CS252880B1 - Sposob přípravy kyseliny kójovej - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká spósobu přípravy kyseliny kójovej transformáciou glycidov pomo- cou šfachtených Ikmeňov Aspergillus tarna- rii. Podstata produlkcie kyseliny kójovej spočívá v tom, že na tekutej živnej ipode s obsahom asimilovatelného uhlíku, dusíka a živných solí sa kultivuje kmen Aspergillus tamarii mutant VIII (CMC F-781), alebo Aspergillus tamarii mutant III (CCM F-780) jednotlivo, alebo· v zmesi pri teplote 20 až 40 °C, pH 1,5 až 7,0 po dobu 72 až 240 hodin, pričom kyselina kójová sa izoluje zahuštěním ultrafialového média s následnou fcryštalizáciou. Riešenie má použitie vo fermentačmom prietnysle na výrobu kyseliny kójovej.

Description

Vynález sa týká spósobu přípravy kyselinykójovej transformáciou glyeidov pomocoušlachtených kmeňov Aspergilluis tamarii.

Kyselinu kójovú v malých množstvách pro-dukuje viacero mikroskopických vláknitýchhúb najma z rodu Aspergillus, ako sú A.flavus, A. oryzae, A. parasiticus, A. nidulans,A. candidus, A. awamoiri, A. clavatuis, A. fu-migatus, A. giganteus, A. chevalieři, A. faci-culatus, A. rugulosus [Korzybski, T., Kow-szyk-Gindifer, Z., Antihiotics, PWN — Po-lish Scientific Puhlishers, Warszawa (1967]].Nevýhodou uvedených kmeňov je nízká pro-dukcia kyseliny kójovej a zložité produkčněmédium. Uvedené nevýhody odstraňuje spó-sob produkcie kyseliny kójovej na tekuitejživnej pode s obsahom asimilovatelnéhonhlífca, duisSka a živných solí, ktorého pod-stata spočívá v tom, že Aspergillus tamariimutant VIII (CCM F-781), alebo Aspergillustamarii mutant III (CCM F-780) sa kulti-vuje jednotlivo, alebo v zmesi, a to povr-chovo, alebo· submerzne, kde ako zdroj cuk-ru v médiu sa použije glukóza, fruktóza,sacharóza, maltóza, galaktóza, xylóza, ara-binóza, a to buď jeden z týcihto cukrov, ale-bo ich zmes, připadne prírodné substrátyobsahujúce tieto cukry, pričorn fcuiltivácia·sa uskuteční piri 'teplote 20 až 40 °C, s· vý-hodou při 30 CC, pri pH 1,5 až 7, s výhodouna začiatku 4,5 pre submerz a 6,5 pre po-vrch, relatívnej vlhkosti pre povrch 55 %až 95 °/o, s výhodou 65 % po dobu 72 až 240hodin, pričorn kyselina ikójová sa izoluje za-huštěním ultrafialového média s násled-nou kryštalizácion, připadne ext-rakciouetylacetáteim, alebo zrážaním roztokem sí-ranu meďnatého, připadne reikryštalizáciouz dekationizovaného roztoku. Výhodou spó-sobu přípravy kyseliny kójovej podlá vyná-lezu je, že na jednoduchom živinom médius asimilovatefným zdrojem uhlíka a živnýchsolí možno povrchovou, alebo suhmerznoufermentáciou získať kyselinu kójovú vo vý-tažku až 35 g na 100 g culkru. Příklad 1 Připraví sa 5,3 litra média o zložení 4,5 %sacharózy, 4,5 % glukózy, 0,2 % dusičnanuamónneho, 0,1 % dihydrofosforečňanu dra-selného, 0,05 % heptahydrátu síranu horeč-natého, 0,05 % chloridu draselného, 0,001percenta heptahydrátu síranu železnatého,2 % kukuřičného výluhu o sušině 50 %. pHroztoku sa upraví na hodnotu 6,5. Sterilizujesa 30 minut pri 115 °C a za horúca sa vylejedo- piatich sterilných hliníkových brocov spriemerom 150 mm a výšky 180 mm. Poochladení média na 45 °C sa na povrch mé-dia rozprášia konidiospóry ikmeňa Asper-gillus tamarii mutant VIII v suspenzii s ak-tívinym uhlím v množstve 2 x 10"7 spor na1 dm2 plochy média. Hrnce sa uložia dokvasnej komory, v ktorej je regulovaná tep-lota a vlhkost. Teplota v kvasnej komořepo očkovaní v priebeihu 12 hodin klesne na 34 °C a v priebehu dalších 12 hodin na 30°Celzia. Táto teplota sa potom udržuje až dokonca. Relativná vlhkost vzduchu je na za-čiatku 90 °/o, po 24 hodinách od očkovania70 %. Táto· vlhkost sa udržuje až do· (koncakultivácie. Na povrchu média v priebehu10 dní kultivácie sa vytvoří súvislá zvrás-nená vrstva mycélia o sušině 20 g . 1_1. Kon-centrácia vytvorenej kyseliny kójovej v mé-diu dosiahla hodnotu 30 g. to1 póvodnéhoobjemu média, t. j. 33 % kvasného výtažku.Příklad 2 Připraví sa 100 ml média takého zloženiaako· v příklade 1. Rozdělí sa po 50 ml dodvoch 250 ml Erlenmayerových buniek aočkuje sa 0,5 mi suspenzie konídiospóir kme-ňa Aspergillus tamarii mutant VIII vo vedeo koncetrácii 107 spor na ml. Baníky sa ulo-žia na rotačnú třepačku s počtem ikyvov210 za minútu o· výstřednosti 8 cm a kulti-vujú sa 48 hodin pri 32 °C. Po tejto doběvyrastie vegetativně inokulum, ktoré tvořísuspenzia hýf aglomerrovaných do sféric-kých zhluíkov priemeru 1,2 až 2 mra. Ďalejsa pripiraví 2,4 litra média o zložení 10 %glukózy, 0,1 °/o chloridu amonného, 0,05 %heptahydrátu síranu horečnatého, 0,016 %dihydrofosforečňanu draselného, 0,007 %chloridu draselného, 0,002 % tetraihydrátusíranu manganatéiho, 0,001 % heptahydrátusíranu zinočnatého, 0,001 % heptahydrátusíranu železnatého. Sterilizuje sa 30 minútpri 115 CC. Po sterilizácii a ochladení médiana 30 °C sa přidá sterilný roztok močovinyvo výslednéj koncentrácii 0,1 °/o. Médium saprenesie do sterilného .laboratórneho fer-•mentéra o celkovom objeme 5 lrtrov s me-chanickým miačením. Po· provzdušnění mé-dia sa sterilně prenesie obsah obidvoch ba-•niek vegetatívneho inokula připravenéhovyššie popísaným postupom a kultivuje sapri 30 °C. Intenzita aerácie je 0,05 až 1,0 jed-notka objemu vzduchu na jednotku objemumédia za minútu, a to na začiatku 0,1 a nakonci 0,5 jednotky objemu vzduchu na jed-notku objemu média za minútu. Obvodovárýchlosť miešania je 3,4 m . s_1.

