CS248032B2

CS248032B2 - Determination method of substances in liquids and aid to perform this method

Info

Publication number: CS248032B2
Application number: CS826525A
Authority: CS
Inventors: Roland Helger; Bertold Limbach
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1981-09-17
Filing date: 1982-09-09
Publication date: 1987-01-15
Also published as: DE3137014A1; EP0075184A1; DE3262156D1; EP0075184B1; JPS5862561A; JPH0321070B2; IL66808A0; DD204164A5; ZA826768B

Description

.Vynález se týká způsobu určování látek' v kapalinách, zejména v tělních tekutinách, například glukózy v krevním séru, a pomůcky k provádění tohoto· způsobu na bázi stlačitelné impregnované matrice.

Určování složek v komplexních systémech, obzvláště biologických kapalin, vyžaduje přesně stanovené provedení pokusu, přičemž vzorek se zkoušenou látkou postupuje různými reakčními postupy. Přitom je časový okamžik přidávání reagencií, které se mají smíchat, různý podle použité metody a množství vzorku. Měrný signál, který se má po uplynutí reakce vyhodnotit a který je charakteristický pro metodu a látku, která se má stanovit, vede konečně ke zjištění koncentrace, hledané látky. Podle složitosti takových postupů byla doposud vyzkoušena řada různých způsobů, které by vedly k optimální spolehlivosti, jednoduchosti a hospodárnosti. Především v klinické chemii byly vyvinuty jako následek velice vysokého, počtu analýz metody, které umožňují ' provedení více stanovení pokud · možno jednoduchým způsobem, a v krátkém čase. Toho se jednak dosáhne použitím mechanizovaných analytických systémů, jednak připravením nezbytných reakčních činidel a reakčních směsí v předem připravené formě. Přitom se používají především analytické systémy, při kterých' se vzorky manuálně nebo zcela mechanizovaně smíchají s reakčními roztoky ze zásobní nádrže. Připravení roztoků, s eventuálně potřebnou předpřípravou vzorku, jakož kontrolou a čištěním dávkovacího a mísícího systému, má však za následek četné pracovní úseky a možné zdroje chyb. Obzvláště poměrně malá stálost některých analytických látek v roztoku vyžaduje velice často výměnu nespotřebovaných roztoků. Zkušební podmínky vyžadují vždy přesně reprodukovatelný přídavek různých objemů různých roztoků, což u automatizovaných systémů znemožňuje jednoduchou výměnu analytického způsobu.

Popsané těžkosti · vedly k , vývoji různých zkušebních ,, systémů. Je , například známé, že se reakční činidla v pevné formě uvedou do· styku se zkoušeným · roztokem buď jako impregnované nosné materiály, jako· napuštěné filtrační papíry, nebo· , jako lyofilizáty v příslušné reakční nádobě; u těchto · systémů je jen ještě' zapotřebí připitetovat rozpouštědlo a zkoušený vzorek. Umístění různých lyofilizovaných reakčních činidel na různých místech dovoluje přitom · provedení po sobě jdoucích reakcí. Tyto systémy představují pro· zkušební provedení zjednodušení, avšak při přípravě příslušných reakčních nádob nástávají značné problémy. Především zůstává u těchto forem provedení nevýhoda společná pro všechny vodné systémy, že se nemůže provádět žádná separace nezbytná pro analýzu · tělesných tekutin a všechna reakční činidla přidávaná v průběhu analýzy se musí přidávat současně:

Při tak zvaném suchém analytickém způsobu odpadá naproti tomu část tohoto· problému. · Přitom se zkoušený vzorek nanese na · savý nosič, který obsahuje v nejjednodušším případě v jediné vrstvě matrice všechna nezbytná reakční činidla v optimální koncentraci; tím odpadnou všechny jinak obvyklé pipetovací úseky. Kromě toho nepředstavuje vytvoření takového suchého systému žádný problém, pokud · se týká stálosti. Nevýhodou- tohoto jednostupňového · systému je jako u vodných způsobů, že chybí možnost přípravy a úpravy · vzorku, jakož i možnost vyřadit rušící látky.

Avšak také u zkušebních systémů s vícevrstevně uspořádanými suchými materiály, které mohou obsahovat například vrstvy pro · oddělení rušících látek, koncentrační zóny a různé reakční a uzavřené úseky, · je pohlcení a další průtok · zkoumané kapaliny a odtok z jednotlivých reakčních · úseků závislý na difúzi a kapilárním působení a tím prakticky není ani regulovatelný ani ovladatelný. Není možné reakci na určitém místě zastavit nebo ovlivnit dobu prodlení v reakční zóně.

