachování stejného nebo i vyššího nárůstu biomasy.

Vyšší ekonomika celého procesu výroby kyseliny L-asparago-vé se promítá nejen z hlediska nižších nákladů na kultivačnímedium, ale výrazně též z hlediska využití z nakultivovanýchbuněk s vysokou aspartasovou aktivitou připraveného biokataly-zátoru, který má při shodném obsahu buněk 2 až 5krát delší ope-rační poločas. V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení,aniž by se jimi omezoval. Příklad 1

Jeden hmot. díl pekařských kvasnic byl suspendován v při-bližně pětinásobném množství vody, pH suspenze bylo upravenona hodnotu 6,5 a směs byla ponechána za nepřístupu vzduchu přiteplotě 50 °C po dobu 48 h. poton byla suspenze odstředěna naseparátoru a potřebné množství supernatantu /po stanovení suši-ny/ bylo použito pro přípravu kultivačního média.

Mikroorganismus Escherichia alcalescens byl zaočkován kličkou ze šikmého agaru do 500 ml varné baňky s plochým dnem obsa-hující 75 ml média následujícího složení; 0,5 % hmot. kvasnič-ného autolyzátu /vztaženo na sušinu^ připraveného výše popsanýmpostupem, 0,5 % hmot. peptonu, 0,75 % obj. hovězího vývaru a0,9 % hmot. fumaranu amonného. Acidita kultivačního média posterilizaci byla v rozmezí pH 5 až 8, s výhodou 6,5. Kultivaceprobíhala na rotační třepačce za intenzivního vzdušnění po do-bu 6 až 24 h, s výhodou 16 h při teplotě 25 až 40 °0, s výhodoupři 54 °C. Získané inokulum bylo použito k zaočkování vlastníchprodukčních baněk.

Varné 500 ml baňky s plochým dnem obsahující 25 až 150 ml,s výhodou 75 ml kultivačního média o složení totožném s médiempoužitým k přípravě inokula byly zaočkovány vždy 1 ml inokula.Po kultivaci za podmínek popsaných při kultivaci inokula byly

Claims (1)

1. - 4 - 252 925 buněčné suspenze slity a stanovena průměrná specifická enzymo-vá aktivita L-aspartat : amoniak lyasy, která činila 93 ^katna gram vlhkých buněk. Příklad 2 Buňky mikroorganismu Sscherichia alcalescens byly kultivo-vány shodným postupem jako v příkladu 1 v kultivačním médiu ná-sledujícího složení: 1 % hmot. kvasničného autolyzátu /vizpříklad 1/ stabilizovaného sterilizací při 120 °G po dobu 1 h, 2 % hmot,, peptonu, 0,25 % obj. hovězího vývaru a 1 % hmot. fu- maranu amonného. Získané buňky vykazovaly aspartasovou aktivi- ·· tu 78yukat na gram vlhké biomasy. Příklad 5 Kultivací mikroorganismu Escherichia coli v kultivačnímmédiu o složení 0,2 % hmot. kvasničného autolyzátu /viz příklad1/, 0,1 % hmot. peptonu, 5 % obj. hovězího extraktu a 0,8 %fumaranu amonného za shodných podmínek jako v příkladu 1 bylapřipravena suspenze mikrobiálních buněk Escherichia coli o as-partasové aktivitě 12 ukat na 1 gram vlhké biomasy. PŘEDMĚT VYNÁLEZU Způsob kultivace mikroorganismů rodu Escherichia, vykazu-jících L-aspartat : amoniak lyasovou aktivitu, za intenzivníhovzdušnění, v me'diu obsahujícím kvasničný autolyzát připravenýautolýzou kvasinek při pH 5 až 7,5, vyznačující se tím, že kul-tivační médium obsahuje kvasničný autolyzát připravený bez-prostředně před kultivací mikrobiálních buněk rodu Escherichianebo stabilizovaný sterilizací při max. 120 °C po dobu max. 1 hodiny v koncentraci 0,2 až 1 % hmot. sušiny, s výhodou 0,5 %hmot. sušiny ve formě supernatantu nebo filtrátu.