Laminárna rýchlosť prúdenla vzduchu jev medziach 0,4 až 2,8 m . s_1 vztiahnutá najednotkovú plochu priečneho řezu fermein-téira pri turbulentnom -miešaní. Maximálnaprodukcia kyseliny kójovej š-a dosiahne v 6.deň fermentácie, pričorn jej koncentráciabola 33 g na liter média. Příklad 3

Postupuje sa rovnako ako v příklade 2 stým rozdielom,, že inokulum sa připraví zkonídiospór -pirodufcčného ikmeňa Aspergil-l'us tamarii mutant III. Maximálna produk-cia kyseliny kójovej sa dosiahla v 9. deňfermentácie, pričorn jej koncentrácia bola 19,4 g na liter média.

Claims (1)

1. 252880 P r í ik 1 a 'd 4 Postupuje sa rovnalko ako v predchádzajú-com příklade s tým rozdielom, že namiestoglukózy sa použije eaoharóza. Maximálnaprodulkcia kyseliny kójovej sa dosiahla za 6,5 dňa a jej konceintrácia bola 37 g na li-ter média. Význam vynálezu spočívá v tom, že eko-nomickou cestou možno· získat kyselinu kó- jovú, ktorá pre svoje amtioxidačné a chala-tačné vlastnosti ako aj pre vlastnosti biolo-gickej účinnosti móže nájsť široké použitiev potravinárskom, farmaceutickom i che-mičkám priemysle, imajúc na zřeteli, že ky-selina kójová nie je mutagénnou pre eufca-ryotické buňky [Shibuya T. a spol., J. Toxi-col. Sci., 7, 4, 255 až 262 (1982)] a v pří-rodě sa machádzajúcimi mifcróbnymi spolo-čenstvaimi je degradovatelná. PREDMET Sposob přípravy kyseliny kójovej na telku-tej pode so zdrojem aisimilovatelného uihlí-ka, dusíka a živných solí vyznačujúci satým, že kmene Aspergilluis tamarii rnutantVIII (CCM F-781), alebo Aspergillus tamariirnutant III (CCM F-780] sa povrchovo· alebosubímeirzne kultivujú jednotlivo, alebo v zme-si, kde ako zdroj cukru v médiu sa použijeglukóza, frufctóza, sacharóza, maltóza, ga-laktóza, manóza, xylóza, arabinóza, připadnezmes týchto cukirov, alebo prírodmé substrá-ty oibsahujúce tieto cukry, pričom fcultivá-cla sa uskuteční pri tepláte 20 až 40 °C, svýhodou pri 30 °C, pri pH 1,5 až 7,0, s vý-hodou na začiatku 4,5 pre subemrz a 6,5 prepovrch, relativné j vlhkosti 55 až 95 °/o, svýhodou 70 % pre povrch ipo dobu 72 až VYNÁLEZU 240 hodin, pričom intenzita aerácie pri sub-merze je 0,05 až 1,0 objemu vzduchu naobjem média za minutu, s výhodou na za-čiatku 0,1 a na konci 0,5 jednotky objemuvzduchu na jednotku objemu média za mi-nutu a obvodová rýchlosť miešadla je v me-dziach 1,0 až 5,0 m. s "1, s výhodou 3,4 m.. s_1, pričom laminárna rýchlosť prúdeiniavzduchu vztiahnutá na jednotková plochupriečneho řezu fermeintéra pri turbulentnommiešaní je v medziach 0,4 až 2,8 m.s-1,pričom kyselina kójová sa izoluje zahuště-ním ultrafialového média s následnou fcryš-talizáciou, připadne extrakciou etylacetátom,alebo zrážaním roztoku síranu meďnatého,připadne rekryštalizáciou z dekationizova-ného roztoku.