Z USA patentu č.· 3 917 453 je · známé zkušební zařízení, které obsahuje absorpční materiál k pohlcení zkoušeného roztoku a rovněž stlačitelnou vrstvu složenou z absorbentu, která slouží k dávkování a protékání zkoumané tekutiyn. Tato· vrstva je uspořádaná mezi dvěma krycími vrstvami, které obsahují nezbytná reakční činidla, a může reagovat se stanovenou látkou za tvorby barviva, které se kolorimetricky vyhodnotí. Toto· zařízení je však zatíženo, řadou nevýhod: není · možné kvantitativní stanovení, fotometrické vyhodnocení a automatizace; rovněž není možné pomocí tohoto· zařízení provádět reakce, které vyžadují více po sobě probíhajících reakčních stupňů, a eventuálně potřebné oddělení nežádoucích látek mezi dvěma reakčními zónami.

Úkolem vynálezu je vyvinout způsob určování látek v· kapalinách, zejména v tělních tekutinách a zařízení k provádění tohoto způsobu za odstranění výše uvedených nevýhod.

Tento úkol byl vyřešen tak, že se způsob určování látek v kapalinách provádí za · použití pomůcky, která sestává z válcové reakční nádoby obsahující alespoň jednu stlačitelnou matrici.

Tímto zařízením se může provádět jednoduché protlačování vzorku matricí bez ovlivňování difúzí a je ovladatelné jak manuálně, tak také automaticky.

Předmětem · vynálezu je způsob určování látek v kapalinách, zejména v tělních tekutinách, · např. glukózy v krevním séru, za použití stlačitelných matric impregnovaných reakčními činidly, jehož podstata spočívá v tom, že vyšetřovaný vzorek se nanese na matrici, uloženou v uzavřené reakční nádobě a impregnovanou reakčním činidlem, příslušným pro zjišťované látky, po uplynutí reakční doby se vzorek z matrice vytlačí a po případném následném průchodu nejméně jednou následující matricí, impregnovanou reakčním činidlem příslušným pro určení další zjišťované látky, např. proteinu, se vzorek opticky vyhodnotí.

Dalším předmětem vynálezu je pomůcka к provádění způsobu na bázi stlačitelné impregnované matrice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje nejméně jednu matrici impregnovanou reakčním činidlem pro určení příslušné látky ve vyšetřovaném vzorku, uloženou ve válcové reakční nádobě opatřené pístem.

Pomůcka obsahuje matrice ve tvaru kotouče, které jsou od sebe odděleny vloženými děrovanými kotouči nebo zúžením reakční nádoby. Matrice sestává s výhodou ze dvou až deseti segmentů uložených na sobě. Alespoň nad jednou matricí je uložena rozváděči vrstva.

Neočekávaně se ukázalo, že pomůcka podle vynálezu umožňuje použití a účinnost analytických metod a také reakčních činidel stejným způsobem jako srovnatelný systém ve vodném roztoku, kromě toho však spojuje nebo nahrazuje další způsoby předúpravy vzorku, jako odstředění, filtraci nebo chromatografické dělení.

Pomůcka pro analýzu kapalin se může rozčlenit do jednotlivých úseků, ve kterých od sebe odděleně probíhají všechny reakce, dělení a stanovení nezbytná pro analýzu. Při analýze tělních tekutin jsou například zahrnuty kromě reakčního úseku nezbytného pro vlastní stanovení látky a případně kontrolního úseku také připravené úseky, např. к odstranění bílkovin nebo к oddělení rušících látek. Přitom je druh, počet a uspořádání jednotlivých úseků volně kombinovatelný. Například při speciálních stanoveních odpadají oddělené přípravné úseky nebo se může spojit v jednom společném přípravném úseku více různých reakčních úseků.

U pomůcky podle vynálezu jsou všechna reakční činidla potřebná к reakci od počátku stejnoměrně lyofilizována, imobilizována nebo jiným způsobem obsažena v celé matrici. Nanesení zkoušené kapaliny vede к přímému promísení reakčních složek v celé oblasti matrice. Jednotlivé reakční úseky jsou uvnitř reakčního systému jasně odděleny, to znamená, že nenastává žádná předčasná difúze nebo promíchání. Kromě toho má pomůcka podle vynálezu oproti stavu techniky řadu dalších výhod. Další mechanickou manipulací, jako stlačením vrstvy matrice během reakce, se může například dosáhnout zlepšení promíchání a zvýšení reakční rychlosti; pomůcka umožňuje použití různých a rozdílně připravených matric pro jednotlivé zkušební úseky; vyhodnocení není jen vizuální, nýbrž je také možné fotometrické vyhodnocení; provedení se může uskutečnit manuálně a mechanizovaně; použití matrice umožňuje přesné dávkování a snadnou manipulaci látek a kapalin ve zkušebním systému.

Pomůcka podle vynálezu má tak výhody uvedené při popsaném vícevrstvém suchém způsobu, jako žádné nestabilní reagenční roztoky, žádné pipetování, více zkušebních úseků, avšak kromě toho není celkový protlačený reakční roztok závislý na difúzi, a proto je možné jako u příslušných vodných systémů postup ovlivnit a libovolně přerušit. Možný stavebnicový princip umožňuje snadnou výměnu dílčích úseků a celkových zkušebních systémů. Základem pomůcky je matrice z ohebného, elastického savého materiálu, která slouží jako nosič pro reakční činidla a vzorek a jako reakční prostor, funguje jako dělicí prostředí a umožňuje pokud možno dokonalé, v každém případě však reprodukovatelné a reverzibilní uvolnění roztoků. Tato matrice je schopna do sebe dokonale a stejnoměrně pojmout a nahromadit určitý objem zkoušené kapaliny, aby se tato mohla například při nastaveném nepatrném přetlaku nebo podtlaku nebo příslušném mechanickém tlaku pokud možno úplně odstranit; tento postup je libovolně opakovatelný. Matrice musí kromě toho mít dostatečnou mechanickou a chemickou stabilitu. Pod pojmem ohebná a elastická matrice se v této souvislosti rozumí prostorová a tvarová výplň konstantní při stálých vnějších podmínkách, aniž by byla potřebná nádoba; může se reversibilně měnit pomocí tlaku. Matrice může sestávat z jednoho kusu, z více segmentů nebo z více volných nebo dodatečně dohromady spojených částí, například slepením nebo zesítěním, které vyhovují zcela nebo z převážné části příslušným požadavkům.

Vhodné materiály pro matrici jsou přírodní a syntetické houbovité a pěnové, porézní látky, například pěnové hmoty s otevřenými dutinkami a sendvičové pěnové hmoty různého původu a elastické mikrokapsle, granuláty nebo jiná tvarová tělíska ze savých materiálů. К těmto se s výhodou počítají polyuretanové pěny s otevřenými dutinkami, obzvláště polyesterové a studené pěny. Kromě toho jsou použitelné jako matrice také speciální pěnové hmoty, jako pěnové hmoty obsahující SH-skupiny při použití enzymů, které SH-skupiny potřebují, ale také transparentní polymery pro vizuální vyhodnocení.

Stlačitelnost těchto materiálů se může pohybovat v rozmezí 2 až 10 kPa, přičemž materiály se stlačitelíností pod 2 kPa mají špatné mechanické vlastnosti, materiály nad 10 kPa vyžadují při protlačení kapaliny příliš velký tlak. Objemová hmotnost nemá na použitelný materiál žádný podstatný vliv.

Pěnové hmoty dostupné v obchodě vykazují z části silnou enzymatickou inhibici, u některých může dojít během provádění způsobu podle vynálezu к silnému zákalu.

4 803 ’ 2

8ř

Inhibice se - však neohá zpravidla - úplně eliminovat přídavkem - komplexotvorných látek. Kromě toho - se mohou získat další zlepšení příslušnou - předúpravou. Pro kinetické stanovení enzymů v- kapalinách se mohou naproti tomu pokládat matrice s enzymatickou inhibicí za - obzvláště - výhodné. Je - možné napustit matrice, které obsahují - potřebná reakční činidla, zkoušenou tekutinou, přičemž - - vlastní reakce bud - vůbec neprobíhá, nebo pouze pomalu. Při protlačení - celkového roztoku z - matrice do zkušebního úseku zůstanou nežádoucí inhibiční látky v - matrici a - kinetické- stanovení je možné při poměrně nepatrné - počáteční - extínkci.

Nanesení reakčních činidel - na - matrici - se zpravidla provádí lyofílizací - segmentů z - pěnové - látky napuštěným - roztokem - - reakčních činidel. Toto· má - kromě - velké stability nanesených látek také výhodu - v tom, že je potřebné - pouze nepatrné - množství - reakčních činidel. Bylo neočekávaně zjištěno, že - při oddělování proteinu ze - zkoumaného'- - vzorku pomocí koagulačního - činidla, jako - kyseliny - trichloroctové, - je zapotřebí - desetinásobně menší množství koagulačního- činidla než - u běžných srážecích - metod. Tím^s se odstraní značné tvoření soli - podmíněné - potřebnou neutralizací - a mohou se zapojit za sebou různé zkušební - úseky- podle vynálezu.

Obecně se - nanesou - na - matrici všechna reakční činidla potřebná pro funkci příslušného- úseku, odděleně pro každý úsek. Ve speciálních případech, například - přl· nesnášenlivosti reakčních - činidel - nebo současném průběhu více reakcí s různými - reakčními činidly, může - být- také - účelné - nanášet potřebná reakční činidla odděleně od sebe. To se provádí s - výhodou - tok, - že - se - celá matrice v tomto úseku složí z jednotlivých segmentů, které obsahují různé-' látky. Matricové segmenty mohou - mít libovolnou - formu a- velikost, mohou například sestávat zkruhových segmentů, kotoučů - nebo - kuliček, které jsou na - sobě nezávislé, nebo mohou také být opojeny před; nebo - po vnesení - do reakční nádoby vhodným prostředkem- jako slepením nebo mechanickým- připevněním.

V určitých případech je nutné, aby - bylo zaručeno, aby byl zkoušený roztok dokonale protlačen z jednoho úseku do dalšího, avšak- bez reakčních - činidel rušících v - dalším - úseku. Toto - vyžaduje- mezizapojení příslušně preparované matrice nebo - mobilizaci reakčních činidel, která se- může provádět například adsorpcí, zapouzdřením nebo- chemickou metodou. Tímto způsobem je možné kopulovat více ze sebou- zapojených úseků s velice rozdílnými reakčními podmínkami, například rozdílnými hodnotami pH- nebo s navzájem se rušícími reakčními činidly. Také v případech; ve kterých není možné nanášení napouštěním nebo - lyofilizací, se mohou - látky připravit v kapalné formě, - například nasátím - do - matrice.

Nejrůznější - možnosti imobilizace - - látek na polymerních nosičích chemickou metodou jsou známé - z literatury. Například může - být uvedena vazba na nosič funkčními skupinami nebo- zesítění glutardialdehydem, - akrylamidem atd. Také jsou - možné imobilizace nízkomolekulárních látek - na polyurethanových - pěnách, obzvláště na tak zvaných studených pěnách, příslušně adaptovanou variací tak- - zvaného - triazinového- způsobu, viz Biochem. - J. 109, 137- (1968). - Tento způsob - umožňuje - vázat velký počet sloučenin s OH-, . SH- nebo- NH₂-skupinami na - pěnové hmoty s hustotou - vazeb cca 1 ^mol/ml pěnové hmoty. Kromě reakčních činidel je také samozřejmě - možné- vázat - ' deriváty s krátkým a dlouhým řetězcem, připojené například - na polymery - jako - škrob nebo dextran nebo je zadržovat v pěnové hmotě fyzikálně nebo pohlcením.

Reakční nádoba - má - s výhodou formu válce s kónickým výtokem: s výhodou se použijí pipety, injekční stříkačky - nebo- tak zvané jednocestné - stříkačky o průměru 5 - až 30 - mm, a - to· - o délce 10 - až 150 - mm. Mohou se však také použít kyvetové reakční nádoby. Tyto- reakční nádoby mohou sestávat z průhledné nebo - částečně průhledné plastické hmoty - nebo pevných - materiálů, jako skla - nebo- kovu. Výhodné jsou ohebné průhledné- plastické - hmoty.

Podle výhodného způsobu provedení obsahuje pomůcka nejen jednu matrici, nýbrž více nad sebou uspořádaných matric, které jsou - od sebe odděleny zařízením propustným pro - kapalinu jako- můstkem, mezikotoučem opatřeným otvory nebo - zúžením reakční nádoby. Formou tohoto uspořádání - -a velikostí -otvorů- v mezikotouči se nechají ovlivnit - průtokové - a difúzní procesy při převádění - analyzované kapaliny mezi - jednotlivými - úseky matrice. Mezikotouče se mohou do reakční nádoby vestavět tak, aby při- nastavení určitého tlaku byly posuvné.

Jestliže je reakční nádoba mezi - jednotlivými matricemi zúžena, mohou se tyto zvenčí nařízeným tlakem - uzavřít; přitom se matrice rovněž stlačí, takže kapalina vystoupí z pěnové hmoty a při uvolnění se opět zcela nasaje do pěnové - hmoty. Tento postup je také proveditelný stlačením pístu s otvory.

Pomůcka podle vynálezu je schematicky znázorněna na přiloženém výkrese.

Znázorněná forma provedení sestává z reakční nádoby 1, která vyúsťuje v zúžení 2, které je vytvořeno jako kyveta, a indikačního úseku zkušebního systému nebo sběrné nádrže 3 pro tekutinu vyhodnocovanou vně reakční nádoby. Matrice 4- impregnované reakčními - činidly jsou - od - sebe odděleny mezikotouči 5; nad matricemi se nachází rozdělovači vrstva 6 a - píst 7.

Způsob určování- látek v kapalinách za použití - pomůcky podle vynálezu se provádí tak, že se na- horní matrici- reakční nádoby nanese obvyklým nanášecím - systémem zkoušený - vzorek; přitom se také- _ přidá ke - zře248032 dění nezbytné rozpouštědlo. Přirozeně je také možné jednoduchým kontaktem se zkoušenou kapalinou tuto odsát kapilárním působením do úseku této matricové vrstvy. Tento postup se může usnadnit vhodnou konstrukcí horní části reakční nádoby, například vytvořením komory mající určitý objem. Tím je možné vestavění další rozdělovači vrstvy nad první vrstvou matrice, která může například sestávat z vrstvy filtračního papíru. Přitom se může zkoumaný roztok před nebo po nanesení zředit. Postup se může potom provádět buď hned, nebo se může reakční nádoba uskladnit.

Po stanovené reakční době se první vrstva matrice vhodným zařízením, například pístem stlačí. Tlak se nastaví přitom tak, aby se matrice stlačila a mezikotouče si zachovaly svou polohu. Tím se zajistí, aby se tekutina obsažená v matrici přenesla na druhou matrici. Vlastnosti popsané matrice mají za následek, že těsnění mezi jednotlivými matricemi je zbytečné.

Různé dílčí reakce se mohou tímto způsobem provádět od sebe odděleně, jako odstranění bílkoviny, oddělení složek krve, oddělení izoenzymů, imunní reakce, specifická srážení nebo komplexotvorná srážení, enzymatické nebo chemické identifikační reakce. Kromě toho je také možné zadržet látky pomocí příslušných mezivrstev mezi dvěma úseky. Tyto mezi vrstvy mohou rovněž sestávat z pěnové látky, předem upravené pěnové látky nebo také z filtračních vrstev z papíru nebo jiného savého materiálu.

Je podstatné, aby se zkoušená tekutina přemísťovala reprodukovatelně z jednoho úseku do druhého. Výhodné by bylo kvantitativní převádění, čehož se však na základě použitých materiálů matrice nemůže dosáhnout. Normálně se zadrží 2 až 15 °/o tekutiny z matrice. Toto procento je však pro použitý materiál matrice reprodukovatelně a použije se jako konstantní faktor při vyhodnocování.

Vyhodnocení se provádí obvyklým způsobem podle všech dostupných metod. Výhodné jsou optické a reflektometrické metody vyhodnocení.

Po průchodu poslední vrstvy matrice se reakční roztok dostane do měrného článku uvnitř reakční nádoby a vyhodnocuje se uvnitř reakční nádoby. Je však také možné přemístit reakční roztok do měrného článku nacházející se vně reakční nádoby a vyhodnocení provádět zde. Mohou se však také provádět speciálně kontrolní reakce, jako například kontrola difúze plynu, nebo elektro chemická stanovení.

Jako zkoušené kapaliny hlavně byly použity tělní tekutiny, protože způsob a pomůcka podle vynálezu jsou zejména vhodné ke stanovení složek krve, séra nebo moči.

Vynález bude blíže objasněn v následujících příkladech.

Přikladl

Odstranění bílkovin ze vzorku séra

Z polyurethanové studené pěny se vyvrtají kotoučovité segmenty o 0 15 mm a výšce 4 mm. Tyto se napustí 50 μΐ roztoku trichloroctové kyseliny 2 moly/1 nanesením do středu segmentu a tak dlouho se suší, až mají obsah trichloroctové kyseliny 5 x 10⁵molu. Každý takto připravený matricový segment se zavede do jednocestné stříkačky o obsahu 10 ml. Do středu segmentu se přidá 10 μΐ vzorku séra s 5,5 mg/dl proteinového obsahu, který obsahuje stanovené množství glukózy. Potom se zavede shora společně s pístem matricový segment z polyurethanové studené pěny o 0 15 mm a výšce 16 mm připevněný na pístu stříkačky, který byl napuštěn 1,1 ml vody a protlačí se až к dorazu. Ve vytlačeném celkovém roztoku se stanoví obsah proteinu pomocí biuretového způsobu a obsah glukózy pomocí způsobu glukóza — dehydrogenóza následujícím způsobem:

C = F . E přičemž E je extinkce měřená při 365 mm. Faktor F se vztahuje ke zředění, slepé hodotě a ztrátě glukózy v matrici a byl stanoven řadou pokusů se standardními roztoky jako 710.

Glukóza (mg/100 ml) Protein (g/100 ml)

nasazeno	nalezeno	nasazeno	nalezeno
20	19	5,5	0,1
34	32	5,5	0
50	52	5,5	0,2
70	74	5,5	0,1
100	97	5,5	0,1
141	135	5,5	0
167	174	5,5	0,1
250	245	5,5	0,1
500	478	5,5	0,2

4 8 0' 3 2

Hodnoty ukazují, . že bylo dosaženo odstranění bílkovin a hodnoty glukózy reprodukují použité koncentrace s uspokojivou přesností.

Příklad 2

Stanovení glukózy

Z polyurethanpolýesteroVé pěny se vyvrtají cylindrické matricové segmenty . o 0 15 milimetrů a výšce 16 mm a promyjí se. Usušené segmenty se napustí 1,1 ml roztoku, který obsahoval

0,2 molu/1 fosforečnanového pufru, pH 7,6,

0,15 molu/1 chloridu sodného, . kU/1 glukózy-dehydrogenázy, manální test 50 80 matricový systém 50 79

Příklad 3

Stanovení proteinu

Z polyurethanové studené pěny se vyvrtají válcové matricové segmenty o 0 12 mm a výšce · 8 mm, promyjí se, suší a potom se napustí 0',5 ml roztoku, který obsahoval

m.molů/1 vínanu sodnodraseíného, mmolů/1 jodidu draselného, mmolů/1 síranu mědi · a

200 mmolů/1 hydroxidů sodného· a potom se lyofilizuje. K takto připraveným reakčním matricím v Smilílítrové jednocestné stříkačce se přidá zředěný . zkoušený roztok obsahující různá množství . albuminu, 10 μΐ vzorku + 0,5 ml vody. Zavedením a opakovaným stlačením pístu opatřeného se během .10 minut několikrát vytlačí roztok . v matricovém segmentu do prostoru pod · matrici .a opět se nasaje do pěnové hmoty. Během této doby byl . výtok stříkačky utěsněn. Potom se · vymění píst za píst bez otvorů, celkový roztok se vytlačí do kyvety a měří se extinkce roztoku při 546 nm proti slepámu pokusu reakčmho roztoku. Přepočítáním se nechá . zjistit proteinová koncentrace · výchozího, vzorku při F = 15.

Protein (g/100 ml)

Nasazeno. Zjištěno

2,0	2,1
3,0	3,0
5,0	4,9
6,0	6,2
8,0	7,9
10,0	10,1
12,0 '	11,8

0,11 kU/1 mutarotázy, mmolu/1 nikotmamidadenindinukleo- tidu, mmolů/1 éthylendiamintetraacetátu a potom se lyofilizuje. K takto· připraveným reakčním matricím v lOmililitrové jednocestné skříkačce se přidá nasátím 1,1 ml vzorku séra s odstraněnou bílkovinou, který obsahoval 10 μΐ určitého množství glukózy. Po 10 minutách se vytlačí celkový roztok stlačením · stříkačkového pístu do kyvety. . Při extinkci 365 nm (F · = 647] se stanoví koncentrace glukózy ve vzorku. Srovnáním s výsledky, které se získaly obvyklým způsobem stanovení jako mannálním testem při analogických zkušebních podmínkách, byly zjištěny následující koncentrace glukózy v mg/100 ml, které ukazují dobrou shodu:

100 165 · 200 370 435 500

102 161 204 365 427 485

Příklad 4

Stanovení glutamátoxalacetáttransaminázy

Z polyu^ethanpolýesterové pěny se vyvrtají válcové matricové . segmenty o'. 0 20 mm a výšce 30 mm a promyjí se. Usušené segmenty se z poloviny jako segmenty . I napustí roztokem, který obsahoval .

mmolů/1 fosforečnanového pufru, pH 7,4,

200 . mmolů/1 L-asparátu,

0,18 mmolu/1 NADH redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu, g/1 albuminu, gl,2 kU/1 nikotinamidadenindinukleotidu a §0,6 kU/1 malátdehydrogenázy a . lyofilizuje . se. Příslušným způsobem se přidá k .druhé polovině segmentů označených segment II 3 ml roztoku mmolů/1 fosfátového pufru, pH 7,4, mmolů/1 oxoglutarátu a mmolů/1 ethylendiamintetraacetátu a lyofilizuje se. Ve 20mililitrové jednocestné stříkačce se převrství segment I polyethylenovým mezikotoučem o 0 20 mm a tloušťce 2 mm s provrtanými děrami a ségmentem II. Na tento . se dá 2,5 ml zředěného· vzorku standardního séra obsahujícího. . ' 500 μΐ séra s různými nastavenými aktivitami. glutamátoxalacetáttransaminázy + 2 ml . fyziologického roztoku a . po 5 minutách .se . stlačením stnkačkbvého pístu převede ná segment I. Přitom se vyvine jen takový tlak, aby se dosáhlo pokud možno úplného převedení, ale

4 8 O 3 2 nikoliv posun mezikotouče. Po dalších 2 minutách se úplným stlačením pístu vytlačí celkový roztok do kyvety a zaznamená se průběh extinkce při 334 nm. Ze stoupání získaných křivek se nechá vypočítat enzymatická koncentrace zkoušeného vzorku při F — 1 471.

Glutamátoxalacetáttransamináza (U/l)

Nasazeno^ Nahrazeno

3,2

5,0

111

140

2,9

5,3

74 109 143

Příklad 5

Odstranění bílkoviny a stanovení glukózy

V lOmililitrové jednocestné stříkačce se oddělí několikanásobně provrtaným polyethylenovým kotoučem o 0 15 mm a tloušťce 2 mm segment ke stanovení glukózy jako v příkladu 2 a nad ním se uspořádá segment k odstranění bílkoviny podle příkladu

1. Ke stanovení obsahu glukózy sér se dá na horní segment impregnovaný kyselinou trichlóroctovou 10 ,μ! vzorku séra s různým určitým množstvím glukózy při obsahu proteinu 5,5 mgldl, jak popsáno v příkladu 1, a stlačí se 1,1 ml vody na segment ke stanovení glukózy. Přitom se vyvine pouze takový tlak, aby se dosáhlo pokud možno· úplného převedení celkového roztoku, avšak aby se neposunul mezikotouč. Po 10 minu-, tách se stlačením pístu až k dorazu vytlačí celkový roztok do kyvety. Stanovení koncentrace glukózy se provádí měřením extinkce při 365 nm. Získá se analogicky podle příkladu 2 lineární měřicí rozsah 20 až >500- mg/dl glukózy.

Příklad 6

Stanovení glukózy

Z polyurethanové polyesterové pěny se vyvrtají válcové matricové segmenty o průměru 15 mm a výšce 16 mm a promyjí se.

Vysušené segmenty se napustí 1 ml roztoku, který obsahoval ' mmolů/1 fosforečnanového pufru,

PH 7,5,

0,2 kU/1 diaforázy a

0,6 m‘molu/1 3-(4-jódfenyl )-2-( 4-nitrof enylj -5-f enyl-2H-tetrazoliumchloridu a potom se lyofilizuje. Takto připravené reakční matrice se v lOmililitrové . jednocestné stříkačce, rozdělené několikrát provrtaným polyethylenovým kotoučem, převrství příslušnými . segmenty reakční matrice ke stanovení glukózy (srov. příklad 2). Na poslední segment se dá analogicky podle příkladu 2 1,1 ml vzorku séra s odstraněnou bílkovinou a celkový roztok se převede po až 3 minutách do- segmentu diafórázaltetrazoliová sůl. Po·- 10 minutách se provádí hodnocení pomocí vizuálního- barevného srovnání matrice napuštěné vzorkem s barevnou srovnávací tabulkou nebo měřením extinkce vytlačeného roztoku při 400 až 600 nm. Získaly se analogické výsledky jako v příkladu ' 2.

Příklad 7

Odstranění bílkoviny a stanovení glukózy

V lOmililitrové jednocestné stříkačce, rozdělené několikrát provrtaným polyethylenovým kotoučem o 0 15 mm . a tloušťce 2 milimetry, se navrství nad sebou od shora dolů segmenty ' k odstraněni bílkoviny podle příkladu 1 a stanovení glukózy podle příkladu 6. Na . matrici napuštěnou kyselinou trichloroctovoú se nanese do- středu 10 μ1 vzorku séra s 5,5 mg/dl obsahu proteinu, který obsahuje určité množství glukózy. Analogicky podle příkladu 5 se vzorek š odstraněnou bílkovinou potom převede společně s proplachovacím roztokem doúseku stanovení glukózy a po dalších 2 až minutách do segmentu diaforázaltetrazoliová sůl. Po dalších 10 minutách se provede vyhodnocení vizuálně pomocí barevné srovnávací tabulky nebo měřením extinkce vytlačeného roztoku při 578 nm. Získaly se analogické výsledky jako . v příkladu 5.

Claims

1. Způsob určování látek v kapalinách, zejména v tělních tekutinách, například glukózy v krevním séru, za. použití stlačitelných matric impregnovaných reakčními činidly, vyznačený tím, že vyšetřovaný vzorek se nanese na matrici, uloženou v uzavřené reakční nádobě a impregnovanou reakčním činidlem, příslušným pro zjišťované látky, po uplynutí reakční doby se vzorek z matrice vytlačí a po případném následném průchodu nejméně jednou následující matricí, impregnovanou reakčním činidlem příslušným pro určení další zjišťované látky, například proteinu, se vzorek opticky vyhodnotí.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že vytlačení vzorku z matrice se provádí tlakem pístu v nádobě.

3. Způsob vyznačený podle bodu 1, vyznačený tím, že během reakční doby se vzorek opakovaně nasává do matrice a vytlačuje z matrice.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že z vyšetřovaného vzorku se předem odstraní bílkovina.

5. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že k odstranění bílkovin se vzorek protlačí matricí impregnovanou koagulačním reakčním činidlem.

6. Pomůcka k provádění způsobu podle bodu 1, na bázi stlačitelné impregnované matrice, vyznačená tím, že nejméně jedna matrice (4) impregnovaná reakčním činidlem pro. určení příslušné látky ve vyšetřovaném vzorku je uložena ve válcové reakční nádobě (1) opatřené pístem (7).

7. Pomůcka podle bodu ' 6, vyznačená tím, že matrice (4) jsou od sebe odděleny vloženými děrovanými kotouči (5).

8. Pomůcka podle bodu 6, vyznačená tím,

VYNÁLEZU že matrice (4) jsou od sebe odděleny zúžením reakční nádoby (1).

9. Pomůcka podle bodů 6 až 8, vyznačená tím, že matrice (4) mají tvar kotouče.

10. Pomůcka podle bodů 6 až 9, vyznačená tím, že matrice (4) sestává ze dvou až deseti segmentů uložených na sobě.

11. Pomůcka podle bodů 6 až 10, vyznačená tím, že alespoň nad jednou matricí (4) je uložena rozváděči vrstva.

12. Pomůcka k provádění způsobu podle bodu 1 k určování glukózy v séru na bázi stlačitelné impregnované matrice, . vyznačená tím, že matrice je impregnovaná reakčním činidlem z fosforečnanového pufru, chlo-ridu sodného, glukózodehydrogenázy, mutarotázy, nikotinamidadenindinukleotidu a ethylendiamintetraacetátu.

13. Pomůcka podle bodu 12, vyznačená tím, že pod matricí (4) je uložen děrovaný kotouč (5) a pod ním matrice (4) impregnovaná roztokem fosforečnanového pufru, diaforázy a 3-[4-jodf enyl)-2-(4-mtrofenylj -5--fenyl-2H-tetrazoliumchloridu.

14. Pomůcka podle bodu 6 k určování proteinu, vyznačená tím, že matrice je impregnovaná roztokem vínanu sodnodraselného, jodidu draselného, síranu měďnatého· a hydroxidu sodného.

15. Pomůcka podle bodu 6 k určování glutamátoxalacetáttransaminázy, vyznačená tím, že v reakční nádobě je uložena matrice impregnovaná roztokem fosforečnanového. pufru, oxoglutarátu a ethylendiamintetraacetátu a pod ní je umístěna matrice impregnovaná fosforečnanovým pufrem, L-aspartátem, redukovaným nikotinamidadenindinukleotidem, albuminem, laktátdehydrogenázou a malátdehydrogenázou.